Fluorimetría. Determinación de Una Muestra de Riboflavina

INFORME LABORATORIO 6
Fluorimetra
Integrantes: Vernica Ulloa

Romina Moris
Fecha: 04/04/2017
Grupo: 3
Introduccin
La fluorimetra es un mtodo espectroscpico que utiliza la fluorescencia de algunas

molculas, que es la capacidad de absorber luz para luego emitirla a longitudes de onda
mayores(1). Esto se debe a que la luz excita los electrones de la molcula con una cierta
energa, pasado un corto tiempo esta energa es emitida tanto por fluorescencia como por
calor u otros fenmenos fsicos, por lo que la luz emitida es de menor energa y en
consecuencia de mayor longitud de onda.
Utilizando un equipo denominado espectrofotmetro de fluorescencia, que mide tanto los

espectros de absorcin y emisin de las molculas fluorescentes como la intensidad de
emisin de estas molculas tras ser excitadas a una determinada longitud de onda.
El equipo est conformado por una fuente de luz, dos monocromadores, un detector y un
registrador. La muestra se ubica entre los monocromadores, pues al medir la intensidad de
emisin se debe filtrar una longitud de onda de excitacin (la de mayor absorcin) y una
longitud de onda de emisin (aquella que la molcula emite con mayor intensidad). Adems
tanto el segundo monocromador como el detector deben situarse perpendicularmente al haz
de luz incidente en el interior del equipo, con lo que se evita que el detector interprete como
luz de emisin fluorescente la luz entregada por la lmpara del equipo.
En este prctico se determinar la concentracin de riboflavina en una muestra problema a

travs de la intensidad de emisin de distintas soluciones estndar de concentracin conocida
con cuyos datos se construir una curva de calibracin.
Materiales y mtodos
Los materiales e instrumentos utilizados en la fluorimetra fue un fluormetro marca PERKIN

ELMER modelo LS 50 B, celdas plsticas y de cuarzo donde se colocaron las muestras,
solucin de riboflavina de 100 ppm en cido actico al 5% v/v, cido actico al 5%, matraces
volumtricos, micropipetas y puntas para micropipetas.
Inicialmente se procedi a realizar una solucin de 10mg/L de riboflavina en cido actico
(solucin II) a partir de la solucin de riboflavina de 100 ppm. A partir de esta solucin se
prepararon cuatro soluciones patrones de 5, 2.5, 1.25 y 0.625 mg/L utilizando cido actico al
5% como solvente.
Luego se midi el espectro de absorcin de la solucin de riboflavina 10mg/L en un
espectrmetro de absorcin molecular marca MASIP modelo Helios Alpha y los espectros de
excitacin y emisin de la solucin de riboflavina 0.625 mg/L en fluormetro.
Finalmente se midi la intensidad de la fluorescencia en cada una de los patrones y tambin
la de la muestra problema, restando la emisin del cido actico a la medicin (blanco).
Posteriormente se realiz una curva de calibracin intensidad de emisin vs concentracin de
los patrones y se determin la concentracin de la muestra problema.
Resultados y discusin
Los resultados obtenidos de los distintos mtodos de espectrometra de fluorescencia se

presentan a continuacin en los grficos 1,2, 3, 4 y 5.
A travs del espectro de absorcin de la riboflavina (Grfico 1) se obtuvieron dos picos de
absorcin, uno a 360 y otro a 450 nm aproximadamente. Estas longitudes de onda se
utilizaron para obtener los espectros de emisin de la solucin de riboflavina 0,625 ppm
(Grficos 2 y 3).
Grfico 1: Curva de absorcin de riboflavina 10 mg/L en cido actico al 5%

Los dos espectros de emisin realizados a 360 y 450 nm dieron un pico de absorcin a 520
nm, dato que nos permiti realizar el espectro de excitacin, el cual se encontraba a
longitudes de onda menores que el espectro de emisin (Grfico 4, color azul).
Grfico 2: Espectro de emisin a 360 nm de solucin de riboflavina 0,625 mg/L en cido
actico
Grfico 3: Espectro de emisin a 450 nm de solucin de riboflavina 0,625 mg/L en cido

actico
En el grfico 4 se muestran el espectro de emisin en color rojo y el espectro de excitacin en

color azul. Cabe resaltar que los picos que muestra el espectro de excitacin corresponde a las
mismas longitudes de onda que se observaron en el espectro de absorcin en el grfico 1.
Grfico 4: Espectro de emisin y excitacin a 520 nm de solucin de riboflavina 0,625 mg/L

en cido actico.
Los resultados de la medicin de la intensidad de fluorescencia se muestran en la tabla 1,
donde se incluy como solucin nmero 6 a la muestra problema.
Nmero de solucin Concentracin (ppm) Intensidad de emisin
1 10 199,799
2 5 101,042
3 2,5 53,173
4 1,25 28,246
5 0,625 15,521
6 X 53,665
Tabla 1: Intensidad de emisin obtenida a distintas concentraciones de soluciones patrn
Grfico 5: Curva de calibracin intensidad de emisin vs concentracin de soluciones patrn

de datos presentados en Tabla 1
Para calcular la concentracin de la muestra problema se utiliz la ecuacin de la curva de

calibracin de intensidad de emisin vs concentracin, teniendo la muestra una intensidad
de emisin de 53,665. Por lo tanto se tiene la siguiente ecuacin, donde la concentracin
equivale a nuestra incgnita:
53,665 = 20,128x x = 2,6662 ppm Concentracin de la muestra problema,
considerando que a concentracin 0 no hay emisin.
La linealidad obtenida en la curva de calibracin se debe a la baja concentracin de

riboflavina empleada, pues a bajas concentraciones de soluto se reducen al mnimo las
interacciones entre las molculas y la intensidad de emisin depende directamente de la
concentracin de riboflavina, pues tanto la absortividad como el camino recorrido por la luz
a travs de la cubeta se mantienen constantes. A mayores concentraciones de riboflavina
las molculas podran comenzar a absorber la emisin luminosa de las molculas vecinas,
disminuyendo as la cantidad de luz emitida que conseguira llegar hasta el detector.
Lo sealado anteriormente limita la tcnica en cuanto a la concentracin de las muestras
que se pueden cuantificar, pues la desviacin de la linealidad de la curva de calibracin
limitara las concentraciones de las soluciones estndar a la zona en que la intensidad de
emisin y la concentracin de riboflavina se relaciona de forma directa. Adems sera de
suma importancia que la intensidad de emisin de la muestra problema no superar la de la
solucin estndar ms concentrada, pues al interpolar el valor en la curva de calibracin
existe la posibilidad de cometer un error en la medicin.
Al comparar el espectro de absorbancia UV-Vis (Grfico 1) con el de excitacin y emisin

(Grfico 4) se observa que en el grfico 1 la curva presenta una absorbancia bastante baja
incluso en los picos mximos, de hecho estos apenas se distinguen del fondo, por lo que
podemos decir que la concentracin usada para medir (10 ppm) es relativamente baja para el
mtodo. En cambio, cuando se midieron los espectros de excitacin y emisin en el
espectrofotmetro de fluorescencia, se observaron peaks bastante notorios con una
concentracin de 0,625 ppm. Con esto podemos decir que el rango de concentraciones
utilizado en fluorimetra es bastante menor en comparacin con el rango de concentraciones
utilizado en la espectroscopa UV-Vis.
En cuanto a la selectividad del mtodo se puede decir que es mayor a la de la espectroscopa
de absorcin molecular, debido a que la especie no solo se caracteriza segn la longitud de
onda a la que absorbe la luz, si no tambin a la longitud de onda que la emite. Por otra parte
posee una selectividad menor a la de la espectroscopa de absorcin atmica, pues cada
elemento posee un patrn de emisin nico, mientras que la longitud de onda a la que
absorben y emiten la luz dos molculas puede coincidir.
Conclusin
De este prctico podemos concluir que la fluorimetra es un buen mtodo de cuantificacin de

molculas que emiten luz fluorescente mientras se encuentren a baja concentracin.
Adems podemos concluir que este mtodo posee una selectividad intermedia.
Bibliografa
1. Fersht, A. (1980). Estructura y mecanismo de los enzimas (No. 6). Revert.pp 160-161

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Integrantes: Vernica Ulloa

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Grfico 1: Curva de absorcin de riboflavina 10 mg/L en cido actico al 5%

Grfico 3: Espectro de emisin a 450 nm de solucin de riboflavina 0,625 mg/L en cido

En el grfico 4 se muestran el espectro de emisin en color rojo y el espectro de excitacin en

Grfico 4: Espectro de emisin y excitacin a 520 nm de solucin de riboflavina 0,625 mg/L

Nmero de solucin Concentracin (ppm) Intensidad de emisin

Grfico 5: Curva de calibracin intensidad de emisin vs concentracin de soluciones patrn

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