UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA

PRCTICA 5 CROMATOGRA EN PAPEL

Practice 5 Paper Chromatography

El uso de la Cromatografa como tcnica de separacin, permite el anlisis de mezclas complejas

de compuestos muy estrechamente relacionados qumicamente (aminocidos). Adems de
identificar mediante una muestra conocida una muestra problema. Es de suma importancia para el
manejo de aislamiento de protenas.
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INTRODUCCIN:
La palabra cromatografa proviene de kromatos, color y graphos, escrito. Los primeros
registros acerca de la Cromatografa son de 1939 por Brown, que fue el primero que us la
cromatografa circular en papel. Despus en 1944 Consden, Gordon, y Martin, describieron la
cromatografa de particin en papel. En 1906, el botnico ruso Mikhail Tswett (1872-1919)
formaliz el uso de la cromatografa en estudios cientficos, aplicndola a la separacin de los
pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas).
Adems le dio ese nombre a la tcnica. Tswett empac una columna de vidrio vertical (de unos
cuantos centmetros de dimetro) con material adsorbente. Luego, por la columna vertical virti una
solucin que contena la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de una planta.
Pasados unos minutos, el material empacado en la columna haba adquirido una coloracin
diferente por segmentos. Es decir, haba logrado la separacin de los pigmentos naturales de la
planta. En cada segmento de color definido haba un pigmento diferente.
La cromatografa en papel es la tcnica de separacin e identificacin de sustancias
qumicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel de filtro. Se toma una
pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita una gota de la solucin que
contiene la mezcla de las sustancias que se quieren separas. Se deja secar la gota y quedara la
mancha de las sustancias mezcladas. El extremo del papel mas prximo a la mancha se introduce en
un disolvente apropiado, pero sin que la mancha llegue a introducirse en l. Existen muchos tipos de
cromatografa sobre papel, una primera divisin de las variadas clases podra ser:
1- Cromatografa ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del recipiente que sostiene al
papel y va subiendo a travs de el por capilaridad.
2- Cromatografa descendente: el disolvente esta en un recipiente esta en un recipiente del que
cuelga el papel, fluye por l hacia abajo por una combinacin de capilaridad y gravedad.
Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interaccin
con la fase estacionaria al ltimo. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las
propiedades fsicas y/o qumicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes
(picos) se separan cuando el pico que sale despus es retardado lo suficiente para impedir la
sobreposicin con el pico que emergi antes.
Una amplia gama de seleccin de materiales para las fases mvil y estacionaria, permite
separar molculas que difieren muy poco en sus propiedades fsicas y qumicas. En un sentido
amplio, la distribucin de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las
molculas del soluto y las molculas de cada fase. Refleja la atraccin o repulsin relativas que
presentan las molculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre s. Estas fuerzas
pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o
pueden deberse a fuerzas de dispersin de tipo London.
La resultante de las fuerzas: Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las
sustancias, comienzan a actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que
retardan. Las fuerzas propulsoras actan apartando las sustancias de su punto de origen y
desplazndolas en direccin del flujo de origen. Las fuerzas retardantes tratan de impedir el
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movimiento de las sustancias, llevndolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrs en el papel.
La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es la resultante de
estas dos clases de fuerzas.
Fuerzas propulsoras: Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas propulsoras
ms importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le disolvente.
Flujo del disolvente: Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instantneamente soluble en
el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azcar, y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia
ascender desde el origen hasta donde llega el diluyente. En cambio si la sustancia fuera
completamente insoluble en el disolvente en movimiento no se movera del origen. La corriente del
disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha, as pues, si el disolvente fuese capaz
de disolver instantnea y completamente todas las sustancias, estas avanzaran juntas hasta el final
de la trayectoria del disolvente y terminaramos donde empezamos con todas las sustancias juntas.
Fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias que ofrecen la misma
solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad de una sustancia en la corriente del
disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla, mantenindola en movimiento a lo
largo del papel.
Fuerzas retardantes: Hay tambin dos fuerzas retardantes principales: la adsorcin y el
reparto.
Adsorcin: La celulosa de la que esta hecho el papel de filtro, posee propiedades adsorbentes. Las
sustancias depositadas en el papel, en cromatografa, pueden ser ms o menos adsorbidas en el
papel. La adsorcin es otra de las fuerzas diferenciales esto significa que unas sustancias son
adsorbidas ms que otras y, por consiguiente, la liberacin de las sustancias de las manchas variar
de una sustancia a otra. Esto contribuye de nuevo a la separacin. Mientras que se va realizando el
cromatograma, las sustancias mas fuertemente adsorbidas se van quedando atrs, mientras que las
adsorbidas con menos fuerza avanzan hacia el frente.
Reparto: La cromatografa se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos fases
liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente circulando por el papel de
filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. Una hoja de papel de filtro
aparentemente seca contiene entre un 6 y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. Aqu es
donde entra en funcin el reparto. Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no
mezclados es expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartir entre ellos. La cantidad que se
encuentre en cada disolvente depender de la relativa solubilidad del soluto en cada uno. El grado
de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama coeficiente de reparto o razn de
distribucin.
Constante Rf: El ltimo punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina
frente del disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas
recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El smbolo utilizado para designar esta
distancia relativa es Rf y se define mediante: distancia recorrida por el compuesto desde el origen
Rf = Distancia del origen al frente del disolvente Como el denominador es siempre mayor que el
numerador en Rf debera ser un decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un
porcentaje. As un Rf de 50 indicara que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del frente del
disolvente.
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OBJETIVO GENERAL:

Determinar la presencia de un edulcolorante artificial en una muestra problema, mediante

su (Rf), y ver sus propiedades de solubilizacin comparndolo con los Rf de los
aminocidos que lo componen.

OBJETIVOS PARTCULARES:

Separa aminocidos y pptidos mediante el uso de la cromatografa en papel.

Determinar el corrimiento cromatogrfico de un aminocido polar y uno no polar;
comparando el Rf de cada uno de ellos.
Separar e identificar, por medio de la tcnica de cromatografa en papel, el aspartame en un
refresco diettico, comparando su Rf con el del Canderel.

HIPTESIS:

Si el aminocido x presenta un mayor corrimiento en el cromatograma;

entonces decimos que presenta una polaridad compartida con el eluyente.
Si la mancha de un aminocido corre cierta distancia y la muestra problema
tambin la presenta; entonces estaremos hablando del mismo tipo de
aminocido.

MATERIALES
1
7
1
1
1

Hoja de Papel Whatman No2 para cromatografa

Capilares de Vidrio
Cmara para Cromatografa en papel
Placa de Calentamiento
Probeta de 100 mL

REACTIVOS
cido Asprtico
Fenilalanina
Ninhidrina
Butanol
Acido Actico
Isopropanol
Acetona
MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ALUMNO
1
1
1
1

Atomizador de Vidrio de 50 o 100 mL

Pliego de Cartulina
Tijeras
Regla de 30 cm

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1
1
1
1
1

Par de guantes desechables

Secadora de Cabello
Sobre de Canderel o de Nutrasweet
Lata con refresco normal sin colorante
Lata con refresco de Dieta sin colorante

Soluciones
Solucin de isopropanol al 10% (v/v)
Solucin de cido asprtico 0.002M (0.026 en 100 mL de isopropanol al
10%)
Solucin de fenilalanina 0.002M (0.033g en 100 mL de isopropanol al
10%)
Solucin de Ninhidrina al 0.2% (0.2g en 100 mL de acetona).
Solucin de butanol: acido actico: agua, en proporcin 12:3:5 (v/v)
Canderel al 1% (1g en 100 mL de agua)
METODO
1. Colocar un volumen de la mezcla butanol: acido actico: agua en la
cmara para cromatografa, tal que no sobrepase el nivel de 1 cm y
taparla para que se sature a temperatura ambiente (25C). Si la
temperatura ambiente es baja, se debe colocar la cmara cerca de una
placa de calentamiento dentro de la campana de extraccin de vapores.
2. Usar guantes para cortar un fragmento de 20 x 9 centmetros de una
hoja de papel Whatman, el cual debe colocarse sobre la superficie de
una cartulina nueva. Marcar el fragmento de papel con una flecha que
indique el sentido en que corrern las muestras, el cual viene sealado
en la caja de papel Whatman.
3. En el lado ms angosto del papel Whatman, y considerando el sentido
en que corrern las muestras, trazar con lpiz una lnea a un centmetro
del borde. Sobre sta lnea marcar cinco puntos equidistantes, dejando
un margen de 0.5cm en cada extremo (ver figura).
4. Tomar una alicota de fenilalanina, utilizando un capilar de punta
adelgazada, y ponerla sobre uno de los puntos marcados en el papel.
Secar la aplicacin con la secadora de cabello. Realizar cinco
aplicaciones secando en cada ocasin. Hacer lo mismo con el cido
asprtico, Canderel o Nutrasweet, refresco normal y de dieta.
5. Cuando se hayan aplicado las alcuotas de las cinco muestras, hacer dos
perforaciones en la parte superior de la hoja y colocar dos hilos de
aproximadamente 30cm de largo.
6. Colocar la hoja de papel dentro de la cmara de cromatografa,
sostenindola mediante los hilos en una posicin tal que sea
humedecida en forma homognea por la mezcla butanol: acido actico:
agua, pero si que las manchas de las sustancias a separar sean
cubiertas por la mezcla. El papel debe mantenerse en esta posicin
vertical durante todo el procedimiento. Para ello se deben sujetar los
hilos a las paredes externas de la cmara cromatogrfica con un trozo
de cinta adhesiva. Cerrar la cmara y colocarla dentro de la campana de
extraccin del laboratorio.
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7. Dejar correr la cromatografa durante dos horas aproximadamente.
Sacar el papel de la cmara, marcar con un lpiz la posicin donde llego
el disolvente despus del tiempo y dejar secar al aire.
8. Para revelar la posicin de las sustancias que se corrieron en la
cromatogrfica, se rociar el papel con una solucin de ninhidrina
contenida en el atomizador. El rociado se realiza en forma homognea y
a una distancia de unos 10 cm. Secar el papel en una estufa a 100C por
diez minutos.
9. Una vez seco el papel. Marcar con un lpiz los lmites de las manchas
que aparecen y tomar la distancia entre el centro de la mancha y el
punto de aplicacin. A partir de estos datos y distancia a la que llego el
solvente, determinar el Rf de cada uno de los compuestos que se
aplicaron en el papel, mediante la formula siguiente:

RESULTADOS

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ANALISIS DE RESULTADOS

CUESTIONARIO
1.- Qu son la fase estacionaria y la fase mvil de un sistema de cromatografa?

La fase mvil o eluyente es el fluido (lquido o gas) en que estn las sustancias a
separar, y que provoca el arrastre de las mismas por la fase estacionaria mientras se
filtra a travs de ella en una direccin definida. Dependiendo del tipo de
cromatografa, la fase mvil puede tener una composicin fija o variable.

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La fase estacionaria es la que no se mueve y que retiene a los solutos a separar que
interaccionan con ella. Un concepto relacionado, y a veces coincidente, es el de
soporte o matriz, que es el slido que constituye, retiene o mantiene fija la fase
estacionaria. Los requisitos generales que debe tener un soporte son: carcter
hidrofico y ausencia de carga para evitar adsorciones inespecficas, estabilidad
mecnica y qumica, inerte, gran superficie, y tamao del grano y porosidad
controlables.
2.- Cmo puede modificar la fase mvil en un sistema cromatogrfico?
Dependiendo del eluyente que se utilice en la cromatografa, la fase mvil debe elegirse de
forma que se eluyan todos los componentes de la muestra y no se produzca una
acumulacin en la base de la cromatografa.
3.- Qu es el Rf de una sustancia?
Es el ltimo punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente del
disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas
recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El smbolo utilizado para
designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante: distancia recorrida por el
compuesto desde el origen Rf = Distancia del origen al frente del disolvente Como el
denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debera ser un decimal. Por razones
de conveniencia se suele expresar como un porcentaje. As un Rf de 50 indicara que el
compuesto avanzo la mitad de la distancia del frente del disolvente.
Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentracin
del ambiente de la cmara y la temperatura.

4.-Investigue las caractersticas de los aminocidos utilizados en la prctica, y como se

clasifican.

No esenciales

Esenciales

Alanina

Arginina*

Asparagina

Histidina

Aspartato

Isoleucina

Cisteina

Leucina

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Glutamato

Lisina

Aminocidos Esenciales vs. No Esenciales

Los aminocidos arginina, metionina y fenilalanina se consideran esenciales por

razones no directamente relacionadas por la falta de sntesis. La arginina es sintetizada
por las clulas de mamferos pero en un rango que es insuficiente para resolver las
necesidades de crecimiento del cuerpo y la mayora que es sintetizada es procesada para
formar urea. La metionina es requerida en grandes cantidades para producir cisteina, si
el ltimo aminocido no es provisto adecuadamente en la dieta. Igualmente, la
fenilalanina se necesita en grandes cantidades para formar tirosina, si este ltimo
aminocido no es adecuadamente provisto en la dieta.
La fenilalanina: Es un aminocido esencial aromtico (junto con el triptfano y la
tirosina) cuyo grupo R contiene un anillo bencnico (Ruta 2). Uno de los aspectos ms
relevantes de su biosntesis es el mecanismo a travs del cual los anillos aromticos se
forman a partir de precursores alifticos. Tambin se le clasifica, junto con el triptfano,
como un aminocido hidrofbico con estructura cclica. Segn los ltimos estudios
sobre los aminocidos esenciales parece que en la fenilalanina, la estructura carbonada
sera su parte considerada esencial ya que esta estructura es transaminada con rapidez
por el organismo.
La mayor parte de este compuesto se transforma, por medio de hidroxilacin, en
tirosina que es otro aminocido, en este caso considerado como semiesencial.
Adems la fenilalanina es el precursor de las catecolaminas en nuestro cuerpo, si bien
acortamos el mecanismo en la sntesis de catecolaminas utilizando la tirosina como
precursor (ver Ruta 3). Tambin es un constituyente importante de los neuropptidos
cerebrales, como la somatostatina, vasopresina, melanotropina, encefalina, ACTH,
angiotensina, sustancia P y colecistoquinina. Muchas drogas de las que conocemos
como psicotrpicas, contienen fenilalanina.
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La fuente ms importante de fenilalanina son los alimentos ricos en protenas, como es
la carne y los productos lcteos. La fenilalanina tiene utilidades en la industria de la
alimentacin, por ejemplo, en la elaboracin de edulcorantes artificiales.
Acido asprtico: Aminocido glucognico (puede convertirse en glucosa y glucgeno)
cuyo grupo R posee carga negativa a pH 7,0. Se trata de un compuesto muy hidroflico,
y como tal se encuentra casi siempre en la superficie externa de las protenas
globulares. Es un compuesto metablicamente activo debido a su interconversin con
los cidos dicarboxlicos tetracarbonados del ciclo de los cidos tricarboxlicos, despus
de sufrir una transaminacin. Es el precursor de la asparagina. Tambin interviene en
otras reacciones como dador de aminos en la sntesis de urea y de purinas, y como
precursor de los anillos pirimidnicos a travs de la formacin de carbamoilaspartato en
el citosol. Es, junto con el glutmico, el principal neurotransmisor excitatorio de la
corteza cerebral.
5.-Investigar los Rf reportados en la literatura para los aminocidos aqu utilizados,
anote el sistema de fase mvil y fase estacionaria utilizado para obtenerlo. Rf de los
aminocidos de referencia

Aminocido

Rf

Lisina

0.24

cido glutmico

0.47

Glicina

0.49

Cisteina

0.12

Serina

0.31

Metionina

0.59
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Fenilalanina

0.66

Arginina

0.28

Valina

0.59

Triptfano

0.60

Histidina

0.29

Treonina

0.39

http://www.doschivos.com/display.asp?ID=625&f=13547
6.-Hacer una investigacin sobre el uso de actual del aspartame . Anote posibles beneficios
y perjuicios del uso de tal producto.
El ASPARTAME
Se sintetiza a partir del cido asprtico y del ster metlico de fenilalanina para
formar un endulzante blanco, cristalino altamente estable. Es un endulzante de bajas
caloras usado en alimentos y bebidas. Es aproximadamente 130 a 200 veces ms
dulce que el azcar.
VENTAJAS DE USO

Se utiliza para reemplazar el azcar.

Reduce sustancialmente las caloras en los alimentos o incluso las elimina por
completo.
Aprobado por la FDA de los Estados Unidos.

APLICACIONES
* Bebidas refrescantes
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*Helados
*Nctares de fruta
*Postres, gelatinas
*Concentrados de bebidas
*Conservas de fruta, gelatinas
*Edulcorantes de mesa
*Mermeladas, confituras
*Productos lcteos
*Productos hechos al horno
*Goma de mascar
*Repostera

Beneficios y perjuicios del uso del Aspartame en nuestra salud.

Abril, 2011. La Autoridad Europea para la Seguridad Alimentaria, AESA, afirma que no
hay evidencia cientfica para apoyar una relacin causal entre el consumo del edulcorante
aspartame, utilizado para la fabricacin de bebidas y alimentos, con el parto prematuro en
mujeres embarazadas, o con el desarrollo de tumores cancergenos.
La AESA, en una publicacin de febrero del presente ao, desminti cientficamente los
resultados de dos estudios realizados en el 2010 sobre los posibles riesgos para las personas
consumidoras de aspartame.
El primero asociaba la exposicin de ratones suizos al aspartame con el desarrollo de
tumores cancergenos, mientras que en el segundo mostraba una supuesta asociacin entre el
consumo de refrescos endulzados artificialmente y el parto prematuro en una muestra de 59,334
mujeres embarazadas.
En ambos casos, el organismo, con sede en Parma, Italia, concluy que la informacin
disponible en ambos estudios no da razn para reconsiderar las evaluaciones ya realizados sobre
el aspartame o aditivos artificiales ya autorizados en la Unin Europea.
La AESA recomienda que se continen estudiando otros factores relacionados con la dieta
que podran influir en la aparicin de tumores cancergenos. Adems, seala que diferentes tipos

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de edulcorantes se utilizan solos o combinados con las bebidas, y que no hay justificacin para
concentrarse en un edulcorante especfico.
Dulce y Seguro
Si bien existe un debate sobre la seguridad en el uso de aspartame, el edulcorante est
aprobado en ms de 105 pases y grupos independientes del rea de salud tambin le han dado su
visto bueno.
De acuerdo con un artculo de la Revista del Consumidor de la Administracin de Drogas y
Alimentos de los Estados Unidos (FDA), No existen pruebas cientficas que apoyen una relacin
entre el aspartame y cualquier tipo de cncer.
Un estudio del Instituto Nacional del Cncer del ao 2006 indica que el aumento en el
consumo de bebidas con contenidos de aspartame no se relaciona con el desarrollo de linfomas,
leucemia o cncer cerebral.

Es 200 veces ms dulce que el azcar, pero con la ventaja que puede utilizarse en
cantidades tan pequeas que da dulzura a los alimentos que lo contienen sin aportar caloras al
cuerpo. Es posible encontrarlo en cereales, bebidas gaseosas y goma de mascar.

El aspartame est en la lista de los cinco edulcorantes artificiales aprobados por la

Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), junto con la sacarina, el
acesulfame potsico, el neotame y la sucralosa, as mismo est aprobado por el Codex
Alimentarius, referencia regulatoria de la mayora de los pases del orbe.

La FDA evala la composicin y propiedades de los edulcorantes, las cantidades que se

pueden consumir, as como otros estudios en cuanto a su seguridad concluye la nutricionista
Pardo.
La especialista seala que debido a que el aspartame se descompone en fenilalanina, los
organismos internacionales exigen que los productos que lo contengan, lo adviertan en su
etiqueta para aquellas personas que sufren fenilcetonuria. Este defecto congnito causa una
alteracin del metabolismo en el que el organismo no puede metabolizar fenilalanina en el
hgado.

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Por su parte, la nutricionista colombiana y docente universitaria, Consuelo Pardo explica
que es improbable que se pueda exceder la ingesta diaria admisible (IDA) de aspartame, ni
siquiera por nios o personas diabticas. El nivel recomendable por da es de entre 40mg/kg de
peso corporal y 50 mg/kg de peso corporal, lo que equivaldra a consumir 15 refrescos gaseosos
endulzados con aspartame al da.
La regulacin requiere que se coloque una leyenda en las etiquetas de los productos con
contenidos de aspartame, especialmente para alertar a los fenilcetonricos de la presencia de
fenilalanina en el producto.
Los fenilcetonricos son una parte muy pequea de la poblacin que no puede consumir
ningn producto con fenilanalina, como la leche, y el aspartame. Generalmente la enfermedad se
detecta pocos das despus de nacer, mediante la prueba de tamizaje, que es standard en todos
los pases, agrega la nutricionista Pardo.

Bibliografa:
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Harris, D. C. 2003. Anlisis qumico cuantitativo. Ed. Revert. Espaa, Barcelona. 62-63 p.

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