Universidad

de BIOSÍNTESIS COMBINATORIA PARA LA OBTENCIÓN DE NUEVOS

Oviedo
FÁRMACOS ANTITUMORALES DE TIPO INDOLOCARBAZOL
César Sánchez, Alfredo F. Braña, Aaroa P. Salas, Carmen Méndez y José A. Salas.
Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (I.U.O.P.A.) - Obra Social Cajastur,
y Departamento de Biología Funcional, Universidad de Oviedo.
Biosíntesis de Moléculas Antitumorales

INTRODUCCIÓN RESUMEN
H H
O N O N O
Los indolocarbazoles son una familia de productos naturales aislados de diferentes organismos En este póster, presentamos algunos resultados de nuestro trabajo en el
(bacterias, hongos, invertebrados marinos) y que poseen interesantes actividades farmacológicas. campo de la biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles antitumorales
En particular, la rebecamicina y la estaurosporina son dos indolocarbazoles producidos por (recientemente publicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (Ref. 1). Para ello,
varias cepas bacterianas del grupo de los actinomicetos. Actualmente existen varios derivados de N N expresamos en un microorganismo huésped (Streptomyces albus) diferentes
N N
ambos compuestos que se encuentran en ensayos clínicos para el tratamiento de diversos tipos de H conjuntos de genes implicados en la biosíntesis de rebecamicina,
Cl Cl O
cáncer, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson) y ciertas patologías asociadas a la estaurosporina, pirroindomicina y tienodolina (todos estos compuestos son
diabetes. Las actividades terapéuticas de estos compuestos se basan en su acción inhibitoria sobre O OH H3 C H metabolitos derivados de triptófano, producidos por Lechevalieria
ADN topoisomerasas (los derivados de rebecamicina) o sobre diversas proteína quinasas (los O aerocolonigenes, Streptomyces longisporoflavus, S. rugosporus y S.
derivados de estaurosporina). HO NH albogriseolus, respectivamente). La colección de cepas generadas fue
OH CH3
analizada en busca de derivados o precursores de tipo indolocarbazol. El
La biosíntesis combinatoria es una nueva estrategia, dentro de la ingeniería metabólica, que O CH3 resultado fue la obtención de más de 30 compuestos diferentes, cuya
tiene como objetivo la producción de compuestos químicos de interés que sean inaccesibles o H3C actividad antitumoral está siendo ensayada actualmente. El número de
ESTAUROSPORINA
difíciles de obtener por métodos de síntesis química convencional. Para ello, se parte de un REBECAMICINA compuestos derivados podrá ser ampliado mediante métodos biológicos
Derivados en ensayos clínicos contra
conjunto de genes (procedentes de diferentes organismos), cada uno de los cuales es responsable Derivados en ensayos clínicos contra el el cáncer: Midostaurin (PKC412), (manipulaciones genéticas adicionales) o químicos (modificaciones
de una determinada reacción metabólica. La biosíntesis combinatoria consiste en la co-expresión cáncer: Becatecarin (DEAE- CEP-701, UCN-01
rebeccamycin), Edotecarin (J-107088)
químicas de los compuestos obtenidos), con el objetivo de generar
de diferentes combinaciones de dichos genes en un organismo huésped, para crear nuevas rutas compuestos con actividades antitumorales mejoradas.
metabólicas que darán lugar a los compuestos de interés.

IDENTIFICACIÓN DE GENES
En primer lugar, necesitábamos identificar los genes responsables de la biosíntesis BIOSÍNTESIS COMBINATORIA: ESTRATEGIA
de los dos compuestos que queríamos modificar: rebecamicina y estaurosporina.
Esto fue realizado mediante el empleo de sondas heterólogas y mediante la
expresión (en cada caso) del conjunto completo de genes en la bacteria huésped S.
albus, con la consiguiente obtención de nuevas cepas productoras de rebecamicina y
de estaurosporina (Refs. 2, 3). Los genes de biosíntesis de pirroindomicina en S.
pirroindomicina
rugosporus y de tienodolina en S. albogriseolus fueron suministrados por otro S. rugosporus
laboratorio (Prof. Karl-Heinz van Pée, TU Dresden, Alemania). L. aerocolonigenes rebecamicina
pyrH

G O D C P M R F U H T
1 kb
reb G O D C P M R F U H T
H
G
sta R B A N G O D P MA J K I E MB C
M
D pyrH
Formación del indolocarbazol Formación del azúcar
Unión del azúcar Resistencia / Secreción BANCO DE GENES
Cloración Regulación C S. albogriseolus tienodolina
P
S. longisporoflavus estaurosporina O thal
Genes responsables de la biosíntesis de rebecamicina (reb) thal
y de estaurosporina (sta). El código de colores es el mismo que en la Figura 1. staC
staC

BIOSÍNTESIS COMBINATORIA: RESULTADOS

H H
N H H H
Combinaciones de genes Productos
HOOC N COOH O O
HO N O O N O HOOC N COOH Combinaciones de genes
H
N H (diseñadas racionalmente)
N N N N
O O N O S. albus
N N N N N N
rebO rebD 1 H
1
H H
2
H
H H H R1 H H R2
4 O OH
N N N N 7 R1=Cl, R2=H
rebO rebD rebP 2, 3, 4 H
N
H
3
H H
O OH
HO
OH 8 R1=R2=Cl
O O H OCH3
O N O 26 R1=Br, R2=H
HO 27
rebO rebD rebC rebP 2 O
H
N O
H
N
OH
OH
6
30
R1=R2=Br
R1=Cl, R2=Br
O
N N H
H H 5
rebO rebD rebC rebP rebG 5 R1 R2
R1
N
H
N
R2 H
N O
9 R1=Cl, R2=H O OH N N N
N N O
H
rebO rebD rebC rebP rebG rebM 6, 5 10 R1=R2=Cl
28 R1=Br, R2=H
HO
OH
R1
O OH
R2 H
O OH N N
OH R1 H H R2
29 R1=R2=Br HO
HO
rebO rebD rebH 7, 8, 1 / 26, 27, 30 11 R1=R2=Cl OH
OCH3 OH
OH
N
H
N
15 R1=Cl, R2=H
H
N
31 R1=R2=Br O OH O
H
N O 12 R1=R2=Cl
13 16 R1=R2=Cl Colección de cepas recombinantes
rebO rebD rebC rebP rebH 9, 10, 2 / 28, 29 32 R1=R2=Br HO
OH
H OCH3
N N N
HOOC COOH H H
rebO rebD rebC rebP rebT rebG rebH 11 / 31 R1
N
H
N N O 14 R1
O OH
R2
O OH R2 R1 R2
H H
N Cl HOOC N COOH HO
O O
rebO rebD rebC rebP rebT rebG rebM rebH 12 / 32 HO
OH
N
H
N
H Cl
OH
OH
OCH3 N N
H H 17 R1=Cl, R2=H
21 R1=Cl, R2=H
rebO rebD staP 2, 3, 4 19 R1=Cl, R2=H 22 R1=R2=Cl N N 24
Cl N
H
N
H 18 R1=R2=Cl
H H
20 R1=R2=Cl 23 25
rebO rebD rebC staP 2
rebO rebD staC staP 3
rebO rebD staC rebP 3
Actividad antitumoral de algunos de los compuestos obtenidos en este trabajo.
rebO rebD staC rebP rebG 13
rebO rebD staC rebP rebG rebM 14, 13 GI50 a (μM)
Tumor cell lines Sta b 12 6 2 3 9 1 7
rebO rebD staC rebP rebH 15, 16, 8 Prostate DU-145 0.004 0.444 0.339 3.07 2.39 8.09 18.5 18.5
LN-caP 0.011 0.438 0.291 >30.7 13.0 12.6 >25.9 >25.9
rebO rebD staC rebP rebG rebH 17, 18, 8 Ovarian IGROV 0.008 0.426 0.168 8.76 7.10 12.4 14.4 14.4
IGROV-ET 0.006 0.777 0.461 16.1 6.20 7.25 15.1 15.1
rebO rebD staC rebP rebG rebM rebH 19, 20, 8 Breast SK-BR3 0.013 0.845 0.279 0.162 1.90 1.48 7.08 7.08
Melanoma SK-MEL-28 0.025 0.906 0.201 >30.7 10.1 14.1 17.1 17.1
rebO rebD pyrH 21, 22, 1 NSCL c A549 0.008 0.761 0.512 >30.7 10.6 6.98 14.3 14.3
Leukemia K-562 0.641 0.470 0.383 >30.7 29.0 14.0 12.2 12.2
rebO rebD rebC rebP pyrH 23, 2 Pancreas PANC1 0.008 1.23 0.668 13.6 8.25 8.76 10.8 10.8
Colon HT29 0.076 1.55 1.11 >30.7 15.6 2.54 >25.9 >25.9
rebO rebD staC rebP pyrH 24, 3 LOVO 0.014 0.144 0.479 1.57 1.32 3.20 7.99 7.99 1. Extracción y purificación de compuestos (HPLC).
LOVO-DOX 0.058 6.08 6.08 >30.7 11.3 15.2 >25.9 >25.9
rebO rebD thal 25, 1 Cervix HELA 0.007 0.314 0.758 0.959 0.652 2.49 7.71 7.71 2. Caracterización estructural (MS, NMR).
HELA-APL 0.022 0.996 0.630 6.15 4.53 15.1 25.5 25.5
3. Ensayos de actividad antitumoral.
a
GI50, 50% growth inhibition.
Algunas de las combinaciones de genes que fueron b
For comparison, values for staurosporine (Sta) are also shown.
expresadas en S. albus, y productos obtenidos. c
NSCL, non-small cell lung.

AGRADECIMIENTOS REFERENCIAS
Gracias a Obra Social Cajastur por el apoyo financiero a C.S. Este trabajo ha sido financiado 1. Sánchez C, Zhu L, Braña AF, Salas AP, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2005. Combinatorial biosynthesis of antitumor indolocarbazole compounds.
por el Ministerio de Educación y Ciencia (BIO2000-0274, BMC2003-00478) y por el Plan Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 461-466.
Regional de Investigación del Principado de Asturias (GE-MED01-05). Agradecemos 2. Sánchez C, Butovich IA, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2002. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin:
también el apoyo de la Red Temática de Investigación Cooperativa de Centros de Cáncer characterization and generation of indolocarbazole derivatives. Chem. Biol. 9, 519-531.
(Ministerio de Sanidad y Consumo). El estudio de compuestos mediante NMR fue realizado 3. Salas AP, Zhu L, Sánchez C, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2005. Deciphering the late steps in the biosynthesis of the anti-tumour
por el laboratorio del Prof. Jürgen Rohr en la Universidad de Kentucky (EE.UU.). indolocarbazole staurosporine: sugar donor substrate flexibility of the StaG glycosyltransferase. Mol. Microbiol. 58, 17-27.