Tesis en PDF para UNLP Final Reducida

Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Exactas

Departamento de Ciencias Biolgicas
Trabajo de Tesis Doctoral

Alimentos funcionales: Obtencin de un producto
probitico para aves a partir de suero de quesera
fermentado con microorganismos de kefir
Lic. Alejandra Londero

Directora: Dra. Anala G. Abraham
Co-directora: Dra. Graciela L. Garrote
- 2012 -
El presente trabajo de Tesis, para optar por el ttulo de Doctor de la Facultad de Ciencias
Exactas, fue realizado en el Centro de Investigacin y Desarrollo en Criotecnologa de
Alimentos (CIDCA), UNLP-CONICET.
Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de la Universidad Nacional de La Plata, por
haberme otorgado la formacin que me posibilit la realizacin de este trabajo y a la
Facultad de Ciencias Exactas, por haberme permitido realizar mis estudios de postgrado.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas por otorgarme las becas que
me permitieron llevar a cabo este trabajo.
A la Dra. Noem Zaritzky por haberme permitido desarrollar este trabajo en el Centro de
Investigacin y Desarrollo en Criotecnologa de Alimentos (CIDCA).
A Ricardo Quinta y a Rui Sereno por haberme dado la oportunidad de trabajar en
Controlvet pero sobre todo por su clida atencin y su admirable generosidad.
A Graciela De Antoni por haberme integrado a su equipo de trabajo.
A Pablo Prez, Andrea Gmez-Zavaglia, Graciela De Antoni, Patricio de Urraza, Mara
Serradell, Anala Abraham y Graciela Garrote por haberme participado en los proyectos
que financiaron este trabajo. Y porque, gracias a su empeo y a sus valores personales,
han constituido no slo un slido equipo de trabajo sino adems un grupo humano
fundado en la solidaridad y el respeto.
A mis directoras por su haberme guiado con dedicacin y compromiso durante el
desarrollo y la escritura de este trabajo. Por su cario, aliento y apoyo en todo momento.
A Grace por haberme acompaado en cada paso transmitindome confianza y
tranquilidad y a Anala por levantarme siempre el nimo con su optimismo.
Especialmente a todos y a cada uno de mis compaeros de trabajo por su permanente
disposicin a colaborar y a compartir conocimientos. Por su invaluable ayuda y por hacer
placentero el trabajo cotidiano.
A Pablo por haberme introducido al aprendizaje prctico de la microbiologa con tanta
consideracin, respeto, paciencia y minuciosidad. Por ser tan buen compaero y por
haberse tomado el trabajo de revisarme hasta las comas de la tesis.
A Judith por estar siempre dispuesta a ayudar, por darme confianza, por sus consejos y
por ser un ejemplo.
A Fernanda y a ngela por haber sido compaeras fieles en los ms arduos momentos de
trabajo en el laboratorio.
A Marina y a Carito por las revisiones de la tesis.
A Nachito, a Cami y a Yani por su compaa durante la escritura de la tesis.

A mis padres por su apoyarme siempre y no dejarme jams bajar los brazos.
A mi hermana Eli, por haber sido siempre un ejemplo a seguir y por su confianza en m.
A mi hermanita Ju por iluminar cada da de mi vida con su alegra, sostenerme con su
fortaleza y por sobre todas las cosas por estar incondicionalmente a mi lado.
A mi ta Tata por haberme ayudado a corregir la bibliografa.
A Mariana por su ayuda con el diseo y por ser una amiga de hierro.
A Gabi por haber sido mi ms fuerte punto de apoyo, por su compaa y cario
incondicional.
A todos aquellos que me ofrecieron ayuda y de alguna manera estuvieron cerca durante la
escritura de este trabajo.
NDICE
INTRODUCCIN GENERAL
1.
El suero
1.1
Valorizacin del suero
1.2
Procesos y productos
1.3
Propiedades funcionales de componentes del suero
1.4
Produccin de suero en la Argentina
2.
Alimentos funcionales en aves: Probiticos
2.1
Conceptos generales
2.2
Microbiota intestinal y su rol en la salud
10
2.3
Productos probiticos y su aplicacin
12
2.4
Mecanismos de accin de los probiticos
15
2.5
Consideraciones para la administracin de los probiticos
19
2.6
Marco legal
22
3.
Enfermedades causadas por enteropatgenos en aves
24
3.1
Salmonelosis
25
3.2
Mecanismos de patognesis de Salmonella
27
3.3
Mtodos de control de salmonelosis en aves
29
3.4
Probiticos para el control de Salmonella en aves
32
4.
Uso de antimicrobianos en la conservacin de pienso para aves
34
4.1
Contaminacin de pienso
34
4.2
Mtodos de control de microorganismos en el pienso
35
4.3
Uso de bacterias cido lcticas y sus metabolitos como conservantes de

pienso
37
5.
El kefir
39
5.1
Descripcin del producto
39
5.2
Propiedades funcionales
43
5.3
Fermentacin de suero con grnulos de kefir
45
Objetivos
49
CAPTULO 1. CARACTERIZACIN DE SUEROS FERMENTADOS CON GRNULOS O

MICROORGANISMOS DE KEFIR
Introduccin
51
Objetivos
52
Materiales y mtodos
53
1.
Sueros de quesera y medios de cultivo
53
2.
Obtencin de leche y suero fermentados con grnulos de kefir
53
3.
Obtencin de suero fermentado empleando otros cultivos iniciadores
3.1
(starters)
53
Empleo de cultivos madre como starters
53
3.1.1 Cultivo madre en suero
53
3.1.2 Cultivo madre en leche
54
3.2
Empleo de cepas aisladas de kefir como starters
54
4.
Aumento de biomasa de grnulos de kefir
55
5.
Anlisis de la composicin qumica de grnulos de kefir y productos

fermentados
55
5.1
Determinacin de humedad
55
5.2
Determinacin de cenizas
55
5.3
Anlisis de minerales
55
5.4
Determinacin de azcares
56
5.5
Determinacin del contenido de lactosa
56
5.6
Determinacin del contenido de protenas totales
56
5.7
Determinacin de lpidos
57
6.
Cinticas de acidificacin y produccin de cidos orgnicos
57
7.
Enumeracin de microorganismos viables
58
8.
Microscopa electrnica de barrido (MEB)
58
9.
Extraccin de ADN
59
9.1
Extraccin de ADN de grnulos de kefir
59
9.2
Extraccin de ADN de productos fermentados
60
9.3
Extraccin de ADN de cepas de referencia
61
10.
Amplificacin mediante reaccin de polimerizacin en cadena (PCR)
61
11.
Anlisis por electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)
62
12.
Identificacin de bandas DGGE
63
Resultados y discusin
65
1.
Fermentacin de suero con grnulos de kefir
65
1.1
Similitud de grnulos de kefir crecidos en leche y suero
65
1.2
Anlisis de leche y suero fermentados con grnulos de kefir
79
2.
Efecto de la variacin del porcentaje de grnulos de kefir inoculados, el tipo

de suero y la temperatura de incubacin
85
2.1
Fermentacin de suero con distintos porcentajes de grnulos de kefir
85
2.2
Empleo de distintos sueros como sustrato
90
2.3
Fermentacin de suero a distintas temperaturas
93
2.3.1 Grnulos de kefir en suero a distintas temperaturas
94
2.3.2 Caracterizacin de suero fermentado con grnulos de kefir a diferentes

temperaturas
98
3.
Fermentacin de suero con cultivos iniciadores alternativos
105
3.1
Fermentacin de suero con cultivos madre en suero y en leche
105
3.2
Fermentacin de suero con microorganismos aislados de kefir
109
3.2.1 Crecimiento de los microorganismos en suero en cultivos puros y mixtos
110
3.2.2 Acidificacin de suero y produccin de cidos orgnicos
112
Conclusiones
115
CAPTULO 2. EFECTO INHIBITORIO DE SUERO FERMENTADO CONTRA PATGENOS

INTESTINALES: ENSAYOS IN VITRO
Introduccin
117
Objetivos
118
Materiales y mtodos
119
1.
119
Bacterias patgenas
2.
Reduccin de la concentracin de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis en
119
suero por fermentacin con grnulos de kefir

3.
Preparacin de sobrenadantes
120
4.
Ensayo de inhibicin por difusin en agar
120
5.
Determinacin de la concentracin inhibitoria y bactericida mnima
121
6.
Efecto de los sobrenadantes de suero fermentado con grnulos de kefir

sobre el crecimiento de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis
7.
8.
Efecto de los sobrenadantes de suero fermentado con cepas aisladas kefir

sobre el crecimiento de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis
122
Supervivencia de patgenos en sobrenadantes de suero fermentado
122
1.
123
Reduccin de la concentracin de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis en

suero por fermentacin con grnulos de kefir
2.
121
123
Inhibicin de Salmonella Enteritidis y E. coli por sobrenadantes de suero

fermentado
126
2.1
Ensayo de difusin en agar
126
2.2
Concentracin inhibitoria y bactericida mnima
130
2.3
Cinticas de crecimiento de Salmonella Enteritidis y Escherichia coli en

presencia de distintas concentraciones de sobrenadante de suero
fermentado
2.4
Curvas de muerte de Salmonella Enteritidis y Escherichia coli en

sobrenadante de suero fermentado
2.5
132
133
Efecto inhibitorio de sobrenadantes de suero fermentado con Lactobacillus

kefir CIDCA 8348, Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 y Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154 sobre Salmonella Enteritidis y Escherichia coli
Conclusiones
137
141
CAPTULO 3. ANTAGONISMO DEL SUERO FERMENTADO SOBRE LA ADHESIN E INVASIN DE

SALMONELLA ENTERICA SEROVAR. ENTERITIDIS EN MODELOS IN VITRO E IN VIVO
Introduccin
143
Objetivos
144
Materiales y mtodos
145
1.
Cultivo de clulas Caco-2/TC7
145
2.
Ensayo de adhesin de microorganismos de kefir a clulas in vitro
146
3.
Ensayos de asociacin e invasin de Salmonella Enteritidis a clulas Caco-
146
2/TC7
4.
Efecto de los microorganismos de kefir sobre la asociacin e invasin de
148
Salmonella Enteritidis a clulas Caco-2/TC7

4.1
Preincubacin de la monocapa celular con microorganismos de kefir
148
4.2
Preincubacin de Salmonella Enteritidis con microorganismos de kefir
149
4.3
Preincubacin de Salmonella Enteritidis con sobrenadantes de suero
149
fermentado
5.
Tcnicas de microscopa
150
5.1
Tincin de May Grnwald Giemsa
150
5.2
Marcacin fluorescente del citoesqueleto con Isotiocianato de Fluorescena
150
(FITC).
5.3
Microscopa electrnica de barrido
151
6.
Ensayos in vivo
151
6.1
Animales de laboratorio y bioterios
151
6.2
Productos administrados
152
6.3
Preparacin del inculo del patgeno
153
6.4
Protocolos experimentales
153
6.5
Traslocacin de Salmonella Enteritidis a bazo e hgado
158
6.6
Determinacin del contenido de Salmonella en heces
159
6.7
Anlisis de la microbiota intestinal por electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante
159
6.8
Anlisis estadstico
160
PARTE A: Antagonismo de suero fermentado sobre la adhesin e invasin de
Salmonella Enteritidis en modelos in vitro
161
1.
Asociacin e invasin de Salmonella Enteritidis a clulas Caco-2/TC7
161
2.
Adhesin de los microorganismos de kefir a clulas Caco2/TC7
166
3.
Efecto de la presencia de microorganismos de kefir sobre la asociacin e

invasin de Salmonella Enteritidis a clulas Caco-2/TC7
170
3.1
Preincubacin de la monocapa de enterocitos con microorganismos de kefir
170
3.2
172
4.
Efecto de los sobrenadantes de suero fermentado sobre la asociacin e

invasin de Salmonella Enteritidis a clulas Caco-2/TC7
181
PARTE B: Antagonismo de suero fermentado sobre la adhesin e invasin

de Salmonella Enteritidis en modelos in vivo
187
1.
Inocuidad del suero fermentado sobre pollos parrilleros
187
2.
Anlisis de la microbiota intestinal por electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante (DGGE)
3.
192
Antagonismo del suero fermentado sobre la asociacin e invasin intestinal de

Salmonella Enteritidis
197
3.1
Efecto de la administracin de una dosis controlada de suero fermentado
198
3.2
Efecto de la administracin de suero fermentado ad libitum
201
Conclusiones
207
CAPTULO 4. BIOCONSERVACIN DE PIENSO PARA AVES POR ADICIN DE SUERO FERMENTADO

Introduccin
209
Objetivos
211
Materiales y mtodos
212
1.
Hongos
212
2.
Preparacin de la solucin de esporas
212
3.
Inhibicin de la germinacin conidial por sobrenadantes de suero

fermentado
213
4.
Adicin del suero fermentado al alimento
213
4.1
Preparacin del alimento adicionado
213
4.2
Supervivencia del probitico en el alimento
214
4.3
Resistencia del alimento a la contaminacin fngica
214
215
1.
Inhibicin de la germinacin conidial por sobrenadantes de suero fermentado
215
2.
Adicin de suero fermentado al alimento para su conservacin
221
2.1
Supervivencia de bacterias cido lcticas y levaduras en el alimento
222
balanceado
2.2
Resistencia a la contaminacin fngica
224
Conclusiones
229
CONCLUSIONES GENERALES
231
APNDICE
233
1.
Medios de cultivo
233
2.
Buffers y reactivos
236
3.
Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante: reactivos, preparacin de

geles y tincin
238
3.1
Reactivos
238
3.2
Preparacin de los geles y siembra
239
3.3
Tincin
240
BIBLIOGRAFA
241
Introduccin general
Introduccin general
1. El suero
De acuerdo al Cdigo Alimentario Argentino, con la denominacin de sueros de lechera
se entiende a los lquidos formados por parte de los componentes de la leche, que
resultan de diversos procesos de elaboracin de productos lcteos, por ejemplo de
quesos, de manteca, de casena o de ricota. Tambin se define como el lquido
remanente de la coagulacin de las casenas de la leche mediante la accin de
quimosinas (cuajo) o cidos minerales u orgnicos y su posterior remocin (Guimares y
col., 2010).
Una comparacin del anlisis qumico de leche de vaca y suero de leche se presenta en
la Tabla 1. Este anlisis revela que alrededor del 50 % de los slidos de leche
permanecen en el suero, junto con prcticamente el 100 % de la lactosa y alrededor del
20 % de la protena. La lactosa constituye una alta proporcin (> 75 %) de los slidos de
suero y contribuye en gran parte a que el suero sea considerado uno de los alimentos
ms contaminantes del medio ambiente debido a que su demanda bioqumica de
oxgeno es mayor a 35000 ppm y la demanda qumica de oxgeno supera las 60000 ppm
( on le
iso, 1996).
Tabla 1: Anlisis qumico comparativo de leche y sueroa bovinos

Componentes % p/v
Leche
Suero
Casenas
2.8
<0.1
0.7
0.7
Lpidos
3.7
0.1
Cenizas
0.7
0.5
Lactosa
4.9
4.9
Slidos totales
12.8
6.3
Protenas de suero
Smithers y col. (1996).

Las protenas del suero comprenden ~50% -lactoglobulina, ~20% -lactoalbmina, ~15%
glicomacropptidos (solo en suero de cuajo), ~15% de protenas y pptidos minoritarios (ej.
inmunoglobulinas, lactoferrinas, lactoperoxidasa, albmina srica, lisozima y factores de
crecimiento).
b
Mientras que el poder contaminante del suero de leche es bien conocido, este efluente
de la industria lctea tambin representa una excelente fuente de protenas funcionales
y pptidos, vitaminas, minerales y lactosa (Tabla 1) que hasta hace relativamente poco
Introduccin general
tiempo no haban sido reconocidas. Estos componentes del lactosuero, y principalmente

sus protenas y pptidos que poseen alto valor nutricional, han propulsado su
transformacin desde un material de desecho a un producto lcteo valioso con
aplicacin en la industria agroalimentaria, biotecnologa y farmacutica.
1.1 Valorizacin del suero

Antiguamente considerado un residuo de la elaboracin de algunos productos lcteos,
principalmente quesos, el suero ha experimentado en las ltimas dcadas un profundo y
acelerado proceso de revalorizacin.
Tradicionalmente, se consideraba al suero como un elemento no deseable, de escaso
inters y de alto costo de eliminacin. La prctica ms comn ha sido sencillamente
verterlo en los cursos de agua, lo que es muy perjudicial desde el punto de vista
ambiental. En efecto, se puede estimar que una fbrica de queso que procesa 280000
litros de leche cruda por da, por ejemplo, produce alrededor de 250000 litros de suero
lquido y puede contaminar tanta agua como una ciudad de 50000 habitantes. Una
prctica menos perjudicial de uso muy frecuente es su suministro a terneros o cerdos
para complementar su alimentacin.
Al desarrollarse la industria quesera, result evidente que estas soluciones no eran
suficientes para afrontar el problema de la eliminacin del suero. Asimismo restricciones
legales a la contaminacin ambiental por suero se fueron aplicando progresivamente en
los pases donde ms abundante es su produccin. Esto oblig a los fabricantes de
quesos a procesar el suero o a disponer instalaciones propias de eliminacin, lo que
repercuti negativamente en los rendimientos productivos. La industria se esforz
entonces por desarrollar instalaciones para el secado y por encontrar nuevos usos para
el suero. Paralelamente, estas medidas han contribuido tambin a intensificar la
investigacin sobre los usos alternativos del suero, agregndose innumerables
alternativas de procesamiento de complejidad tecnolgica creciente que permiten
obtener mltiples ingredientes de usos alimentarios y no alimentarios, de altsimo valor
agregado.
Introduccin general
1.2 Procesos y productos
Suero lquido. Sin ningn tratamiento el suero puede agregarse al agua de animales de
granja. Adems de las protenas de alta calidad y lactosa que contiene, el suero aporta
calcio, fsforo y vitaminas solubles en agua. Sin embargo su alta proporcin de lactosa y
minerales limitan su uso directo en alimentacin ( on le
iso, 1996). Tambin se lo
ha sido utilizado como fertilizante en agua de riego pero tiene el inconveniente de dejar
depsitos salinos residuales. La principal limitacin de uso del suero lquido es que es
perecedero y su transporte es muy costoso.
Suero en polvo. En esta forma el suero conserva las propiedades del producto fresco por
ms tiempo y facilita su manipulacin y transporte. Diferentes tipos de suero en polvo
son
preparados,
incluyendo
suero
concentrado,
en
polvo
cido
dulce,
desmineralizado, enriquecido con grasas, entre otros. El principal mercado de este

producto es la alimentacin animal. Pequeas cantidades de suero en polvo combinado
con melaza o harinas de soja son utilizadas tambin en alimentacin humana (helados,
tortas, salsas, derivados lcteos, polvos de hornear, entre otros) ( on le
iso, 1996).
Concentrados y aislados de protenas de suero. Las protenas del suero tienen un valor
nutricional muy elevado debido a un adecuado balance de aminocidos, varios de ellos
esenciales -como la lisina y el triptofano- adems de otros aminocidos azufrados, que
les otorgan un altsimo valor biolgico. El creciente conocimiento sobre las propiedades
fsico-qumicas y funcionales de las protenas de suero y los avances en los procesos de
fraccionamiento, han sido la base para el desarrollo de nuevas aplicaciones (Etzel, 2004).
Mediante procesos de ultrafiltacin las protenas de suero son concentradas
generndose productos con distintas proporciones de protena 35 %, 50 %, 65 % y 80 %
(p/p). Con procesamientos adicionales de diafiltracin o cromatografa de intercambio
inico pueden producirse aislados de pureza igual o mayor al 90 %. Actualmente se
producen de esta manera -lactoglobulina y -lactalbumina a escala industrial (Smithers,
2008).
Las protenas de suero tienen una amplia aplicacin en alimentos y nutricin,
utilizndose como sustituto parcial de la leche en polvo descremada o como fuente de
protena de alta calidad nutricional y funcional en comidas rpidas, jugos, confitera,
Introduccin general
helados, galletitas, carnes procesadas, bebidas lcteas proteicas, postres, alimentos

para nios y productos dietticos. Asimismo se aplican como surfactantes en diferentes
productos cosmticos tales como cremas para piel, sales de bao y detergentes (Audic y
col., 2003) y en la elaboracin de pelculas plsticas para recubrir alimentos, drogas y
papeles especiales (McHugh y col., 1994; Han y Krochta, 1999). La hidrlisis enzimtica
de las protenas de suero incrementa su solubilidad en agua y modifica sus propiedades
funcionales (Prieto y col., 2010), estos hidrolizados son utilizados como suplementos en
frmulas para infantes, ancianos, atletas y fisicoculturistas (Sousa y col. 2004).
Lactosa y sus derivados. La mayor parte de la lactosa del suero o del permeado es
recuperada por un proceso que involucra su cristalizacin (Yang y Silva, 1995; Gnzle y
col., 2008). Los mayores usos de la lactosa incluyen su inclusin como ingrediente
alimentario, en frmulas para infantes, excipiente o recubrimiento para pldoras en la
industria farmacutica y como materia prima para la produccin de derivados de la
lactosa con valor agregado tales como lactulosa, lactitol, cido lactobinico, lactosil
urea, galacto-oligosacaridos y lactosacarosa (Yang y Silva, 1995; Audic y col., 2003,
Gnzle y col., 2008). Las soluciones de lactosa hidrolizada poseen mayor poder
endulzante que la lactosa y tienen usos relacionados con los alimentos, particularmente
en productos de confitera e industrias de helados reemplazando la sacarosa y jarabe de
almidn (Guimares y col., 2010).
Suero como sustrato en la obtencin de otros productos. Otra aplicacin del suero
incluye su uso para la produccin de compuestos de mayor valor por fermentacin. Los
ejemplos clsicos son la obtencin de etanol y protenas celulares mediante bioprocesos basados en la aplicacin de levaduras, sin embargo se han propuesto mltiples
productos alternativos (Yang y Silva, 1995; Gonzlez Siso, 1996; Audic y col., 2003). Entre
estos bioproductos se encuentran el biogs (metano), cidos orgnicos (actico,
propinico, lctico, ctrico, glucnico, giberlico), aminocidos (glutmico, lisina y
treonina), vitaminas (B12 y B2, cobalaminas y riboflavina), polisacridos (goma xntica,
dextran,
fosfomanano,
oligosacridos,
lactulosa,
pupulano,
gelano),
mono
lactosacarosa, tagatosa),
poligalactorunasa) y otros compuestos
oligosacridos
enzimas
(galacto-
(-galactosidasa
(fructosa-difosfato, 2,3-butanodiol, calcio,
Introduccin general
magnesio acetato, lactato de amonio, butanol y glicerol) (Guimares y col., 2010; Illanes,
2011).
1.3 Propiedades funcionales de componentes del suero

Las propiedades funcionales de los distintos sueros, los concentrados y los aislados de
protenas son innumerables: capacidad emulsificante, gelificante, sustitucin de grasa
lctea en productos dietticos, solubilidad, aireacin, desarrollo de color y sabor, ligante
de agua, viscosidad y solubilidad, entre otras (Fennema, 1996; Foegeding y col., 2002;
Vega y Roos, 2006).
Por otro lado, se ha demostrado que el suero y algunos de sus componentes presentan
propiedades benficas para la salud. Protenas de suero tales como la -lactoalbmina,
la -lactoglobulina, la lactoferrina, la lactoperoxidasa y la albmina de suero bovino
poseen alto valor biolgico, estimulan el sistema inmune y presentan actividad
antimicrobiana, entre otras propiedades metablicas (Madureira y col., 2007).
Aparte de la bio-actividad inherente a muchas de las protenas del suero, la hidrlisis
enzimtica de las mismas genera pptidos bioactivos. Se ha demostrado que algunos de
estos pptidos mejoran la respuesta inmunolgica y presentan propiedades
antimicrobianas, antihipertensivas, antinflamatorias y antitumorales (Papenburg, 1990;
Hakkak, 2001; Gauthier y col., 2006; Michaelidou y Steijns, 2006; Clement y col., 2007;
Saito, 2008). Como ejemplos de pptidos bioactivos derivados de protenas de suero
pueden mencionarse: (i) la albutensina que inhibe a la enzima convertidora de
angiotensina (ECA) y estimula la contraccin del leon y la soroforina con actividad
opioide, ambas derivadas de la albmina srica; (ii) la -lactoforina, que proviene de la
-lactoalbmina, inhibe la ECA; (iii) los pptidos -lactoforina y -lactotensina,
derivados de la -lactoglobulina, inhiben y estimulan la contraccin del leon
respectivamente; (iv) la lactoferricina y otros estrechamente relacionados, derivados de
la digestin peptdica de la lactoferrina, que poseen actividad antimicrobiana/antiviral,
inmunomoduladora y antioxidante (Korhonen, 2006). Estos ltimos son los pptidos
bioactivos derivados de protenas de suero ms prometedores comercialmente (El-Loly y
col., 2011).
Introduccin general
El efecto positivo sobre la salud, sumado a su alto valor nutricional, hace que las
protenas de suero y sus derivados sean cada vez ms utilizados como ingredientes
verstiles en la elaboracin de alimentos, tanto para mejorar su calidad como su
funcionalidad. Entre los productos en los que se utilizan se pueden mencionar frmulas
para infantes, suplementos entricos y clnicos, productos para nutricin deportiva,
productos para control de peso y para el control del estado anmico (
ha al in, 2006).
1.4 Produccin de suero en la Argentina

Dado que el suero lquido proviene mayoritariamente de la elaboracin de quesos, este
producto presenta particular importancia en pases como el nuestro, con una arraigada
tradicin quesera y niveles significativos de produccin.
En Argentina el sector industrial lcteo puede dividirse en tres segmentos claramente
identificados:
Un grupo de unas 10-12 empresas con una recepcin de ms de 250000 litros
diarios, diversificadas en sus lneas de produccin, mayormente con actividad
exportadora, y que procesan el 50-55 % de la produccin nacional.
Un grupo de unas 90-100 empresas con una recepcin de entre 20.000 y 250000
litros diarios, que juegan un fuerte papel en el sector quesero y con una actividad
exportadora inexistente, y que procesan el 25 % de la produccin nacional.
Ms de 1000 empresas y tambos fbrica con menos de 20000 litros diarios de
recepcin, que se dedican casi en forma exclusiva a la fabricacin de quesos, y
que procesan el 20-25 % de la produccin nacional.
De esta manera, comparado con otros pases reconocidamente lecheros, Argentina se

caracteriza por tener una gran cantidad de empresas lcteas que transforman cerca de
la mitad de la produccin nacional de leche en quesos. Y a su vez, cerca de la mitad de
esta produccin quesera es desempeada por ms de mil pequeos establecimientos
(CIL, 2003).
Slo las grandes empresas, que como se mencion anteriormente procesan cerca del 50
% de la produccin lctea, poseen tecnologas de punta para el procesamiento de suero.
Las principales plantas procesadoras de suero son AFISA (Arla Food Ingredients SA,
empresa conjunta al 50 % entre la empresa danesa Arla y la argentina Sancor), con una
Introduccin general
planta en la localidad cordobesa de Portea; y Remotti, con plantas en Crdoba, Santa

Fe y Buenos Aires. Otras son: Mastellone Hnos., Milkaut, Garca Hnos., Sobrero y
Cagnolo, Cotapa, Arcolen, Williner, Saputo, Cooperativa de James Craik y Lcteos
Conosur. Estas compaas lderes producen suero en polvo y concentrados proteicos (~
5 %), as como lactosa y sus derivados (~ 33 %). Gran parte de estos productos son
exportados a pases de todo el mundo, siendo los principales importadores Brasil,
Indonesia, China, Chile y Singapur (Schaller, 2009).
Las restantes, cerca de 1000 empresas lcteas argentinas productoras de queso, no
cuentan con capacidad para procesar el suero producido. Parte del suero es utilizado
para la produccin de ricota. En la elaboracin de este producto, las protenas son
precipitadas por calentamiento en medio cido, de manera que se aprovechan
solamente las propiedades nutricionales de mismas. El resto del suero, se estima que
aproximadamente el 62 % del total de la produccin en Argentina, es utilizado en
alimentacin animal o vertido como efluente a los ros (Pescuma y col., 2010).
Esto valores dan idea de que en nuestro pas el suero contina siendo un importante
problema ambiental. A su vez la sub-utilizacin o descarte del suero dejan fuera de los
canales de consumo humano una fuente valiosa de protenas de alta calidad y
desaprovechan adems el potencial econmico de este producto. Es por tanto,
necesaria la bsqueda de alternativas econmicas de valorizacin del suero que sean
aplicables a pequeas y medianas empresas, conciliando de esta manera el inters del
sector productivo con las demandas sociales de proteccin del medio ambiente.
2. Alimentos funcionales: Probiticos en aves
2.1 Conceptos generales

No existe una definicin mundialmente acordada para el catalogar a los alimentos
funcionales, aunque generalmente se considera funcional a aquellos alimentos que se
consumen como parte de una dieta normal y contienen componentes biolgicamente
activos que ofrecen beneficios para la salud y reducen el riesgo de sufrir enfermedades.
Este tipo de alimentos ha tenido un importante desarrollo en las ltimas dos dcadas,
impulsado por el actual reconocimiento de que llevar un estilo de vida sano, incluida la
dieta, puede contribuir a mantener el estado de salud y bienestar. Asimismo el
Introduccin general
incremento de la esperanza de vida con los consecuentes costes sanitarios que implica,
ha propiciado la bsqueda por parte de los gobiernos, los investigadores y los
profesionales de la salud y de la industria alimenticia de complementos para mantener
una vida saludable.
Como respuesta al creciente inters sobre este tipo de alimentos, han aparecido
tambin organismos regulatorios que buscan establecer normas y directrices que
regulen el desarrollo y la publicidad de dichos alimentos.
La Unin Europea ha creado una Comisin Europea de Accin Concertada sobre
Bromatologa Funcional en Europa (FUFOSE: Functional Food Science in Europe)
coordinada por el Instituto Internacional de Ciencias de la Vida (ILSI: International Life
Sciences Institute) cuyo objetivo es desarrollar y establecer un enfoque cientfico sobre
las pruebas que se necesitan para respaldar el desarrollo de alimentos funcionales. Los
integrantes de esta comisin en el artculo Scientific Concepts of Functional Foods in
Europe: Consensus document publicado por en la revista British Journal of Nutrition
declaran que:
Los alimentos funcionales deberan presentarse en forma de alimentos normales, y que
se deben demostrar sus efectos en las cantidades que normalmente se consumiran en la
dieta. Un alimento funcional puede ser un alimento natural, un alimento al que se ha
aadido un componente, o un alimento al que se le ha quitado un componente mediante
medios tecnolgicos o biolgicos. Tambin puede tratarse de un alimento en el que se ha
modificado la naturaleza de uno o ms de sus componentes, o en el que se ha
modificado la biodisponibilidad de uno o ms de sus componentes, o cualquier
combinacin de estas posibilidades. Un alimento funcional puede estar destinado a toda
la poblacin o a grupos determinados, que se pueden definir, por ejemplo, segn su edad
o su constitucin gentica.
Asimismo la FUFOSE apoya el desarrollo de dos tipos de alegatos de salud, que se
indican a continuacin, con respecto a los alimentos funcionales:
1. TIPO A: Alegatos de "mejora de funcin" asociados a determinadas funciones
fisiolgicas y psicolgicas y/o actividades biolgicas que son modificadas por la ingesta
del alimento.
2. TIPO B: Alegatos de "reduccin de riesgo de enfermedades" , que se asocian al
consumo de un alimento o de sus componentes para ayudar a reducir el riesgo de
Introduccin general
padecer una determinada enfermedad o afeccin, gracias a los nutrientes especficos

que contenga o no contenga dicho alimento.
Entre los productos funcionales los lcteos son los ms estudiados y numerosos. Estos
estn producidos frecuentemente por la fermentacin de leche u otros productos
lcteos por bacterias probiticas o por su enriquecimiento con los metabolitos que estas
producen (Saxelin y col., 2003). Los productos lcteos funcionales pueden clasificarse en
tres grupos:
1) Probiticos: son microorganismos vivos que al ser administrados en dosis adecuadas
confieren efectos benficos para la salud del hospedador (FAO/WHO 2002). Adems, se
llama alimento probitico a aqul que contenga como ingrediente a estos
microorganismos vivos, en una dosis suficiente y en una matriz alimentaria adecuada de
modo que, luego de su ingestin, se obtenga el efecto deseado, independientemente de
sus propiedades nutricionales (Schrezenmeir y De Vrese, 2001).
2) Prebiticos: son componentes alimentarios no digeribles que ejercen efectos
benficos en el hospedador al estimular selectivamente el crecimiento o modificar la
actividad metablica de una especie bacteriana colnica, o de una cantidad limitada de
esas especies (Gibson y Robertfroid, 1995). El fundamento de la accin de los
prebiticos es que no pueden ser digeridos en el tracto gastrointestinal proximal, debido
a la inexistencia de enzimas digestivas capaces de hidrolizar las uniones glucdicas que
presentan. Actan como fibras solubles y son fermentados a nivel del colon,
favoreciendo la actividad y estimulando del crecimiento de bifidobacterias y
lactobacilos. Los prebiticos ms estudiados son la inulina, los fructooligosacridos
(FOS), los galactooligosacridos (GOS) y los glucooligosacridos tales como los glucanos.
3) Simbiticos: resultan de una combinacin de probiticos y prebiticos, que afectan
benficamente la salud del hospedador favoreciendo la supervivencia e implantacin de
microorganismos selectivos vivos en el tracto gastrointestinal (Schrezenmeir y De Vrese,
2001).
En las ltimas dcadas, con el creciente inters en los cuidados de la salud y la
disminucin de riesgos, la atencin de los consumidores, as como de la industria y la
investigacin, los probiticos adquirieron gran significancia. Se encuentran en el
10
Introduccin general
mercado diversas marcas comerciales de productos de probada o potencial actividad

probitica, as como tambin, existen productos fermentados naturales que se elaboran
en forma artesanal y pueden considerarse probiticos (kefir, yogur).
2.2. Microbiota intestinal y su rol en la salud

El intestino delgado del pollo recin nacido es inmaduro y su desarrollo requiere
cambios morfolgicos, bioqumicos y moleculares que ocurren durante las 2 primeras
semanas de vida, aunque los cambios ms dramticos suceden dentro de las 24 h
despus del nacimiento. Durante las primeras 48 h luego de la eclosin, la yema
contribuye al mantenimiento del intestino delgado y a su desarrollo. Durante este
perodo, el pollo debe hacer la transicin entre utilizar energa en forma de lpidos
provistos por la yema al empleo de alimento exgeno rico en carbohidratos (Noy y
Sklan, 1999). El consumo de alimento es acompaado por el rpido desarrollo del tracto
gastrointestinal y los rganos asociados, siendo determinante para el desarrollo del
intestino y su funcin (Potturi y col., 2005).
El estado temprano luego de la eclosin es tambin crtico para el establecimiento de la
comunidad microbiana del tracto intestinal. Este proceso inicia con un ambiente
gastrointestinal estril al momento de la eclosin y contina hacia el establecimiento de
una comunidad microbiana que se hace ms compleja a medida que el animal crece
(Van Der Wielen y col., 2002) desarrollando cada regin un perfil microbiano distintivo
(Gong y col., 2008).
El tracto gastrointestinal de los pollos contiene bacterias, hongos y protozoos, pero las
bacterias son los microorganismos predominantes (Gabriel y col., 2006). La
concentracin de microorganismos aumenta de la regin proximal a la distal, siendo en
el leon de 108-9 UFC/g y en los ciegos de 1010-11 UFC/g (Chambers y Gong, 2011). Se
estima que el tracto gastrointestinal de los pollos posee cerca de 10 13 bacterias y que
90% de las mismas an no han podido ser cultivadas e identificadas por mtodos de
cultivo convencionales (Apajalahti y col., 2004; Chambers y Gong, 2011). A partir del
desarrollo de mtodos moleculares para el estudio de comunidades microbianas
complejas, se han publicado numerosos trabajos con la finalidad de caracterizar la
microbiota del leon y ciego de pollos y el rol de la alimentacin en estas comunidades
Introduccin general
(Guan y col., 2003; Lu y col., 2003; Bjerrum y col. 2006; Gong y col., 2008; Nava y col.,
2009)
Lu y col., (2003) mediante clonado y secuenciacin de genes de ARNr 16S describieron
que la microbiota del leon se halla dominada por especies del gnero Lactobacillus,
siguindoles en abundancia bacterias pertenecientes a las familias Clostridiaceae,
Streptococcaceae y Enterococcocaceae, mientras que en los ciegos el grupo
predominante es Clostridiaceae (Figura 1).
Figura 1: Composicin de la microbiota del leon y ciegos de pollos parrilleros

determinada por secuenciacin de 1230 clones de una librera de ADNr 16S. (A)
Composicin bacteriana del leon (B) Composicin bacteriana de los ciegos. Adaptado
de Lu y col. (2003).
Las bacterias comensales normales de intestino coexisten en equilibrio dinmico con el

hospedador y su metabolismo representa gran parte de la actividad bioqumica del
organismo, influenciando el estado nutricional y la salud del hospedador.
Algunos
microorganismos
pueden
afectar
negativamente
al
hospedador
al
desencadenar respuestas inflamatorias, generar infecciones localizadas o sistmicas o

sintetizar toxinas o compuestos perjudiciales. Otros, principalmente Lactobacillus y
Bifidobacterium, en cambio contribuyen de forma significativa al estado de salud del
hospedador, por sus funciones: a) metablicas, interviniendo en la asimilacin de
nutrientes de la dieta y glicanos endgenos; b) protectoras, contribuyendo al efecto
barrera y al desplazamiento de microorganismos patgenos y c) trficas, interviniendo
en la modulacin del sistema inmune, en el desarrollo y la proliferacin celular (Tannock,
2004; Lan y col., 2005).
11
12
Introduccin general
Consecuentemente la manipulacin de la microbiota intestinal se ha convertido en una

estrategia para prevenir la colonizacin de enteropatgenos, as como para promover la
salud y rendimiento productivo de los pollos (Chambers y Gong, 2011).
2.3 Productos probiticos y su aplicacin

La prevencin y control de enfermedades ha llevado durante las ltimas dcadas a
incrementos sustanciales en el uso de antibiticos como curativos, profilcticos y
factores de crecimiento. Sin embargo, la utilidad de los agentes antimicrobianos como
medida preventiva ha sido cuestionada debido a la diseminacin de resistencia a
antimicrobianos entre bacterias patgenas, lo que puede tener serias consecuencias en
el tratamiento de personas contra estos patgenos (Foley y Lynne, 2008; Gyles, 2008;
Mathers y col., 2011; Rodicio y col., 2011). Las crecientes restricciones respecto al uso de
antimicrobianos sumadas a la preocupacin de los consumidores por los efectos nocivos
de la presencia de residuos de antibiticos en los alimentos, incluidas las reacciones
alrgicas y los efectos carcinognicos, han propiciado la bsqueda, por parte de los
productores, de alternativas para el control de patgenos (Kabir, 2009).
Algunas de soluciones potenciales que han emergido en las ltimas dcadas como
alternativas al uso de antibiticos como promotores del crecimiento en produccin
animal son: i) los probiticos, ii) compuestos qumicos no tradicionales, iii)
bacterifagos, iv) cidos orgnicos, extractos de plantas y aceites esenciales (Tellez y
col., 2011).
Los probiticos son una opcin cada vez ms aceptada por los productores. El concepto
de probiticos en aves surgi a partir de la idea de administrar microorganismos del
tracto intestinal de individuos adultos a pollos recin nacidos. Esto se fundamenta en
que las aves comerciales nacen en incubadoras, siendo privadas del contacto con
microorganismos intestinales provenientes de la madre. El tracto gastrointestinal de
pollos recin nacidos es inmaduro y sufre modificaciones morfolgicas, bioqumicas y
moleculares durante 2 semanas luego del nacimiento. La adquisicin de la microbiota
intestinal en esta etapa es crtica para el desarrollo del tracto intestinal y de los rganos
asociados y depende en gran medida de la alimentacin (Yegani y Corver, 2008).
En 1973, Nurmi y Rantala demostraron por primera vez que el tratamiento de pollos
recin nacidos con una suspensin de material proveniente del intestino de pollos
Introduccin general
adultos aumentaba la resistencia de los mismos a contraer Salmonella sp. Este efecto
protector se denomin popularmente exclusin competitiva (EC) o concepto de
Nurmi y actualmente existen numerosas preparaciones comerciales basadas en este
principio en el mercado.
Las preparaciones comerciales de EC frecuentemente contienen cultivos microbianos
realizados a partir del tracto intestinal de individuos adultos sanos de la misma especie.
Algunos de los productos probiticos para aves ms populares existentes en el mercado
son AviFree, Aviguard, Broilact, MSC, Preempt y CF-3 (Schneitz, 2005). Todos ellos son
cultivos mixtos derivados del contenido cecal de aves domsticas, que presentan una
composicin de especies desconocida. Los mismos tienen un largo historial de uso y
predominan en el mercado no europeo (Applegate y col., 2010). Sin embargo el uso de
cultivos no definidos est restringido legalmente en algunos pases, por ejemplo en la
Unin Europea (EFSA, 2005b, 2007, 2008). Una de los riesgos de este tipo de productos
es la transferencia de patgenos oportunistas a individuos susceptibles que los
consumen (Mead, 2000). Otro riesgo es la transferencia de genes de resistencia a
antibiticos a la microbiota del tracto intestinal de las aves o del humano que las
consume (Tollefson y col., 1997).
Otros probiticos comerciales contienen una o ms cepas bacterianas de identidad
conocida. Existe un cultivo constituido por Lactobacillus reuteri que se utiliza
comercialmente aunque su eficacia contra enteropatgenos ha sido cuestionada
(Schneitz, 2005). Se ha descripto que los probiticos multiespecficos son ms efectivos
que aquellos compuestos por una o unas pocas especies (Timmerman y col., 2004).
Se han llevado a cabo, adems, numerosos estudios sobre el uso de cepas
potencialmente probiticas en aves que an no se comercializan. Los microorganismos
ms comnmente estudiados como probiticos incluyen bacterias cido lcticas,
bifidobacterias, Bacillus spp., Bacteroides spp., Escherichia coli, Propionibacterium spp.,
Streptococcus spp. y levaduras (Applegate y col., 2010). Se espera que los probiticos
aumenten la resistencia de las aves a la colonizacin por patgenos sin producir efectos
adversos sobre su salud. Numerosos probiticos han demostrado reducir la colonizacin
intestinal de Salmonella (Al-Zenki y col., 2009; Mountzouris y col., 2009; Vil y col., 2009;
Higgins y col., 2010; Knap y col., 2011; Menconi y col., 2011), de Clostridium perfrigens
13
14
Introduccin general
(Hofacre y col., 1998; Knap y col., 2010) y de Campylobacter spp. (Soerjadi y col., 1982;
Soerjadi-Liem y col., 1984; Schoeni y Wong, 1994; Santini y col., 2010).
Algunos autores han reportado adems que los probiticos mejoran la productividad de
las aves, sin embargo los datos de la literatura disponibles ofrecen una variedad de
resultados conflictivos en lo referente a la eficacia de los probiticos en la mejora de
rendimiento de los pollos. Algunos estudios indican que ocasionan una mejora en la
productividad. Awad y col. (2009) hallaron que la administracin de un probitico
constituido por Lactobacillus sp. homofermentativos y heterofermentativos adicionados
al alimento (108 UFC/tonelada) produca mejoras en la ganancia de peso diaria,
conversin alimentaria, rendimiento del cadver, peso de los rganos y morfologa del
epitelio intestinal de pollos de 1 a 35 das de edad. Kim y col. (2011) tambin reportaron
que la inclusin en la dieta de un probitico multi-especfico aumentaba el rendimiento
productivo de las aves. Paralelamente demostraron que haba una disminucin de la
concentracin de coliformes y Clostridium sp. en los ciegos, un cambio en la morfologa
del intestino delgado y un aumento de la digestibilidad de nutrientes. Alkhalf y col.
(2010) hallaron que la administracin del probitico comercial Bactocell compuesto
por Pediococcus acidilactici (0.8-1 x 109 UFC/kg de alimento) adicionado a la dieta
mejora la ganancia de peso diaria y la conversin alimentaria de pollos entre 3-6
semanas. Asimismo reportaron una disminucin en el colesterol en sangre por el
tratamiento con el probitico. Efectos promotores del crecimiento han sido informados
por otros autores (Timmerman y col., 2006; Radfar y col. 2008; Wu y col., 2008; Alkhalf y
col., 2010; Bahrain Pour y Kermanshahi, 2010). Igual de frecuentes son los estudios que
no hallan efecto de los probiticos en la productividad de pollos de engorde. Telg y
Caldwell (2009) no hallaron diferencias significativas en la conversin alimentaria ni en la
ganancia de peso por administracin de un probitico comercial de composicin
definida y Czerwiski y col. (2010) tampoco hallaron diferencias en el rendimiento de
pollos Ross por administracin en el alimento del probitico LABYuc-Probio compuesto
por bacterias cido lcticas, Saccharomyces cerevisiae y extracto de Yucca schidigeri.
Rahimi y col. (2011) demostraron que la administracin del probitico comercial
Primalac no tena efecto sobre la conversin alimentaria ni el peso de los rganos.
Otros autores han informado resultados similares negando el efecto promotor del
Introduccin general
crecimiento de diversos probiticos (Chumpawadee y col., 2009; Vil y col. 2009;

Houshmand y col., 2011).
2.4 Mecanismos de accin de los probiticos

Los probiticos pueden intervenir en la funcin metablica y fisiolgica del intestino de
pollos actuando a travs de diferentes mecanismos tales como los que se listan a
continuacin:
Prevencin de la colonizacin de patgenos. Se ha descripto que los probiticos
mejoran el estado de salud y reducen el riesgo de contraer enfermedades entricas y
sistmicas de aves. Los mecanismos por los cuales ejercen este efecto son an poco
claros. El mecanismo m s frecuentemente descripto es la exclusin competitiva. Esto
se refiere al bloqueo fsico de la colonizacin de patgenos oportunistas por la adhesin
de bacterias probiticas. Los probiticos tambin pueden prevenir la colonizacin
intestinal de patgenos mediante otros mecanismos. Por ejemplo Lactobacillus
plantarum inhibe la adhesin de E. coli enterohemorrgica induciendo la transcripcin y
secrecin de mucinas MUC 2 y MUC3 por clulas globulares (Fooks y Gibson, 2002).
Lactobacillus kefir es capaz de inhibir la adhesin e invasin de Salmonella enterica
serovar Enteritidis a clulas Caco-2/TC7 mediante la secrecin de protena de capa-S que
interacta con estructuras de la superficie del patgeno (Golowczyc y col., 2007).
Los probiticos pueden adems competir con los patgenos por los nutrientes
(Cummings y Macfarlare, 1997) o producir cambios en el microambiente del tracto
intestinal que afectan la supervivencia, adhesin o invasin de los patgenos. Los cidos
grasos producidos por los probiticos, como parte de su metabolismo nutricional,
disminuyen el pH del medioambiente intestinal afectando la supervivencia de bacterias
patgenas (Marteau y col., 2004).
Estos cambios en el ambiente fsico pueden afectar adems la funcin del epitelio
intestinal y del metabolismo en general. Los cidos grasos voltiles sirven como fuente
de energa a los colonocitos y afectan el transporte de nutrientes, el metabolismo, el
crecimiento y la diferenciacin de estas clulas (Marteu y col., 2004). Estos compuestos
adems son rpidamente absorbidos en el epitelio del intestino delgado y colon,
estimulando la absorcin de electrolitos y agua y afectando el crecimiento de las clulas
15
16
Introduccin general
epiteliales. Los cidos orgnicos pueden tambin actuar como fuente de energa para las
aves. Se ha descripto que estn implicados en la regulacin heptica de lpidos y
carbohidratos, y que actan como sustrato energtico en msculos, rin y cerebro
(Chichlowski y col., 2007a).
Los probiticos pueden, adems, producir bacteriocinas o sustancias inhibitorias no
proteicas. Por ejemplo la popiridina, una poliamina modificada, producida por la
microbiota intestinal inhibe la adhesin e internalizacin de Salmonella y Shigella a
clulas epiteliales intestinales (Gusils, 2003).
Mantenimiento de la integridad de la barrera intestinal. Los enterocitos actan como
barrera protectora contra microorganismos y sustancias que no sirven de nutrientes. Un
componente importante para la funcin de barrera del epitelio intestinal es el mucus
secretado por clulas globulares que se hallan dispersas en el epitelio. El mismo consiste
en mucinas, protenas, glicoprotenas, lpidos, glicolpidos y receptores solubles que
reconocen protenas especficas que facilitan la adhesin bacteriana. Los probiticos
pueden contribuir a mejorar la funcin de barrera del epitelio intestinal afectando la
secrecin de mucus. Caballero-Franco (2007) observ que luego del tratamiento con
probiticos el contenido de mucina luminal aumentaba un 60 % respecto al valor basal,
sugiriendo una estimulacin de la expresin de MUC2 o un aumento del nmero de
clulas globulares. Chichlowski (2007b) describi un mayor nmero de clulas globulares
en el epitelio intestinal de pollos luego del tratamiento con probiticos. Adicionalmente
ensayos in vitro han demostrado un incremento en la produccin de mucinas,
especialmente MUC3, luego del tratamiento con numerosas especies de Lactobacillus
(Montalto y col., 2004). Se cree que metabolitos producidos por la fermentacin
bacteriana juegan algn rol en el crecimiento y maduracin de clulas globulares.
Morfologa intestinal y absorcin de nutrientes. Se ha reportado que la administracin
de probiticos modifica la histomorfologa del epitelio intestinal de las aves. Awad y col.
(2009) asociaron la mayor productividad de pollos, debida al consumo de probitico, con
un aumento de la altura de las vellosidades en relacin a la profundidad de las criptas en
el duodeno e leon. Tambin se ha demostrado el aumento de la altura de las
vellosidades del leon por adicin de Enterococcus faecium (Samli y col., 2007), Bacillus
subtilis var. natto (Samanya y Yamauchi, 2002) y de un probitico multiespecie (Kim y
Introduccin general
col., 2011) a la dieta de pollos. De similar manera, Chichlowski y col. (2007b) reportaron
un aumento de la longitud de las vellosidades del yeyuno por el consumo de un
probitico constituido por Bifidobacterium thermophilum y E. faecium. El aumento de la
altura de las vellosidades es un indicador de la activacin de la funcin intestinal (Yasar y
Forbes, 1999; Shamoto y Yamauchi, 2000). La mayor altura de las vellosidades conduce
al incremento en la funcin absorbente del intestino debido al aumento de la superficie
de absorcin, de la expresin de enzimas del borde en cepillo y de los sistemas de
transporte de nutrientes (Awad y col. 2009). Esto sugiere que los probiticos activan la
actividad del intestino. En este sentido se ha reportado un aumento de la absorcin
pasiva de prolina y glucosa en pollos por el consumo de B. thermophilum y E. faecium
(Chichlowski y col., 2007b).
Digestin y biodisponibilidad de nutrientes. Los probiticos pueden generar
compuestos asimilables a partir de compuestos complejos no digeribles por el
hospedador, sintetizar nutrientes o aportar enzimas que aumenten su disponibilidad o
reducir compuestos perjudiciales o antinutrientes. Los lactobacilos pueden secretar
enzimas que contribuyen a la actividad amilasa intestinal. Jin y col. (2000) demostraron
que la administracin de L. acidophilus o una cultivo mixto de Lactobacillus a pollos
durante 40 das aumenta significativamente (P<0.05) los niveles de amilasa. Esto
tambin ha sido observado luego de la administracin de probiticos a lechones
(Collington y col., 1990). Asimismo est bien establecido que los probiticos pueden
alterar la actividad de enzimas intestinales o la digestibilidad de nutrientes al modificar
el pH gastrointestinal (Dierick, 1989). Se ha demostrado que Aspergillus oryzae afecta el
metabolismo de macronutrientes en gallinas ponedoras, postulndose que interfiere en
la digestibilidad de los mismos mediante la produccin de enzimas amilolticas y
proteolticas (Schneitz, 2005). Tambin se ha reportado que el consumo de Lactobacillus
casei por pollos causa una disminucin de la actividad ureasa del intestino delgado
acompaada por una mejora de la productividad (Yeo y Kim, 1997). Esta enzima est
asociada con la conversin de cido rico, producto de excrecin de nitrgeno en aves,
en amonaco que es un compuesto txico para los enterocitos. Lan y col. (2002, 2012)
reportaron que la adicin de una especie bacteriana productora de fitasa, Mitsuokella
jalaludinii, a alimento pobre el fsforo mejora la ganancia de peso y disminuye la
17
18
Introduccin general
conversin alimenticia relacin entre el alimento que consume y el peso que gana de
pollos. El fitato representa la mayor fuente de fsforo del alimento de los pollos pero los
mismos no cuentan con las enzimas necesarias para su degradacin. Este compuesto es
adems un anti-nutriente, ya que por su alta carga negativa retiene minerales
reduciendo su disponibilidad, forma complejos con protenas disminuyendo su
digestibilidad e inhibe la actividad de la tripsina y la pepsina. De manera que las mejoras
halladas en la productividad de las aves se asociaron con la capacidad de la bacteria
probitica de atacar enzimticamente este antinutriente evitando sus efectos
perjudiciales.
Balance de la comunidad microbiana. Numerosos estudios indican que la
administracin de Lactobacillus y Bacillus probiticos disminuyen los niveles de bacterias
entricas nocivas e incrementan los de bacterias benficas productoras de cido lctico
de la microbiota intestinal. Mountzouris y col. (2007) reportaron que la administracin
de Lactobacillus en concentracin 2 x 106 UFC/g de alimento durante 42 das
incrementaba la concentracin de Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. y cocos gram
positivos en los ciegos; mientras que no afecta la concentracin de aerobios ni
anaerobios totales, coliformes o Bacteroides spp. Li y col. (2009) hallaron un incremento
de la concentracin de Lactobacillus spp. y una disminucin de la de Bifidobacterium sp.
en el contenido cecal por la administracin en la dieta de un probitico constituido por
Lactobacillus spp. y Bacillus cereus. Ha sido demostrado que la administracin de
Bacillus subtilis en la dieta en concentracin 103 UFC/g de alimento reduce la
concentracin de Clostridium spp. y de E. coli en el contenido intestinal (Teo y Tan,
2007). Tambin se ha descripto que la administracin de Enterococcus faecium
incrementa la concentracin de bacterias cido lcticas en el leon de pollos (Samli y col.,
2007). Cambios en la composicin de la microbiota intestinal han sido ligados
directamente con mejoras en el rendimiento de aves (Torok y col., 2008).
Mejora la funcin del sistema inmune. La manipulacin de la microbiota intestinal a
travs de la administracin de probiticos influencia el sistema inmune de diversas
maneras. Se ha informado que regula positivamente la inmunidad celular y que aumenta
la produccin de anticuerpos, la interaccin entre clulas T y clulas dendrticas y la
seal de receptores Toll-like. Muchos de estos efectos han sido observados en el
Introduccin general
intestino de pollos desafiados experimentalmente con patgenos entricos (Lee y col.,

2010).
Se ha demostrado que pollos tratados con probiticos producen mayor cantidad de
anticuerpos frente a un determinado antgeno cumpliendo un importante rol como
adyuvantes. A modo de ejemplo, los ttulos de anticuerpos luego de la vacunacin
contra el virus de la enfermedad de Newcastle y contra Eimeria son mayores para pollos
que consumen probitico que para aquellos que no reciben el tratamiento (Lee y col.,
2010).
La expresin de citoquinas en pollos es alterada en respuesta a una dieta que contiene
probiticos. Distintos estudios han proporcionado pruebas de que los lactobacilos
inducen la expresin de citocinas Th2, como IL-4 e IL-10 (Christensen y col., 2002;
Lammers y col., 2003; Rakoff-Nahoum y col., 2004) y TGF-1 (Lebman y col., 1999). A
travs de la estimulacin de la produccin de citoquinas por diferentes subconjuntos de
clulas del sistema inmune, los probiticos intervienen en la induccin y regulacin de la
respuesta inmune (Maassen y col., 2000; Christensen y col., 2002; Lammers y col., 2003).
A nivel celular se ha hallado que pollos que consumen Lactobacillus sp. tienen mayores
porcentajes de linfocitos intraepitelilales intestinales CD3+, CD4+, CD8+ y TCR2+
comparados con pollos que no reciben probitico (Dalloul y col., 2003). Por otro lado se
ha reportado que la administracin de probiticos a pollos ocasiona un incremento
espontneo de la proliferacin de linfocitos en el bazo, lo que indicara un aumento en la
inmunidad celular (Dalloul y col., 2003; Lee y col., 2007). Farnell y col. (2006) reportaron
adems que los probiticos incrementan la degranulacin y explosin oxidativa de
heterflos. Los heterfilos son la segunda mayor poblacin de clulas sanguneas de
aves y cumplen una funcin equivalente a los neutrfilos de mamferos siendo
componentes crticos de la inmunidad innata a travs de su funcin fagoctica y citoltica
mediada por intermediarios reactivos de oxgeno, enzimas proteolticas y otras
sustancias microbiocidas (Dar y col., 2009).
2.5. Consideraciones para la administracin de los probiticos

Varios factores afectan la efectividad del tratamiento por probiticos siendo la dosis y la
forma de administracin dos factores particularmente importantes a considerar.
19
20
Introduccin general
Asimismo se ha sugerido que los probiticos pueden tener distinto efecto de acuerdo a
la edad de los animales. Dado que durante la edad temprana la microbiota intestinal no
est desarrollada y los pollos son ms propensos a contraer enfermedades se ha
propuesto la administracin de probiticos inmediatamente luego del nacimiento
(Vilagravel y col., 2010).
Forma de administracin. Las vas de administracin de probiticos ms empleadas en
aves son la inclusin en el en el agua de bebida o la pulverizacin, menos
frecuentemente los productos son agregados directamente a los comederos o
mezclados con el alimento, finalmente la aplicacin en dosis individuales se limita a
criaderos con bajo nmero de individuos (Schneitz, 2005).
La adicin de los probiticos en el agua de bebida fue la primera forma de
administracin testeada a campo, dando resultados exitosos (Wierup y col., 1988, 1992;
Schneitz, 2005). Sin embargo, se han citado como desventajas de esta forma de
administracin el consumo desigual por individuo, la prdida de viabilidad de algunos
microorganismos anaerbicos o sensibles al cloro del agua y la imposibilidad de
administrar el producto a pollos recin nacidos (Schneitz, 2005).
El uso de aerosoles, como un mtodo para administrar probiticos fue sugerido
inicialmente por Pivnick y Nurmi (1982). Posteriormente, Goren y col. (1984, 1988)
desarrollaron un modo de aplicacin por aspersin para el tratamiento de los pollitos
recin nacidos en criaderos. La aplicacin por aspersin, ya sea manual (Schneitz y col.,
1990) o automtica (Chen y col., 1998; Schneitz, 1992) permite tratar a los polluelos con
rapidez despus de la eclosin y asegura un reparto equilibrado de los materiales de
tratamiento. Adems se ha demostrado que no causa efectos adversos sobre la salud o
el rendimiento de las aves (Corrier y col., 1995). La pulverizacin en la cmara de cra
seguida por la administracin de agua potable fue utilizada por Blankenship y col. (1993)
demostrando ser eficaz en el control de la infeccin por Salmonella, sin embargo no hay
evidencia de que un doble tratamiento de este tipo ofrezca la mxima proteccin.
La posibilidad de que los pollos se infecten en las incubadoras ha alentado a los
investigadores a buscar una forma de administracin en la cual las aves puedan ser
tratadas antes de la eclosin (Cox y col., 1990; 1991). Cox y col. (1993) desarrollaron un
mtodo in ovo en el que se introduce el producto probitico en la cmara de aire o en el
Introduccin general
amnios del huevo un par de das antes de la eclosin. Sin embargo, la aplicacin en la
cmara de aire reduce el porcentaje de nacimientos y la inoculacin en el amnios mata a
todos los embriones. Meijerhof y Hulet (1997) obtuvieron resultados similares con el
producto comercial Broilact.
Dosis. La dosis de los probiticos es un factor importante en su uso efectivo. La dosis
recomendada para la mayora de los probiticos se halla en el rango de 10 8 a 109
UFC/pollo por da (Mountzouris y col., 2010). Hay acuerdo general en que la eficacia es
dependiente de la dosis, sin embargo algunos autores han descripto mayor efectividad a
dosis elevadas mientras que otros han hallado el efecto inverso. Higgins y col. (2008)
demostraron que la aplicacin de un probitico constituido por once BAL (FM-B11;
Ivesco, LLC, Springdale, AR) en concentracin 106 y 108 UFC/pollo despus del desafo
con 104 UFC/pollo de Salmonella Enteritidis reduce el riesgo de colonizacin intestinal
del patgeno, mientras que empleando una dosis de probitico 10 4 UFC/pollo no
detectaron proteccin. Kim y col. (2011) reportaron que la administracin de un
probitico multiespecie en dosis 108 y 109 UFC/kg de alimento era ms efectiva en la
mejora de parmetros productivos de pollos que una dosis de 10 7 UFC/kg. En el mismo
sentido, se ha indicado que Bacillus subtilis mejora en mayor medida el rendimiento de
las aves administrado en dosis 106 UFC/kg de alimento que en dosis 104 UFC/kg (Teo y
Tan, 2007). Sin embargo, Mountzouris y col. (2010) hallaron un mejor rendimiento en
pollos por el consumo del probitico PoultryStar en concentracin 108 UFC/kg que
cuando se utiliz en concentracin 109 y 1010 UFC/kg. Asimismo, el efecto de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en el aumento de peso de las aves fue mayor
cuando la dosis de probitico se disminuy de 8 x 10 9 a 2-6 x 109 UFC/kg (Apata, 2008).
Esta diversidad de resultados indica que la dosis es dependiente del producto y que un
nivel mayor de administracin no siempre conduce a un efecto mayor. Por otra parte la
eficiencia de los probiticos, a una determinada dosis, est condicionada por diversos
factores que dificultan an ms la generalizacin, tales como su composicin de
especies microbianas, la viabilidad en el alimento y en el tracto intestinal, el mtodo y
frecuencia de aplicacin, la dieta basal, la edad de las aves, la higiene del ambiente y
otros factores ambientales causantes de estrs (Mountzouris y col., 2010).
21
22
Introduccin general
2.6 Marco legal

Debido a la tendencia mundial en la aplicacin de restricciones legales en el uso de
antibiticos como promotores de crecimiento en la industria avcola, se prev un
aumento de la incidencia de enfermedades en aves y en el hombre. A raz de este temor
se ha impulsado la bsqueda de alternativas de control a travs de promocin de
subsidios para investigacin en estas reas. Son ejemplos de esta situacin, los
proyectos europeos C-EX (Devolopment of e Competitive Exclusion Product for Poutry
Meeting the Regulatoy Requeriments for Registration in European Union),
PoutryFlorGut, REPLACE y PROEUHEALTH-PROPATH (Anadn y col., 2006). Como
consecuencia la investigacin en el desarrollo de productos probiticos para animales ha
sufrido grandes avances. Sin embargo la implementacin de estos avances en el
mercado se ha visto obstaculizada por el proceso de regulacin y registro de productos
comerciales. Las restricciones y la velocidad de aprobacin de estos productos varan
entre pases. En Estados Unidos y Europa se ha realizado un significativo progreso en la
legislacin para la evaluacin segura de probiticos (EFSA, 2005a; FAO/WHO, 2002) sin
embargo, no hay an un nico estndar disponible y muchos pases an no cuentan con
normativas que contemplen estos productos.
En la Unin Europea los aditivos para alimentos animales se hallan regulados por el
Reglamento (CE) n 1831/2003 y sus normas en desarrollo (Reglamento (CE) N
429/2008). En este reglamento se contemplan aditivos que puedan influir positivamente
en el rendimiento de los animales en buen estado la salud o aquellos utilizados para
influir positivamente el medio ambiente. La categora "aditivos zootcnicos" se
encuentra dividida en cuatro grupos funcionales:
(a) digestivos: sustancias que, suministradas a los animales, facilitan la digestin de la
dieta, actuando sobre determinadas materias primas para piensos;
(b) estabilizadores de la flora intestinal: microorganismos u otras sustancias definidas
qumicamente que, suministradas a los animales, tienen un efecto positivo en la flora
intestinal;
(c) sustancias que influyen positivamente en el medio ambiente;
(d) otros aditivos zootcnicos.
La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria public una gua que orienta a los
interesados en la preparacin y presentacin de sus solicitudes de autorizacin de estos
Introduccin general
productos. La gua se hallan dividida en 6 secciones: (1) resumen del expediente, (2)
identificacin y caracterizacin de las condiciones de uso del aditivo y mtodos de
control, (3) estudios referidos a la seguridad del aditivo, (4) estudios referidos a la
eficacia del aditivo y (4) plan de monitoreo post-venta. El documento debe estar abalado
por datos cientficos pertinentes (publicados y no publicados, tanto favorables como
desfavorables) que constituyen la base de fundamentacin. El producto debe estar
caracterizado en cuanto a sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas, estabilidad,
compatibilidad con otros ingredientes alimentarios, condiciones de uso, mtodos de
control. Asimismo debe indicarse el nombre cientfico de los microorganismos y su
procedencia. Deben presentarse pruebas que demuestren que es seguro para el animal,
el consumidor y el medioambiente debiendo efectuarse ensayos de toxicidad oral,
genotoxicidad, mutagenicidad, produccin de toxinas y factores de virulencia,
resistencia a antibiticos y transmisibilidad de los mismos, asimismo debe contemplarse
el margen de seguridad evalundose el riesgo de un aumento accidental de la dosis. La
eficacia debe evaluarse en al menos 3 ensayos demostrando efectos significativos (P <
0.05) en el animal especfico para el cual estar destinado (EFSA, 2008).
Las exigencias de los ensayos requeridos por estas normas igualan a los necesarios para
la aprobacin de sustancias qumicas frecuentemente dificultando la aplicacin de estos
estudios a microorganismos (Anadn y col., 2006). Estas estrictas regulaciones han
conducido a que existan en el mercado europeo unos pocos aditivos probiticos para
aves conteniendo una o excepcionalmente dos especies. Mientras que en pases no
europeos ni norteamericanos el mercado se halla dominado por productos probiticos
de composicin indefinida o parcialmente definida cuya efectividad ha demostrado ser
notoriamente superior (Dunne y col., 1999; Sanders y col., 1999; Klose y col., 2006).
Recientemente en Europa, la European Food Safety Autority (EFSA) ha introducido el
concepto de Qualified Presumption of Safety (QPS) similar al concepto de GRAS
(Generally Regarded As Safe) regulado por la Food and Drug Administration de los
Estados Unidos. El concepto de QPS provee un sistema de evaluacin de seguridad
aplicable a todos microorganismos deliberadamente introducidos en la cadena
alimentaria (EFSA, 2005b). Esto significa un gran avance al permitir que las especies
contempladas bajo este status puedan entrar en el mercado sin necesidad de pasar los
23
24
Introduccin general
numerosos test de seguridad, limitantes en cuanto a tiempo y costos (Gaggia y col.,

2010).
Sin duda el futuro de los probiticos como aditivos depender en gran medida del
desarrollo regulatorio en el rea. Las exigencias en cuanto a la demostracin de calidad,
eficiencia y especialmente seguridad de las preparaciones probiticas para aves
determinarn la oportunidad de desarrollo de nuevos productos con insercin en el
mercado (Anadn y col., 2006).
3. Enfermedades causadas por enteropatgenos en aves

Las enfermedades entricas son relevantes en la industria avcola ya que causan
prdidas en la productividad, aumento de la mortalidad y se asocian a la contaminacin
de humanos a travs de alimentos derivados (Patterson y Burkholder, 2003). Entre los
enteropatgenos que afectan ms frecuentemente a las aves se encuentran Salmonella
spp., Escherichia coli, Campylobacter jejuni y Clostridium perfrigens (Doyle y Erickson,
2006; McReynolds y col., 2009). La colibacilosis, ocasionada por Escherichia coli y la
salmonelosis, ocasionada por Salmonella spp., son las enfermedades bacterianas que
causan mayores prdidas econmicas en la industria avcola y constituyen un riesgo de
transmisin al hombre a travs del consumo de alimentos derivados (Mor-Mur y Yuste,
2010; Lutful Kabir, 2010).
Escherichia coli es una bacteria oportunista que suele causar enfermedades en pollos
inmunolgicamente deprimidos. Hay cepas de E. coli, conocidas como E. coli patgena
(APEC), que son capaces de causar colibacilosis debido a su capacidad invasiva. La
infeccin en aves implica la colonizacin del tracto respiratorio, el paso a travs del
epitelio y la penetracin de las bacterias a la mucosa de las vas respiratorias. La
supervivencia y multiplicacin de E. coli en el torrente sanguneo, da lugar a una
septicemia, que se desencadena en lesiones de mltiples rganos, por lo general
pericarditis, saculitis, perihepatitis y peritonitis (Lutful Kabir, 2010). Desde el punto de
vista econmico, esta enfermedad representa un problema importante para la industria
avcola en todo el mundo, causando prdidas significativas debido a las tasas de
conversin ms bajas produciendo una prdida de peso, altas tasas de mortalidad y de
baja calidad del cadver, con el consiguiente rechazo de la produccin y el alto costo del
tratamiento (Dziva y Stevens, 2008; Saberfar y col., 2008).
Introduccin general
Salmonella es el agente infeccioso causal de la salmonelosis, enfermedad cuyas

caractersticas se detallan a continuacin.
3.1 Salmonelosis
Dentro del gnero Salmonella existen 2 especies, bongori y enterica, la ltima de las
cuales contiene 6 subespecies enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica
(Brenner y col., 2000). De estas subespecies solo S. enterica subsp. enterica causa
enfermedades en animales de sangre caliente (Uzzau y col., 2000). Las otras subespecies
son comnmente halladas en el medioambiente o asociadas a poiquilotermos estando
menos frecuentemente relacionadas con enfermedades humanas (CFSPH, 2005).
Los serotipos de Salmonella se dividen en tres grupos basados en el rango de
hospedadores que pueden colonizar: restringidos, adaptados al hospedador y ubicuos.
Los serotipos restringidos se asocian casi exclusivamente a ciertas especies
hospedadoras. Por ejemplo Typhi, Gallinarum y Abortusovis estn relacionadas a
enfermedades sistmicas en humanos, aves y ovinos respectivamente. Aquellos
adaptados al hospedador causan tpicamente enfermedades sistmicas en un nmero
limitado de especies relacionadas pero pueden producir ocasionalmente enfermedades
en otros. Por ejemplo Dublin y Choleraesuis causan enfermedades severas en ganado
vacuno y en porcinos respectivamente, pero pueden infectar otros mamferos
incluyendo humanos. Las serovariedades ubicuas, como por ejemplo Typhimurium y
Enteritidis, pueden ocasionar enfermedades sistmicas en una amplio rango de
hospedadores, pero usualmente producen gastroenteritis autolimitante (Uzzau y col.,
2000).
Las infecciones de aves con Salmonella son importantes tanto como causa de
enfermedades en criaderos como por su transmisin a humanos a travs de la
contaminacin de alimentos derivados (Lutful Kabir, 2010).
La diseminacin de la infeccin por Salmonella en aves ocurre por transmisin horizontal
mediante contaminacin fecal de alimento, agua y/o camas. La infeccin ocurre
frecuentemente por va oral, aunque las vas nasal y cloacal son tambin consideradas
importantes en la propagacin la enfermedad. Asimismo puede haber transmisin
vertical a travs del ovario u oviducto infectados o del contacto de la superficie del
25
26
Introduccin general
huevo con heces contaminadas y la posterior penetracin del patgeno al interior del
huevo (Kabir, 2009).
Las aves sufren 3 tipos de enfermedades asociadas a Salmonella sp.: pullorosis, tifosis
aviar y paratifosis. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum es el agente
etiolgico de la tifosis aviar y la pullorosis que son causadas por las serovariedades
Gallinarum y Pullorum, respectivamente. Asimismo varios serotipos mviles ubicuos
altamente invasivos, tales como Typhimurium, son causantes de la enfermedad
paratifoidea (Shivaprashad, 1997).
La tifosis aviar es una enfermedad hiperaguda, aguda o crnica que afecta
principalmente a pollos adultos, mientras que la pullorosis afecta a pollos jvenes de no
ms de 2 o 3 semanas de edad, tendiendo a hacerse crnica en adultos. Ambas
enfermedades son indistinguibles hasta que el agente etiolgico se asla e identifica
(Parveen y col., 2007). Los signos clnicos en polluelos de corta edad incluyen anorexia,
diarrea, deshidratacin, debilidad y alta mortalidad (Shivaprasad, 2000). En adultos la
enfermedad tifoidea se manifiesta mediante anorexia, descenso en la produccin de
huevos, incremento de mortalidad y reduccin de la fertilidad (Shivaprasad, 2000). En
tanto que los pollos adultos que contraen pullorosis no exhiben sntomas clnicos
(Shivaprashad, 1997). La enfermedad paratifoidea slo presenta sntomas similares a los
de la pullorosis en aves muy jvenes, mientras que en aves adultas suele causar una
infeccin asintomtica.
A pesar de que la tifosis y pullorosis estn ampliamente distribuidas mundialmente, la
enfermedad ha sido prcticamente erradicada en aves comerciales en pases
desarrollados tales como Estados Unidos de Amrica, Canad y la mayora de los pases
de Europa Occidental (Shivaprashad, 1997). Esto se ha logrado mediante la
implementacin de Programas de control que exigen buenas prcticas de manejo e
higiene conjuntamente con la aplicacin de test serolgicos de rutina y polticas de
sacrificio (Lutful Kabir, 2010).
Tambin en los pases latinoamericanos los progresos y mejoras en el manejo y la
nutricin avcola que se han implementado en los ltimos veinte aos han reducido la
prevalencia de la tifosis y la paratifosis. A pesar de esto Salmonella Gallinarum contina
siendo una causa constante de infecciones con tifosis aviar en aves de distinto tipo y su
control ha resultado dificultoso. Asimismo S. Enteritidis, S. Tiphymurium y actualmente
Introduccin general
tambin S. Heidelberg presentan alta prevalencia y resultan un serio problema de salud

pblica (SENASA, 2002).
En Latinoamrica S. enterica serovar Enteritidis encabeza la lista de patgenos
emergentes y re-emergentes causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
(ETA) en las ltimas dos dcadas. En el perodo 1995-1999, Salmonella fue el segundo
agente causal ms importante (35.3 %) de brotes de ETA en Amrica Latina y el Caribe.
Durante el perodo 1993-2002 se registraron en Latinoamrica 1256 brotes de
salmonelosis, que afectaron a 48334 personas y produjeron 15 muertes. El 29.2 % de los
casos fue consecuencia del consumo de huevos o productos derivados y el 9.4 %, fue
debido a la ingesta de carne de aves. El 9.8 % de los brotes fue causado por Salmonella
Enteritidis y en el 85 % de los casos no se pudo determinar la serovariedad implicada
(Fuente: Sistema de Informacin Regional para la Vigilancia Epidemiolgica de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos SIRVETA).
En Argentina durante el perodo 1993-2002 ocurrieron 60 brotes de salmonelosis que
produjeron 889 enfermos y 4 muertos. Segn un informe del Boletn epidemiolgico
Nacional publicado en 2006 las 5 serovariedades prevalentes en muestras de origen
humano en Argentina en el perodo 2004-2005 fueron: S. Enteritidis (36.0 %), S.
Typhimurium (20.5 %), S. Infantis (8.7 %), S. Newport (5.3 %) y S. Agona (4.9 %);
siguiendo la misma tendencia que en aos anteriores.
La mortalidad por salmonelosis en pases desarrollados en poco frecuente (< 5 %) sin
embargo en pases en desarrollo con mayor frecuencia de enfermedades invasivas la
mortalidad se encuentra entre 18 y 24 % (Chimalizeni y col., 2010).
3.2 Mecanismos de patognesis de Salmonella

Para el desarrollo de la enfermedad es necesario que la bacteriana se localice en un
ambiente adecuado, se adhiera, invada, se replique, resista a los mecanismos de
defensa del hospedador y le ocasione dao.
La adhesin al epitelio intestinal es un importante factor de virulencia ya que permite a
la bacteria resistir al fluido luminal. Salmonella presenta al menos cuatro tipos de
fimbrias, con diferente especificidad de unin a superficies celulares y no celulares, que
le permiten conseguir contacto estrecho con los enterocitos. La fimbria tipo 1 (Fim) se
une a receptores -D-manosa en las clulas, la fimbria larga polar (Lpf) se une a clulas
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Introduccin general
de las Placas de Peyer, mientras que la fimbria codificada por plsmidos (Pef) y la fimbria
agregativa delgada (Curli) le permiten su adhesin a clulas epiteliales intestinales. La
fibra agregativa delgada interviene tambin en la autoagregacin, que aumenta la
supervivencia de la bacteria en presencia de sustancias inhibitorias. Adems Salmonella
presenta molculas de adhesin tipo-lectina que se unen a receptores glicoconjugados
Gal (13) Gal NAc de los enterocitos (Bhunia, 2008). Estos sistemas de adhesin se
expresan cuando
las condiciones fsico-qumicas, tales como la temperatura, pH,
osmolaridad y disponibilidad de nutrientes en el hospedador son las adecuadas

(Figueroa Ochoa y Verdugo, 2005).
Figura 2: Diagrama esquemtico mostrando la invasin de Salmonella a travs de la

mucosa intestinal. La bacteria puede traslocar por 3 vas: (1) induciendo una alteracin
en los enterocitos que la engloban dentro de vacuolas que permiten su multiplicacin,
(2) a travs de clulas M que le permiten arribar a una localizacin subcelular o (3) por
clulas dendrticas que la transportan desde el lumen a una localizacin subcelular.
Tambin puede multiplicarse dentro de clulas fagocticas como macrfagos,
neutrfilos o clulas dendrticas, induciendo apoptosis y promoviendo la inflamacin.
Las clulas dendrticas son responsables de la diseminacin sistmica de la bacteria a
ndulos linfticos, hgado y bazo. (Adaptado de Bhunia AK, 2008, Foodborne Microbial
Pathogens, Ed Springer).
Introduccin general
La invasin de Salmonella a travs de la mucosa intestinal ocurre preferentemente a

travs de las clulas M, rpidamente las destruye y luego infecta a clulas absortivas
vecinas travs de los dominios baso-laterales y a linfocitos subyacentes. Las clulas
dendrticas pueden ser tambin un medio de internalizacin de este patgeno.
Finalmente es capaz de invadir a travs de la superficie apical de clulas absortivas del
epitelio intestinal. En este caso la invasin implica desaparicin de las microvellosidades
de la clula epitelial y la induccin de cambios en el citoesqueleto de actina que causan
el enrulamiento (ruffling) de la superficie celular y la inclusin del patgeno en vacuolas
(Figura 2). El proceso de internalizacin de Salmonella esta mediado por el sistema de
secrecin tipo III codificado por la isla de patogenicidad 1 (SP1-1). A travs de este
sistema el patgeno enva numerosos efectores a la clula epitelial que inducen cambios
en las mismas al interferir en sus vas de sealizacin (Figueroa Ochoa y Verdugo, 2005).
Luego de la invasin Salmonella es capaz de sobrevivir y multiplicarse dentro del
compartimento vacuolar de las clulas hospedadoras y utilizarlas para diseminarse por
la superficie de la mucosa e iniciar una infeccin sistmica. Los mecanismos implicados
en estos procesos estn mediados por el sistema de secrecin tipo III codificado por la
isla de patogenicidad 2 (SPI-2) (Brumell y col., 2000).
La estrategia infectiva de Salmonella incluye su interaccin con clulas del sistema
inmune, estando adaptada a sobrevivir y replicarse en el compartimento vacuolar de las
mismas. Por este motivo presenta mecanismos de virulencia sumamente complejos. Es
la nica bacteria descripta que contiene dos sistemas de secrecin tipo III. Se estima,
adems, que el 4 % del cromosoma de S. Typhimurium (alrededor de 200 genes) son
factores de virulencia. Estos factores incluyen cinco islas de patogenicidad, numerosas
islotes de patogenicidad menores y al menos 1 plsmido de virulencia (Salama y Falow,
1999). Cabe destacar que si bien en los ltimos aos se ha avanzado en el conocimiento
de los mecanismos moleculares implicados en la patogenia de esta bacteria y sus vas de
regulacin (Figueroa Ochoa y Verdugo, 2005; Valdez y col., 2009), debido a su
importancia, los estudios continan siendo de inters en la actualidad.
3.3 Mtodos de control de salmonelosis en aves

Un amplio rango de intervenciones se han sugerido para reducir el riesgo de
contaminacin de Salmonella en produccin avcola, incluyendo la seleccin de
29
30
Introduccin general
variedades de aves resistentes a la colonizacin, tratamientos para reducir la

transmisin vertical, prcticas de sanidad para prevenir la contaminacin en los
criaderos y durante el transporte, la eliminacin de patgenos en alimento y agua de
bebida, el uso de aditivos en agua y alimento para crear medioambientes adversos para
la colonizacin por el patgeno y tratamientos biolgicos que inactivan directa o
indirectamente al patgeno. Para lograr una exitosa reduccin del patgeno en la
industria avcola es necesaria una combinacin de estas estrategias (Cox y Pavic, 2010).
Los principales vectores de Salmonella en aves son animales invasores, las camas, las
excreciones, el agua y el alimento.
Artrpodos y roedores pueden actuar como transmisores de enteropatgenos.
Salmonella se halla distribuida en moscas y en menor medida en escarabajos y caros. Si
bien estos animales han sido implicados como vectores de este patgeno, existen pocos
estudios a campo que indiquen la relevancia de esta forma de transmisin en el
contexto de la produccin (Wales y col., 2010). La aplicacin de programas de control de
insectos y roedores sumados a una buena higiene de las instalaciones son
recomendadas para reducir esta forma de transmisin.
Respecto a las camas, el material del lecho puede ser tratado con distintos productos
disponibles en el mercado que reducen la contaminacin con patgenos. Ejemplos de
estos productos son: PLT (Jones-Hamilton Products, Walbridge, OH) constituido por un
cido granular deshidratado de bisulfato de sodio (Line, 2002); Poultry Guard (Oil Drip
Company, Chicago, IL) un material arcilloso granular impregnado con cido sulfrico
utilizado para contrarrestar la produccin de amonio bajando el pH de las camas
(Vicente y col., 2007), SoftAcidTM (Borregaard Lignotech, Rothschild, WI) una mezcla de
lignosulfonato de sodio, cido frmico y cido propinico (Garrido y col., 2004),
Microtreat P (Agtech Products, Waukesha, WI) un sistema biolgico conteniendo
bacterias que controlan la descomposicin de los desechos de las camas (Wiard y col.,
2001), entre otros.
El agua muchas veces proviene de fuentes naturales y no es de calidad potable. Se
sugiere su tratamiento con agentes qumicos, filtracin u smosis reversa para asegurar
que est libre de patgenos. Existen asimismo acidificantes comerciales para el agua que
contienen cidos orgnicos que han mostrado ser efectivos en el control de
Introduccin general
enteropatgenos y que reducen la formacin de biofilms sin afectar negativamente a las

aves (Chaveerach y col., 2004).
El alimento es particularmente un punto crtico de control de Salmonella en la
produccin avcola, siendo uno de los mayor vehculos de transmisin de este patgeno
(Cox y Pavic, 2010). Los mtodos de control de microorganismos en el pienso sern
explicados ms adelante (ver seccin 4.2).
Otra medida de control preventivo es la vacunacin, esta es una prctica difundida para
el control de virus y patgenos en aves. Existen en el mercado vacunas ms eficaces para
combatir las serovariedades de Salmonella Pullorum y Gallinarum que serovariedades
no especficas de hospedador que frecuentemente ocasionan intoxicaciones
alimentarias (Barrow, 2007). Entre estas ltimas el desarrollo de vacunas se ha limitado
a las serovariedades prevalentes, tales como Enteritidis y Typhimurium (Cox y Pavic,
2010). Para combatir estas ltimas se han desarrollado tanto vacunas inactivadas como
vivas atenuadas, aunque las primeras son ms utilizadas por los productores por ser
consideradas ms seguras (Barrow, 2007). Las vacunas inactivadas son comnmente
empleadas contra ms de una serovariedad y actan confiriendo inmunidad humoral.
Mientras que las vacunas vivas son ms efectivas en estimulacin de inmunidad celular.
Por esto se recomienda la utilizacin de los 2 tipos de vacunacin combinados para
lograr tratamientos preventivos ms efectivos. El uso de vacunas es una herramienta til
para el control de la infeccin para reproductoras o aves de postura mientras que su uso
es menos frecuente en pollos parrilleros (Soncini, 2011).
Otra estrategia para el control de Salmonella es el uso de fagos (virus que infectan
especficamente a bacterias). Las ventajas de los fagos como agentes teraputicos es
que son especficos, efectivos en la destruccin de la bacteria blanco, resisten
naturalmente en el medioambiente y autolimitan su replicacin. Se ha demostrado que
son efectivos en la reduccin de la carga de Salmonella en pollos vivos (Higgins y col.,
2005; Bielke y col., 2007). La principal limitacin para la aplicacin de este tipo de
terapia es el temor a la emergencia de mutantes insensible a los bacterifagos. Sin
embargo se ha postulado que a diferencia de lo que ocurre con antibiticos, los fagos
evolucionan constantemente para evadir las defensas de su hospedador (Atterbury y
col., 2007). La fagoterapia es una estrategia de control prometedora aunque an se
encuentra en etapa de desarrollo.
31
32
Introduccin general
Tambin la inmunoterapia, es decir la utilizacin de anticuerpos especficos para

controlar microorganismos, ha sido propuesta para el control de Salmonella sp. en aves.
La administracin de anticuerpos a pollos, que reconocen una o ms serovariedades de
Salmonella, provee inmunidad pasiva y reduce as la probabilidad de colonizacin. La
inmunizacin de pollos utilizando determinados antgenos lleva no solo a la produccin
de anticuerpos circulantes en sangre, sino tambin a la acumulacin de anticuerpos IgY
en la yema de los huevos. Estos anticuerpos pueden ser extrados de la yema y utilizados
con fines profilcticos y en menor medida teraputicos (Rahimi y col., 2007). Soluciones
acuosas y polvos formulados por su deshidratacin conteniendo anticuerpos IgY reducen
la carga de S. Enteritidis en gallinas ponedoras (Berghaman y col., 2005; Rahimi y col.
2007).
Cabe destacar que entre los mtodos de control de salmonelosis en aves, la alternativa
que est cobrando cada vez mayor importancia para el tratamiento de este patgeno, es
el uso de probiticos.
3.4 Probiticos para el control de Salmonella en aves

Existen numerosos estudios que demuestran el efecto protector de los probiticos
contra la colonizacin intestinal y daos causados por Salmonella tanto sobre clulas en
cultivo in vitro como in vivo.
Experimentos in vitro han demostrado que la adhesin y/o la invasin de Salmonella sp.
a clulas epiteliales intestinales puede ser reducida por BAL (Coconnier y col., 1993;
Bernet y col., 1994; Wagner y col., 2002; Tsai y col., 2005; Golowczyc y col., 2007; Lin y
col., 2008a; Dhanani y Gaudana, 2011; Yu y col., 2011) y levaduras (Zbinden y col., 1999;
Martins y col., 2010). Este efecto se ha observado tanto al adicionar los probiticos a la
monocapa previamente a la infeccin (efecto barrera) como cuando se coincuba el
probitico con el patgeno y luego se adicionan conjuntamente a la monocapa, mientras
que el efecto es menor o inexistente cuando el probitico se adiciona luego de la
infeccin (reemplazo) (Dhanani y Gaudana, 2011; Yu y col., 2011).
La proteccin de la asociacin de Salmonella a cultivos celulares por probiticos se ha
atribuido fundamentalmente al impedimento fsico no especfico de la interaccin de los
patgenos con receptores de los enterocitos (Coconnier y col., 1993; Martins y col.,
2010). Se ha demostrado adems que esta interferencia puede reducir o inhibir la
Introduccin general
expresin de genes implicados en la internalizacin del patgeno (Martins y col., 2010).

Tambin se han sugerido otros mecanismos tales como la competencia por los
nutrientes, la modulacin de la respuesta inmune y la produccin de cidos orgnicos y
otros compuestos antimicrobianos como las bacteriocinas (Yu y col., 2011). Respecto a
esto ltimo, se ha reportado que la incubacin de Salmonella sp. en sobrenadantes de
cultivos de lactobacilos previamente a la infeccin reduce su capacidad de invadir
cultivos celulares (Hudault y col., 1997; Golowczyc y col., 2007; Lin y col., 2008a). El
cido lctico est implicado en este efecto, aunque se ha demostrado que algunas cepas
producen otros metabolitos que interfieren en la invasin de Salmonella (Makras y col.,
2006). Entre ellos la protena de capa-S, producida por Lactobacillus kefir secretada al
medio de cultivo, puede enmascarar la superficie del patgeno evitando su interaccin
con los enterocitos (Golowczyc y col., 2007).
Estudios in vivo han demostrado el efecto protector de numerosos probiticos
comerciales sobre la colonizacin de ciegos intestinales por Salmonella. Como ejemplos
se pueden citar: Aviguard de composicin indefinida, LevucellSC compuesto por
Saccharomyces cerevisiae, Bactocell compuesto por Pediococcus acidilactici (Al-Zenki y
col., 2009), FM-B11 (Ivesco, LLC, Springdale, AR) constituido por once BAL (Higgins y col.,
2008), Toyicerin constituido por esporas de Bacillus cereus (Vila y col., 2009), Broilac de
composicin indefinida (Nuotio y col., 1992), Biomin compuesto por cepas de
Enterococcus sp., Pediococcus sp., Bifidobacterium sp. y Lactobacillus sp. (Sterzo y col.,
2007).
Tambin se ha reportado que algunos probiticos son capaces de prevenir la invasin de
este patgeno a rganos internos. Estrada y col. (2009) demostraron la capacidad de un
probitico de composicin definida de disminuir la invasin de Salmonella Enteritidis a
bazo e hgado y de reducir su transmisin horizontal en aves de la raza Leghorn.
Revolledo y col. (2009) hallaron asimismo que el probitico comercial Aviguard es capaz
de reducir la invasin de Salmonella Typhimurium a bazo e hgado, mientras que Nuotio
y col. (1992) reportaron este mismo efecto para el probitico comercial Broilac en pollos
infectados con S. Enteritidis.
33
34
Introduccin general
4. Uso de antimicrobianos en la conservacin de pienso para aves
4.1 Contaminacin de pienso

El alimento es el principal componente del total de costos de la produccin de carne y
huevos en la industria aviaria. Es asimismo el principal agente mediante el cual las aves
son expuestas a una amplia variedad de factores a travs del tracto gastrointestinal.
El pienso para aves puede servir como sustrato para el desarrollo de una amplia
variedad de microorganismos. Algunos de estos microorganismos provienen de la
materia prima, sobre todo de los cereales, mientras que otros se introducen durante la
elaboracin y el almacenamiento del alimento.
La diversidad microbiolgica del pienso es variada dependiendo del tipo de alimento, los
tratamientos de procesado y las condiciones de almacenamiento. Si bien algunas
bacterias pueden encontrarse en el pienso para aves, debido a su resistencia a bajas
actividades acuosas los hongos son los principales contaminantes del mismo. Algunos
hongos se adaptan a la baja cantidad de humedad disponible y crecen activamente en el
alimento, mientras que otros producen esporas o entran en estado de latencia hasta
que la humedad es suficientemente alta para su proliferacin.
El almacenamiento del alimento en los criaderos bajo condiciones no adecuadas, tales
como falta de ventilacin y temperatura y humedad elevadas, an por perodos de
tiempo breves puede conducir a la rpida proliferacin de hongos filamentosos
contaminantes (Labuda y Taninov , 2006).
Los hongos pueden afectar negativamente la calidad del alimento mediante la alteracin
de sus propiedades nutricionales y la generacin de dao fsico. Por otra parte el
consumo de alimentos contaminados por hongos puede ocasionar en las aves lesiones
con distinta severidad, dependiendo del estado inmunolgico del ave y de la especie
fngica, produciendo en algunos casos efectos histopatolgicos significativos y atrofia de
los principales rganos del sistema inmune, aumentando as la susceptibilidad a contraer
enfermedades (Rochette y col., 2003). Si bien los hongos en s mismos pueden ser
causantes de enfermedades, los mayores daos son ocasionados por las toxinas que
producen. Las micotoxinas causan importantes prdidas econmicas en la industria
avcola reduciendo la tasa de crecimiento, los porcentajes de nacimiento, la eficiencia
alimentaria y la inmunidad contra enfermedades (Rawal y col., 2010). Se han reportado
Introduccin general
prdidas millonarias debidas a la contaminacin por micotoxinas, as como tambin

prdidas monetarias adicionales en esfuerzos por reducir la contaminacin (CAST, 2003).
El problema de las toxinas fngicas no slo incide en la economa de la produccin
avcola, sino que residuos de micotoxinas consumidas por animales pueden aparecer en
los productos derivados de los mismos destinados al consumo humano. La ingesta de
micotoxinas en humanos puede causar desde depresin del sistema inmunolgico,
irritacin y alergias hasta severos problemas hepticos e incluso pueden tener efecto
hepatocarcinognico (Dersjant-Li y col., 2003).
4.2 Mtodos de control de microorganismos en el pienso

Diversas estrategias son llevadas a cabo con el fin de controlar la contaminacin fngica
y bacteriana del alimento para aves. Entre los mtodos fsicos se incluyen el secado
rpido para disminuir la disponibilidad de agua, el almacenamiento por perodos breves
de tiempo, el tratamiento trmico y las radiaciones. En particular el tratamiento trmico
que se lleva cabo durante la extrusin o peletizacin del alimento, a temperaturas entre
70 y 90 C, es un mtodo efectivo para reducir los niveles de patgenos y desnaturalizar
micotoxinas (Ekperigin y col., 1990; Buser y Abbas, 2002). La radiacin ionizante tambin
ha sido investigada como mtodo para disminuir la carga microbiana del alimento, sin
embargo el nivel de radiacin requerido para lograr efectividad pueden destruir la
tiamina y la riboflavina as como algunos amino cidos, afectando negativamente la
calidad del alimento (Maciorowski y col., 2004). Tambin se ha propuesto el uso de
radiacin ultravioleta para eliminar hongos e inactivar micotoxinas previamente al
almacenamiento del alimento (Maciorowski y col., 2007).
En el pasado, los antibiticos eran ampliamente utilizados como aditivos en alimentos
con la finalidad de promover el crecimiento y reducir su carga microbiana. Sin embargo,
debido a su implicancia en la diseminacin de genes de resistencia, el uso de profilctico
de antibiticos ha sido prohibido en Australia, Estados Unidos y Europa. Como
alternativas de conservantes qumicos para el control de microorganismos en alimentos
para aves se han propuesto diversas sustancias, tales como cidos orgnicos, cidos
minerales, isopropil alcohol, aldehdos, trisodio fosfato, clorato, 2-nitrofenol (Doyle y
Erickson, 2006; Maciorowski y col., 2007). Las principales restricciones para la
aplicabilidad de compuestos es que no deben ser corrosivos ni daar los equipos
35
36
Introduccin general
empleados para producir el alimento, no deben tener efectos negativos en la salud o

crecimiento del animal y deben ser seguros para el hombre (Doyle y Erickson, 2006).
Bajo estas limitaciones los compuestos ms ampliamente empleados a nivel mundial son
los cidos orgnicos, entre ellos los cidos benzoico, srbico, nitroso, sulfuroso, actico y
propinico; o menos frecuentemente sus esteres (Pitt y Hocking, 2009). Existen en el
mercado numerosos aditivos comerciales a base de cidos orgnicos. Se presentan
algunos como ejemplo en la Tabla 2.
Tabla 2: Aditivos comerciales a base de cidos orgnicos utilizados en la preservacin
de alimentos para aves.
Nombre comercial
Informacin general
Referencias
Adimix C
(INVE Nutri-Ad,
Belgium)
Sal sdica de cido n-butrico disponible en

forma de polvo o microcapsulas
Van
Immerseel y
col. (2005)
SalcurbTM
Mezcla de cidos orgnicos (propinico y
(Kemin, Des Moines, benzoico) y formaldehido
IO)
Pumfrey y
Nelson (1991)
GalliacidTM
(Jefo, Quebec,
Canad)
Triglicrido encapsulado con cidos

orgnicos (cido fumrico y frmico, sales de
propionato y el sorbato) diseado para su
liberacin intestinal
Van
Immerseel y
col. (2005)
SalKilTM
(KiotechAgil,
Reading, UK)
Es una combinacin de cidos carboxlicos y

sus sales de amonio en un soporte nico que
ofrece proteccin contra la
contaminacin por enteropatgenos
Hinton y
Linton (1988)
El uso de estos compuestos se considera seguro y se hallan permitidos. Sin embargo

recientemente se ha descripto la adquisicin de resistencia por hongos y levaduras a
algunos cidos empleados como conservantes, tales como el srbico y el benzoico (Brul
y Coote, 1999; Loureiro, 2000; Sanglard, 2002). Se ha descripto que especies
pertenecientes a Penicillium sp., Saccharomyces sp. y Zygosaccharomyces sp. pueden
crecer en presencia de sorbato de potasio (Davidson, 2001) y que las especies de mohos
capaces de degradar sorbato se encuentran en aumento (Nielsen y de Boer, 2000).
Asimismo la levadura Zygosaccharomyces bailii presenta notable capacidad de resistir al
Introduccin general
cido benzoico, siendo capaz de crecer y fermentar licores de frutas de pH 3

conteniendo 800 mg/L de este cido. Tambin se han descripto aislados de Penicillium
roqueforti resistentes al cido benzoico (Nielsen y de Boer, 2000). Se ha reportado
tambin que la levadura Moniliella acetoabutans es tolerante al cido actico, pudiendo
crecer en presencia de 4 % y sobrevivir en presencia de 10 % de este cido (Pitt y
Hocking, 2009).
En base a la creciente documentacin sobre la aparicin de resistencia y dada la presin
pblica por la reduccin en el uso de conservantes qumicos y aditivos en alimentacin
humana y animal se ha previsto que el uso de algunos conservantes actualmente
aceptados podra ser restringido en corto plazo (Brul y Coote, 1999).
Esto ha impulsado el inters en la biopreservacin de alimentos, es decir, la
preservacin de alimentos empleando sustancias naturales. Recientemente se han
desarrollado numerosos antimicrobianos naturales de distintos orgenes, incluyendo
compuestos animales como lisozima, lactoferrina, quitosano, defensinas y pleurocidina;
productos derivados de plantas como saponinas, flavonoides, aceites esenciales y
fitoalexinas; y metabolitos microbianos, tales como bacteriocinas, perxido de
hidrgeno y cidos orgnicos (Tiwari y col., 2009). La biopreservacin, asimismo
contempla el uso de microorganismos, principalmente bacterias cido lcticas con una
larga historia de uso seguro, para extender la vida til de los alimentos o mejorar su
seguridad (Garrote y col., 2010b).
4.3 Uso de bacterias cido lcticas y sus metabolitos como conservantes de pienso
Dado que las bacterias cido lcticas (BAL) prosperan en medioambientes ricos en
nutrientes, se hallan presentes naturalmente en numerosos alimentos. Las mismas han
sido utilizadas por siglos para mejorar el almacenamiento de alimentos y en el ensilado
de diferentes cultivos para alimentacin animal. Cepas especficas de BAL son adems
frecuentemente incluidas en productos probiticos en los que ejercen efectos benficos
para el consumidor. Los alimentos fermentados han sido producidos desde tiempos
antiguos, an cuando la implicancia de los microorganismos en el proceso no fue
comprendida hasta mitad del siglo XIX con el desarrollo de la microbiologa (Caplice y
Fitzgerald, 1999). La fermentacin por BAL es esencial, por ejemplo, para la produccin
de queso, yogurt, salsas fermentadas y chucrut. Hoy en da el principal objetivo de la
37
38
Introduccin general
adicin de BAL no es la conservacin en s misma, sino otorgarle al alimento

caractersticas deseables tales como aroma o textura. En la produccin de alimentos
animales la fermentacin por BAL es probablemente el proceso ms importante en el
ensilado (McDonald y col., 1991).
Debido que las BAL se encuentran naturalmente en numerosos sistemas alimentarios y
han sido parte de la dieta humana por siglos, pueden ser consideradas microorganismos
seguros para el consumidor. Las mismas tienen potencial para extender su uso en
biopreservacin de alimentos para animales.
Las bacterias pueden proteger el alimento de microorganismos deteriorantes por
competencia por los nutrientes o por la produccin de metabolitos antagnicos
(Schillinger y col., 1996). El principal efecto de las BAL en la preservacin es mediante la
produccin de cido lctico, lo que baja el pH inhibiendo as a numerosos
microorganismos (Brul y Coote, 1999). Adems de la produccin de cido lctico, las BAL
producen otras sustancias antimicrobianas, tales como cido actico, etanol, perxido
de hidrgeno, diacetilo, reutenina, reutericiclina y bacteriocinas, que juegan un
importante rol en su capacidad de actuar como preservantes (Lindgren y Dobrogosz,
1991; Caplice y Fitzgerald, 1999). Se han descripto asimismo numerosos compuestos de
bajo peso molecular producidos por BAL que presentan actividad antifngica (Tabla 3).
Tabla 3: Compuestos qumicos de bajo peso molecular antifngicos producidos por
bacterias cido lcticas
Compuesto identificado
Cepa productora
Referencia
cido 4- hidroxi-fenillctico
cido 3-fenillctico
Lactobacillus plantarum
21B
Lavermicocca y col.
(2000)
cido 3-hidroxidecanoico
cido 3-hidroxidodecanoico
cido 3-hidroxitetradecanoic
cido 3-hidroxi-5-cis-dodecenoico
MiLAB14
Sjgren y col. ( 2003)
ciclo (Gly-Leu)
metilidantoina
mevalonolactona
VTT E-78076
Niku-Paavola y col.
(1999)
cidos caproico, propinico,

butrco, actico, frmico y
n-valrico
Lactobacillus
sanfranciscensis CB1
Corsetti y col. (1998)
Peptido, cido fenillctico,

ciclo(Phe-Pro), ciclo(Phe- OH-Pro),
reuterina
Lactobacillus coryniformis
Si3
Magnusson y col.
(2003), Magnusson y
Schnner (2001)
Introduccin general
Las BAL tambin pueden producir compuestos proteicos (Gourama y Bullerman, 1997;
Okkers y col., 1999; Magnusson y Schnrer, 2001) y sustancias an no caracterizadas
qumicamente (Makanjuola y Springham, 1992; Roy y col., 1996; Florianowicz, 2001;
Laitila y col., 2002; De Muynck y col., 2004 Schwenninger y col., 2005; Hatew y col. 2011)
que presentan amplia capacidad antifngica.
La aplicacin de metabolitos producidos por BAL ha sido analizada para la conservacin
de productos panificados (Laverimocca y col., 2003; Valerio y col., 2008; Gerz y col.,
2009), carnes (Kostrzynska y Bachand, 2006; Vsquez y col., 2009) productos lcteos
(Lee y col., 2008) y vegetales (Sathe y col., 2007). Su utilidad en la conservacin de
alimentos animales ha sido sugerida por numerosos autores (Schnner y Magnusson,
2005; Strm, 2005; Parada y col., 2007; Hatew y col., 2011). Sin embargo los estudios
sobre la aplicacin de BAL o sus metabolitos como ingredientes en la conservacin de
pienso para aves se limitan a los trabajos de Murry y col. (2004) y Heres y col. (2003) que
sugieren que la adicin de estas cepas de BAL a alimento para aves podra ser til para
controlar el crecimiento de enteropatgenos en los mismos.
La adicin de BAL o sus metabolitos a alimentos para aves podra ser adems
interesante para el control de hongos y micotoxinas en los mismos. Se ha demostrado
que algunas BAL son capaces de inhibir la produccin de micotoxinas a travs de la
inhibicin del crecimiento del hongo y de la produccin de metabolitos especficos (Dali
y col., 2010). Asimismo se ha encontrado que un gran nmero de BAL presenta
capacidad de capturar aflatoxinas en la superficie celular pudiendo actuar de esta forma
como descontaminantes de la toxina (Garrote y col., 2010b).
5. El kefir
5.1 Descripcin del producto
El kefir es una bebida lctea fermentada artesanal viscosa, de sabor cido, levemente
efervescente y con un aroma caracterstico (Garrote y col., 2001). Es producida por
fermentacin de leche con grnulos de kefir. Estos son masas gelatinosas, irregulares,
color blanco o ligeramente amarillento, y consistencia elstica. Su tamao es variable
oscilando desde pocos milmetros a 2 o 3 centmetros de dimetro y su forma semejante
a las inflorescencias de coliflor (Figura 3).
39
40
Introduccin general
Figura 3: Aspecto de los grnulos de kefir.

En los grnulos, se encuentran inmersas bacterias cido lcticas (108-109 UFC/g de
grnulo), levaduras (107-108 UFC/g de grnulo) y bacterias cido acticas (105-106 UFC/g
de grnulo) (Koroleva 1991; Garrote y col., 2001). Cuando los grnulos de kefir son
adicionados a la leche, parte de los microorganismos pasan a ella donde se multiplican y
producen metabolitos que otorgarn a la leche fermentada sus caractersticas qumicas
y fsicas particulares. La composicin del kefir, as como sus caractersticas
organolpticas estn sujetas a variaciones regionales. Est documentado que stas
variaciones pueden deberse a factores tales como el origen y almacenamiento de los
grnulos de kefir, el tipo leche utilizada, as como a las condiciones de elaboracin del
producto siendo relevantes la relacin grnulo-leche y la temperatura de fermentacin
(Witthuhn y col., 2005; Latorre Garca y col., 2007).
No se conocen los mecanismos por los cuales se originaron los grnulos de kefir
(Koroleva, 1988). Estos se forman solamente a partir de otros grnulos preexistentes y
en el laboratorio no ha sido posible formar un nuevo grnulo partiendo de la asociacin
de cepas aisladas de los mismos (Botazzi y col. 1994). Se cree que los grnulos se
originaron debido a prcticas de las tribus de la regin del Cucaso, quienes dejaban
fermentar la leche en odres hechos de estmago de animales donde la transportaban.
Sin llegar a consumir totalmente el producto, el saco era nuevamente recargado con
leche, repitiendo el proceso durante mucho tiempo. Esta prctica puede haber
permitido la reunin de los microorganismos y formacin de la asociacin simbitica
propia del kefir (Bottazi y Bianchi, 1980).
Introduccin general
La composicin microbiolgica del kefir es compleja y se han aislado una gran variedad
de microorganismos tanto de estos como de la leche fermentada (Tablas 4 y 5).
Tabla 4: Bacterias encontradas en los grnulos de kefir y leche fermentada. Adaptado
de Golowczyc (2008).
Lactobacilos
Lactobacillus kefir a,c,j,n,o,p,r, u, v
Lactobacillus kefiranofaciens l,n,p, u, v,w
Lactobacillus kefirgranum n
Lactobacillus parakefir n,o
Lactobacillus brevis g,h,p,r
Lactobacillus plantarum o,p
Lactobacillus helveticus a,b,h, v
Lactobacillus acidophilus g,p,r
Lactobacillus gasseri r
Lactobacillus delbrueckii a,h,p

Lactobacillus rhamnosus a,r
Lactobacillus casei h, v
Lactobacilli paracasei p
Lactobacillus fructivorans k
Lactobacillus hilgardii k
Lactobacillus fermentum r
Lactobacillus viridescens r
Lactobacillus crispatus s
Lactococos
Lactococcus lactis subsp. lactis a,c,e,f,g,h,k,o,r
Lactococcus lactis subsp. cremoris a,e,f
Estreptococos
Streptococcus thermophilus e,h
Streptococcus durans t
Enterococos
Enterococcus durans d*,e*
(descripta como Streptobacterium durans en ref. d; descripta como
Streptococcus durans en ref. e)
Leuconostoc
Leuconostoc sp. r
Leuconostoc mesenteroides a,b,g*,o, s, u, v
(descripta como Leuconostoc kefir en ref. g)
Bacterias cido acticas
Acetobacter sp. o
Acetobacter pasteurianus g
Otras bacterias
Bacillus sp. r
Bacillus subtilis g
Pseudomonas spp. u, v
Acetobacter aceti a,d
Micrococcus sp. r
Escherichia coli r, u
a Koroleva (1991) ; b Lin y col. (1999); c Pintado y col. (1996); d Rosi y Rossi
(1978); e Yksekdag y col. (2004); f Dousset y Caillet 1993; g Ottogalli y col.
(1973); h Simova y col. (2002); j Kandler y Kunath (1983); k Yoshida y
Toyoshima (1994); l Fujisawa y col. (1988); n Takizawa y col. (1994); o Garrote
y col. (2001); p Santos y col. (2003); r Angulo y col. (1993); s Garbers y col.
(2004); t Yuksekdag y col. (2004); u Chen y col. (2008); v Jianzhong y col.
(2009); w Magalhes y col. (2010)
41
42
Introduccin general
Tabla 5: Levaduras encontradas en los grnulos de kefir y leche fermentada. Adaptado

de Golowczyc (2008).
Kluyveromyces marxianus a,b,g,h,i,j,k,n,o,p,q

Kluyveromyces lactis
Saccharomyces sp. k
Saccharomyces cerevisiae a,d,e,g,j,m,n,o,q
Saccharomyces unisporus c,h,j,m
Saccharomyces exiguus l*
(descripta como Torolopsis holmii en ref. l)
Saccharomyces turicensis h,p
Saccharomyces delbrueckii d
Saccharomyces dairensis n
Saccharomyces humaticus
Torulaspora delbrueckii a,h,m
Brettanomyces anomalus h
Issatchenkia occidentalis j
Issatchenkia orientalis
Pichia fermentans b,m,n,p
Kazachstania exigua o
Kazachstania unispora o,q
Candida friedrichii n
Candida pseudotropicalis f
Candida tenuis f
Candida inconspicua g
Candida maris g
Candida holmii j,m
Candida lambica j
Candida tannotelerans e
Candida valida e
Candida albicans m
Candida kefyr a,j,n
a Koroleva (1991); b Lin y col. (1999); c Pintado y col. (1996); d Rosi y Rossi
(1978); e Dousset y Caillet (1993); f Ottogalli y col. (1973); g Simova y col.
(2002); h Wyder y col. (1997, 1999); i Yoshida y Toyoshima (1994); j Engel
y col. (1986); k Garrote y col. (2001); l Iwasawa y col. (1982); m Angulo y
col. (1993); n Rohm y col. (1992); Latorre Garcia y col (2007); o Jianzhong
y col. (2009); p Wang y col. (2008), q Magalhes y col. (2010)
El kefir se encuentra descripto en el Cdigo Alimentario Argentino, en el apartado de

Leches Fermentadas, como: Cultivo preparado a partir de gr nulos de kefir,
Lactobacillus kefir, especies del gnero Leuconostoc, Lactococcus y Acetobacter que
crecen en una estrecha relacin especfica. Los grnulos de kefir estn constituidos tanto
por levaduras fermentadoras de lactosa (Kluyveromyces marxianus) como levaduras no
fermentadoras de lactosa (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae y
Saccharomyces exigus).
Actualmente su consumo es popular en distintos pases del este europeo. En algunos de
estos pases, en EEUU y en Canad, su produccin alcanza escala industrial y se
comercializa en el mercado. En Argentina se elabora artesanalmente (Garrote, 2000).
Introduccin general
5.2 Propiedades funcionales

El kefir presenta propiedades benficas para la salud que se atribuyen a la presencia de
una microbiota compleja as como a sus productos metablicos. Dentro de estos
productos se pueden mencionar: cidos orgnicos, vitaminas (fundamentalmente del
grupo B), etanol, dixido de carbono, acetaldehdo, diacetilo, protenas de superficie de
algunos microorganismos que se liberan al medio (capa S), y un exopolisacrido (kefiran)
(Guzel-Seydim y col., 2011). Las propiedades funcionales y probiticas del kefir han sido
estudiadas por numerosos autores y se resumen a continuacin los hallazgos ms
relevantes.
Propiedades antimicrobianas. Garrote y col. (2000) estudiaron la actividad
antibacteriana del kefir, demostrando la capacidad inhibitoria de sobrenadantes de
leche fermentada contra bacterias Gram (+) y Gram (-). Otros autores tambin
demostraron actividades antibacterianas de sobrenadantes de productos fermentados
con kefir o con microorganismos aislados a partir de ellos (Brialy y col., 1995; Santos y
col., 2003; Yksekdag y col., 2004; Rodrigues y col., 2005). Kakisu y col. (2007) probaron
que el kefir disminuye la viabilidad y la germinacin de esporas de Bacillus cereus.
Tambin se demostr su actividad antifngica (Cevikbas y col., 1994; Ismaiel y col.,
2011). Las propiedades inhibitorias del kefir han sido asociadas fundamentalmente a su
contenido de cidos orgnicos (Garrote y col., 2000), aunque se ha sugerido que podran
estar involucradas otras molculas como perxido de hidrgeno, acetaldehdo, dixido
de carbono y bacteriocinas (Powell y col., 2007).
Antagonismo contra patgenos intestinales. Estudios in vitro sobre clulas epiteliales
intestinales han demostrado que microorganismos aislados de kefir poseen capacidad
de antagonizar el efecto de patgenos intestinales, tales como Escherichia coli Shigella
spp. y Salmonella spp. por distintos mecanismos.
Se ha probado que cuando Lactobacillus plantarum CIDCA 83114, aislado de kefir, es
incubado sobre cultivos de la lnea celular Hep-2 previene la unin E. coli
enterohemorrgica (EHEC) y minimiza las alteraciones causadas por el patgeno sobre
los enterocitos. Este efecto no es dependiente de la viabilidad del probitico y no puede
ser explicado por exclusin competitiva (Hugo y col., 2008). Estudios posteriores
demostraron que el antagonismo de esta cepa sobre la virulencia de E. coli se relaciona
43
44
Introduccin general
con su capacidad de inhibir los efectos citotxicos de la toxina Shiga 2 producida por
EHEC (Kakisu, 2010). Tambin se ha demostrado la capacidad de BAL (L. plantarum
83114 y Lactococcus lactis 8221) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae 8112 y
Kluyveromyces marxianus 8154) aislados de kefir de prevenir la invasin de Shigella
sonnei y Shigella flexneri a clulas en cultivo Hep-2 y de reducir los daos celulares
causados por el patgeno (Bolla, 2010; Kakisu, 2010). Cepas de Lactobacillus kefir son
tambin capaces de inhibir la adhesin e invasin de Salmonella enterica serovar.
Typhimurium a clulas Caco-2/TC7, a travs de la liberacin al medio de cultivo de
protenas de capa-S que interactan con estructuras de superficie del patgeno
(Golowczyc y col., 2007).
Modulacin de la respuesta inmune. Se ha propuesto que la modulacin del sistema
inmune sera uno de los mecanismos por los cuales las bacterias probiticas podran
ejercer sus efectos benficos para la salud del hospedador (Gill y Rutherfurd, 2001; De
Simone, 2005). Esto podra deberse a la actividad de los microorganismos por s mismos
(Cross, 2002) o a los pptidos bioactivos formados durante el proceso fermentativo y/o
digestivo, ya que se ha demostrado la actividad biolgica que presentan algunos de
estos pptidos, incluyendo la modulacin de la respuesta inmune en modelos animales
(Gill y col., 2000; LeBlanc y col., 2004). Adems, de acuerdo a la evidencia presentada en
los ltimos aos, los polisacridos presentes en el producto fermentado podran tener
implicancia en la modulacin de la respuesta inmune, habindose demostrado este
efecto para el kefiran (Vinderola y col., 2005, 2006b, 2006c; Medrano y col., 2011).
Inhibicin del crecimiento de tumores. Se ha comprobado que la ingesta oral de kefir
produce una reduccin del crecimiento de tumores en ratones, este efecto se ha
asociado con la induccin de procesos apoptticos de las clulas tumorales y con la
respuesta inmune inducida por componentes de la fraccin soluble de kefir,
particularmente polisacridos (Shiomi y col., 1982; Liu y col., 2002; Hlastan-Ribi y col.,
2005; De Moreno y col., 2007).
Metabolismo del colesterol. Grnulos de kefir de distintos orgenes pueden reducir los
niveles de colesterol presentes en leche hasta 62 % luego de su incubacin por 24 h a
20 C (Vujicic y col., 1992). Adems, Lactobacillus acidophilus CU 673 aislado de kefir
presenta capacidad de asimilar colesterol (Yoon y col., 1999) y Kluyveromyces marxianus
Introduccin general
es capaz de capturarlo en su pared celular (Yoshida y col., 2005). Sin embargo, estudios
in vivo arrojan resultados contradictorios respecto al efecto anticolesterolmico del
kefir. Liu y col. (2006) mostraron que el kefir, producido en leche de vaca y de soja,
disminuye la concentracin de colesterol y de triglicridos en suero en hmster. Sin
embargo Urdaneta y col. (2007) hallaron un pequeo incremento en los niveles de
colesterol y triacilglicerol en ratas que consumieron kefir. St-Onge y col. (2002)
describieron que el consumo de kefir en sujetos con hipercolesterolemia no produjo
efecto alguno sobre los niveles de colesterol total, y tampoco sobre la concentracin de
colesterol
LDL,
colesterol
HDL
triglicridos.
En
consecuencia,
el
efecto
hipocolesterolmico del kefir est en discusin.

Efecto antihipertensivo. Quirs y col. (2005) revelaron que kefir elaborado a partir de
leche de cabra inhibe a la enzima transformadora de la angiotensina (ACE) in vitro por la
presencia de pptidos de bajo peso molecular producidos por la protelisis durante la
fermentacin. Tambin se ha descripto que la administracin de kefiran reduce la
actividad ACE en suero en ratas (Maeda y col., 2004).
Reduccin de los sntomas de la intolerancia a la lactosa. La intolerancia a la lactosa es
la incapacidad de digerir completamente la lactosa asociada con una actividad
insuficiente de la en ima -galactosidasa intestinal. Este sndrome afecta a
aproximadamente un 75 % de la poblacin adulta mundial (Scrimshaw y col., 1988). El
kefir presenta actividad -galactosidasa que permanece cuando el producto es
consumido (De Vrese y col. 1992). Estudios llevados a cabo en humanos indican que el
consumo de kefir es capaz de mejorar la digestibilidad de la lactosa (Hertzler y Clancy,
2003).
5.3 Fermentacin de suero con grnulos de kefir

El uso de grnulos de kefir para fermentar suero de quesera fue propuesto por primera
vez por Rimada y Abraham (2001). Estos autores demostraron que los grnulos
aumentan su biomasa en suero desproteinizado, lo acidificaban, reducen su
concentracin de lactosa y liberan polisacridos al medio. Asimismo describieron que la
produccin de polisacridos y el crecimiento de los grnulos en este sustrato se ven
afectados por la temperatura de fermentacin.
45
46
Introduccin general
Recientemente Magalhes y col. (2010) evaluaron la estabilidad de la comunidad

microbiana de los grnulos de kefir al cambiar de sustrato de leche a suero,
determinando que no haba variaciones en la estructura externa del grnulo, analizada
por microscopa confocal empleando sondas fluorescentes, ni en los perfiles DGGE de
bacterias y levaduras. En trabajos ms recientes estos autores describieron que la
acidificacin y la produccin de cidos orgnicos y de compuestos voltiles son similares
en leche y suero fermentados con grnulos de kefir (Magalhes y col., 2011a, 2011b).
Tambin se ha estudiado el empleo de microorganismos aislados de kefir para fermentar
suero. Mazaheri Assadi y col. (2008) analizaron la composicin qumica y la aceptabilidad
de los productos obtenidos de la fermentacin de suero con 6 cepas de bacterias cido
lcticas y 3 cepas de levaduras aisladas de kefir, as como de cultivos mixtos combinando
estas cepas en distintas proporciones. Hallaron que el producto obtenido empleando
cepas aisladas presentaba baja acidez y efervescencia y no se asemejaba al kefir
tradicional, mientras que algunas combinaciones de cepas permitieron la obtencin de
productos con caractersticas organolpticas aceptables semejantes a las del suero
fermentado con grnulos de kefir.
Investigadores de los Departamentos de Qumica de la Universidad Aristotlica de
Thessalonoki y de la Universidad de Patras han trabajado intensamente en los ltimos 6
aos en el desarrollo de productos a base de suero por fermentacin con cultivos de
kefir. Estos autores utilizan como starters clulas prensadas hmedas de kefir que
obtienen cultivando kefir comercial en medios sintticos. La composicin microbiolgica
del kefir comercial que emplean y del starter que desarrollan no se halla caracterizada
en ninguna de sus publicaciones, estando las mismas sesgadas hacia la optimizacin de
procesos para obtener los productos deseados y la caracterizacin qumica de los
productos obtenidos.
Varias aplicaciones han sido propuestas para la valorizacin de suero empleando
grnulos de kefir. Entre ellas podemos mencionar la produccin de alcohol,
polisacridos, bebidas fermentadas, leudantes para panificacin, starters para la
produccin de queso y protenas celulares.
Alcohol. La conversin de lactosa en etanol ha sido una de las estrategias ms
consideradas como solucin para la bio-remediacin del suero y el permeado de suero.
Introduccin general
Se han propuesto para tal fin levaduras fermentadoras de lactosa como Kluyveromyces
marxianus y cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae (Guimares y col., 2010).
Por poseer levaduras fermentadoras de lactosa, se ha sugerido el empleo de grnulos de
kefir en la produccin de alcohol a partir de suero (Athanasiadis y col., 2002; Kourkoutas
y col., 2002; Koutinas y col., 2007). Kourkoutas y col. (2002) estudiaron la produccin de
etanol a partir de suero adicionado con 1% de extracto de pasas de uva y melasa
empleando levaduras de kefir inmovilizadas en un soporte de celulosa deslignificado. La
productividad y la concentracin de etanol y azcares residuales fueron aceptables para
la produccin de alcohol y bebidas alcohlicas a escala industrial. Se ha desarrollado
asimismo un proceso de escalado para la produccin de alcohol empleando un sistema
de bioreactores de lecho fijo (MFBT) de 12000 L (Koutinas y col., 2007).
Polisacridos. Se ha sugerido el empleo de suero como sustrato para la obtencin de
kefiran. El kefiran es producido durante el crecimiento de los grnulos de kefir, parte del
mismo queda retenido en la matriz de los grnulos constituyendo un 8-10% de la misma
y otra parte es liberada al medio durante la fermentacin del suero. La produccin de
este EPS a partir de la lactosa presente en el suero ha sido caracterizada a distintas
temperaturas y empleando distintas concentraciones de grnulos de kefir, asimismo se
han desarrollado distintos mtodos para su obtencin (Rimada y Abraham 2001; 2003).
El uso de suero para la produccin de kefiran es una alternativa interesante, ya que se
ha demostrado que este EPS posee efectos benficos sobre la salud, es capaz de formar
geles cohesivos traslcidos y pelculas comestibles transparentes que podran emplearse
como aditivo o recubrimiento de alimentos (Shiomi y col., 1982; Murofushi y col., 1983;
Rodrigues y col., 2005; Vinderola y col., 2006a; Medrano y col. 2008, 2009, 2011;
Piermara y col., 2008; 2009; 2011).
Bebidas fermentadas. Athanasiadis y col. (2004) propusieron el desarrollo de una
bebida a partir de suero fermentado con microorganismos de kefir inmovilizados en
material celulsico o gluten. Asimismo Mazaheri Assadi y col. (2008) sugirieron el uso de
suero como sustrato para obtener una bebida por fermentacin con grnulos kefir o
microorganismos aislados a partir de ellos.
Agente leudante para panadera. Se ha sugerido el uso de kefir crecido en suero en
reemplazo de levadura para producir masa fermentada para pan a fin de mejorar el
47
48
Introduccin general
sabor, la textura y contribuir a prolongar su vida til mediante la produccin in situ de

compuestos antimicrobianos (Harta y col., 2004; Plessas y col., 2005; 2007).
Starters para la produccin de quesos. Se han realizado numerosos estudios con el fin
de desarrollar cultivos iniciadores para la obtencin de distintos tipos de quesos (duro,
feta y de suero) a partir de kefir empleando suero como sustrato (Kourkoutas y col.,
2006; Dimitrellou y col., 2007; 2009; Katechaki y col., 2008; 2009). Estos estudios
proponen la utilizacin de suero para aumentar la biomasa de microorganismos de kefir
y luego obtener starters por secado trmico o liofilizacin. Se ha reportado que el
empleo de estos cultivos starters aceleran la maduracin (Koutinas y col., 2010),
mejoran la calidad sensorial y el tiempo de conservacin de los quesos (Katechaki y col.,
2008; 2009; Dimitrellou y col., 2009; Koutinas y col., 2010).
Protena celular (en ingls: SCP). Paraskevopopoulou y col. (2003) desarrollaron un
sistema de produccin de SCP a partir de suero fermentado con microorganismos de
kefir. La biomasa obtenida present 53.9 % de protenas con propiedades emulsificantes
similares a protenas de soja pero con mayor capacidad espumante y gelificante.
Koutinas y col. (2005) llevaron a cabo estudio de escalado de este producto a escala
semi-industrial.
Introduccin general
Objetivos
Considerando que gran parte del suero es an desperdiciado se plantea la necesitad de
buscar alternativas para su aprovechamiento, siendo particularmente interesantes
aquellas que requieren baja inversin de manera de estar al alcance de pequeos y
medianos productores. En base a esto se propone el estudio de la fermentacin de
suero con grnulos o microorganismos de kefir a fin de obtener, a bajo costo, un
alimento funcional para aves que aumente el valor agregado del suero y aproveche sus
propiedades nutricionales y las probiticas del kefir.
Se plantean como objetivos especficos de este trabajo de tesis:
1- Estudiar la capacidad de grnulos o microorganismos de kefir para fermentar
suero de quesera y caracterizar los productos obtenidos desde el punto de vista
qumico y microbiolgico.
2- Determinar el efecto inhibitorio del suero fermentado contra patgenos

intestinales mediante ensayos in vitro.
3- Evaluar el antagonismo del suero fermentado sobre la adhesin e invasin de

Salmonella enterica serovar. Enteritidis en modelos in vitro e in vivo en pollos
parrilleros.
4- Analizar la potencialidad del suero fermentado como aditivo para prevenir el
riesgo de contaminacin fngica de alimento balanceado para pollos, as como
para constituir un vehculo de inclusin de microorganismos de kefir viables con
potencialidad probitica a la dieta de estos animales.
49
50
Introduccin general
Captulo 1: Caracterizacin de sueros

fermentados con grnulos o
microorganismos de ker
Captulo 1. Fermentacin de suero
51
INTRODUCCIN
El kefir se elabora artesanalmente por el agregado de grnulos de kefir a leche previamente
pasteurizada y enfriada a 20-25 C. Luego de un perodo de fermentacin de
aproximadamente 24 horas, los grnulos son removidos por filtracin y la bebida est lista
para el consumo.
Una alternativa a la utilizacin de grnulos para la produccin de kefir a gran escala consiste
en realizar fermentaciones consecutivas. La primera se lleva a cabo como se describi
anteriormente para obtener, luego de la remocin de los grnulos, un cultivo madre que
se adiciona a la leche para una segunda fermentacin (Simova y col., 2002). Otro mtodo
propuesto para la obtencin de productos con propiedades organolpticas aceptables se
basa en la preparacin con un cultivo mixto de cepas aisladas de kefir (Beshkova y col.,
2002; Kakisu y col., 2011).
El kefir puede elaborarse a partir de leche de cabra, oveja y vaca (Hayaloglu y col., 2011;
Wjtowski y col., 2003). Tambin se ha demostrado que los grnulos pueden utilizarse para
la fermentacin de otros sustratos, tales como leche de soja (Liu y Lin 2000; Kesenka y col.,
2011; Pourahmad y col., 2011), soluciones azucaradas (Silva y col., 2009) y suero (Rimada y
Abraham, 2001, 2003; Magalhes y col., 2010, 2011a, 2011b).
El suero de quesera es un sustrato interesante dado que presenta buenas propiedades
nutricionales y funcionales. La alternativa de fermentar suero con grnulos de kefir ha sido
explorada por varios autores tal como se describi en la introduccin general, sin embargo,
es escaso el conocimiento sobre la estabilidad de la microbiota de los grnulos en
fermentaciones sucesivas en suero y la caracterizacin microbiolgica de los productos
obtenidos al emplear starters alternativos. Este estudio es fundamental para la utilizacin
de microorganismos de kefir en la fermentacin de suero en procesos industriales.
Asimismo es interesante conocer en qu medida el suero fermentado presenta una
composicin microbiolgica semejante al kefir obtenido en leche, dado que la presencia de
bacterias cido lcticas y levaduras probiticas determina las propiedades beneficiosas para
la salud que se han asociado a su consumo.
52
OBJETIVOS
Estudiar la capacidad de grnulos o microorganismos de kefir para fermentar suero de
quesera y caracterizar los productos obtenidos desde el punto de vista qumico y
microbiolgico.
Objetivos particulares
Evaluar si los grnulos de kefir se conservan como starters al ser utilizados en sucesivas
fermentaciones de suero.
Analizar comparativamente los productos obtenidos de la fermentacin en leche y

suero con grnulos de kefir.
Caracterizar los productos obtenidos al variar el porcentaje de grnulos de kefir

inoculados, el tipo de suero y la temperatura de incubacin.
Analizar el empleo de starters alternativos a los grnulos de kefir para fermentar suero
y caracterizar los productos obtenidos.
53
MATERIALES Y MTODOS
1. Sueros de quesera y medios de cultivo
Se emplearon leche descremada comercial (Sancor S.A, Argentina) y tres tipos de sueros:
suero bovino en polvo donado por la empresa Lactogal S.A. (Portugal) reconstituido en agua
destilada (10 % p/v) y sueros lquidos de origen bovino y ovino provistos por Lacticnios Lda
(Portugal). Los medios de cultivo: Agua Peptonada Tamponada (APT) y Caldo Nutritivo
fueron provistos por Biokar Diagnostics (Beauvais, France), el medio Yeast Extract-glucosechloramphenicol (YGC) agar por Merck (D-64271 Darmstadt, Germany) y el medio De Man
Rogosa & Sharpe (MRS) agar por Difco (Detroit, USA). Todos los medios de cultivo, se
esterilizaron en autoclave a 120 C, durante 15 min. La composicin de estos medios de
cultivo y de otros formulados utilizados durante este estudio se detalla en el Apndice.
2. Obtencin de leche y suero fermentados con grnulos de kefir

Se utilizaron grnulos CIDCA AGK10 de la coleccin del Centro de Investigacin y Desarrollo
en Criotecnologa de Alimentos (CIDCA). Los mismos se adicionaron a suero o leche en
concentracin 1 % o 10 % p/v y se incubaron a 20 C, 30 C o 37 C durante 24 h. Luego de la
fermentacin los grnulos se separaron del producto fermentado por filtracin con un
colador plstico, se lavaron con agua destilada y se volvieron a colocar en suero o leche
para realizar una nueva fermentacin.
3. Obtencin de suero fermentado empleando otros cultivos iniciadores (starters)
3.1. Empleo de cultivos madre como starters

3.1.1 Cultivo madre en suero
Preparacin de cultivo madre en suero: los grnulos de kefir se sembraron al 10 % p/v en
suero y se incub durante 24 h a 20 C. El producto obtenido se denomin cultivo madre en
suero.
Preparacin de suero fermentado con cultivo madre en suero: el cultivo madre en suero se
adicion a suero fresco en una concentracin 10 % v/v y se incub a 20 C durante 24 h.
54
3.1.2 Cultivo madre en leche

Preparacin de cultivo madre en leche: Los grnulos de kefir se sembraron al 10 % p/v en
leche y se incub durante 24 h a 20 C. El producto obtenido se denomin cultivo madre en
leche.
Preparacin de suero fermentado con cultivo madre en leche: el cultivo madre en leche se
adicion a suero fresco en una concentracin 10 % v/v y se incub a 20 C durante 24 h.
3.2 Empleo de cepas aisladas de kefir como starters

Preparacin de suspensiones de cepas aisladas de kefir: se utilizaron las cepas Lactobacillus
plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA
8154. Los lactobacilos se cultivaron en caldo MRS y la levadura en caldo yeast peptone
dextrose (ver Apndice) durante 24 h a 30 C. Los cultivos se centrifugaron a 10000 x g
durante 15 min, se descartaron los sobrenadantes y los pellet se resuspendieron en PBS.
Esta operacin se repiti 2 veces a fin de eliminar por completo el medio de cultivo. Las
suspensiones de microorganismos en PBS fueron utilizadas como starters. La concentracin
de microorganismos viables de las suspensiones se calcul indirectamente midiendo la
densidad ptica a 600 nm. Para esto previamente se construyeron curvas de calibracin
DO600nm en funcin de la concentracin de microorganismos viables.
Preparacin de suero fermentado con cepas aisladas de kefir: el suero es esteriliz por
tindalizacin colocndose 3 veces a vapor fluente (100 C) durante 30 min con un intervalo
de 24 h entre cada vez. Las suspensiones de cepas aisladas de kefir se inocularon
individualmente o las 3 en forma conjunta en 100 ml de suero en cantidad necesaria para
obtener una concentracin final de cada cepa de 1 x 106 UFC/ml de suero. Inmediatamente
luego de la inoculacin se realizaron recuentos de microorganismos viables en MRS-agar
para bacterias cido lcticas y en YGC-agar para levaduras a fin de verificar que el inculo
haya sido el requerido para cada experimento. Luego el suero inoculado se incub durante
72 h a 30 C.
55
4. Aumento de biomasa de grnulos de kefir.

Luego de cada fermentacin los grnulos fueron removidos del medio por filtracin, lavados
con agua destilada y secados sobre un papel absorbente hasta peso constante. Luego
fueron pesados en una balanza analtica Precisa 205A (precisin 0.1 mg). El aumento de
biomasa de los grnulos fue expresado como:
Aumento de biomasa = (peso inicial peso final)/ peso inicial
5. Anlisis de la composicin qumica de los grnulos de kefir y productos fermentados
5.1.
Determinacin de humedad
El contenido de humedad de los grnulos de kefir y productos fermentados fue

determinado por secado a 103 2 C hasta peso constante de acuerdo a la Norma
Portuguesa (NP) 875 (1994).
5.2.
Determinacin de cenizas
La muestra se calent suavemente en la llama para vaporizar el agua y materiales voltiles.

Se llev a masa carbonosa en tringulo de pipas. Luego se inciner en una mufla a 550 C
hasta cenizas blancas y se determin el porcentaje de cenizas (Artculo 13.12, Metodologa
Analtica Oficial, Cdigo Alimentario Argentino).
5.3.
Anlisis de minerales
La muestra fue incinerada a 550 C segn lo descripto en la seccin 5.2. Para la

determinacin de sodio, magnesio y potasio la misma fue luego digerida con cido
clorhdrico diluido, filtrada y diluida hasta el volumen adecuado de acuerdo al elemento a
cuantificar. Luego se analiz en un espectrofotmetro de absorcin atmica con llama de
aire acetileno. La absorbancia de la muestra fue comparada con una curva patrn del
elemento a fin de efectuar su cuantificacin (Norma ISO 6869, 2009).
La cuantificacin del fsforo se realiz de acuerdo a la Norma Portuguesa 874 (2000). La
muestra incinerada fue digerida con cido clorhdrico diluido y cido ntrico, se filtr y
56
diluy a concentracin adecuada para su medicin. La solucin cida conteniendo

ortofosfato se trat con un reactivo de Vanadato-Molibdato formndose un complejo
estable de color amarillo (cido vanadimolibdofosfrico), su absorbancia se ley a 430 nm.
Los valores fueron luego comparados con una curva patrn de concentraciones conocidas
de fsforo.
5.4.
Determinacin de azcares
La cantidad de azcares totales presentes en las muestras fue determinada mediante el

Mtodo de Antrona. Para la determinacin, en primer lugar se hidroliz una masa de
grnulo en una mezcla de agua destilada y cido clorhdrico 9:1. A continuacin se
colocaron en tubos de vidrio con tapa 200 l de las soluciones a ensayar y 2 ml de reactivo
de Antrona (ver Apndice), se agit por inversin y se llev a bao de agua a ebullicin
durante 15 minutos. Luego se enfri a temperatura ambiente y se dej en oscuridad
durante 30 minutos. Finalmente se ley la absorbancia a una longitud de onda de 620 nm
en un espectrofotmetro Henos Alpha & Beta (Thermo Spectronic, UK). En forma
simultnea se realiz una curva de calibracin, usando soluciones de glucosa de
concentracin conocida en un rango entre 0 y 400 g/ml. El mtodo se realiz de acuerdo a
Southgate (1991).
5.5. Determinacin del contenido de lactosa

La lactosa se cuantific por cromatografa lquida de alta presin segn el mtodo descripto
por Chavez-Servn y col. (2004). La separacin se efectu en una columna C18 5-m (150 x
4.0-mm), a una tasa de flujo de 1.0 ml/min con 1 % v/v de cido actico:acetonitrilo 95:5
como fase mvil. La deteccin fue realizada con un detector a 273 nm.
5.6.
Determinacin del contenido de protenas totales
El contenido de protenas totales en los productos fermentados se determin por el mtodo

de Kjeldal segn la norma ISO 5983-2 (2009).
57
La determinacin de protenas en grnulos de kefir se realiz mediante el mtodo del acido

biscinconnico (BCA). Para ello se pesaron 0.5 g de grnulos en una balanza analtica (Precisa
Instrument Ltd., Switzerland), se adicion 1 ml de buffer fosfato pH 7 con urea 3 M y se
calent a bao Mara durante 45 min. Luego se analizaron las muestras mediante el kit
comercial BCA de Pierce (Rockford, Illinois, EE. UU.) segn las instrucciones del fabricante.
La curva de calibracin se realiz con albumina disuelta en el mismo buffer utilizado para
disolver los grnulos.
5.7.
Determinacin de lpidos
Los lpidos se determinaron de acuerdo al mtodo de Rose-Gottlieb. El suero o el suero

fermentado fueron tratados con amonaco y alcohol para desagregar las protenas y luego la
grasa liberada fue extrada con ter dietlico y ter de petrleo (Artculo 13.8 B,
Metodologa Analtica Oficial, Cdigo Alimentario Argentino).
6. Cinticas de acidificacin y produccin de cidos orgnicos

Durante la fermentacin se tomaron muestras a intervalos regulares para determinar el pH
y produccin de cidos orgnicos. El pH se midi mediante un peachmetro modelo pH211
asociado a un microelectrodo HI 1131B (Hanna Instrument, USA). Los cidos orgnicos se
determinaron cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografa lquida de alta
presin (HPLC). Para la preparacin de la muestra 1 ml de producto fermentado se
centrifug durante 10 min a 14000 x g. El sobrenadante obtenido se filtr a travs de una
membrana de 0.45 m (Millipore Corporation, Milford, MA 01757, USA) y 10 l del filtrado
se inyectaron en el cromatgrafo. Los cidos se separaron en una columna de intercambio
inico AMINEX HPX-87H (BioRad Labs, Richmond, CA 94804, USA) y se detectaron a 214 nm
(Waters 996, Millipore Corporation, Milford, MA 01757, USA). La determinacin se llev a
cabo a una velocidad de flujo de 0.7 ml/min a 60 C y utilizando H2SO4 0.009 N como fase
mvil. La identificacin de los cidos se bas en la comparacin de los tiempos de retencin
con soluciones estndar de cidos (Tabla 1.1). El tiempo de retencin de los cidos se
obtuvo a partir de un cromatograma realizado con una solucin acuosa de los estndares
58
preparados con reactivos de grado HPLC (Sigma Chemical Co), obtenidos en la puesta a
punto del mtodo.
Tabla 1.1: Tiempo de retencin de soluciones estndar de cidos orgnicos
Tiempo (min)
cido oxlico
8.2
cido ctrico
9.2
cido ascrbico
10.1
cido pirvico
10.6
cido mlico
10.8
cido succnico
13.0
cido lctico
14.4
cido frmico
15.7
cido actico
17.0
Acido propinico
20.0
Acido butrico
24.1
Se realizaron curvas de calibracin con cido lctico, cido actico y cido ctrico mediante
las cuales se calcularon las concentraciones de los mismos en las muestras.
7. Enumeracin de microorganismos viables

Para determinar la concentracin de microorganismos viables en grnulos de kefir y
productos fermentados se llevaron a cabo diluciones apropiadas en triptona 0.1 % y se
realiz un recuento de microorganismos viables en placa emplendose MRS agar para
bacterias cido lcticas (BAL) e YGC agar para levaduras. Los grnulos de kefir fueron
previamente disgregados en un mortero estril. Los resultados se expresaron como
unidades formadoras de colonia (UFC)/ml para los productos fermentados y UFC/g para los
grnulos de kefir.
8. Microscopa electrnica de barrido (MEB)

Para el anlisis de grnulos de kefir crecidos en leche y suero por MEB se cortaron porciones
de 1 a 2 mm de grnulos frescos. Los mismos fueron fijados durante 20 h con glutaraldehdo
59
(Riedel de Haen, Seelze, Germany) al 2 % v/v en buffer fosfato pH 7. Luego se llev a cabo la
deshidratacin en soluciones crecientes de etanol (20, 50, 70, 90 y 100 %) en PBS,
colocndose las muestras 1 h en cada concentracin. Las muestras fueron montadas en
tacos metlicos y cubiertas con Au 24 durante 10 min por evaporacin en vaco (Fine Coat,
Sputer JFC 1100). La observacin se realiz en un microscopio electrnico de barrido Philips
SEM 505 que cuenta con un programa para la obtencin de imgenes digitales (Digitalizador
de Imagen Soft Imaging System ADDA II (SIS).
9. Extraccin de ADN
9.1 Extraccin de ADN de grnulos de kefir

Se evaluaron 4 procedimientos de disrupcin de los grnulos de kefir que se describen a
continuacin:
1. Los grnulos se escurrieron durante 20 min en papel secante. Luego, se coloc 1 g de
grnulos con 20 ml de agua esterilizada por filtracin en un bao de agua hirviendo durante
20 min, con el fin disolver el polisacrido presente en la matriz de los grnulos. Se
centrifug 15 min a 15000 x g en una centrfuga Sorvall RC-5B plus (Sorvall Products, L.P.
Newtown, CT, USA). Se descart el sobrenadante y el pellet se resuspendi en 10 ml de
agua, se calent y centrifug como se describi anteriormente. El pellet se resuspendi en 1
ml de agua.
2. Se repiti el procedimiento 1. Luego la muestra resuspendida en 1 ml de agua fue tratada
por shock trmino, colocndose 3 veces alternativamente durante 30 s en nitrgeno lquido
y 30 s en agua a 80 C.
3. Los grnulos se escurrieron durante 20 min en papel secante. Luego, 1 g de grnulos de
fue congelado en nitrgeno lquido, triturado en un mortero y resuspendido en 1 ml de
agua a temperatura ambiente. Luego se repiti el mismo procedimiento de congelacin y
trituracin.
4. Se repiti el procedimiento 3. Luego la muestra se resuspendi en 10 ml de agua a 80 C.
Se centrifug por 15 min a 15000 x g y el pellet se resuspendi en 1 ml de agua.
60
Luego todas las muestras se centrifugaron por 15 min a 15000 x g y el ADN fue extrado y
purificado directamente mediante el uso del kit AccuPrep Genomic DNA Extraction
(BIONEER, Korea) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante para tejidos o
tratado previamente con enzimas lticas.
Para el tratamiento enzimtico las muestras fueron resuspendidas en 10 l de buffer liticasa
(ver Apndice), se aadieron 10 l de liticasa 2.5 mg/ml (Sigma Chemical, St. Louis, USA) y la
mezcla se incub durante 1 h a 37 C. Luego se agregaron 40 l de buffer TES (ver Apndice)
y 10 mg/ml de lisozima (Sigma Chemical, St. Louis, USA) y se incub durante 15 min a 20 C.
Se seleccion una metodologa de acuerdo a la calidad de los perfiles obtenidos por
electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) y a la cantidad y pureza del
ADN obtenido medida por espectrofotometra.
9.2 Extraccin de ADN de productos fermentados

Para la extraccin de ADN 1.5 ml de producto fermentado fueron centrifugados a 10000 x g
por 15 min. El pellet se utiliz directamente (procedimiento 1) o bien fue tratado
previamente por shock trmico, resuspendindose en agua y colocndose 5 veces
alternativamente durante 30 s en nitrgeno lquido y 30 s en agua a 80 C (procedimiento
2). Para la extraccin y purificacin de ADN las muestras resultantes se trataron empleando
el kit AccuPrep Genomic de BIONEER de acuerdo al protocolo para clulas (protocolo A) o
para tejidos directamente (protocolo C) o con tratamiento enzimtico previo (protocolo B).
El tratamiento enzimtico se realiz de acuerdo a lo descripto en la seccin 9.1. Las
variables antes mencionadas fueron ensayadas para leche fermentada con grnulos de
kefir. Se seleccion una metodologa de acuerdo a la calidad de los perfiles DGGE.
9.3 Extraccin de ADN de cepas de referencia
Para la extraccin de ADN de todas las cepas se emple el kit AccuPrep Genomic DNA
Extraction (BIONEER, Korea) de acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante para la
extraccin de ADN de clulas. Se emplearon las cepas comerciales: Lactobacillus plantarum
DSMZ 20174, Lactobacillus parakefir DSMZ1055, Lactobacillus kefiranofaciens subsp.
61
kefiranofaciens DSMZ 5016 y JCM 6985, Lactobacillus acidophilus DSM Z20079,

Lactobacillus casei DSMZ 20011, Lactobacillus brevis ATCC 8287 y JCM 1059, Lactobacillus
kefir ATCC8007 y JCM 5818 y Kluyveromyces lactis. Las cepas ATCC fueron adquiridas de
American Type Culture collection (Manassas, VA 20108, USA), las cepas DSMZ a partir de
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen (Alemania), las cepas JCM de
Japanese Collection of Microorganisms (Japn) y las NZ de New Zealand Dairy Research
Institute Culture Collection (Nueva Zelanda).
Adems se utilizaron cepas aisladas previamente a partir de grnulos de kefir y
pertenecientes a la coleccin de CIDCA: L. plantarum CIDCA 83114 y 337, L. parakefir CIDCA
8328, L. kefir CIDCA 8348 y CIDCA 8321, Acetobacter sp. CIDCA 8431, Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154, Saccharomyces unisporus CIDCA 81107 y Saccharomyces cerevisiae
CIDCA 8112.
10. Amplificacin mediante reaccin de polimerizacin en cadena (PCR)

El ADN de la comunidad bacteriana fue analizada empleando los primers universales GC338f y 518r que amplifican la regin V3 del gen del ARNr 16S (Muyzer y col., 1993) y la de
levaduras utilizando los primers GC-NL1 y LS2 que se amplifican la regin D1 del gen del
ARNr 26S (Cocolin y col., 2000) (Tabla 1.2).
Tabla 1.2: Primers empleados para la amplificacin de ADN de la comunidad de bacterias y
levaduras de grnulos de kefir y productos fermentados.
Primer
Secuencia 5 3
GC-338f
5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG
GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG -3
518
5-ATT ACC GCG GCT GCT GG -3
GC-NL1
5- GCG GGC CGC GCG ACC GCC GGG ACG CGC GAG CCG GCGGCG
GGC CAT ATC AAT AAG CGG AGG AAA AG -3
LS2
5- ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC -3
Las reacciones PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 20 l conteniendo 0.5 M de

cada primer, 2.5 U de Taq DNA polimerasa (Inbio Highway, Tandil, Argentina), 2 l del buffer
62
provisto con la enzima (100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 9), 2.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de
cada dNTP y 3 l de ADN. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo en el ciclador MyCycler
Thermal (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Los programas de amplificacin para Eubacterias se
detallan en la Tabla 1.3 y para levaduras en la Tabla 1.4.
Tabla 1.3: Programa de amplificacin para Eubacterias utilizando los primers GC-338f y 518.
Temperatura (C)
Tiempo
N de ciclos
94
5 min
94
30 s
35
60
60 s
Annealing
72
30 s
Extensin
72
5 min
Descripcin
Desnaturalizacin inicial
Desnaturalizacin
Extensin final
Tabla 1.4: Programa de amplificacin para levaduras utilizando los primers GC-NL1 y LS2.
Temperatura (C)
Tiempo
N de ciclos
Descripcin
95
5 min
95
60 s
30
60
45 s
Annealing
72
60 s
Extensin
72
7 min
Desnaturalizacin inicial
Desnaturalizacin
Extensin final
Alcuotas de los productos de amplificacin se analizaron por electroforesis en geles de

agarosa (10 g/L) conteniendo bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.
11. Anlisis por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)

Los productos PCR fueron analizados por DGGE utilizando un equipo DGGE-2401 (C.B.S.
Scientific Co., Del Mar, CA, USA) con geles de 15 x 20 x 0.075 cm. Las muestras se
sembraron en geles de poliacrilamida 8 % p/v en buffer TAE. La separacin ptima se
alcanz empleando gradientes desnaturalizantes urea-formamida 40-60 % para productos
de amplificacin empleando primers para Eubacterias y 30-70 % para productos de
amplificacin empleando primers para levaduras (100 % corresponde a 7 M de urea y 40 %
63
v/v de formamida). La electroforesis se llev a cabo a voltaje constante 100 V durante 16 h

a 60 C. Los geles se tieron y visualizaron bajo luz U.V. La tincin se realiz con bromuro
de etidio cuando se analizaron perfiles DGGE de cepas aisladas y con Syber Gold (Invitrogen,
Oregon, USA) cuando se estudi la comunidad microbiana de grnulos de kefir y productos
fermentados. El colorante SYBR Gold (Invitrogen, Oregon, USA) es 10 veces ms sensible
que el bromuro de etidio. Este es un colorante fluorescente de cianina asimtrica que forma
un complejo con ADN o ARN de simple o doble cadena aumentando 1000 veces su
fluorescencia.
Los reactivos utilizados, el mtodo de preparacin de los geles y de tincin se detallan en el
Apndice.
12. Identificacin de bandas DGGE

Las bandas de los geles de poliacrilamida se identificaron por comparacin de su posicin
con las de bacterias cido lcticas y levaduras de identidad conocida. Adems se llev a
cabo un anlisis de secuenciacin. Las bandas fueron extradas con un bistur, eluidas en
buffer TE y almacenadas durante 16 h a 4 C para permitir la difusin del ADN. Luego se
reamplificaron con los primers originales sin la cola GC utilizando el protocolo descripto en
la seccin 10.
Los productos de la amplificacin fueron purificados mediante el kit comercial (GFXTM
Genomic Blood DNA Purification Kit, GE Healthcare, UK) de acuerdo a las instrucciones del
proveedor. Las muestras de ADN obtenidas se analizaron mediante electroforesis en un gel
de agarosa 1 %. Las bandas resultantes fueron comparadas de con las de un marcador de
tamao molecular 100-1000 pb para ADN con concentracin conocida (Inbio-Highway,
Argentina) verificndose que presenten el tamao esperado y estimndose la concentracin
de ADN.
Posteriormente se prepararon clulas competentes de Escherichia coli utilizando un mtodo
qumico. Un mililitro de un cultivo de E. coli de 16 h se sembr en 100 ml de medio LB y se
cultiv a 37 C en agitacin (225 rpm) hasta DO600nm= 0.45-0.55. Luego se coloc en hielo
por 15 min. Se centrifug (3000 rpm, 4 C, 8 min), se descart el sobrenadante
64
cuidadosamente y el pellet fue resuspendido en 5 ml de medio LB ms 5 ml de TSS-2X (ver

Apndice). La solucin resultante se incub en bao de hielo por 20 min, se fraccion en
eppendorf estriles y se congel con N2 lquido. Las clulas competentes fueron
almacenadas a -80 C hasta su uso.
Para el clonado se utilizo el kit pGEM-T y pGEM-T Easy Vector Systems (Promega Co., USA).
La insercin del plsmido y el clonado se llevo a cabo segn las instrucciones del proveedor.
Se seleccionaron 5 colonias recombinantes por cada muestra y se enviaron a Macrogen
(Seul, Korea) para su secuenciacin en el equipo 3730XLs 23 ABI DNA sequencer. Las
secuencias fueron
comparadas con
las de
la
base
de
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) usando el programa BLAST.
datos del
GenBank
65
RESULTADOS Y DISCUSIN
1. Fermentacin suero con grnulos de kefir

Los grnulos de kefir se cultivan tradicionalmente en leche a temperatura ambiente. Por lo
tanto en una primera instancia se analiz si los mismos se conservaban como starters al ser
utilizados en sucesivas fermentaciones de suero.
Los grnulos de kefir se cultivaron en leche y suero durante 20 subcultivos a 20 C y se
analiz comparativamente su crecimiento, aspecto, composicin qumica y composicin
microbiolgica en ambos sustratos. Se analiz luego el pH, el contenido de cidos orgnicos,
la concentracin de lactosa y la composicin microbiolgica de la leche y el suero
fermentados empleando grnulos de kefir crecidos en los correspondientes sustratos.
1.1 Similitud de grnulos de kefir crecidos en leche y suero

Cuando los grnulos de kefir son cultivados en leche incrementan su peso como
consecuencia del crecimiento de los microorganismos y el aumento de la matriz de
polisacrido y protena que los rodea. En el presente estudio se determin que la tasa de
crecimiento de los grnulos de kefir, definida como aumento de peso por gramo de grnulo
por subcultivo, no fue significativamente diferente (P>0.05) en leche y suero con valores de
0.085 0.040 g/g y 0.076 0.040 g/g respectivamente. Asimismo no se observaron
diferencias en la apariencia de los grnulos luego de 20 subcultivos sucesivos en suero
(Figura 1.1). Estos resultados fueron alentadores ya que el aspecto de los grnulos nos da
informacin acerca de su estado fisiolgico y el aumento de peso indica que la microbiota
presente en los grnulos est activa y el balance de microorganismos es adecuado siendo
esto necesario para la sntesis de los componentes de la matriz que los inmovilizan (Garrote
y col., 2010a).
66
Figura 1.1: Apariencia de grnulos de kefir AGK-10 luego de 20 subcultivos a 20 C en leche

(izquierda) y en suero (derecha).
La composicin microbiolgica y qumica (Tabla 1.5) de los grnulos subcultivados en ambos

sustratos tampoco fue significativamente diferente (P>0.05) confirmando la observacin
macroscpica sobre el estado general de los grnulos.
Tabla 1.5: Composicin microbiolgica y qumica de grnulos de kefir crecidos en leche y
suero.
BAL1
(UFC/g)
Levaduras
(UFC/g)
Humedad
(g/kg)
Leche
6.7 2.7 x 107 a2
3.5 0.8 x 107a
838 10 a
49 8a
87 15a
Suero
6.0 3.1 x 107 a
8.2 3.0 x 107a
805 5 a
52 4a
87 7a
Protenas Polisacridos
(g/kg)
(g/kg)
BAL: bacterias cido lcticas

Dentro de la misma columna letras iguales indican que no existen diferencias significativas ( 0.05)
evaluadas mediante test T de student.
2
La composicin de los grnulos hallada en este trabajo es similar a la de descripta

previamente por otros autores para grnulos de kefir crecidos en leche (Garrote y col.,
1997; Abraham y De Antoni, 1999). As mismo los valores se corresponden con aquellos
descriptos por Rimada y Abraham (2001) para grnulos de kefir CIDCA AGK1 crecidos en
suero desproteinizado. Estos autores hallaron una concentracin de 1.8 1.4 x 10 8 UFC/g
67
de BAL y de 2.1 1.7 x 107 UFC/g de levaduras, un contenido de protenas de 50 6 g/kg, de

polisacridos de 82 16 g/kg y una de humedad de 807 13 g/kg.
La distribucin de los microorganismos en la superficie de los grnulos de kefir crecidos en
suero se estudi por microscopa electrnica de barrido (Figura 1.2). Se observ la presencia
de una abundante cantidad de microorganismos, predominando las bacterias con forma de
bacilos de distinta longitud y tamao, algunas libres y otras en cadenas. Esto se evidencia
claramente en las fotografas de menor aumento (Figura 1.2 A y B). No pudo detectarse la
presencia de cocos. Como se seala con flechas en rojo en la Figura 1.2 C y D, las levaduras
se encontraron dispersas entre los bacilos en algunas zonas en mayor abundancia que en
otras.
A
68
Figura 1.2: Microscopa electrnica de barrido de la superficie de grnulos de kefir crecidos

en suero. El aumento se indica al pie de cada fotografa. Las flechas rojas sealan, a modo
de ejemplo, algunas zonas con presencia de levaduras.
Las fotografas obtenidas por microscopa electrnica de barrido en el presente trabajo

fueron notablemente similares con aquellas obtenidas por Zhou y col. (2009) de la
superficie externa de grnulos de kefir tibetanos crecidos en leche. Estos autores
describieron que la porcin externa de grnulos contena una alta densidad de lactobacilos
cortos y levaduras, mientras que en la interna observaron material fibrilar, levaduras y
bacilos de mayor longitud rectos y curvados. Estos autores tampoco observaron cocos en la
superficie externa de los grnulos, a pesar de que hallaron la presencia de Lactococcus lactis
en los mismos por mtodos independientes de cultivo. Atribuyen esta observacin a una
baja capacidad de adhesin de los lactococos a la superficie de los grnulos.
En correspondencia con lo hallado en el presente trabajo, Magalhes y col. (2010) no
detectaron diferencias en la estructura externa ni interna de grnulos de kefir crecidos en
leche y suero analizados mediante microscopia confocal empleando sondas moleculares
especficas para cidos nuclecos, paredes celulares de levaduras y polisacridos. Estos
autores describen que las levaduras se agrupan en pequeas regiones distribuidas al azar
entre las bacterias y el polisacrido. En las observaciones al microscopio de barrido
realizadas en el presente estudio no se observaron agrupamientos entre levaduras.
A fin de profundizar el estudio sobre la composicin microbiana de los grnulos de kefir
crecidos en suero y leche se emple electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante
69
(DGGE). Esta es una de las tcnicas moleculares ms extensamente utilizada para el estudio
de comunidades microbianas complejas (Muyzer, 1999). Garbers y col. (2004) demostraron
que el DGGE es un mtodo exitoso para tipificar el consorcio microbiano presente en los
grnulos de kefir, as como para distinguir entre grnulos de diferente origen y cultivados en
distintas condiciones. Adems ha sido descripto que mediante DGGE es posible detectar
bacterias cido lcticas presentes en kefir que no se recuperan mediante tcnicas
dependientes de cultivo (Chen y col., 2008).
En una primera etapa fue necesario optimizar la extraccin de ADN a partir de grnulos de
kefir. Se emplearon 4 procedimientos para disgregar los grnulos con el fin de seleccionar el
ms adecuado para separar los microorganismos de los componentes de la matriz (ver
materiales y mtodos, seccin 9.1). Se extrajo luego ADN con y sin tratamiento previo con
enzimas lticas. El ADN obtenido fue amplificado y analizado mediante DGGE.
Para el estudio de la comunidad bacteriana se amplific por PCR la regin V3 del ADNr 16S
empleando los primers universales GC-338f y 518r. Los productos PCR fueron luego
analizados por DGGE empleando un gradiente urea-formamida 40-60 %. La comunidad de
levaduras se analiz mediante los primers universales GC-NL1 y LS2 que amplifican la regin
D1 del ADNr 26S y se emple un gradiente urea-formamida 30-70 %.
Los perfiles DGGE obtenidos al amplificar el ADN obtenido mediante los diferentes
procedimientos de extraccin con primers para Eubacterias fueron iguales (Figura 1.3 A),
pero empleando primers para levaduras slo los procedimientos en los que los grnulos
fueron disgregados en agua caliente (1, 2 y 4) y tratados enzimticamente resultaron
exitosos (Figura 1.3 B). El agua caliente disuelve el polisacrido presente en la matriz de los
grnulos permitiendo la liberacin de los microorganismos contenidos en la misma,
mientras que la liticasa degrada la pared celular de las levaduras mejorando la extraccin de
ADN. El aumento de la eficiencia de extraccin de ADN de levaduras al tratar las muestras
con liticasa previamente al uso de un kit comercial ha sido descripta por otros autores
(Kirchmayr y col., 2011). Los tres procedimientos para los que se obtuvieron perfiles con
mayor nmero de bandas, presentaron buena cantidad y pureza de ADN con una relacin
de absorbancia 260/280 mayor a 1.8 y una concentracin mayor a 70 ng/l. Debido a su
70
simplicidad, el procedimiento 1 con tratamiento enzimtico fue seleccionado para las

siguientes extracciones.
A
B
Sin tratamiento
enzimtico
Con tratamiento
enzimtico
Sin tratamiento
enzimtico
Con tratamiento
enzimtico
Figura 1.3: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. El ADN fue extrado de
grnulos de kefir mediante 4 procedimientos (1 a 4) seguidos de un tratamiento enzimtico
o sin este tratamiento y luego amplificado por PCR empleando los primers universales para
Eubacterias GC-338f y 518r (A) o los primers universales para levaduras GC-NL1 y LS2 (B).
Se compararon los perfiles DGGE de grnulos de kefir tradicionales crecidos en leche y de

los mismos grnulos despus de 20 subcultivos en suero a 20 C. Los perfiles DGGE de
bacterias presentes en grnulos de kefir crecidos en leche y suero resultaron idnticos
(Figura 1.4).
71
Figura 1.4: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN de grnulos de kefir
cultivados en leche (GL) en suero (GS) durante 20 subcultivos a 20 C amplificado
empleando los primers universales para Eubacterias GC-338f y 518r. (RB) Bacterias de
referencia: Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens JCM 6985, Lactobacillus
kefir ATCC 8007 y Lactobacillus parakefir DSMZ 1055.
Para la identificacin de bandas se analiz el perfil DGGE de especies de bacterias

previamente descriptas en kefir (Guzel-Seydim y col., 2011): Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus parakefir, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus kefir, Lactococcus lactis
subsp. cremoris, Acetobacter sp. Se analiz ms de una cepa para las especies: L. kefir
(CIDCA 8348, ATCC 8007 y JCM 5818), L. plantarum (CIDCA 83114 y DSMZ 20174), L.
kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens (DSMZ 5016 y JCM 6985) y L. brevis (JCM 1059 y
ATCC 8287).
Todas las cepas de la misma especie analizadas presentaron bandas en igual posicin. En la
Figura 1.5 A se muestran como ejemplo las bandas obtenidas para distintas cepas de L.
kefir. L. kefir, L. parakefir, L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, L. acidophilus, L. casei y
72
L. brevis presentaron bandas en distintas posiciones del gradiente. Sin embargo para
Acetobacter sp. y L. plantarum se obtuvieron bandas en la misma posicin. A modo de
ejemplo se presenta un gel en el que se incluyen algunas de las cepas bacterianas ms
frecuentemente descriptas en kefir junto con el perfil de bacterias de grnulos crecidos en
suero (Figura 1.5 B). Los grnulos de kefir slo presentaron bandas coincidentes con las de
L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, L. kefir y L. parakefir. Estas tres especies fueron
incluidas en las subsiguientes corridas electroforticas como referencia.
A
Figura 1.5: Posicin de bandas DGGE de distintas especies de Lactobacillus. A: L. kefir (2a)
CIDCA 8348, (2b) ATCC 8007 y (2c) JCM 5818. B: (1) L. kefiranofaciens subsp.
kefiranofaciens JCM 6985, (2) L. kefir ATCC 8007, (3) L. plantarum 337, (4) L. brevis JCM
1059, (5) L. parakefir DSMZ 1055, (6) grnulo de kefir crecido en suero a 20 C.
Chen y col. (2008) analizaron la posicin de bandas de DGGE de 20 cepas bacterianas

descriptas en kefir utilizando los mismos primers que en el presente estudio. Empleando un
gradiente desnaturalizante 30-50 % obtuvieron bandas en igual posicin para L. brevis y L.
plantarum, las cuales se diferenciaron en el presente estudio al utilizar un gradiente 4060 %. Estos autores obtuvieron bandas en distinta posicin para las subespecies Lb.
73
delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii y Lb. delbrueckii subsp.
lactis; y para Lc. lactis subsp. cremoris y Lc. lactis subsp. lactis.
La posibilidad de discriminar especies, subespecies y cepas por DGGE est condicionada por
varios factores. Por un lado las diferencias que presenten en la secuencia amplificada. Los
productos PCR analizados por DGGE tienen una longitud menor a 500 pb siendo frecuente
que especies relacionadas no presenten diferencias en esta secuencia (Ercolini, 2004). Est
descripto que algunas especies relacionadas tienen secuencias V3 idnticas y no pueden ser
distinguidas por DGGE (Ogier y col., 2002). Por otra parte puede suceder que las especies
difieran en esta regin pero se desnaturalicen a la misma concentracin de agente
desnaturalizante y por ende migren a la misma posicin. Tambin el gradiente ureaformamida empleado incide en el patrn de migracin obtenido. Si bien la comparacin de
la posicin de bandas con cepas de referencia resulta de utilidad como una primera
aproximacin para determinar su identidad, es indispensable recurrir a la secuenciacin
para lograr una identificacin especfica de las mismas.
Para la identificacin de las bandas presentes en los perfiles DGGE de grnulos de kefir por
secuenciacin cada una de las bandas indicadas con letras (AL) en el gel mostrado en la
Figura 1.4 fue escindida del gel, clonada, amplificada y secuenciada segn se indic en la
seccin 12 de Materiales y mtodos. Los resultados de la bsqueda de secuencias similares
en el GenBank se presentan en la Tabla 1.6.
Las primeras 6 bandas que se observan en los perfiles de ambos grnulos (A a G) alinearon
indistintamente con Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens y con Lb. kefiranofaciens
subsp. kefirgranum. Esto se debe a que la secuencias completa del 16S ADNr es idntica
para estas dos subespecies filogenticamente relacionadas (Ninane y col., 2007).
La banda H aline con Lactococcus lactis, las bandas I y J con L. kefir y la banda K con L.
parakefir. La banda L no pudo identificarse dado que aline con numerosas especies del
gnero Lactobacillus.
74
Tabla 1.6: Porcentaje (%) de similitud de secuencias parciales de 16S ADNr con secuencias
presentes en la base de datos del NCBI.
Banda
A-G
Especie relacionada
N de acceso % Similitud
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum
AB372208.1
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens
FJ915793.1
98 (D, F)
99 (A) 100
(B, C, E, G)
Lactococcus lactis subsp. lactis
HM004215.1
100
Lactococcus lactis subsp. cremoris
GU344727.1
100
Lactobacillus kefir
AB429371.1
100
Lactobacillus kefir
AB429371.1
100
Lactobacillus parakefir
AB447485.1
97
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum
AB372208.1
98
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens
FJ915793.1
98
Lactobacillus crispatus
AY339180.1
98
Lactobacillus jensenii
AY262343.1
98
Lactobacillus acidophilus
GU454853.1
98
Lactobacillus helveticus
GU560037.1
98
Las secuencias de bandas DGGE constituyen fragmentos cortos de ADN (menores a 500 pb)
que pueden presentar escasa o nula variacin entre especies relacionadas, lo que dificulta
la identificacin. A esto se suma la dificultad impuesta por la heterogeneidad de secuencias
para una misma especie depositadas en la base de datos. Se han descripto niveles
inesperadamente altos de variacin intraespecfica de las secuencias del ARNr de la
subunidad pequea del ribosoma de procariotas depositadas en GenBank (Clayton y col.,
1995). Si bien esto se ha atribuido frecuentemente a errores metodolgicos (Lin y col.,
2008b) hay quienes sostienen que no puede descartarse que la variabilidad intraespecfica
sea mayor de lo que hasta el momento se ha credo (Clayton y col., 1995). Esto afecta
crticamente la utilidad informativa de las secuencias y puede conducir a errores en la
identificacin o a identificaciones ambiguas, tales como el alineamiento de una banda con
mltiples secuencias, como se obtuvo para la banda L.
Siete bandas del perfil DGGE de grnulos de kefir alinearon con L. kefiranofaciens sin
discriminar subespecie y dos con L. kefir. Asimismo se observaron bandas mltiples para las
cepas de referencia pertenecientes a estas 2 especies.
75
La multiplicidad de bandas para una determinada especie es comnmente atribuida a

mltiples copias heterogneas del gen del ARNr 16S. Se ha descripto que el nmero de
copias del operon ribosmico por genoma bacteriano vara considerablemente, de 1 a 15
(Klappenbach y col., 2001). Scheirlinck y col. (2008) reportaron que el 54 % de 1194 BAL
aisladas de masa fermentada presentaban ms de una banda al ser analizadas por DGGE. En
concordancia con esta observacin, las 17 especies del gnero Lactobacillus sp.
consideradas en la base de datos rrndb (The Ribosomal RNA Operon Number Database:
http://rrndb.cme.msu.edu) poseen entre 5 y 9 copias del ADNr 16S, con un promedio de
5.36 copias.
Las copias de los genes ADNr del mismo genoma pueden presentar cierto grado de
heterogeneidad, denominada microheterogeneidad. En general las secuencias difieren en
menos de 15 posiciones sin embargo se han descripto diferencias de hasta 70 posiciones
(Rastogi y col., 2009; Mylvaganam y col., 1994). Pei y col (2010) describieron que el 74 % de
las especies, de las cuales se conoce el genoma completo y presentan copias mltiples del
ADNr 16S, tienen variaciones entre las copias de este gen que se encuentran entre 0.06 y
20.38 %, con un promedio de 0.55 %. Estos investigadores estimaron que la probabilidad de
encontrar especies cuya variabilidad en la secuencia del ADNr 16S sea mayor a un 1 % en
una comunidad es de aproximadamente 4.2 %.
De acuerdo a los datos antes mencionados, es frecuente hallar copias mltiples diferentes
del gen ADNr 16S para especies de Lactobacillus sp., mientras que la probabilidad de que
estas copias sean suficientemente diferentes para obtener mltiples bandas en un perfil
DGGE es baja aunque no inexistente. De manera que es posible que la multiplicidad de
bandas observadas para L. kefiranofaciens y L. kefir se deba a este fenmeno. Otros autores
han descripto que la alta frecuencia de especies de BAL que presentan multiplicidad de
bandas DGGE podra deberse a que presentan variabilidad en la regin V3 entre copias del
ADNr 16S (De Arajo y Schneider, 2008; Scheirlinck y col., 2008).
La presencia de copias levemente diferentes de ADNr 16S puede adems acentuar la
formacin de molculas heteroduplex, dado que su presencia es mayor cuando ms
similares sean las secuencias (Dahllof y col., 2000). Debido a la desigualdad entre las
76
secuencias los heteroduplex, los mismos suelen formar bandas en zonas donde el gradiente
desnaturalizante es menor (Muyzer y Smalla, 1998). Esto conducira a la obtencin de
bandas en posiciones alejadas del gradiente an cuando las secuencias presentan escasas
diferencias.
Se analiz tambin la similitud ente los perfiles DGGE de levaduras presentes en grnulos
cultivados en leche y suero. Los perfiles obtenidos presentaron algunas similitudes y
diferencias (Figura 1.6). Se detectaron 5 bandas coincidentes entre ambos perfiles,
sealadas en la Figura 1.6 con las letras b, d, e, f y g. Mientras que las bandas indicadas
como a, c y h se detectaron en el perfil DGGE de grnulos cultivados en leche y no en el de
aquellos cultivados en suero.
Figura 1.6: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN de grnulos de kefir
cultivados en leche (GL) en suero (GS) durante 20 subcultivos a 20 C amplificado
empleando los primers universales para levaduras GC-NL1 y LS2. (RL) Levaduras de
referencia: Kluyveromyces lactis, Saccharomyces unisporus CIDCA 81107, Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154, y Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112.
77
Se incluyeron en el anlisis levaduras de identidad conocida, que haban sido previamente

aisladas a partir de grnulos de kefir: Saccharomyces unisporus, Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae. Se hallaron en los perfiles de ambos
productos bandas coincidentes con S. unisporus, K. marxianus y S. cerevisiae.
Las bandas se escindieron del gel, se re-amplificaron mediante los mismos primers sin la
cola GC y se analizaron por secuenciacin. Los resultados obtenidos de la contrastacin de
las secuencias con la base de datos del NCBI se presentan en la Tabla 1.7.
Tabla 1.7: Porcentaje (%) de similitud de secuencias parciales de 26S ADNr con secuencias
presentes en la base de datos del NCBI.
Banda
Especie relacionada
Nmero de acceso
% Similitud
Kazachstania exigua
EU982209.1
100
Kazachstania turicensis
EU982208.1
100
Saccharomyces cerevisiae
EU441887.1
100
No se hallaron similitudes significativas
Kazachstania unispora
GQ222348.1
97
Kazachstania servazzii
FM200037.1
97
Kazachstania aquatica
AB500207.1
97
Kluyveromyces marxianus
GQ179986.1
100
BK006945.1
100
EU441887.1
100
Kazachstania exigua
EU982209.1
100
Kazachstania turicensis
EU982208.1
100
Por secuenciacin se confirm la presencia de K. marxianus (banda e) y de S. cerevisiae

(bandas b, f y g) en los grnulos de kefir crecidos en ambos sustratos, observada tambin
por comparacin de la posicin de bandas. Mientras que se determin la presencia de Kaz.
exigua o Kaz. turicensis (bandas a y h) slo en grnulos crecidos en leche.
La banda c, que slo estuvo presente en grnulos de leche, no pudo identificarse dado que
no aline con ninguna secuencia disponible en la base de datos. Esto podra deberse a que
corresponde con una especie cuya secuencia del ADNr 26S no se halla incluida en la base de
datos. Tambin podra corresponder a un heteroduplex, una molcula quimrica u otro un
artefacto generado durante la PCR (Kanagawa, 2003), sin embargo esto es poco probable
78
dado que la banda se obtuvo reiteradas veces en corridas realizadas a partir de distintos
productos PCR.
Para las bandas a, d y h la identificacin fue ambigua, alineando la misma banda con
distintas especies. Esto podra deberse a que las especies no difieren en la regin D1 del
ADNr 26S que fue secuenciada. Las tres especies de Kazachstania (Kaz. aquatica, Kaz.
servazzii y Kaz. unispora) que alinearon con la banda d, se encuentran prximas
filogenticamente. Se ha descripto que sus secuencias en regiones D1/D2 del ADNr 26S
difieren en menos del 3 % (Wu y Bai, 2005). Asimismo Kaz. exigua y Kaz. turicensis que
alinearon con el mismo porcentaje de similitud con las bandas a y h son especies
estrechamente relacionadas (Lee y col., 2009).
Por lo tanto, del anlisis DGGE de grnulos de kefir cultivados en leche y suero se
obtuvieron perfiles idnticos para bacterias y similares para levaduras. Mediante este
mtodo se detect la presencia de L. kefiranofaciens, L. parakefir, L. kefir, Lc. lactis, K.
marxianus y S. cerevisiae en grnulos de kefir crecidos en leche y suero. Mientras que
Kazachstania exigua o Kazachstania turciensis y la banda c, que no aline con ninguna
secuencia disponible en la base de datos del GenBank, estuvieron presentes slo en
grnulos de kefir crecidos en leche, indicando una reduccin de la diversidad de levaduras al
emplear suero como sustrato.
En concordancia con los resultados obtenidos en el presente trabajo Magalhes y col.
(2010) describieron la presencia de L. kefiranofaciens, S. cerevisiae, S. unisporus y K.
marxianus en grnulos de kefir luego de una fermentacin de suero. Aunque en el presente
estudio se lograron detectar ms especies en grnulos crecidos durante 20 subcultivos en
este sustrato.
A pesar que se ensayaron distintos mtodos de extraccin de ADN y se emple Sybr Gold
para mejorar la resolucin de los perfiles DGGE, no se obtuvo la diversidad microbiolgica
esperada de acuerdo a lo descripto previamente por el empleo de mtodos de cultivo
tradicionales (Garrote y col., 2001; Simova y col., 2002; Loretan y col., 2003; Witthuhn y
col., 2004). La dificultad para detectar ciertas especies por PCR-DGGE puede deberse a su
79
baja concentracin, su alta resistencia a los agentes lticos utilizados o a la amplificacin

preferencial de determinados ADN moldes (Muyzer y Smalla, 1998; Ercolini, 2004; De
Arajo y Schneider, 2008).
Chen y col. (2008) analizaron la diversidad microbiana de distintos grnulos de kefir
taiwaneses mediante mtodos de cultivo y por DGGE y hallaron que mientras que algunas
bacterias identificadas por tcnicas de cultivo no eran detectadas por DGGE, este ltimo
mtodo permita la deteccin de otras que no haban sido aisladas. De manera similar, en
este trabajo no se encontraron representadas en el perfil DGGE algunas especies
bacterianas previamente aisladas de grnulos de kefir de la coleccin del CIDCA tales como
L. plantarum y Acetobacter sp. (Garrote y col., 2001). Por otro lado, fue posible detectar la
presencia de L. kefiranofaciens y Kaz. exigua o Kaz. turicensis que no haban sido
anteriormente aisladas de grnulos de kefir de la coleccin.
En esta primera etapa del estudio, se demostr la similitud de grnulos de kefir
provenientes de leche respecto a aquellos subcultivados reiteradas veces en suero en
cuanto a su crecimiento, aspecto macroscpico, composicin qumica y composicin
microbiolgica cuantitativa y cualitativa. De manera que el suero es un sustrato adecuado
para la fermentacin con grnulos de kefir, permitiendo que los mismos se conserven como
starters.
1. 2 Anlisis de leche y suero fermentados con grnulos de kefir

Los grnulos de kefir crecidos en suero durante 20 subcultivos, caracterizados en la seccin
1.1, fueron empleados para fermentar suero durante 24 h a 20 C. El producto obtenido fue
analizado en cuanto a su pH, contenido de cidos orgnicos, concentracin de lactosa y
composicin microbiolgica comparativamente con el producto obtenido de la
fermentacin de leche en iguales condiciones.
Durante la fermentacin de suero con 10 % p/v de grnulos de kefir el pH descendi de 6.3
a 3.6, fundamentalmente por la produccin de cido lctico que aument de 0.05 % a 0.90
%. Durante el proceso se degrad un 49 % de la lactosa presente en el suero, que descendi
80
de 6.5 % a 3.3 %. El producto obtenido al fermentar leche present mayor pH y similar

contenido de cido lctico y lactosa que el suero fermentado (Tabla 1.8).
La composicin microbiolgica se analiz mediante recuentos de viables en placa. El
contenido de bacterias cido lcticas en suero fermentado con grnulos de kefir fue
significativamente menor y el de levaduras significativamente mayor (P<0.05) que en leche
fermentada (Tabla 1.8).
Tabla 1.8: Composicin microbiolgica cuantitativa, pH, concentracin de cido lctico y de
lactosa de leche y suero fermentados 24 h con 10 % p/v de grnulos de kefir a 20 C.
BAL
(UFC/ml)
Levaduras
(UFC/ml)
pH
cido lctico
(%)
Lactosa
(%)
Leche
3.9 3.1 x108 a
8.8 5.4 x105 a
3.9 0.1 a
1.20 0.18 a
3.8 0.5 a
Suero
1.0 0.7 x107 b
4.2 1.7 x106 b
3.6 0.1 b
0.90 0.03 a
3.3 0.9 a
* Dentro de la misma columna letras diferentes indican diferencias significativas (=0.05) evaluadas
mediante test T de student.
Para analizar por DGGE la diversidad microbiana de los productos fermentados se evaluaron
previamente distintos procedimientos de extraccin de ADN (Materiales y mtodos, seccin
9.2). Cuando se amplifico con primers universales para Eubacterias, se obtuvieron perfiles
idnticos con todos los mtodos coincidiendo con los resultados obtenidos en las muestras
de grnulos de kefir. Cuando se amplific con primers universales para levaduras se
obtuvieron perfiles con mayor nmero de bandas para los procedimientos que incluyeron
un tratamiento enzimtico con liticasa (Figura 1.7, calles 1B y 2B). El procedimiento 1B se
seleccion para extracciones subsiguientes por ser el ms sencillo metodolgicamente.
81
Figura 1.7: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de productos de

amplificacin de ADN de leche fermentada 24 h a 20 C con 10 % p/v de grnulos de kefir
obtenidos empleando los primers universales para levaduras GC-NL1 y LS2. En las calles 1B
a 2C se muestran distintos procedimientos de extraccin de ADN. (RL) Levaduras de
referencia: Kluyveromyces lactis, Saccharomyces unisporus CIDCA 81107, Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154 y Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112.
Se estudi la repetitividad de los perfiles al emplear ADN extrado a partir de 3 partidas

distintas del mismo producto fermentado y en distintas corridas electroforticas. Los
perfiles obtenidos en extracciones independientes fueron idnticos. Se presenta a modo de
ejemplo un gel en el que se muestra el perfil DGGE de bacterias presentes en suero y leche
fermentados con grnulos de kefir obtenidos de muestras independientes (Figura 1.8 A).
En cuanto a los perfiles obtenidos en distintas electroforesis existieron diferencias en la
distancia recorrida por las bandas en el gel. Esto podra estar asociado con la formacin
desigual del gradiente desnaturalizante. Por otro lado, se observaron diferencias en la
intensidad de la misma banda entre distintos geles, aunque la intensidad relativa entre
bandas del mismo perfil se mantuvo constante. Esto podra atribuirse a una eficiencia
diferencial de la amplificacin y/o tincin entre ensayos. Se muestran como ejemplo 2
82
ensayos DGGE de la misma muestra de ADN en las cuales se evidencian las dificultades
antes sealadas (Figura 1.8 B). Pueden notarse que en la corrida presentada a la izquierda
todas las bandas se visualizan con mayor intensidad que en la de la derecha, asimismo se
observan diferencias en la distancia relativa entre bandas. Para poder comparar perfiles de
distintas corridas electroforticas se utilizaron en todos los geles patrones conformados por
cepas de bacterias y levaduras de referencia.
A
Figura 1.8: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de productos PCR

obtenidos empleando los primers universales para Eubacterias GC-338f y 518r. A: Las
distintas calles representan extracciones independientes de ADN de distintas partidas de
leche (LF) y suero (SF) fermentados 24 h a 20 C con 10 % p/v de grnulos de kefir. B: Las
calles representan el mismo ADN amplificado y analizado en electroforesis independientes.
Una vez seleccionado el protocolo de extraccin y analizada la repetitividad de extracciones

de ADN de productos fermentados obtenidos independientemente y de distintas corridas
electroforticas, se analizaron comparativamente la diversidad de especies en leche y suero
83
fermentados. Se observaron diferencias en la intensidad de ciertas bandas de los perfiles

DGGE (Figura 1.9).
A
Figura 1.9: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN extrado a partir de
leche (LF) y suero (SF) fermentados 24 h a 20 C con 10 % p/v de grnulos de kefir. A:
Amplificado empleando primers universales para Eubacterias GC-338f y 518r. B:
Amplificado empleando primers universales para levaduras GC-NL1 y LS2. (RB) Bacterias de
kefir ATCC 8007 y Lactobacillus parakefir DSMZ 1055. (RL) Levaduras de referencia:
Kluyveromyces lactis, Saccharomyces unisporus CIDCA 81107, Kluyveromyces marxianus
CIDCA 8154, y Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112.
Por comparacin de bandas con cepas de identidad conocida y secuenciacin se detect en

los perfiles de bacterias de ambos productos la presencia de L. kefiranofaciens (bandas A a
G), Lc. Lactis (banda H), L. kefir (bandas I y J) y L. parakefir (banda K). Sin embargo, las
bandas correspondientes con L. kefir y L. parakefir presentaron menor intensidad en leche
que en suero fermentado (Figura 1.9 A).
84
Con respecto a las levaduras en ambos productos se detect la presencia de S. unisporus

(banda d), K. marxianus (banda e) y S. cerevisiae (bandas f y g). Tal como se observ en
grnulos de kefir, las bandas correspondientes a Kaz. exigua o Kaz. turicensis (a y h) se
detectaron en leche pero no en suero fermentado, mientras que la banda e
correspondiente a K. marxianus tuvo mayor intensidad en suero que en leche fermentada
(Figura 1.9 B).
La mayor intensidad de las bandas correspondientes a L. kefir, L. parakefir and K. marxianus
observada en el producto fermentado obtenido en suero respecto al de leche, podra
indicar una mayor concentracin de estas especies en el suero fermentado ya que la
intensidad de cada banda es generalmente considerada una medida semi-cuantitativa de
una determinada especie en la comunidad (Illian y col., 2009). Sin embargo la relacin entre
la intensidad de las bandas de DGGE y la cantidad de ADN molde no es siempre lineal. En
PCR multi-molde algunos mecanismos pueden favorecer la ampliacin de determinados
moldes debido a las propiedades de los genes, de sus secuencias adyacentes, o del genoma
total, lo que puede causar que la abundancia relativa de los productos finales de
amplificacin no refleje necesariamente la relacin de genes en la mezcla inicial (Polz y
Cavanaugh, 1998). Entre los factores que ms contribuyen a la amplificacin diferencial se
pueden mencionar la desnaturalizacin preferencial debido al bajo contenido de G-C, la
accesibilidad diferencial de los genes codificantes para ARNr dentro del genoma, la
interferencia de secuencias adyacentes, la afinidad de los primers por la secuencia blanco y
el nmero de copias de los genes (Suzuki y Giovannoni, 1996; Hansen y col., 1998; Farrelly y
col., 1995; Kanagawa, 2003). De Araujo y Scheider (2008) demostraron que estos errores
pueden conducir a fallas en la determinacin de las especies dominantes en comunidades
microbianas analizadas por DGGE.
En concordancia con los resultados del presente trabajo, Magalhes y col. (2010) hallaron la
presencia de S. unisporus, K. marxianus y S. cerevisiae en suero fermentado durante 48 y 72
h con grnulos de kefir mediante DGGE analizando secuencias de la regin ITS (primers GCITS1/ITS2) y del ADNr 18S (primers GC-NS3/YM951). Amplificando la regin V6-V8 (primers
GC-968f/1401r) y la regin V3 del ADNr 16S (primers GC-338f/518r) estos autores slo
85
pudieron identificar en estos productos una banda correspondiente con L. kefiranofaciens y

una banda que aline con la secuencia de una bacteria del gnero Lactobacillus sp. no
identificada a nivel especie.
2. Efecto de la variacin del porcentaje de grnulos de kefir inoculados, el tipo de suero y

la temperatura de incubacin
2.1 Fermentacin de suero con distintos porcentajes de grnulos de kefir

Uno de los factores que afectan las caractersticas del producto obtenido es la relacin
grnulo de kefir/sustrato. Empleando los grnulos de kefir adaptados a suero, que fueron
caracterizados en la seccin 1.1, se estudi la influencia de la variacin de la proporcin del
inculo starter sobre el aumento de biomasa de los grnulos y sobre la composicin
microbiolgica, el contenido de lactosa, el pH y la concentracin de cidos orgnicos del
suero fermentado 24 h a 20 C.
El aumento de biomasa de los grnulos inoculados en suero en concentracin 1 % fue 0.37
0.11 g/g, aproximadamente 4 veces mayor que cuando los mismos se sembraron en
concentracin 10 % (0.076 0.04 g/g).
7
pH
3
0
12
16
20
24
Tiempo (h)
Figura 1.10: Cintica de acidificacin de suero fermentado a 20 C con grnulos de kefir
adaptados a suero inoculados en concentraciones 1 % p/v () y 10 % ().
86
Cuando se analizaron comparativamente las cinticas de acidificacin pudo notarse que, a

diferencia del descenso abrupto de pH que ocurri durante las primeras horas de
incubacin cuando la concentracin de grnulos fue 10 % p/v (de pH 6.3 a 4.4 0.1 en 2 h),
cuando se emplearon grnulos en concentracin 1 % p/v el pH descendi gradualmente
durante la fermentacin presentando el producto luego de 24 h un pH de 5.3 0.2 (Figura
1.10).
En concordancia con los resultados obtenidos en el presente trabajo en suero, Garrote y
col. (1998) describieron que al fermentar leche con grnulos de kefir en concentracin
10 % la acidificacin ocurre ms rpidamente que al emplearlos al 1 %.
Magalhes y col. (2011b) describieron una cintica de acidificacin de suero con 5 % p/v de
grnulos de kefir similar a la obtenida en el presente estudio con grnulos en
concentracin 10 % p/v. Estos autores hallaron que el pH desciende abruptamente durante
las primeras horas de fermentacin y luego se estabiliza en valores prximos a 4.
En cuanto a la composicin microbiolgica, se observ un contenido similar de levaduras
en el suero fermentado con grnulos de kefir en concentracin 1 % (1.7 0.6 x 106 UFC/ml)
y 10 % (4.2 1.7 x 106 UFC/ml). Sin embargo el contenido de BAL fue un orden logartmico
mayor cuando los grnulos se inocularon en menor proporcin (1.5 1.0 x 108 vs. 1.0 0.7
x 107 UFC/ml).
Al analizar la composicin microbiolgica del suero fermentado con 10 % p/v de grnulos
de kefir a las 4 h de fermentacin (pH 4) se hall que el contenido de BAL fue 1 x 107
UFC/ml y el de levaduras de 2 x 106 UFC/ml, de manera que la concentracin de
microorganismos no aument en las siguientes horas de incubacin. La menor
concentracin de BAL hallada en suero fermentado con 10 % de grnulos de kefir podra
relacionarse con una reduccin de la tasa de crecimiento debida al bajo pH ya que este
permanece a valores inferiores a 4 luego de 4 h de incubacin y a alta concentracin de
cido lctico. Las altas concentraciones de cido lctico no disociado suelen ser el principal
factor que limita el crecimiento de las BAL (Bouguettoucha y col., 2011). El descenso ms
gradual de pH durante la fermentacin con 1 % de grnulos de kefir podra permitir un
mayor crecimiento microbiano durante el perodo de incubacin.
87
Asimismo es posible que el crecimiento se encuentre limitado por la escasez de nutrientes.

Las BAL son microorganismos fastidiosos respecto a los requerimientos nutricionales,
precisando medios ricos para su crecimiento. El nitrgeno podra actuar como nutriente
limitante del crecimiento, ya que se ha descripto que el crecimiento de BAL en suero es
insuficiente sin la adicin de fuentes externas de nitrgeno (Burns y col., 2008). Debe
considerarse que, adems de los microorganismos que son liberados al medio, aquellos
contenidos en los grnulos permanecen activos metablicamente, estando en cantidad 10
veces superior al inocular los grnulos al 10 % que al emplearlos al 1 %. De manera que es
esperable que los nutrientes se agoten con anterioridad durante la fermentacin de suero
con 10 % de grnulos de kefir, siendo otra alternativa para explicar la menor concentracin
de BAL en el producto fermentado obtenido.
Se analiz posteriormente la produccin de cidos orgnicos durante la fermentacin. Esta
es una caracterstica importante, debido a que los cidos orgnicos estn vinculados con las
propiedades organolpticas e inhibitorias de los productos fermentados. En el
cromatograma de suero sin fermentar se obtuvieron 3 picos pronunciados a tiempos de
retencin 7.6, 9.2 y 15.4 min (Figura 1.11). El pico a tiempo 9.2 min correspondi a cido
ctrico mientras que los otros 2 picos no coincidieron con el tiempo de retencin de ninguno
de los cidos orgnicos incluidos como referencia: oxlico (8.2 min), ctrico (9.2 min),
ascrbico (10.1 min), pirvico (10.6 min), mlico (10.8 min), succnico (13.0 min), lctico
(14.4 min), frmico (15.7 min), actico (17.0 min), propinico (20.0 min) y butrico (24.1
min). Asimismo se observaron picos de menor rea con tiempos de retencin equivalentes
a cido mlico, lctico y a un cido no identificado a tiempo de retencin 12.4 min.
88
0,4
cido ctrico
9.2
0,3
15.4
0,2
7.6
0,1
cido mlico
10.8
cido lctico
14.3
12.4
0,0
10
12
14
16
18
20
Tiempo de retencin
Figura 1.11: Cromatograma de suero bovino en polvo reconstituido al 10 % p/v.
Las concentraciones de cidos ctrico, lctico y actico fueron calculadas mediante curvas de
calibracin construidas con soluciones de cidos con concentracin conocida. El suero
present un contenido de cido ctrico de 0.84 0.07 g/100ml, de cido lctico de 0.05
0.01 g/100ml y de cido actico de 0.014 0.003 g/100ml. Estos valores son similares a los
descriptos por Mullin y Emmons (1997) para suero de queso Cheddar que presenta una
concentracin de cido ctrico entre 0.10 y 0.16 g/100ml, de cido lctico entre 0.02 y 0.04
g/100ml y trazas de cido actico. La concentracin de cidos orgnicos en los quesos y
sueros es variable dependiendo el tipo de suero e incluso puede diferir entre partidas de la
misma variedad de queso (Mullin y Emmons, 1997).
Al fermentar suero con 10 % de grnulos de kefir se observ un aumento de las reas bajo
los picos con tiempos de retencin equivalentes a los cidos mlico, lctico, actico,
succnico y de otros a tiempo de retencin 7.5, 8.5, 20.9 min que no pudieron ser
identificados. Mientras que la concentracin de cido ctrico fue menor en el producto
fermentado que en el suero (Figura 1.12).
Cuando la fermentacin se llev a cabo con grnulos en concentracin 1 % se obtuvo una
variacin similar de los cidos orgnicos, aunque no se observ produccin de cido
succnico. La produccin de cidos orgnicos fue notoriamente menor al emplear grnulos
en menor proporcin, en correspondencia con el mayor pH del producto.
89
0,4
cido ctrico 9.3

0,3
cido lctico
14.3
cido mlico
10.7
cido actico
17.0
cido
succnico 15.3
0,2
7.5
0,1
12.9
8.5
20.9
0,0
10
12
14
16
18
20
22
24
Tiempo de retencin
Figura 1.12. Cromatogramas de suero () y suero fermentado durante 24 h a 20 C con

grnulos de kefir en concentracin 1 % () y 10 % ().
Se cuantific la concentracin de cido lctico y actico en ambos productos a lo largo de

la fermentacin. En 24 h el suero fermentado con grnulos en concentracin 1 % present
1610 250 ppm (0.16 %) de cido lctico y 115 31 ppm (0.01 %) de actico, en tanto que
al emplear grnulos al 10 % las concentraciones fueron 9000 690 ppm (0.90 %) y 800 51
ppm (0.08 %) respectivamente. La produccin de ambos cidos fue notoriamente menor al
emplear menor inculo (Figura 1.13).
B
800
10000
cido actico (ppm)
cido lctico (ppm)
7500
5000
2500
600
400
200
0
0
0
12
16
Tiempo (h)
20
24
12
16
20
24
Tiempo (h)
Figura 1.13: Produccin de cido lctico (A) y cido actico (B) durante la fermentacin a 20
C de suero con grnulos de kefir en concentracin 1 % p/v () y 10 % ().
El consumo de lactosa comenz luego de 5 h de incubacin cuando se emplearon grnulos

de kefir en concentracin 10 %, mientras que cuando se utilizaron al 1 % hubo un perodo
de 13 h antes de observarse descenso en el contenido de lactosa del suero (Figura 1.14).
Asimismo la concentracin de lactosa remanente en el producto result superior cuando
se inocularon grnulos en menor concentracin.
7
6
Lactosa (g/100ml)
90
5
4
3
2
0
12
16
20
24
Tiempo (h)
Figura 1.14: Concentracin de lactosa en suero durante su fermentacin con grnulos de
kefir en concentracin 1 % p/v () y 10 % ().
Este anlisis permiti determinar que al inocular de grnulos de kefir en concentracin 10 %

p/v hay mayor acidificacin, produccin de cidos orgnicos y consumo de lactosa durante
la fermentacin de suero que cuando se inoculan al 1 % p/v. A pesar de que el crecimiento
de los grnulos de kefir y la concentracin de BAL en el suero fermentado fueron mayores al
utilizar grnulos al 1 % p/v, se opt por emplear la mayor concentracin de inculo en los
siguientes estudios a fin de acelerar el proceso de fermentacin.
2.2 Empleo de distintos sueros como sustrato

La composicin del suero es variable segn la leche a partir de la cual se fabrique el queso y
de su proceso de elaboracin. Si bien el queso elaborado a partir de leche de vaca es el ms
popular, en algunas regiones del mundo la leche de cabra y de oveja son utilizadas en la
manufactura de productos lcteos lo que resulta en la generacin de suero de distintos
orgenes. A fin de determinar si la utilizacin de distintos sueros afecta las caractersticas del
producto obtenido se analizaron comparativamente los productos de fermentacin de 3
91
sueros de quesera: dos provenientes de quesos de origen bovino (uno de ellos

deshidratado por secado en spray) y uno de origen ovino. Se determin la composicin
qumica de los 3 tipos de suero empleados como sustrato, observndose diferencias en su
contenido de lpidos, protenas, lactosa y minerales (Tabla 1.9). Cabe sealar que antes de
realizar el anlisis fsico-qumico el suero en polvo se reconstituy en agua al 10 % p/v.
Tabla 1.9: Composicin qumica de distintos sueros empleados como sustrato
Bovino en polvo
reconstituido al
10 % p/v
Bovino lquido Ovino lquido
Protenas (g/100g)
1.0
1.3
1.6
Lpidos (g/100ml)
<0.3
0.4
0.7
Lactosa (g/100g)
6.5
7.1
4.6
91.3
88.7
90.7
Cenizas (g/100 ml)
0.8
1.7
1.6
Sodio (mg/100ml)
60
430
440
10.1
11.4
11.3
239.4
324.0
162.5
Calcio (mg/100 ml)
55
56
50
Fsforo (mg/100ml)
<100
<100
<100
pH
6.34
6.38
6.43
cido lctico (g/100ml)
0.05
0.04
0.22
Humedad (g/100ml)
Magnesio (mg/100ml)
Potasio (mg/100ml)
Los grnulos de kefir fueron cultivados en concentracin 10 % p/v en los distintos sueros
durante 20 subcultivos cada 24 h a 20 C. El crecimiento de los grnulos en suero vacuno
en polvo reconstituido fue 0.076 0.04, en suero vacuno lquido 0.068 0.05 y en suero
ovino lquido 0.056 0.03. Estos valores no fueron significativamente diferentes (=0,05).
Tampoco se observaron cambios en el aspecto macroscpico de los grnulos que
mantuvieron su integridad a lo largo de sucesivos cultivos en los tres sueros analizados
(Figura 1.15).
92
Figura 1.15: Apariencia de grnulos de kefir crecidos durante 20 subcultivos a 20 C en

suero bovino en polvo reconstituido (A), bovino lquido (B) y ovino (C).
La composicin microbiolgica en los 3 sueros fermentados con grnulos de kefir tampoco

result significativamente diferente (P>0.05). El promedio de la concentracin de bacterias
cido lcticas fue 1.0 a 1.2 x 107 UFC/ml y el de levaduras de 2.0 a 4.2 x 106 UFC/ml (Tabla
1.10).
Tabla 1.10: Composicin microbiolgica de distintos sueros fermentados con grnulos de
kefir 10 % p/v durante 24 h a 20 C.
Suero
BAL (UFC/ml)
Levaduras (UFC/ml)
Bovino en polvo
1.0 0.6 x107 a 1
4.2 1.5 x106 a
Bovino lquido
1.0 0.3 x107 a
2.0 1.4 x106 a
Ovino lquido
1.2 0.4 x107 a
2.7 1.6 x106 a
Dentro de la misma columna letras diferentes indican diferencias significativas (=0.05) evaluadas
La composicin qumica de los sueros fermentados fue similar a la de los sueros empleados
como sustratos, excepto en el contenido de lactosa y de cido lctico (Tabla 1.9 vs. Tabla
1.11).
Durante la fermentacin el contenido de lactosa en todos los sueros disminuy 40 a 50 %
respecto al inicial, mientras que el cido lctico alcanz una concentracin promedio en el
producto de 0.9 a 1.2 % (Tabla 1.11).
93
Tabla 1.11: Composicin qumica de distintos sueros fermentados con 10 % p/v de grnulos
de kefir durante 24 h a 20 C.
Bovino en polvo
Bovino lquido
Ovino lquido
0.93 0.06
1.35 0.07
1.25 0.49
<0.3
0.4
0.4
3.36 0.92
3.81 1.26
2.71 0.45
93.23 1.01
89.5 0.14
91.65 0.21
Cenizas (g/100 ml)
0.69 0.02
1.85 0.07
1.65 0.07
Sodio (mg/100ml)
50 10
440 20
460 10
8.8 2.4
10.4 1.6
10.6 1.7
Potasio (mg/100ml)
220.1 8.6
290.5 6.8
159.0 16.8
Calcio (mg/100ml)
48.0 9.0
57.9 2.3
55.4 1.7
<100
<100
<100
pH
3.65 0.09
3.54 0.06
3.39 0.04
0.90 0.03
0.99 0.04
1.20 0.05
Protenas (g/100g)
Lpidos (g/100ml)
Lactosa (g/100g)
Humedad (g/100ml)
Magnesio (mg/100ml)
Fsforo (mg/100ml)
Los resultados obtenidos indican que los grnulos de kefir se preservan como starters y que
la composicin microbiolgica de los productos y las variaciones en la composicin qumica
del suero durante la fermentacin son similares al utilizar distintos sueros como sustrato.
2.3 Fermentacin de suero a distintas temperaturas

La temperatura de fermentacin es una variable a tener en cuenta ya que influye en la
velocidad de elaboracin de un producto fermentado.
La mayor parte de los microorganismos del kefir son mesfilos, por lo que el kefir se elabora
convencionalmente a temperatura ambiente, generalmente entre 20 y 25 C. Publicaciones
previas indican que a temperaturas ms altas de fermentacin hay un mayor aumento de
biomasa de los grnulos de kefir, la produccin de etanol comienza con anterioridad (Zajsek
y Gorsek, 2010), se acelera la velocidad de fermentacin, hay mayor consumo de lactosa
(Golfinopoulos y col., 2011) y varan la produccin de exopolisacrido y las caractersticas
reolgicas del kefir (Rimada y Abraham, 2001; Bensmira y col., 2010). De acuerdo con estos
estudios, distintas temperaturas podran emplearse segn el producto que se desee
obtener. Sin embargo, existen escasos antecedentes sobre el efecto de la temperatura en la
integridad de los grnulos de kefir y la composicin microbiolgica de los mismos y del

producto fermentado.
2.3.1 Grnulos de kefir en suero a distintas temperaturas
En una primera etapa se evalu el aspecto macroscpico, la composicin qumica y
microbiolgica de los grnulos de kefir luego de 20 subcultivos en suero a distintas
temperaturas. Como se indic en la seccin 1.1 cuando los grnulos de kefir se emplearon
en sucesivas fermentaciones de suero a 20 C conservaron su composicin microbiolgica,
capacidad de crecimiento y apariencia comparados con los grnulos de kefir originales
provenientes de leche.
30
25
Biomasa (g)
94
20
15
10
5
0
12
15
Das
Figura 1.16: Aumento de biomasa de grnulos de kefir crecidos en suero a () 20 C, ()

30 C y () 37 C.
Cuando la fermentacin se llev a cabo a 30 C el crecimiento fue similar durante las

primeras fermentaciones, sin embargo luego de 9 cultivos en suero a 30 C los grnulos
presentaron un crecimiento escaso e inconstante (Figura 1.16), el crecimiento promedio en
20 mediciones result de 0.069 0.07 g/g. En concordancia con estos valores, Rimada y
Abraham (2001) hallaron en suero desproteinizado un incremento de biomasa de los
grnulos a 30 C de 0.05 0.02 g/g. Zajsek y Gorsek (2010) informaron que el crecimiento
de los grnulos de kefir en leche se incrementaba linealmente al aumentar la temperatura
de fermentacin de 15 a 31 C. De acuerdo a los resultados del presente estudio no es
posible obtener un aumento constante de la biomasa en el tiempo a 30 C en suero.
95
Asimismo se observ un cambio en el aspecto de los grnulos crecidos a esta temperatura,

los mismos presentaron aspecto menos granuloso, consistencia menos compacta y fueron
ms adhesivos que los grnulos crecidos a 20 C (Figura 1.17). Los grnulos de kefir crecidos
a 30 C presentaron adems un contenido de humedad significativamente menor y mayor
cantidad de protenas en relacin a los polisacridos en la matriz del grnulo respecto a los
cultivados a 20 C (Tabla 1.12).
Figura 1.17: Apariencia de los grnulos de kefir luego de ser incubados durante 20 das a
distintas temperaturas. De izquierda a derecha: 20 C, 30 C y 37 C.
A 37 C los grnulos fueron incapaces de aumentar su biomasa al subcultivarse cada 24 h

por perodos prolongados en suero (Figura 1.16) resultando la tasa de crecimiento negativa
(-0.017 0.047 g/g). En concordancia con estos resultados Rimada y Abraham (2001)
hallaron que los grnulos de kefir disminuyen su biomasa 0.03 g/g en 5 h y 30 min en suero
de leche desproteinizado a 37 C. Los grnulos presentaron coloracin amarillenta, un
granulado de menor tamao y fueron ms compactos que aquellos crecidos a 20 C (Figura
1.17). Al igual que en la incubacin a 30 C, la matriz de los grnulos crecidos a 37 C
present un menor contenido de humedad y mayor relacin protenas/polisacridos que la
de aquellos crecidos a 20 C (Tabla 1.12). La desintegracin de los grnulos podra deberse a
una modificacin del crecimiento o viabilidad de los microorganismos por la temperatura.
Asimismo podra verse afectada la actividad metablica de algunos microorganismos
responsables de la secrecin de la matriz del grnulo.
96
Tabla 1.12: Composicin microbiolgica, contenido de humedad y relacin

protenas/polisacridos de grnulos de kefir crecidos en suero a distintas temperaturas de
incubacin.
BAL
(UFC/g)
Levaduras
(UFC/g)
Humedad
(g/kg)
Protenas/
polisacridos
20 C
6.0 3.1 x 107 a*
8.2 3.9 x 107 a
805 5 a
0.60 a
30 C
1.3 0.5 x 108 a,b
7.5 5.3 x 107 a,b
716 18 b
1.01 b
37 C
2.1 0.7 x 108 b
7.4 6.8 x 106 b
703 9 b
0.86 c
*Dentro de la misma columna letras diferentes indican diferencias significativas (=0.05) evaluadas
La concentracin de bacterias cido lcticas y levaduras de los grnulos de kefir crecidos en

suero a 30 C no vari significativamente respecto a la de aquellos crecidos a 20 C (Tabla
1.12). A 37 C los grnulos presentaron una concentracin de bacterias cido lcticas
significativamente mayor y de levaduras significativamente menor (P<0.05) que a 20 C
(Tabla 1.12). En concordancia con este resultado Zajsek y Gorsek (2010) describieron que las
levaduras presentes en los grnulos de kefir disminuan progresivamente a cuando los
mismos se incubaban en leche a temperaturas mayores a 25 C.
Cuando se compararon los grnulos crecidos a distintas temperaturas por DGGE no se
observaron diferencias en los perfiles de bacterias (Figura 1.18 A). Sin embargo la banda d
cuya secuencia aline con Kaz. unispora, Kaz. servazzii y Kaz. aquatica y banda f que aline
con K. marxianus estuvieron ausentes en los grnulos crecidos a 30 C y 37 C (Figura 1.18
B). Esto indica que hubo una reduccin de la diversidad de levaduras al aumentar la
temperatura de incubacin.
97
Figura 1.18: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN extrado a partir
de grnulos de kefir crecidos durante 20 subcultivos en suero a 20 C, 30 C y 37 C. A:
kefir ATCC 8007 y Lactobacillus parakefir DSMZ 1055. (RL) Levaduras de referencia:
Kluyveromyces lactis, Saccharomyces unisporus CIDCA 81107, Kluyveromyces marxianus
CIDCA 8154 y Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112.
Los resultados indican que al aumentar la temperatura de incubacin de 20 C a 30 y 37 C

los grnulos no aumentan su biomasa, presentan modificaciones en su aspecto, en la
composicin qumica de su matriz y ocurre un desbalance en la composicin microbiolgica.
De manera que para preservar la integridad de los grnulos subcultivados cada 24 h en
suero es conveniente emplear una temperatura de incubacin de 20 C.
2.3.2 Caracterizacin de suero fermentado con grnulos de kefir a diferentes

temperaturas.
Se realizaron cinticas de acidificacin empleando grnulos adaptados a suero durante 20
subcultivos a cada una de las temperaturas ensayadas (20 C, 30 C y 37 C) y grnulos
crecidos previamente en leche a 20 C.
Cuando grnulos de kefir previamente crecidos en leche se utilizaron para fermentar suero
se observ un aumento de la velocidad de acidificacin con la temperatura (Figura 1.19).
Cuando se utilizaron los grnulos despus de 20 subcultivos en suero a las diferentes
temperaturas, las cinticas de acidificacin no variaron a 20 C y 30 C, pero a 37 C la
capacidad de acidificacin se vio notoriamente reducida (Figura 1.19). Los productos
obtenidos empleando grnulos luego de 20 subcultivos en suero presentaron pH 3.3 a 30
C, 3.6 a 20 C y 3.9 a 37 C. Este resultado se encuentra en concordancia con las
modificaciones en el aspecto, crecimiento, composicin qumica y composicin
microbiolgica halladas en los grnulos crecidos a 37 C.
pH
98
3
0
12
16
20
24
Tiempo (h)
Figura 1.19: Cintica de acidificacin de suero fermentado con 10 % (p/v) de grnulos de

kefir en el primer cultivo en suero (smbolos abiertos) o en el cultivo 20 en suero (smbolos
cerrados) incubados a 20 C (,), 30 C (,), y 37 C (, ).
99
La composicin de cidos orgnicos a lo largo de la fermentacin de suero a distintas

temperaturas se analiz mediante HPLC de intercambio inico.
A
20 C
0,5
0,4
cido lctico
cido ctrico
0,3
cido
succnico
7.6
0,2
cido actico
cido
8.5
0,1
15.5
mlico
0,0
8
10
12
14
16
18
Tiempo de retencin
30 C
cido lactico
0,5
0,4
cido citrico
0,3
0,2
7.6
cido mlico
15.5
8.5
0,1
13.3
11.3
cido actico
0,0
8
10
12
14
16
18
Tiempo de retencion
37 C
0,5
0,4
cido ctrico
cido lctico
0,3
7.6
cido
cido
mlico
0,2
succnico
cido actico
8.5
0,1
11.5
15.5
0,0
8
10
12
14
16
18
Tiempo de retencin
Figura 1.20: Cromatogramas de suero () y suero fermentado con grnulos de kefir

adaptados a suero en concentracin 10 % p/v durante 7 () y 24 () h a 20 C (A), 30 C (B)
y 37 C (C).
A todas las temperaturas hubo un descenso de la concentracin de cido ctrico y un

aumento de la concentracin de cidos lctico, actico y succnico. A 30 C hubo adems
una notable produccin de cido mlico. Asimismo se observ en todos los cromatogramas
un aumento del rea bajo los picos a tiempos de retencin 7.6 y 8.5 que no pudieron ser
identificados (Figura 1.20).
La concentracin de cido lctico y actico en suero a lo largo de la fermentacin se calcul
mediante curvas de calibracin con concentraciones de cidos conocidas. En concordancia
con las cinticas de acidificacin obtenidas luego de 20 subcultivos en suero, la produccin
de cido lctico durante la fermentacin fue mayor a 30 C que a 20 C desde las primeras
horas de incubacin, mientras que a 37 C fue an menor que a 20 C (Figura 1.21 A). Por
otra parte, la produccin de cido actico fue similar a 30 C y 37 C y mayor que a 20 C
(Figura 1.21 B). En 24 horas de incubacin los niveles de cido lctico y actico fueron
respectivamente 0.90 % y 0.08 % en suero fermentado a 20 C, 1.99 % y 0.19 % a 30 C y
0.82 % y 0.16 % a 37 C.
B
cido actico (ppm)
A
cido lctico (ppm)
100
20000
15000
10000
5000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
0
10
15
Tiempo (h)
20
25
10
15
20
25
Tiempo (h)
Figura 1.21: Produccin de cido lctico (A) y cido actico (B) en durante la fermentacin
de suero a distintas temperaturas de incubacin: 20 C (), 30 C () y 37 C ().
Las BAL fermentan azcares principalmente mediante 2 rutas. La va de Embden-MeyerhofParnas que conduce casi exclusivamente a la produccin de cido lctico, conocindose este
metabolismo como fermentacin homolctica. Y la va de las pentosas fosfato que conduce
a la generacin de cantidades significativas de otros productos finales tales como etanol,
101
acetato y CO2 adems de cido lctico y es conocida con fermentacin heterolctica

(Axelsson, 2004). El kefir presenta en su composicin BAL tanto homo como
heterofermentativas, que explican la produccin de cido lctico y actico durante la
fermentacin del suero con grnulos de kefir.
Si bien estas vas son las ms frecuentes, diferentes condiciones de crecimiento pueden
afectar significativamente los productos finales formados por las BAL fundamentalmente
debido al desvo del piruvato hacia rutas metablicas alternativas y/o al uso de aceptores
externos de electrones.
La presencia de citrato en el suero puede incidir en la formacin de productos metablicos
distintos a los cidos lctico y actico durante la fermentacin. El citrato puede ser
metabolizado por algunas BAL, su metabolismo se ha estudiado en mayor detalle para
Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Leuconostoc sp. y Weissella sp. que son empleadas
para la sntesis de compuestos aromticos en la industria lctea (Garca Quintans y col.,
2008). Sin embargo tambin se ha descripto para especies del gnero Lactobacillus tales
como L. casei, L. plantarum, L. viridensces, L paracasei, L. zeae y L. rhamnosus (Skeie y col.,
2008).
Figura 1.22: Ruta de utilizacin de citrato en bacterias cido lcticas y sus productos
metablicos. El citrato es transportado al interior de la clula por un transportador
especfico de membrana (T), luego es escindido en oxalacetato y acetato por la citrato liasa
(CL). El oxalacetato puede seguir 2 vas: 1. la formacin de piruvato y CO2 por actividad de la
enzima oxalacetato descarboxilasa (OAD), el piruvato puede ser metabolizado a distintos
productos finales dependiendo del microorganismo y las condiciones de fermentacin; 2.
En ausencia de OAD el oxalacetato acta como aceptor de electrones generndose
succinato.
102
El citrato es transportado al interior de las clulas y luego es escindido a acetato y

oxalacetato por la enzima citrato liasa. Si la bacteria presenta la enzima oxalacetato
descarboxilasa, el oxalacetato puede ser convertido a piruvato. El exceso de piruvato
generado puede seguir rutas que conducen a la produccin de diacetilo, acetona, formiato
y acetato dependiendo de la bacteria y las condiciones de crecimiento (Figura 1.22, va
indicada como 1). En ausencia de la enzima oxalacetato descarboxilasa el oxalacetato acta
como aceptor de electrones transformndose a succinato (Figura 1.22, va indicada como
2). Esta ruta ha sido descripta para explicar la produccin de cido succnico durante el cometabolismo de citrato con otros azcares tales como la lactosa (Axelsson, 2004). Asimismo
podra explicar la produccin de cido succnico durante la fermentacin de suero
observada en el presente estudio.
El metabolismo del cido ctrico contribuye a mejorar el crecimiento durante su cometabolismo con otras fuentes de azcares. Adems se ha descripto que tiene un efecto
protector contra el estrs cido, ya que conduce a la alcalinizacin del citoplasma por el
consumo intracelular de protones durante su degradacin y del medio externo por la
secrecin de compuestos menos cidos resultantes de su catabolismo (Garca Quintans y
col., 2008).
El aumento de cido mlico durante la fermentacin de suero, observado
fundamentalmente a 30 C, podra asociarse al metabolismo de levaduras. Algunas
levaduras, tales como Zygosaccharomyces rouxxi (Taing y Taing, 2007) y Saccharomyces
cerevisiae (Schwartz y Radler, 1988; Pines y col., 1996, 1997; Zelle y col., 2008) son capaces
de producir cido mlico. Se ha descripto que la produccin puede ocurrir por 4 vas: i) por
reduccin de oxalacetato a malato, ii) por condensacin de oxalacetato con acetil-CoA para
formar cido ctrico seguido por la oxidacin a malato a travs del ciclo de los cidos
tricarboxlicos, iii) por condensacin de 2 molculas de acetil-CoA por va cclica a travs del
ciclo del glioxilato, o iv) utilizando enzimas del glioxilato a travs de una va no cclica en la
cual el oxalacetato es regenerado por carboxilacin del piruvato (Figura 1.23) (Zelle y col.,
2008).
103
Figura 1.23: Rutas metablicas que pueden conducir a la produccin de malato por
levaduras. Adaptado de Zelle y col., 2008.
La composicin microbiolgica de los productos fermentados a distintas temperaturas se

analiz mediante recuentos de BAL y levaduras viables en placa realizados al momento en
que los cultivos alcanzaron pH 4 y a las 24 h de fermentacin.
Los productos fermentados alcanzaron pH 4 luego de 2 h a 30 C, de 4 h a 20 C y de 16 h a
37 C. La concentracin de microorganismos en los 3 productos a estos tiempos fue
semejante a la obtenida luego de 24 h de fermentacin (Figura 1.24 A vs. B).
El suero fermentado a 30 C y 37 C present significativamente mayor (P<0.05) contenido
de bacterias cido lcticas que el suero fermentado a 20 C. El contenido de levaduras fue
significativamente diferente (P>0.05) entre las 3 temperaturas de fermentacin. Puede
notarse que a temperaturas elevadas hay un desbalance de la microbiota aumentando la
relacin BAL/levaduras.
A
pH 4
b
10
b
b
10
24 h
10
a
b
10
UFC/ml
UFC/ml
10
10
10
a
c
a
b
10
10
10
20 C
30 C
37 C
Temperatura de incubacin
20 C
30 C
37 C
Temperatura de incubacin
Figura 1.24: Concentracin de bacterias cido lcticas () y levaduras () en suero

fermentado con grnulos de kefir a distintas temperaturas al alcanzar pH 4 (A) y luego de
24 h de fermentacin (B). Letras diferentes entre barras del mismo color de cada grfico
indican diferencias significativas (=0.05).
104
Las diferencias halladas en los recuentos no se vieron reflejadas en los perfiles DGGE
que resultaron idnticos a las distintas temperaturas de incubacin (Figura 1.25). De
manera que la temperatura no afect la composicin de especies presentes en el
producto pero si la concentracin de microorganismos viables.
A
Figura 1.25: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN extrado a partir
suero fermentado 24 h con 10 % p/v de grnulos de kefir a 20 C, 30 C y 37 C. A:
kefir ATCC 8007, Lactobacillus parakefir DSMZ 1055 y Lactobacillus casei DSMZ 20011. (RL)
Levaduras de referencia: Kluyveromyces lactis, Saccharomyces unisporus CIDCA 81107,
Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154, y Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112.
Tal como indican las cinticas de pH realizadas con grnulos provenientes de leche es
posible aumentar la velocidad de fermentacin empleando mayores temperaturas de
incubacin. Sin embargo los grnulos se alteran luego de sucesivas fermentacin cada 24 h
en suero a 30 y 37 C, lo cual se refleja en una disminucin de la capacidad de acidificacin,
105
diferencias en la composicin de cidos orgnicos y en el balance microbiano de los

productos fermentados obtenidos a distintas temperaturas. Dado que el contenido de BAL y
levaduras de los productos fue similar a pH 4 que luego de 24 h de fermentacin sera
interesante evaluar la integridad de los grnulos en fermentaciones sucesivas de suero a
altas temperaturas acortando el tiempo de incubacin.
3. Fermentacin de suero con cultivos iniciadores alternativos

Uno de los desafos ms importantes en la industrializacin del kefir es lograr un producto
de calidad satisfactoria y constante, dado que la diversidad microbiana de los grnulos
dificulta la obtencin de un producto de caractersticas homogneas. Por otra parte, para
elaborar kefir a escala industrial se requeriran grandes cantidades de grnulos de kefir y el
desarrollo de estrategias para aprovechar el exceso de grnulos que se generara debido su
constante crecimiento. En consecuencia se evaluaron procesos de fermentacin de suero
empleando, como starters alternativos a los grnulos de kefir, cultivos madre y cepas
aisladas de kefir.
3.1 Fermentacin de suero con cultivos madre en suero y en leche

Los cultivos madre en suero y en leche se obtuvieron de la fermentacin de suero y leche
con grnulos de kefir al 10 % p/v durante 24 h a 20 C. Estos cultivos fueron luego aadidos
a suero fresco en concentracin 10 % v/v e incubados durante 24 h a 20 C (Figura 1.26).
Mediante esta tcnica se reduce 10 veces la cantidad de grnulos indispensables para lograr
la misma cantidad de producto que al emplear directamente grnulos de kefir.
productos obtenidos fueron caracterizados qumica y microbiolgicamente.
Los
106
Figura 1.26: Esquema del procedimiento utilizado para obtener suero fermentado con
cultivos madre en suero y en leche.
La composicin microbiolgica de los cultivos madre empleados como starters se presenta

en la Tabla 1.13. A fines comparativos se incluye tambin en la tabla la composicin
microbiolgica de los grnulos de kefir. Estos inculos presentan diferencias no slo en su
contenido de BAL y levaduras viables sino tambin en sus perfiles DGGE (seccin 1.1 Figuras
1.4 y 1.6; seccin 1.2 Figura 1.9).
Tabla 1.13: Composicin microbiolgica de los grnulos de kefir y de los cultivos madre en
suero y leche empleados como starters.
BAL (UFC/g)
Levaduras (UFC/g)
Grnulos de kefir
6.0 3.1 x 107
8.3 3.0 x 107
Cultivo madre en leche
3.9 3.1 x 108
8.8 5.4 x 105
Cultivo madre en suero
1.0 0.7 x 107
4.2 1.7 x 106
Cuando se emplearon como inculos cultivos madre obtenidos en suero o en leche se

obtuvieron productos con un contenido de BAL significativamente mayor que al emplear
grnulos de kefir (Tabla 1.14). El contenido de levaduras fue significativamente (P<0.05)
mayor en el suero fermentado con cultivo de suero y menor en aquel fermentado con
cultivo de leche respecto al producto obtenido empleando grnulos de kefir (Tabla 1.14).
107
Tabla 1.14: Composicin microbiolgica de suero fermentado empleado distintos starters.

Starter
BAL (UFC/ml)*
Levaduras (UFC/ml)*
Grnulos de kefir (10 % p/v)
1.0 0.7 x 107 a
4.2 1.7 x 106 a
Cultivo madre en leche (10 % v/v)
7.7 1.3 x 108 b
7.5 3.0 x 105 b
Cultivo madre en suero (10 % v/v)
1.5 0.3 x 108 c
1.1 0.5 x 107 c
*Se presenta el promedio y el desvo estndar de 8 mediciones independientes.
Los productos obtenidos de la fermentacin de suero con cultivos madre en leche y suero
fueron caracterizados en cuanto a su composicin qumica (Tabla 1.15). El suero
fermentado con cultivos madre no presenta una variacin significativa en su contenido de
protenas, lpidos, humedad, cenizas ni minerales respecto al suero empleado como
sustrato (Tabla 1.15 vs. Tabla 1.9 suero bovino en polvo reconstituido, seccin 2.2).
Tabla 1.15: Composicin qumica de suero fermentado con cultivos madre en suero y en
leche.
Suero fermentado utilizando como starter
Cultivo madre en suero Cultivo madre en leche
Protenas (g/100g)
1.05 0.07
1.25 0.07
Lpidos (g/100ml)
<0.3
<0.3
Lactosa (g/100g)
3.60 0.99
4.5 1.08
Humedad (g/100ml)
91.95 0.21
91.6 0.14
Cenizas (g/100 ml)
0.55 0.21
0.75 0.07
Sodio (mg/100ml)
60 10
50 10
Magnesio (mg/100ml)
9.2 2.1
9.7 1.4
Potasio (mg/100ml)
219.8 24.4
223.6 15.7
Calcio (mg/l)
44.3 10.6
57.1 1.3
Fsforo (mg/100ml)
<100
<100
pH
5.05 0.35
4.46 0.01
0.20 0.07
0.55 0.02
cido actico (g/100ml)
0.04 0.02
0.11 0.01
El suero fermentado con cultivo de leche present menor pH y mayor contenido de cido
lctico y actico que el fermentado con cultivo de suero. Por otro lado, en el cromatograma
del producto fermentado con cultivo de suero se observ una notable produccin de cido
108
mlico y, a diferencia de lo hallado en otros sueros fermentados, no se detect una

disminucin sino un aumento de la concentracin de cido ctrico (Figura 1.27).
La mayor produccin de cido mlico podra deberse a la mayor concentracin de levaduras
en el suero fermentado con cultivo de suero, dado que como se explic anteriormente este
cido puede generarse como producto final del metabolismo de algunas levaduras.
Tambin el cido ctrico puede formarse como producto metablico de levaduras (Grewal y
Kalra, 1995; Anastasssiadis y col., 2008).
0,5
cido ctrico
0,4
0,3
cido mlico
cido lctico
0,2
7.6
0,1
cido actico
20.9
0,0
6
10
12
14
16
18
20
22
Figura 1.27: Cromatograma de suero () y de suero fermentado 24 h a 20 C con cultivo

madre en suero () y en leche ().
La diferencia entre el perfil de cidos orgnicos de suero fermentado con grnulos de kefir y
con cultivo madre de suero podra deberse a diferencias en la composicin de especies de
ambos productos. Respecto a esto Simova y col. (2002) describieron variaciones en la
composicin y estructura cuantitativa de especies presentes en leche fermentada con
grnulos de kefir respecto a aquella fermentada con kefir, indicando que ocurre un
desbalance en la microbiota. En qu medida la modificacin de la composicin microbiana,
pH y composicin de cidos orgnicos de los productos obtenidos a partir de cultivos madre
es favorable o desfavorable deber ser evaluada de acuerdo con la aplicacin que se le
otorgue al producto.
109
3.2 Fermentacin de suero con microorganismos aislados de kefir

El CIDCA cuenta con una coleccin de bacterias cido lcticas y levaduras aisladas de kefir
que han sido estudiadas en cuanto a sus caractersticas probiticas determinndose su
resistencia a bajos pH, tolerancia la bilis, capacidad de autoagregar y coagregar con otros
microorganismos, su adherencia a enterocitos en cultivo, su accin antagnica sobre
toxinas y/o microorganismos patgenos y su capacidad inmunomoduladora in vitro.
Golowczyc y col. (2008) estudiaron las propiedades superficiales y probiticas de 11
lactobacilos homofermentativos aislados de kefir de la especie Lactobacillus plantarum.
Entre ellos se seleccion la cepa CIDCA 8327 por presentar alta tolerancia a la bilis,
resistencia a pH cido (sobrevida del 42 % a pH 2.5 durante 3 h), alta adhesin a clulas
Caco-2 in vitro y capacidad de inhibir el crecimiento de Salmonella enterica serovar.
Thyphimurium, S. enterica serovar. Gallinarum, S. enterica serovar. Enteritidis, Shigella
sonnei y Escherichia coli.
Entre los lactobacilos heterofermentativos se seleccion la cepa de Lactobacillus kefir CIDCA
8348 que presenta alta de hidrofobicidad, resistencia a la bilis, alta adhesin a clulas
intestinales epiteliales y capacidad de coagregar con Salmonella enterica serovar. Enteritidis
(Golowczyc, 2008). Esta cepa posee adems capa-S, cuya protena constituyente es
excretada naturalmente al medio de crecimiento y se deposita sobre la superficie de
Salmonella disminuyendo su capacidad invasiva (Golowczyc y col., 2007).
Se escogi tambin la levadura Kluyveromyces marxianus CIDCA 8354 que presenta alta
tolerancia a las sales biliares y a la acidez, reduce la accin citotxica de Clostridium difficile
(Diosma, 2010) y presenta capacidad inmunomoduladora (Romanin y col., 2010).
Se evalu la factibilidad de utilizar suero como sustrato para crecer estas cepas y se
caracterizaron los productos fermentados obtenidos.
Las cepas L. kefir CIDCA 8348, L. plantarum CIDCA 8327 y K. marxianus CIDCA 8154 aisladas
de kefir se inocularon por separado o las 3 conjuntamente en suero esterilizado por
tindalizacin a una concentracin 106 UFC/ml. Se analiz el crecimiento, la acidificacin y la
produccin de cidos orgnicos durante 72 h de incubacin.
3.2.1 Crecimiento de los microorganismos en suero en cultivos puros y mixtos

K. marxianus CIDCA 8154 y L. plantarum CIDCA 8327 fueron capaces de desarrollar en suero
hasta alcanzar una concentracin de 5 x 107 UFC/ml y 1 x 108 UFC/ml respectivamente,
mientras que L. kefir CIDCA 8348 present un crecimiento escaso en este medio,
alcanzando concentracin de 1 x 107 UFC/ml. Cuando se inocularon las 3 cepas
simultneamente, el crecimiento de L. plantarum y K. marxianus no se modific respecto al
obtenido con las cepa puras, pero el de L. kefir aument significativamente, alcanzando una
concentracin de 1 x 108 UFC/ml en el producto fermentado (Figura 1.28).
Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154
Concentracin (UFC/ml)
A
10
10
10
24
48
72
Tiempo (h)
Lactobacillus plantarum CIDCA 8327
110
10
10
10
24
48
Tiempo (h)
72
Lactobacillos kefir CIDCA 8348
111
10
10
10
24
48
72
Tiempo (h)
Figura 1.28: Crecimiento de Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 (A), Lactobacillus

plantarum CIDCA 8327 (B) y Lactobacillus kefir CIDCA 8348 (C) cuando son inoculadas en
suero individualmente () o cuando crecen las 3 en cultivo mixto ().
Lactobacillus kefir es incapaz de metabolizar la lactosa, el carbohidrato mayoritario del

suero, por lo que este efecto sinrgico en el crecimiento podra deberse en parte a la
fermentacin de lactosa por K. marxianus. El metabolismo de lactosa por parte de la
levadura permitira su transformacin en otros compuestos orgnicos que puedan ser
utilizados como nutrientes por los lactobacilos. Adems K. marxianus posee capacidad de
producir vitaminas que mejoran el crecimiento de los lactobacilos (Lopitz-Otsoa y col.,
2006). Es probable que durante la fase estacionaria de crecimiento de K. marxianus,
despus de 48 h de cultivo, se produzca autolisis celular y se liberen al medio factores de
crecimiento tales como aminocidos esenciales y vitaminas, que contribuyan al desarrollo
de lactobacilos.
El efecto estimulante de las levaduras sobre el crecimiento de lactobacilos aislados de kefir
ha sido informado por otros autores. Echeverra y col. (2007) demostraron que la presencia
de S. cerevisiae (no fermentadora de lactosa) y de K. marxianus (fermentadora de lactosa) o
de sus metabolitos estimulan el crecimiento de los lactobacilos e incrementan su capacidad
acidificante. Bolla (2011) tambin describi un mayor crecimiento de L. plantarum, L. kefir y
Lactococcus lactis aislados de kefir en cultivos mixtos con levaduras.
3.2.2 Acidificacin de suero y produccin de cidos orgnicos

Lactobacillus kefir cultivado en forma individual acidific levemente el suero en 72 h de
incubacin desde pH 6.2 hasta pH 5.7 0.07. Mientras que el pH fue menor en los
productos obtenidos con K. marxianus (pH 5.0 0.10) y con L. plantarum (pH 5.1 0.15). El
suero fermentado con las tres cepas conjuntamente present un pH de 4.5 0.1 luego de
72 h de incubacin (Figura 1.29).
6,5
6,0
5,5
pH
112
5,0
4,5
24
48
72
Tiempo (h)
Figura 1.29: Acidificacin durante la fermentacin de suero con Lactobacillus kefir CIDCA
8348 (), Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 (), Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154
() y las tres cepas en cultivo mixto ().
El contenido de orgnicos de los distintos productos fermentados se analiz mediante HPLC

de intercambio inico (Figura 1.30). Pudo observarse que el cromatograma de suero
fermentado con L. kefir CIDCA 8348 es semejante al del suero sin fermentar, en
correspondencia con su escaso crecimiento y acidificacin. El principal cido producido por
L. plantarum CIDCA 8327 durante la fermentacin fue el cido lctico, siendo este resultado
esperable dado que esta especie es homofermentativa facultativa. El suero fermentado con
K. marxianus CIDCA 8154 present cido mlico y cido actico, as como 2 picos notorios a
tiempos de retencin 7.6 y 8.5 min que no coincidieron con ninguno de los cidos incluidos
como patrn (oxlico, ctrico, ascrbico, pirvico, mlico, succnico, lctico, frmico, actico,
propinico y butrico).
113
En el suero fermentado con las 3 cepas en forma conjunta se observa mayor concentracin
de cido lctico y actico que al emplear cepas individuales, probablemente debido al
mayor crecimiento de L. kefir en el cultivo mixto. En el perfil de este producto tambin es
destacable el aumento de las reas bajos los picos a tiempos de retencin 7.6 y 8.5 min que
no pudieron ser identificados.
0,4
cido ctrico
0,3
7.6
0,2
cido lctico
8.5
cido mlico
0,1
cido actico
0,0
6
10
12
14
16
18
20
Tiempo de retencin
Figura 1.30: Cromatograma de suero () y suero fermentado durante 72 h con Lactobacillus

plantarum CIDCA 8327 (), con Lactobacillus kefir CIDCA 8348 (), con Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154 () y con las 3 cepas en forma conjunta ().
Se determin la concentracin de cidos lctico y actico de los sueros fermentados con

cepas individuales y en cultivo mixto (Tabla 1.16). Pudo notarse que el suero fermentado
con L. kefir (pH 5.7) present baja concentracin de ambos cidos, mientras que el
fermentado con L. plantarum con pH similar al obtenido con K. marxianus (pH ~ 5) present
mayor contenido de cido lctico y menor de cido actico que dicho producto. El suero
fermentado con el cultivo mixto present mayor concentracin de ambos cidos en relacin
a los fermentados con las cepas individuales. Este producto present alto contendido de
cido actico (0.19 %) en comparacin con el suero fermentado con grnulos de kefir (0.08
%), con cultivo de suero (0.04 %) y con cultivo de leche (0.11 %). Mientras que su
concentracin de cido lctico fue intermedia entre el suero fermentado con cultivo de
suero que present menor concentracin (0.20 %) y los suero fermentados con cultivo
madre de leche y grnulos de kefir que presentan mayor concentracin de este cido (0.55
% y 0.90 % respectivamente).
Tabla 1.16: Concentracin de cidos lctico y actico en suero fermentado 27 h de con
cepas aisladas de kefir inoculadas individualmente o en cultivo mixto.
cido lctico (%)
cido actico (%)
Lactobacillus plantarum CIDCA 8327
0.23 0.02
0.04 0.003
Lactobacillus kefir CIDCA 8348
0.11 0.01
0.04 0.004
Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154
0.13 0.01
0.15 0.02
Cultivo mixto
0.46 0.01
0.19 0.02
La produccin de cido lctico y cido actico durante la fermentacin en el cultivo mixto

ocurre durante todo el perodo de incubacin (Figura 1.31).
2400
Acido acetico (ppm)
4500
Acido lactico (ppm)
114
3000
1500
1600
800
0
0
24
48
Tiempo (h)
72
24
48
72
Tiempo (h)
Figura 1.31: Produccin de cidos lctico y actico durante la fermentacin de suero con un
cultivo mixto de Lactobacillus kefir CIDCA 8348, Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 y
Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154.
Los resultados obtenidos indican que es posible utilizar el suero como medio para el
crecimiento de L. plantarum y K. marxianus, asimismo es posible emplearlo como sustrato
para el cultivo mixto de lactobacilos y levaduras aisladas de kefir. La fermentacin de suero
con cepas aisladas de kefir podra permitir la obtencin de productos fermentados con
composicin microbiolgica definida. Por otro lado constituye un sistema simplificado
siendo ms sencillo controlar las variables para la obtencin de un producto de calidad ms
constante que al utilizar grnulos de kefir y cultivos madre como starters.
115
CONCLUSIONES
Los grnulos de kefir cultivados en suero durante 20 fermentaciones sucesivas de 24 h a

20 C presentan similar crecimiento, aspecto macroscpico, composicin qumica y
composicin microbiolgica que aquellos cultivados en leche en iguales condiciones.
El suero fermentado con grnulos de kefir al 10 % p/v durante 24 h a 20 C, tiene mayor

concentracin de levaduras y menor de bacterias cido lcticas, aunque presenta similar
contenido de lactosa, de cido lctico y perfil DGGE que la leche fermentada en iguales
condiciones.
Los grnulos de kefir cultivados en suero y el suero fermentado con los mismos
contienen microorganismos pertenecientes a las especies: Lactobacillus kefir,
Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus parakefir, Lactococcus lactis, Kluyveromyces
marxianus y Saccharomyces cerevisiae.
Cuando los grnulos son inoculados en suero en concentracin 1 % p/v el producto

fermentado obtenido presenta similar concentracin de levaduras y mayor
concentracin de bacterias cido lcticas que al inocular los grnulos en concentracin
10 % p/v. Sin embargo la acidificacin, degradacin de lactosa y produccin de cidos
orgnicos es menor al emplear menor concentracin de inculo. Se seleccion por lo
tanto el empleo de grnulos en concentracin 10 % p/v a fin de aumentar la velocidad
de fermentacin.
El empleo de sueros con distinta composicin qumica como sustratos para la

fermentacin con grnulos de kefir no afecta significativamente las caractersticas del
producto obtenido.
116
El empleo de temperaturas de incubacin de 30 C y 37 C no es factible en

fermentaciones de suero de 24 h dado que los grnulos no se preservan como starters
vindose afectada su capacidad de crecimiento, aspecto macroscpico, composicin
microbiolgica y qumica. Estos cambios se reflejan asimismo en un desbalance de la
composicin microbiolgica de los productos fermentados.
Los sueros fermentados con cultivos madre en leche y suero presentan diferencias en su
pH, composicin microbiolgica y contenido de cidos orgnicos respecto al suero
fermentado con grnulos de kefir.
Las cepas aisladas de kefir Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 y Lactobacillus

plantarum CIDCA 8327 son capaces de crecer empleando suero como sustrato y
acidificarlo mediante la produccin de cidos orgnicos, mientras que Lactobacillus kefir
CIDCA 8348 presenta escaso crecimiento en este medio. Cuando se cultivan las tres
cepas en forma conjunta se potencia el crecimiento L. kefir y la produccin de cidos
orgnicos durante la fermentacin.
Se puede concluir que el suero es un sustrato adecuado para la fermentacin con

grnulos de kefir a 20 C, influyendo la proporcin de grnulos en las caractersticas del
producto obtenido. Asimismo es posible utilizar cultivos madre o cepas aisladas de kefir
como starters alternativos.
Captulo 2: Efecto inhibitorio de suero

fermentado contra patgenos
intestinales: ensayos in vitro
Captulo 2. Inhibicin de enteropatgenos
INTRODUCCIN
Salmonella enterica y Escherichia coli se encuentran entre los patgenos intestinales que
causan mayores prdidas econmicas en la industria avcola y constituyen adems un riesgo
de transmisin al hombre a travs del consumo de alimentos derivados (Mor-Mur y Yuste,
2010). Debido a las crecientes restricciones en el uso de antibiticos en la produccin
primaria, ha surgido como alternativa de control la aplicacin de otros antimicrobianos tales
como cidos orgnicos en el agua, el alimento y camas de las aves con el fin de crear
medioambientes adversos para la colonizacin del patgeno. Resulta de sumo inters el
desarrollo de productos naturales que sean inocuos para el medioambiente, seguros para
las aves y los consumidores.
Se ha demostrado que el kefir inhibe el crecimiento de E. coli, Salmonella spp., Shigella
flexneri, Shigella sonnei, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Klebsiella
sp., Streptococcus salivarius, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Listeria
monocytogenes (Brialy y col. 1995; Garrote y col., 2000; Rodrigues y col., 2005).
En esta parte del trabajo se pretende analizar la efectividad de distintos sueros fermentados
con kefir, descriptos en el Captulo 1, para inhibir cepas de E. coli y Salmonella enterica
aisladas a partir de aves infectadas o alimentos derivados contaminados. Este conocimiento
es un primer paso en el estudio sobre la posibilidad de aplicar estos productos para el
control de enteropatgenos en la industria avcola.
117
118
OBJETIVOS
Determinar el efecto inhibitorio de distintos sueros fermentados contra patgenos

intestinales mediante ensayos in vitro.
Evaluar la supervivencia de Salmonella enterica y Escherichia coli al proceso de

fermentacin de suero con grnulos de kefir.
Estudiar el efecto inhibitorio del crecimiento y bactericida de distintos sueros

fermentados sobre cepas de Salmonella enterica y Escherichia coli aisladas a partir de
aves infectadas o alimentos derivados contaminados. Analizar los metabolitos
responsables del mismo.
MATERIALES Y MTODOS
1. Bacterias patgenas
Aislados patgenos de Salmonella enterica y Escherichia coli fueron provistos por Controlvet
S.A. (Tondela, Portugal). Se emplearon 100 aislados de E. coli obtenidos a partir de rganos
(bazo, hgado y pulmones) de pollos infectados y que fueron identificados de acuerdo a la
Norma Portuguesa (NP) 2308:1986. Asimismo se utilizaron 100 aislados de Salmonella
enterica obtenidos a partir de muestras de alimentos o pollos infectados, que de acuerdo a
la norma ISO 6579:2002/A1:2007, 23 fueron identificaros como Salmonella enterica serovar.
Enteritidis (Salmonella Enteritidis), 21 como Salmonella enterica serovar. Typhimurium
(Salmonella Typhimurium), 7 como Salmonella enterica serovar. Infantis (Salmonella
Infantis) y 49 no pudieron ser tipificados.
Tambin se utiliz Salmonella Enteritidis CIDCA 101 aislada de una muestra clnica del
Hospital de Pediatra Prof. Juan P. Garrahan, Buenos Aires, Argentina provista por el Dr. H.
Lopardo. Su identificacin se realiz mediante ensayos bioqumicos tradicionales y por
serotipificacin mediante el empleo de anticuerpos flagelares y somticos.
2. Reduccin de la concentracin de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis en suero por

fermentacin con grnulos de kefir
Se inocularon 100 ml de suero con los aislados S. Enteritidis 2713 o E. coli 2710 en
concentracin final 102, 103, 104, 105 y 106 UFC/ml. El suero contaminado se incub a 20 C
con agitacin, directamente o luego de la adicin de 10 % p/v de grnulos de kefir. Luego de
24 h de incubacin se analiz la concentracin de patgenos en el suero y en el suero
fermentado. Cuando fue necesario se realizaron diluciones seriadas 1:10 en triptona 0.1 % y
luego se llevaron a cabo recuentos empleando medios diferenciales. Para Salmonella se
emple medio Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) agar (Merck, D-64271 Darmstadt, Germany)
y las colonias negras caractersticas se contaron luego de 24 h de incubacin a 37 C. El
recuento diferencial de E. coli se realiz en placas de Triptona Bilis X-Glucuronido (TBX) agar
119
120
(Merck, D-64271 Darmstadt, Germany) sembradas con 1 ml de la dilucin adecuada en

profundidad y las colonias celestes se contaron luego de 24 h de incubacin a 44 C. Los
experimentos se realizaron por triplicado.
La supervivencia de bacterias patgenas luego de la fermentacin fue evaluada mediante el
mismo procedimiento para concentraciones de patgeno iniciales de 102 y 104 CFU/ml para
los aislados E. coli 2760, E. coli 2622, E. coli 2751, E. coli 2846, Salmonella enterica no
serotipificada 54, Salmonella Typhimurim 45, Salmonella Infantis 2729 y Salmonella
Enteritidis 735.
3. Preparacin de sobrenadantes
Se obtuvieron sobrenadantes de suero fermentado por centrifugacin a 13000 x g durante
15 min. Los mismos fueron filtrados a travs de una membrana de nitrocelulosa con un
dimetro de poro de 0.45 m (Orange Scientific, T Alleud, Belgium). Los sobrenadantes
estriles se almacenaron a -20 C hasta su utilizacin.
Mediante este mismo procedimiento se obtuvieron sobrenadantes de: suero fermentado
llevado a pH 4.5 y a pH 7 con NaOH 2.5 N (Merck, Darmstadt, Germany), suero fermentado
calentado por 20 min a 100 C, suero acidificado a pH 3.5 con HCl 2 N y suero suplementado
con cido lctico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) a la concentracin presente en el
suero fermentado.
4. Ensayo de inhibicin por difusin en agar

La actividad inhibitoria de los sobrenadantes sobre microorganismos patgenos se
determin por ensayos de difusin en agar. Los microorganismos patgenos se crecieron
en agua peptonada tamponada (APT, Biokar Diagnostics). Se coloc 1 ml de una
suspensin conteniendo 1.5 x 108 UFC/ml sobre una placa de petri con 12 ml de medio
Mller Hinton agar (Biokar Diagnostics) y se distribuy homogneamente sobre la
superficie. El lquido excedente se retir de la placa y la misma se dej secar 5 a 10 minutos
abierta en una cabina de flujo laminar clase II (modelo BIO-II-A, Telstar S. A.). Luego se
realizaron en el medio de cultivo orificios de 5 mm de dimetro, en cada uno de los cuales
se sembraron 40 l de los sobrenadantes a ensayar. Las placas se incubaron durante 24 h a

37 C y se midi el dimetro del halo de inhibicin del crecimiento en 3 direcciones
alrededor de cada orificio.
5. Determinacin de la concentracin inhibitoria y bactericida mnima

Para determinar la concentracin inhibitoria y bactericida mnima se realizaron diluciones
de los sobrenadantes de suero fermentado en agua peptonada tamponada (APT) a
concentraciones 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % y 70 % en un volumen final de 1 ml. Luego
cada tubo se inocul con 50 l de una suspensin del microorganismo patgeno en
concentracin 1.5 x 107 UFC/ml. Los tubos se incubaron durante 24 h a 37 C. Se observ el
crecimiento del patgeno (turbidez) en los tubos. La menor concentracin a la que se
produjo una inhibicin completa del crecimiento visible fue considerada la concentracin
inhibitoria mnima (CIM). De aquellos tubos en los que no se observ turbidez se realizaron
estras en medio Meller Hinton agar. La menor concentracin de sobrenadante de suero
fermentado para la cual no hubo crecimiento en las estras se consider la concentracin
bactericida mnima (CBM).
6.
Efecto de los sobrenadantes de suero fermentado con grnulos de kefir sobre el
crecimiento de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis.

Se analiz la inhibicin del crecimiento de S. Enteritidis 2713 y E. coli 2710 por
sobrenadantes de suero fermentado con grnulos de kefir mediante un ensayo
turbidimtrico.
El crecimiento del patgeno en caldo nutritivo conteniendo suero fermentado se analiz a
travs de mediciones de turbidez con un espectrofotmetro SmartSpec Plus (BioRad
Laboratories, Richmond, CA, USA). Se diluy sobrenadante de suero fermentado a
concentraciones 10 %, 20 %, 30 % y 40 % en caldo nutritivo en un volumen final de 5 ml.
Luego se inocularon todas las diluciones con 50 l de una suspensin con 1.5 x 108 UFC/ml
de patgeno. Se homogeniz y se midi la densidad ptica (DO) inicial a =600 nm. Se
121
122
incub a 37 C, a intervalos de 15 minutos se tomaron muestras y se midi la DO. Luego se

grafic la DO en funcin del tiempo.
7.
Efecto de los sobrenadantes de suero fermentado con cepas aisladas kefir sobre el
crecimiento de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis.

Se estudi el efecto inhibitorio de sobrenadantes de suero fermentado con cepas aisladas
de kefir sobre el crecimiento de S. Enteritidis 2713 y E. coli 2710. Para esto primero se
ferment suero con L. kefir CIDCA 8348, L. plantarum CIDCA 8327 y K. marxianus CIDCA
8154 inoculadas individualmente o combinadas segn lo descripto en el seccin 3.3 del
captulo 1. Luego se evalu el efecto inhibitorio de los sobrenadantes de estos cultivos
adicionados a caldo nutritivo en concentraciones de 10 a 100 % midiendo la densidad
ptica a 600 nm luego de distintos tiempos de incubacin.
8.
Supervivencia de patgenos en sobrenadantes de suero fermentado
Se analiz la supervivencia de Salmonella Enteritidis 2713 y de E. coli 2710 en

sobrenadante de suero fermentado 24 h a 20 C con grnulos de kefir en concentracin
10 % p/v. Para esto, un cultivo de 18 h del microorganismo patgeno en 5 ml de APT se
centrifug durante 10 min a 8000 x g. El pellet se resuspendi en el mismo volumen de
sobrenadante de suero fermentado estril en concentracin 60 % y 100 % y se incub a
37 C. A intervalos de tiempo predeterminados se tomaron alcuotas y se determin la
concentracin de microorganismos viables (UFC/ml) en medio Meller Hinton agar.
1.
Reduccin de la concentracin de Escherichia coli y Salmonella Enteritidis en suero
por fermentacin con grnulos de kefir

El suero, por ser rico en nutrientes, es contaminado fcilmente por microorganismos del
medio ambiente. Es de inters evaluar si los metabolitos producidos durante la
fermentacin tienen efecto inhibitorio sobre microorganismos contaminantes de manera
de garantizar la obtencin de un producto libre de patgenos y con un estndar
microbiolgico adecuado.
La capacidad del kefir de excluir microorganismos contaminantes, por competencia por los
nutrientes y produccin de metabolitos inhibitorios, permite que su consumo sea seguro
an cuando se elabora de manera artesanal, en condiciones no estriles y a temperatura
ambiente.
Para evaluar la supervivencia de patgenos al proceso de fermentacin se inocul suero con
E. coli 2710 o con S. Enteritidis 2713 en concentraciones de 102, 103, 104 y 106 UFC/ml.
Inmediatamente despus se adicionaron grnulos de kefir al 10 % y se incub durante 24 h
a 20 C. Luego de la fermentacin se evalu la concentracin de patgenos remanentes en
el producto mediante recuento de microorganismos viables en placa emplendose medios
diferenciales.
En suero (Tablas 2.1 y 2.2) independientemente de la concentracin inicial (102 a 106
UFC/ml), ambos patgenos alcanzaron en 24 h concentraciones superiores a 10 6 UFC/ml
indicando que este es un medio apto para su desarrollo.
Cuando el suero conteniendo 106 UFC/ml de Salmonella Enteritidis 2713 fue fermentado
durante 24 h con grnulos de kefir, la concentracin del patgeno disminuy 4 rdenes
logartmicos (Tabla 2.1) mientras que, cuando la concentracin inicial de Salmonella fue
menor a 105 UFC/ml no se detect crecimiento del patgeno.
El mismo ensayo se realiz contaminando suero con 102 y 104 UFC/ml de otras 4 cepas de
Salmonella enterica (S. Typhimurium 45, S. Infantis 2729, S. Enteritidis 735 y una cepa de S.
enterica no serotipificada 54). Cuando el suero contaminado con cada una de las cepas fue
123
124
fermentado durante 24 h con grnulos de kefir, no se detect la presencia de Salmonella en

el producto.
Tabla 2.1: Concentracin de Salmonella Enteritidis 2713 en suero contaminado
artificialmente con distintas concentraciones de este patgeno luego de su incubacin
durante 24 h a 20 C en ausencia o en presencia de grnulos de kefir (10 % p/v).
Concentracin
inicial en suero
(UFC/ml)
Concentracin luego de 24 h en Concentracin luego de 24 h en

suero en ausencia de grnulos suero en presencia de grnulos
de kefir (UFC/ml)
de kefir (UFC/ml)
1 x 102
1.1 x 106
NC*
1 x 103
5.0 x 106
NC
1 x 10
7.2 x 10
NC
1 x 10
1.5 x 10
NC
1 x 10
5.0 x 10
1.7 2.9 x 102
*NC: no se detect crecimiento del patgeno.

E. coli 2710 en suero creci hasta concentraciones mayores a 107 UFC/ml en 24 h a 20 C.
Cuando el suero contaminado con E. coli fue fermentado 24 h con grnulos de kefir la
viabilidad del patgeno se redujo 2 rdenes logartmicos en el producto (Tabla 2.2). El
mismo resultado se obtuvo para los aislados E. coli 2760, E. coli 2622, E. coli 2751 y E. coli
2846.
Tabla 2.2: Concentracin de E. coli 2710 en suero contaminado artificialmente con distintas
concentraciones de este patgeno luego de su incubacin durante 24 h a 20 C en ausencia
o en presencia de grnulos de kefir (10 % p/v).
Concentracin
inicial en suero
(UFC/ml)
Concentracin luego de 24 h en
suero en ausencia de grnulos de
kefir (UFC/ml)
Concentracin luego de 24 h
en suero en presencia de
grnulos de kefir (UFC/ml)
1 x 102
6.0 x 107
NC *
2.0 2.0 x 101
1 x 104
3.1 x 108
1.2 0.8 x 102
1 x 105
3.5 x 108
2.2 3.1 x 103
1 x 10
1.8 x 10
*NC: no se detect crecimiento del patgeno.
Los datos obtenidos indican que la fermentacin de suero con grnulos de kefir no slo
evita la proliferacin de microorganismos patgenos que eventualmente pueden actuar
como contaminantes sino que adems posee la capacidad de reducir su concentracin,
contribuyendo de este modo a la calidad y seguridad del producto obtenido.
Otros autores han estudiado la supervivencia de patgenos durante la fermentacin de
leche con grnulos de kefir. Garrote y col. (2000) describieron que al fermentar con
grnulos de kefir (2 % p/v) leche contaminada con E. coli, el crecimiento del patgeno se
detiene hallndose a la misma concentracin al inicio de la fermentacin que luego de
24 h. Otros autores sin embargo, hallaron que E. coli, S. Typhimurium y Staphylococcus
aureus son capaces de sobrevivir y crecer durante la fermentacin de leche con 5 % de
grnulos de kefir ( arag zl
y col., 2007). Tambin se ha descripto un bajo efecto
inhibitorio de microorganismos contaminantes cuando en lugar de utilizar grnulos de

kefir, se emplea cultivo madre en leche. Gulmez y Guven (2003) hallaron que, cuando leche
contaminada con patgenos es inoculada con 5 % v/v de cultivo madre, E. coli y Yersinia
enterocolitica aumentan su concentracin aproximadamente un orden logartmico en 24 h
de incubacin, mientras que el crecimiento de Listeria monocytogenes se detiene.
En relacin a los estudios previos mencionados, realizados en leche, en el presente trabajo
se hall mayor reduccin de microorganismos contaminantes durante la fermentacin de
suero con grnulos de kefir. Tal como se demostr en el captulo 1, el descenso de pH
debido a la produccin de cidos orgnicos ocurre rpidamente en suero desde el inicio de
la fermentacin, lo cual podra inhibir el crecimiento de los patgenos desde las primeras
horas de incubacin. Los resultados indican adems que durante la fermentacin se
producen metabolitos que presentan efecto bactericida sobre S. enterica y E. coli.
La capacidad inhibitoria del suero fermentado sobre estos patgenos se analiz en mayor
detalle empleando distintas metodologas, tal como se describe a continuacin.
125
126
2. Inhibicin de Salmonella Enteritidis y Escherichia coli por sobrenadantes de suero

fermentado
2.1 Ensayo de difusin en agar
Se evalu mediante ensayos de difusin en agar el efecto inhibitorio de distintos sueros
fermentados, descriptos y caracterizados en el Captulo 1, sobre 100 aislados de S. enterica
y 100 de E. coli. Se compar el efecto inhibitorio de distintos tipos de sueros fermentados
con grnulos de kefir en concentracin 10 % p/v. Asimismo se evalu la capacidad
inhibitoria de suero fermentado con 1 % p/v de grnulos de kefir y con cultivos madre en
suero y leche (Tabla 2.3).
Tabla 2.3: Actividad inhibitoria de diferentes sueros fermentados sobre 100 cepas de
Salmonella enterica y 100 cepas de Escherichia coli evaluada mediante ensayos de difusin
en agar.
Starter
Suero
Bovino en polvo
Dimetro de la zona de inhibicin

promedio ( Desvo estndar), mm
S. enterica (n =100) 2
E. coli (n=100)
9.20 (1.06) Aa 1
8.92 (0.82) Ab
10.37 (0.69) Ba
9.69 (0.59) Bb
10.37 (0.61) Ba
9.97 (0.64) Cb
Bovino en polvo
NI3
NI
Bovino lquido
NI
NI
Ovino lquido
NI
NI
Cultivo madre en suero
Bovino en polvo
NI
NI
Cultivo madre en leche
Bovino en polvo
NI
NI
Grnulos de kefir 10 %p/v Bovino lquido

Ovino lquido
Grnulos de kefir 1 %p/v
Las letras maysculas comparan para cada especie la sensibilidad a los distintos sueros fermentados
(filas). Las minsculas comparan el efecto inhibidor de cada suero sobre S. enterica y E. coli
(columnas). Los promedios de los dimetros de la zona de inhibicin con igual letra no difieren
significativamente (=0,05).
2
3
n: nmero de cepas testeadas.

NI: no se detectan halos de inhibicin.
Los productos obtenidos al fermentar distintos sueros (bovino lquido, bovino en polvo
reconstituido y ovino lquido) con grnulos de kefir en concentracin 10 % p/v inhibieron el
crecimiento de todas las cepas estudiadas (Tabla 2.3). Para el mismo producto fermentado
el promedio de los halos de inhibicin fue significativamente mayor para S. enterica que
para E. coli. Tambin hubo diferencias significativas en la capacidad inhibitoria al emplear

distintos sueros como sustrato. Los sueros lquidos bovino y ovino fermentados
presentaron mayor efecto inhibitorio que el producto obtenido a partir de suero en polvo
reconstituido.
El suero fermentado mediante cultivos madre en suero o leche, as como el obtenido a
partir de grnulos en concentracin 1 % p/v, todos con pH mayor a 4, no presentaron
actividad inhibitoria del crecimiento de S. enterica ni de E. coli.
Se presenta a modo de ejemplo los halos de inhibicin obtenidos para una cepa de E. coli
empleando distintos sueros fermentados con grnulos de kefir 10 % p/v y distintos starters
(Figura 2.1).
A
B
DISTINTOS SUEROS
DISTINTOS STARTERS
Figura 2.1: Inhibicin de Escherichia coli 2622 por sobrenadantes de suero fermentado con
A) grnulos de kefir 10 % p/v empleando distintos sueros como sustrato: (SBP) suero
bovino en polvo reconstituido, (SVL) suero bovino lquido y (SOL) suero ovino lquido y B)
distintos starters: (SFG) grnulos de kefir en concentraciones 1 % p/v y 10 % p/v y cultivos
madre en suero y leche.
A fin de indagar la naturaleza de los metabolitos involucrados en el efecto inhibitorio se

realizaron diferentes tratamientos a los sobrenadantes.
La capacidad inhibitoria de los sobrenadantes luego de un tratamiento trmico (20 min a
100 C) se evalu mediante ensayos de difusin en agar sobre 10 cepas de S. enterica y 10
de E. coli. El dimetro promedio de la zona de inhibicin fue 9.5 0.7 mm para S. enterica y
127
128
9.1 0.9 mm para E. coli. Estos valores no fueron significativamente diferentes respecto a
los de los sobrenadantes sin tratar (=0.05), indicando que el agente inhibitorio no es una
sustancia termolbil.
A fin de analizar la influencia del pH en la inhibicin se evaluaron los halos de inhibicin
generados por suero acidificado con cido clorhdrico hasta pH 3.5 y de suero fermentado
con grnulos de kefir a pH 4.5 y pH 7. Ninguno de estos productos fue capaz de inhibir los
50 aislados de S. enterica y 50 de E. coli evaluados. Se muestra como ejemplo una placa
obtenida para una cepa de Salmonella Enteritidis (Figura 2.2 A).
A
Figura 2.2: Inhibicin de Salmonella Enteritidis 2713 por sobrenadantes de: (A) suero, suero
acidificado con HCl a pH 3.5, suero fermentado con grnulos de kefir (SFG) en
concentracin 1 % p/v y 10 % p/v y este ltimo a pH 4.5 y pH 7. (B) suero bovino en polvo
reconstituido (SBP), suero bovino lquido (SBL) y suero ovino lquido (SOL) fermentados con
grnulos de kefir 10 % p/v y suero acidificado artificialmente con cido lctico (0.86 %), con
cido actico (0.08 %) o ambos cidos orgnicos (0.86 % y 0.08 % respectivamente).
Por lo tanto aunque el pH en s mismo no fue suficiente para inhibir el crecimiento de S.

enterica y de E. coli, el efecto inhibitorio fue dependiente del bajo pH. En base a estos
resultados se plante la necesidad de analizar la importancia de los cidos orgnicos
producidos durante la fermentacin en la accin antibacteriana.
Se evalu el efecto inhibitorio de suero acidificado artificialmente con cido lctico, cido
actico o ambos, en concentraciones y pH similares a las del suero fermentado con
grnulos de kefir. El suero acidificado con cido actico solo no present efecto inhibitorio
a esta concentracin, mientras que los halos obtenidos para el suero adicionado con cido
lctico solo o con ambos cidos resultaron semejantes (Figura 2.2 B). El suero conteniendo
la misma concentracin de cido lctico que el producto fermentado present halos de
inhibicin promedio de 9.3 0.7 mm para 10 aislados de S. enterica y de 8.8 0.6 mm para
10 aislados de E. coli. Estos valores no resultaron significativamente diferentes (=0.05)
respecto a los obtenidos para sobrenadante de suero fermentado (Tabla 2.3), sugiriendo
que el cido lctico no disociado es el principal metabolito responsable de la actividad
inhibitoria.
El uso de cido lctico es uno de los mtodos ms antiguos empleados para inhibir el
crecimiento de bacterias Gram (-) y Gram (+) (Helander y col., 1997). El principal
componente involucrado en dicha inhibicin es la forma no disociada de este cido
orgnico que puede atravesar las membranas bacterianas y as bajar el pH intracelular
causando efectos adversos en numerosas funciones celulares (Presser y col., 1997;
Carpenter y Broadbent, 2009). Teniendo en cuenta el pH, la concentracin de cido y la
constante de disociacin del mismo, se calcul la concentracin de la forma no disociada
del cido lctico en los productos fermentados que presentaron poder inhibitorio (Tabla
2.4). Los sueros bovino y ovino lquidos fermentados con 10 % p/v de grnulos de kefir,
que presentaron mayor efecto inhibitorio (Tabla 2.3), tuvieron mayor contenido de cido
lctico no disociado, confirmando el rol de este metabolito en la inhibicin.
Tabla 2.4: pH, concentracin de cido lctico total y cido lctico no disociado de los
sobrenadantes de distintos sueros fermentados con 10 % p/v de grnulos de kefir
pH
cido lctico
total (mM)
cido lctico no
disociado (mM)
Bovino en polvo reconstituido
3.65
100
61.86
Bovino lquido
3.54
110
74.39
Ovino lquido
3.39
133
99.30
Suero
129
130
De manera similar a lo hallado en el presente estudio en suero, se ha descripto que la

leche fermentada con grnulos de kefir presenta capacidad de inhibir el crecimiento de E.
coli (Brialy y col., 1995; Garrote y col., 2000; Rodrigues y col., 2005) y de Salmonella spp.
(Garrote y col., 2000; Rodrigues y col., 2005). El kefir posee otros metabolitos
antimicrobianos adems de los cidos orgnicos, tales como etanol, acetona, acetaldehdo
(Guzel-Seydim y col., 2000; Beshkova y col., 2003), diacetilo (Beshkova y col., 2003), CO 2
(Garrote y col., 1997; Grnnevik y col., 2011) y polisacridos (Rodrigues y col., 2005;
Barbosa y col., 2011). Asimismo cepas aisladas de kefir son capaces de producir
bacteriocinas (Ryan y col., 1996; Powell y col., 2007; Simova y col., 2008). Sin embargo la
contribucin de dichos componentes en el efecto antimicrobiano del kefir no ha podido
dilucidarse completamente. Garrote y col. (2000) describieron que los cidos orgnicos no
disociados eran los principales implicados en el efecto antimicrobiano del kefir. En
concordancia con dicho estudio, en el presente anlisis se demuestra que el efecto
inhibitorio del suero fermentado con grnulos de kefir sobre S. enterica y E. coli se debe
fundamentalmente a su contenido de cido lctico no disociado.
2.2 Concentracin inhibitoria y bactericida mnima

Luego de determinar que los productos obtenidos por fermentacin de distintos sueros con
10 % p/v de grnulos de kefir presentan actividad antimicrobiana se determin su
concentracin inhibitoria mnima (CIM) y bactericida mnima (CBM) mediante ensayos de
inhibicin por dilucin en medio lquido.
Estos parmetros se calcularon sobre 20 cepas de S. enterica y 20 cepas de E. coli para suero
bovino en polvo reconstituido fermentado. Asimismo se analiz el poder inhibitorio de los
sueros ovino y bovino lquidos fermentados sobre 10 aislados de cada una de estas
especies.
La CIM de los 3 sueros fermentados fue 30 % para E. coli. Para S. enterica la CIM de los
sueros bovino y ovino lquidos fermentados tambin fue 30 %, pero la de suero bovino en
polvo reconstituido fue 30 % para 10 cepas y 40 % para otras 10 cepas de esta especie.
Paralelamente con el anlisis de la CIM se determin la concentracin bactericida mnima

(CBM) de los distintos sueros fermentados sobre S. enterica y E. coli. La CBM result
variable de acuerdo al aislado analizado (Tabla 2.5). La CBM de los sobrenadantes de suero
bovino y suero ovino lquidos fermentados fue entre 40 % y 60 % para la mayora de los
aislados de S. enterica y para todos los de E. coli. Mientras que para suero en polvo
reconstituido fermentado la CBM result entre 50 % y 70 % para la mayor parte de los
aislados de ambas especies.
Tabla 2.5: Concentracin bactericida mnima (CBM) de suero fermentado con 10 % p/v de
grnulos de kefir sobre Salmonella enterica y Escherichia coli.
S. enterica
CBM (%)
SBP
30
E. coli
SBL
SOL
SBP
SBL
SOL
2/21b
1/10
1/20
40
2/21
2/10
4/10
1/11
1/10
50
4/21
4/10
2/10
7/20
7/11
7/10
60
3/21
4/10
3/10
6/20
3/11
2/10
70
9/21
4/20
90
1/21
2/20
Las columnas corresponden a sobrenadantes de diferentes sueros fermentados con grnulos de

kefir 10 % p/v. SBP: suero bovino en polvo reconstituido, SBL: suero bovino lquido, SOL: suero ovino
lquido.
b
Nmero de aislados de S. enterica o E. coli con cierta concentracin bactericida mnima / nmero
total de cepas estudiadas.
Considerando que por ensayos de inhibicin por difusin en agar se determin que el
principal agente inhibitorio del suero fermentado es el cido lctico no disociado, se calcul
su contenido en los distintos sueros fermentados a las concentraciones a las que resultaron
bacteriostticos y bactericidas.
Las diluciones de suero fermentado con efecto bacteriostticas contuvieron 10 a 20 mM de
cido lctico no disociado. Mientras que su concentracin en las diluciones con efecto
bactericida fue entre 20 y 50 mM.
131
En concordancia con los resultados hallados en el presente trabajo stling y Lindgren

(1993) reportaron una CIM de 7mM de cido lctico no disociado sobre un aislado de
Salmonella sp. y 4 aislados de E. coli.
2.3
Cinticas de crecimiento de Salmonella Enteritidis y Escherichia coli en presencia
de distintas concentraciones de sobrenadante de suero fermentado

El crecimiento de Salmonella Enteritidis 2713 y E. coli 2710 en presencia de sobrenadante
de suero fermentado con grnulos de kefir (10 % p/v) en distintas concentraciones se
analiz mediante mediciones espectrofotomtricas de turbidez en el tiempo.
Para Salmonella Enteritidis 2713 la curva de crecimiento no fue diferente respecto a la del
control cuando se adicion al medio de cultivo sobrenadante de suero fermentado en
concentracin 20 % v/v. Cuando el sobrenadante se adicion en concentracin 30 % v/v se
prolong la fase de latencia y se redujo la tasa de crecimiento, aunque la densidad ptica
alcanzada luego de 24 h fue similar al control. En medio de cultivo conteniendo
sobrenadante en concentracin 40 % v/v el patgeno no desarroll an transcurridas 24 h
de cultivo (Figura 2.3 A).
A
1
DO600nm
132
0,1
Tiempo (horas)
20
24
DO600nm
0,1
20
24
Tiempo (horas)
Figura 2.3: Inhibicin del crecimiento de Salmonella Enteritidis 2713 (A) y E. coli 2710 (B)
por sobrenadante de suero fermentado con grnulos de kefir 10 % p/v adicionado al medio
de cultivo en distintas concentraciones. Referencias medio de crecimiento: () caldo
nutritivo y sobrenadante diluido en el mismo medio en concentraciones () 10 % v/v, ()
20 % v/v, () 30 % v/v y () 40 % v/v.
El crecimiento de E. coli 2710 se modific an en presencia de 10 % v/v de sobrenadante

de suero fermentado, prolongndose la fase de latencia y disminuyendo la densidad ptica
del cultivo a las 24 h de incubacin de 1.1 a 0.7. Cuando se adicion al medio de cultivo 20
% v/v de sobrenadante se ampliaron las diferencias respecto al control en los parmetros
de crecimiento antes mencionados y se observ adems una reduccin de la tasa de
crecimiento. Mientras que en medio con una concentracin de sobrenadante igual o
mayor a 30 % v/v el crecimiento de este patgeno se inhibi por completo (Figura 2.3 B).
2.4 Curvas de muerte de Salmonella Enteritidis y Escherichia coli en sobrenadante de

suero fermentado
El efecto bactericida del suero fermentado con grnulos de kefir (10 % p/v) sobre S.
Enteritidis 2713 y E. coli 2710 se analiz siguiendo la curva de muerte de estos patgenos
al ser expuestos a sobrenadante de este producto puro y diluido en medio de cultivo en
concentracin 60 % v/v. Se seleccion esta dilucin por hallarse prxima a la concentracin
133
bactericida mnima de las cepas estudiadas, dado que la CBM de suero fermentado
previamente determinada fue 50 % para S. Enteritidis 2713 y 60 % para E. coli 2710.
Cuando E. coli 2710 se incub en 60 % de sobrenadante diluido en medio de cultivo APT su
viabilidad disminuy 2 rdenes logartmicos en 7 h de incubacin y luego de 24 h slo
sobrevivieron 102 UFC/ml. En sobrenadante de suero sin diluir no se detectaron
microorganismos viables al cabo 7 h de incubacin (Figura 2.4).
10
10
UFC/ml
134
10
10
10
-1
10
12
18
24
Tiempo (h)
Figura 2.4: Mortalidad de Escherichia coli 2710 en sobrenadante de suero fermentado con
grnulos de kefir (10 % p/v) sin diluir () y diluido en agua peptonada tamponada a
concentracin 60 % ().
Salmonella Enteritidis 2713 present una mortalidad an mayor en sobrenadante de suero

fermentado. Cuando el sobrenadante se emple en concentracin 60 % el nmero de
microorganismos viables descendi 3 rdenes logartmicos en 5 h de incubacin y la
mortalidad fue total a las 24 h. Al exponer las bacterias a suero fermentado sin diluir las
mismas perdieron su viabilidad en apenas 2 h de incubacin (Figura 2.5).
10
10
UFC/ml
10
10
10
12
18
24
Tiempo (h)
Figura 2.5: Mortalidad de Salmonella Enteritidis 2713 en sobrenadante de suero

fermentado con grnulos de kefir (10 % p/v) sin diluir () y diluido en agua peptonada
tamponada a concentracin 60 % ().
De este modo, el poder inhibitorio del suero fermentado fue demostrado en el presente
estudio mediante distintos mtodos de anlisis in vitro. Inicialmente se aplic un estudio
de inhibicin por difusin en agar a fin de evaluar el efecto inhibitorio de distintos
productos fermentados sobre numerosos microorganismos indicadores y analizar la
naturaleza de los metabolitos implicados en la inhibicin. Se determin por este mtodo
que el suero fermentado con 10 % p/v de grnulos de kefir inhibe el crecimiento de 100
cepas de Salmonella enterica y 100 de Escherichia coli. La capacidad antimicrobiana de este
producto se pudo atribuir a su contenido de cido lctico no disociado. Los sueros
fermentados empleando menor concentracin de grnulos de kefir o cultivos madre en
suero y en leche, con menor concentracin de este agente antimicrobiano, no resultaron
inhibitorios. Si bien los ensayos de difusin en agar permiten realizar una evaluacin rpida
de numerosos productos y microorganismos indicadores simultneamente, la obtencin
de resultados cuantitativos mediante este mtodo requiere la estandarizacin estricta del
ensayo y an as los resultados son menos precisos que al utilizar otros mtodos (Davidson
y Parish, 1989). Asimismo se ha descripto que la sensibilidad es baja en comparacin con
135
136
otras tcnicas (Galvin, 1999; Morgan, 2000). Sin embargo es de utilidad como un anlisis
previo a otros que requieren mayor cantidad de material y tiempo.
A fin de analizar cuantitativamente el poder inhibitorio del suero fermentado con grnulos
de kefir se realizaron ensayos de dilucin en medio lquido. Se calcul por este mtodo la
concentracin inhibitoria y bactericida mnima del suero fermentado. Este conocimiento es
til para la aplicacin del producto como aditivo antimicrobiano. Se determin que el
suero fermentado con grnulos de kefir es bacteriosttico en concentraciones 30 a 40 %,
conteniendo concentraciones de cido lctico no disociado entre 10 y 20 mM. La
concentracin bactericida de este producto vari de acuerdo a la cepa indicadora analizada
entre 40 y 70 %, conteniendo concentraciones de cido lctico no disociado entre 20 y 50
mM.
Finalmente se aplicaron en este trabajo mtodos descriptivos que permiten evaluar de
manera ms detallada la respuesta de los microorganismos a un agente antimicrobiano en
el tiempo. Es posible por estos mtodos determinar si se ve afectada la tasa de
crecimiento, la cosecha mxima y/o la fase de latencia. Se realizaron mediciones del
crecimiento por turbidez. Los ensayos de turbidez son sencillos, presentan buena
repetitividad y requieren poco material. Sin embargo la concentracin de microorganismos
a la cual es posible realizar las mediciones es limitada, dado que la turbidez se detecta a
concentraciones superiores a 106 UFC/ml y no es posible distinguir entre clulas viables y
no viables. Se determin por este mtodo que el suero fermentado en concentraciones
inferiores a la CIM acta disminuyendo la cosecha mxima, prolongando la fase de latencia
y/o retardando la velocidad de crecimiento. Las cinticas empleando recuento permiten
estudiar con mayor detalle cmo afecta un agente antimicrobiano la viabilidad de un
microorganismo en el tiempo y analizar si el agente tiene un efecto letal. Este anlisis
permiti determinar que el suero fermentado en concentraciones prximas a la CBM causa
una cada abrupta de la concentracin de microorganismos viables, presentando efecto
letal en pocas horas de exposicin.
2.5 Efecto inhibitorio de sobrenadantes de suero fermentado con Lactobacillus kefir

CIDCA 8348, Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154
sobre Salmonella Enteritidis y Escherichia coli
Se analizaron las cinticas de crecimiento de S. Enteritidis 2713 y E. coli 2710 en presencia
de suero fermentado con cepas aisladas de kefir cultivadas individualmente o en un cultivo
mixto en suero.
El sobrenadante del suero fermentado con L. plantarum CIDCA 8327 redujo la tasa de
crecimiento y la cosecha mxima de S. Enteritidis 2713 cuando su concentracin en el
medio de cultivo fue superior a 80 % (Figura 2.6 A) y de E. coli 2710 cuando fue igual o
mayor a 60 % (Figura 2.6 B).
A
B
Control
60%
80%
Control
60%
80%
100%
DO600nm
DO600nm
100%
0,1
Tiempo (h)
24
0,1
24
Tiempo (h)
Figura 2.6: Crecimiento de Salmonella Enteritidis 2713 (A) y de Escherichia coli 2710 (B) en
caldo nutritivo adicionado con distintas concentraciones de sobrenadante de suero
fermentado 72 h con Lactobacillus plantarum CIDCA 8327. Concentracin de sobrenadante:
0 % (), 60 % v/v (), 80 % v/v () 100 % v/v ().
La tasa de crecimiento y la cosecha mxima de S. Enteritidis 2713 y de E. coli 2710 fue

menor cuando se cultivaron en sobrenadante de suero fermentado con L. kefir CIDCA 8348
con respecto al control de cada uno de los patgenos crecidos en caldo nutritivo (Figura
2.7). Cabe destacar que este producto presenta actividad inhibitoria a pesar de su alto pH
(5.7) y escaso contenido de cidos orgnicos (0.11 % de cido lctico y 0.04 % de cido
actico) (Captulo 1, Tabla 1.16). El efecto inhibitorio podra deberse a la presencia de
137
otro/s metabolito/s en el sobrenadante de suero fermentado con L. kefir. Golowczyc y col.

(2007) describieron que la capacidad bactericida sobre Salmonella Enteritidis de
sobrenadantes de 8 cepas de L. kefir crecidas durante 48 h en MRS, no poda ser explicado
slo por la presencia de cidos orgnicos, sugiriendo la produccin de otros compuestos
inhibitorios por estas cepas.
A
B
1
Control
80%
Control
80%
100%
DO
600nm
100%
DO
600nm
138
0,1
Tiempo (h)
24
0,1
24
Tiempo (h)
fermentado 72 h con Lactobacillus kefir CIDCA 8348. Concentracin de sobrenadante: 0 %
(), 80 % v/v () y 100 % v/v ().
Entre los sobrenadantes de cultivos de cepas aisladas de kefir en suero, el de K. marxianus

CIDCA 8154 fue el que present mayor efecto inhibitorio. En caldo nutritivo adicionado con
60 % v/v de este sobrenadante Salmonella Enteritidis 2713 no creci luego de 6 h 30 min
indicando una prolongacin de la fase de latencia. Luego de 24 h de incubacin la densidad
ptica alcanzada por este cultivo fue menor que en el control. Cuando se adicion al medio
sobrenadante en concentracin 80 % v/v el crecimiento del patgeno fue prcticamente
nulo alcanzando en 24 h una densidad ptica menor al 20 % de la que present el control
(Figura 2.8 A).
B
1
Control
50%
60%
Control
50%
600nm
80%
0,1
DO
DO600nm
60%
80%
0,1
100%
24
Tiempo (h)
100%
24
Tiempo (h)
fermentado 72 h con Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154. Concentracin de
sobrenadante: 0 % (), 50 % v/v (), 60 % v/v (), 80 % v/v () y 100 % v/v ().
Cuando se cultiv E. coli 2710 en caldo nutritivo en presencia de 60 % p/v de este

sobrenadante se prolong la fase de latencia, aunque no se observaron diferencias en la
densidad ptica alcanzada en 24 h respecto al control. De manera similar a lo observado
para S. Enteritidis 2713 el crecimiento prcticamente se detuvo cuando se adicion al
medio de cultivo sobrenadante en concentracin 80 % v/v (Figura 2.8 B).
El suero fermentado por esta cepa presenta pH similar al obtenido por fermentacin con L.
plantarum, aunque su composicin de cidos orgnicos es diferente. Este producto
contiene cidos lctico (0.13 %), actico (0.15 %), mlico y otros 2 cidos que no pudieron
ser identificados en el presente estudio; la combinacin de estos cidos podran estar
implicados en el mayor efecto inhibitorio de esta cepa. Asimismo es probable que otros
metabolitos generados por la actividad metablica de K. marxianus, tales como CO2 y
etanol, intervengan en la capacidad inhibitoria.
El producto obtenido por fermentacin mixta empleando las tres cepas present
propiedades inhibitorias potenciadas respecto al fermentado con cepas individuales. Al
adicionar el sobrenadante de este producto en concentracin 40 % v/v se prolong 2 h la
fase de latencia de Salmonella Enteritidis 2713 y de E. coli 2710 aunque luego de 24 h la
139
DO alcanzada fue para ambos patgenos similar a la del control. En medio de cultivo
conteniendo 50 % v/v de sobrenadante ambos patgenos fueron incapaces de crecer
(Figura 2.9). Esto se halla en concordancia con el mayor contenido de cidos orgnicos y
menor acidez de este producto respecto al obtenido con cepas aisladas (Captulo 1, Tabla
1.16).
A
B
Control
20%
40%
40%
50%
0,1
Control
DO600nm
DO600nm
140
50%
0,1
80%
60%
0
24
Tiempo (h)
24
Tiempo (h)
fermentado 72 h con un cultivo mixto de Lactobacillus kefir CIDCA 8348, Lactobacillus
plantarum CIDCA 8327 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154. Concentracin de
sobrenadante: 0 % (), 40 % v/v (), 50 % v/v (), 60 % v/v () y 80 % v/v ().
Por lo tanto el producto obtenido de la fermentacin de suero con un cultivo mixto de

cepas aisladas de kefir demostr un fuerte poder antimicrobiano, inhibiendo por completo
el crecimiento de E. coli y Salmonella Enteritidis an diluido al 50 %. Estos resultados son
interesantes ya que abren la posibilidad de obtener un producto inhibitorio de manera
sencilla y controlada reproducible a gran escala.
CONCLUSIONES
Al fermentar con grnulos de kefir durante 24 h a 20 C suero contaminado
artificialmente con 105 UFC/ml de Salmonella enterica o 102 UFC/ml de Escherichia
coli, los patgenos no se recuperan en el producto.
Suero bovino en polvo reconstituido o lquido y suero ovino fermentados con
grnulos de kefir al 10 % p/v presentan capacidad inhibitoria del crecimiento sobre
100 cepas de Salmonella enterica y 100 cepas de Escherichia coli. La concentracin
inhibitoria mnima de estos productos es 30 % para E. coli y 30 a 40 % para S.
enterica.
Los distintos sueros fermentados con 10 % p/v de grnulos de kefir presentan
adems efecto bactericida, siendo la concentracin bactericida mnima variable de
acuerdo a la cepa y al producto fermentado.
El efecto inhibitorio del suero fermentado no se debe slo al bajo pH ni a una
sustancia termolbil. El cido lctico no disociado es uno de los metabolitos
responsables de la inhibicin.
El suero fermentado con cultivos madre en suero y en leche, as como el obtenido a
partir de grnulos de kefir en concentracin 1 % p/v, todos con pH superior a 4, no
presentan actividad inhibitoria del crecimiento de Salmonella enterica ni de
Escherichia coli.
El suero fermentado con Lactobacillus kefir CIDCA 8348, Lactobacillus plantarum
CIDCA 8327 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 inhibe el crecimiento de
Salmonella Enteritidis y Escherichia coli. El producto obtenido por la fermentacin
conjunta de las tres cepas posee propiedades inhibitorias potenciadas respecto al
fermentado con cepas individuales.
141
142
Captulo 3: Antagonismo de suero

fermentado sobre la adhesin e invasin
de Salmonella enterica serovar.
Enteritidis en modelos in vitro e in vivo
Captulo 3. Antagonismo contra Salmonella
INTRODUCCIN
La asociacin e invasin de Salmonella al epitelio intestinal representa un paso crtico para

iniciar la infeccin. Los probiticos pueden interferir en este proceso mediante competencia
con los microorganismos patgenos por los sitios de adhesin y los sustratos metablicos
(Servin, 2004). Asimismo pueden inhibir la adhesin del patgeno unindose a las clulas
intestinales, bloqueando as los sitios de unin sobre los enterocitos, o formando agregados
con los propios patgenos en la luz del intestino (Ouwehand y col., 2002; Collado y col.,
2006).
Debido a la dificultad del estudio de la interaccin entre probiticos y patgenos in vivo se
han desarrollo modelos de clulas epiteliales intestinales in vitro que han resultado de
utilidad en la dilucidacin de estos mecanismos. Empleando clulas Caco-2 y Caco-2/TC7 se
ha demostrado que microorganismos aislados de kefir son capaces de antagonizar la
asociacin e invasin de Salmonella enterica a epitelio intestinal (Santos y col., 2003;
Golowczyc y col., 2008). Sin embargo, en estos sistemas simplificados no se considera la
interaccin con la flora residente, la presencia de mucus, el movimiento peristltico, entre
otros factores que podran interferir en los resultados (Applegate, 2010). Los antecedentes
de estudios in vivo del efecto antagnico del kefir sobre Salmonella se limitan al trabajo
publicado por Zacconi y col. (1995) en el cual se demuestra que la administracin de kefir
previene la colonizacin de los ciegos de aves por Salmonella kedougou.
En el Captulo 2 se demostr que el suero fermentado con grnulos de kefir y cepas aisladas
de kefir presenta efecto inhibitorio sobre Salmonella enterica serovar. Enteritidis. En este
captulo se propone estudiar el efecto de estos productos sobre la asociacin e invasin del
patgeno mediante ensayos in vitro empleando un modelo de clulas epiteliales
intestinales Caco-2/TC7 y mediante estudios in vivo en pollos parrilleros.
143
144
OBJETIVOS
Evaluar el antagonismo del suero fermentado sobre la adhesin e invasin de Salmonella
enterica serovar. Enteritidis en modelos in vitro e in vivo en pollos parrilleros.
Caracterizar las propiedades adherentes e invasivas de tres aislados de Salmonella

enterica serovar. Enteritidis en el modelo de clulas epiteliales en cultivo Caco-2/TC7.
Estudiar el efecto de la interaccin de los microorganismos presentes en el suero

fermentado con el patgeno en el proceso de asociacin e invasin.
Estudiar la accin de los sobrenadantes de suero fermentado en el proceso de

asociacin e invasin del patgeno.
Analizar el efecto de la administracin de suero fermentado en la prevencin de la

colonizacin intestinal de Salmonella enterica serovar. Enteritidis en pollos parrilleros.
MATERIALES Y MTODOS
1.
Cultivo de clulas Caco-2/TC7
La lnea celular Caco-2 es un modelo de epitelio intestinal de origen humano proveniente de

un adenocarcinoma de colon (ATCC HTB-37) (Fogh y Orfeo, 1977) que exhibe un patrn de
diferenciacin estructural y funcional caracterstica de los enterocitos, como por ejemplo
ribete en cepillo, uniones estrechas funcionales y alto nivel de enzimas asociadas al ribete
en cepillo como fosfatasa alcalina, sacarasa isomaltasa y aminopeptidasa (Pinto y col., 1983;
Chantret y col., 1994). Las clulas Caco-2/TC7 son un clon de las clulas Caco-2 con mayor
velocidad de diferenciacin. Se utilizaron clulas de la lnea Caco-2-/TC7 (pasaje 23 a 30).
Las clulas se mantuvieron congeladas en nitrgeno lquido en viales conteniendo 1 ml de
medio DMEM completo (ver Apndice) con 5 % de dimetilsulfxido (Riedel-de Han AG, D3016 Seelze, Alemania) como crioprotector. Para reactivarlas se descongel un vial a 37 C,
se centrifug a 1000 rpm durante 10 min para retirar el crioprotector, las clulas se
resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo fresco en una botella de 25 cm 2 (Corning Costar
Co., Cambridge, MA, USA) con 4 ml de medio DMEM completo. El cultivo se mantuvo a 37
C en estufa con atmsfera controlada (5 % CO2 95 % aire) cambiando el medio cada 2
das. A los 7 das se obtuvo una monocapa confluente y se repic a una botella de 75 cm 2.
En cada repique la monocapa se observ en un microscopio invertido para verificar su
uniformidad y continuidad. Los repiques se realizaron de la siguiente manera: se descart el
medio ya agotado y se lav la monocapa dos veces con PBS estril, luego se colocaron 10 ml
de solucin de tripsina (ver Apndice) y se llev a la estufa a 37 C durante 5 a 8 min.
Cuando se observaron los primeros indicios de desprendimiento celular, se levant la
monocapa en 10 ml de DMEM para inactivar la enzima. Se centrifug a baja velocidad
durante 5 minutos, se descart el medio y se reemplaz por medio DMEM fresco. Se
tomaron 50 l de la suspensin de clulas y se mezclaron con igual volumen de una solucin
de azul tripn al 10 % en PBS. Se realiz el recuento de clulas en una cmara de Neubauer
contando slo aquellas clulas brillantes (viables).
145
146
Se prepar una suspensin de 2.5 x 105 clulas/ml y se sembraron 0.5 ml por fosa en placas
de 24 fosas (Corning Costar Co., Cambridge, MA, USA). Las placas con clulas Caco-2/TC7 se
incubaron 7 das (clulas en confluencia) a 37 C en una estufa de atmsfera controlada (5
% CO2 95 % aire) cambiando el medio cada 2 das.
2.
Ensayo de adhesin de microorganismos de kefir a clulas in vitro
Se estudi la adhesin de microorganismos presentes en el suero fermentado con grnulos

de kefir y con cepas aisladas de kefir a monocapas de clulas intestinales de la lnea Caco2/TC7.
Las monocapas fueron lavadas con PBS a temperatura ambiente. A cada fosa se le
agregaron 0.5 ml de suspensin microbiana previamente lavada con PBS, resuspendida en
DMEM de adhesin (ver Apndice). Las placas fueron incubadas a 37 C durante 1 h en
atmsfera controlada (5 % CO2 95 % aire) sin agitacin. Luego fueron lavadas 3 veces con
PBS para remover los microorganismos no adheridos. Para determinar la concentracin de
bacterias y levaduras adheridas, a cada fosa se le colocaron 0.5 ml de agua bidestilada
estril y se dej 1 h a 37 C para permitir la lisis y desprendimiento de la monocapa. Se
tom todo el volumen de la fosa, se realizaron diluciones apropiadas en triptona 0.1 % y se
realiz el recuento de microorganismos viables en MRS agar para bacterias cido lcticas y
en YGC agar para levaduras. Las placas fueron incubadas a 30 C en aerobiosis durante 72 h.
Los resultados se expresaron como porcentaje de adhesin:
% A = (bacterias adheridas/bacterias agregadas a la fosa) x 100
3. Ensayos de asociacin e invasin de Salmonella Enteritidis a clulas Caco-2/TC7

Se determin la capacidad de asociacin e invasin de las cepas de Salmonella enterica
serovar. Enteritidis (Salmonella Enteritidis) CIDCA 101, 2713 y 261D.
Salmonella Enteritidis 2713 fue aislada a partir de un pollo parrillero con lesiones tpicas de
salmonelosis y Salmonella Enteritidis 261D a partir de una reproductora COBB de un
criadero de Portugal vctima de un episodio de infeccin por este patgeno. Ambas cepas
fueron aisladas y tipificadas en los laboratorios de la empresa de seguridad alimentaria
Controlvet S.A. (Tondela, Portugal). Salmonella Enteritidis CIDCA 101 fue aislada de una
muestra clnica humana del Hospital de Pediatra Prof. Juan P. Garrahan (Buenos Aires,
Argentina).
Las clulas de la lnea Caco-2/TC7 se incubaron 7 das en placas de 24 fosas. Las monocapas
fueron lavadas 2 veces con PBS a temperatura ambiente. Se centrifug un cultivo de
Salmonella Enteritidis a 5000 x g durante 4 minutos y se resuspendi en PBS. La suspensin
se ajust a una densidad ptica de 0.3 (~ 1 x 108 UFC/ml) y cuando fue necesario se diluy
1:100 en PBS (~ 1 x 106 UFC/ml). Esta suspensin se centrifug y se resuspendi en DMEM
de adhesin. La concentracin de S. Enteritidis se confirm mediante recuento de
microorganismos viables en placa. A cada fosa se le agregaron 0.5 ml de suspensin de
Salmonella. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 C en atmsfera controlada (5 % CO 2
95 % aire) sin agitacin y luego se lavaron 3 veces con PBS para eliminar las bacterias no
asociadas.
Para cuantificar la asociacin (bacterias adheridas internalizadas), a cada fosa se le
agregaron 0.5 ml de agua bidestilada estril y se incub 1 h a 37 C. Esto permiti
desprender la monocapa. Luego, se tom todo el volumen de la fosa, se realizaron
diluciones en triptona 0.1 % y se plaquearon en agar nutritivo.
Para cuantificar las bacterias internalizadas, aquellas adheridas fueron eliminadas por
tratamiento con un antibitico. Luego la monocapa se lav 2 veces y se agregaron 0.5 ml de
agua bidestilada estril (1 h a 37 C) para lisar la monocapa y permitir que las bacterias
internalizadas se liberen. Se realizaron diluciones apropiadas en triptona 0.1 % y se llev a
cabo un recuento de microorganismos viables en placas de agar nutritivo. Los resultados se
expresaron como UFC/fosa.
Como antibitico se utiliz gentamicina que tiene la particularidad de que no difunde a
travs del dominio apical de las clulas por lo que las bacterias que no se internalizan son
afectadas por el antibitico y las que estn internalizadas sobreviven. La sensibilidad a la
gentamicina puede variar entre distintas cepas de Salmonella. Se evalu, por lo tanto, la
concentracin de antibitico adecuada para las cepas de Salmonella Enteritidis empleadas
en este estudio.
147
148
Para esto se prepar una suspensin de S. Enteritidis en PBS con una concentracin 106
UFC/ml. La suspensin se fraccion en tubos estriles y a cada uno se le agreg gentamicina
(Droguera Gatti, La Plata, Argentina) en concentraciones finales crecientes desde 100 hasta
400 g/ml. Luego de 1 y 2 h de incubacin a 37 C se analiz la concentracin de Salmonella
mediante recuento de microorganismos viables en agar nutritivo, retirndose previamente
el sobrenadante conteniendo el antibitico por centrifugacin y lavado con PBS. A partir de
estos resultados se determin la concentracin de gentamicina y el tiempo de incubacin
que resultan bactericidas.
4. Efecto de los microorganismos de kefir sobre la asociacin e invasin de Salmonella

Enteritidis a clulas Caco-2/TC7
4.1.
Preincubacin de la monocapa celular con microorganismos de kefir
Mediante este ensayo se evalu el efecto de la preincubacin de la monocapa de

enterocitos con microorganismos de kefir sobre la asociacin e invasin de S. Enteritidis.
Para ello, suero fermentado con grnulos de kefir o con Lactobacillus kefir CIDCA 8348,
Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 en cultivo
mixto (ver Materiales y mtodos del captulo 1, secciones 2 y 3.3 respectivamente), se
centrifug a 13000 x g durante 15 min, se descart el sobrenadante y el pellet se lav 2
veces con PBS y se resuspendi en DMEM de adhesin.
Se utilizaron placas de 24 fosas con clulas Caco-2/TC7. Las fosas se lavaron 2 veces con PBS
para eliminar el medio de cultivo. A cada fosa se le agregaron 0.5 ml de la suspensin de
microorganismos de kefir. Las placas se incubaron 1 h a 37 C en atmsfera controlada (5 %
CO2 95 % aire). Luego, se lavaron 3 veces para eliminar los microorganismos no adheridos.
A las fosas preincubadas con los microorganismos de kefir se les agregaron 0.5 ml de una
suspensin de Salmonella Enteritidis en DMEM de adhesin y se incubaron nuevamente
durante 1 h a 37 C en atmsfera controlada (5 % CO2 95 % aire). La cantidad de
Salmonella agregada a cada fosa fue de aproximadamente 1 x 108 UFC o 1 x 106 UFC
dependiendo del ensayo. Luego de la incubacin, se determin el nmero de bacterias
asociadas e internalizadas como se explic en la seccin 3. Simultneamente se realizaron

controles de la asociacin e invasin de S. Enterica realizando el mismo ensayo en ausencia
de microorganismos de kefir.
4.2.
Se prepar una suspensin de microorganismos de kefir en PBS. Para ello, 10 ml de suero

fermentado con grnulos de kefir o con L. kefir CIDCA 8348, L. plantarum CIDCA 8327 y K.
marxianus CIDCA 8154 en cultivo mixto, se centrifugaron a 13000 x g durante 15 min, se
descart el sobrenadante, el pellet se lav 2 veces con PBS y se resuspendi en 10 ml o en 1
ml (suspensin concentrada 10 veces) de PBS. Se prepar una suspensin de Salmonella en
PBS como se detall en la seccin 3.
Se preincub 1 ml de la suspensin de microorganismos de kefir con 1 ml de la suspensin
de S. Enteritidis durante 1 h a 37 C. Luego 0.4 ml de la mezcla y 0.4 ml de DMEM de
adhesin fueron adicionados a la placa de clulas Caco-2/TC7 y se incubaron durante 1 h a
37 C en atmsfera controlada (5 % CO2 95 % aire). Luego de lavar las fosas 3 veces, se
cuantific Salmonella asociada e internalizada como se explic anteriormente (seccin 3).
Como control, 1 ml de suspensin de Salmonella se preincub con 1 ml de PBS sin
microorganismos de kefir a 37 C y se realiz el mismo ensayo.
4.3.
Preincubacin de Salmonella Enteritidis con sobrenadantes de suero fermentado
Se realiz una preincubacin de Salmonella Enteritidis con sobrenadantes de suero

fermentado con grnulos de kefir y con las cepas aisladas de kefir. Para esto, un cultivo de
18 h del patgeno se centrifug (5000 x g, 4 min) y el pellet se resuspendi en igual
volumen de sobrenadante libre de microorganismos. Luego, se incub a 37 C durante 1 h.
Pasado el tiempo de incubacin, se centrifug y se resuspendi en DMEM de adhesin. Se
realiz el ensayo de asociacin e invasin como se indic en la seccin 3.
149
150
5. Tcnicas de microscopa
Las clulas Caco-2/TC7 se sembraron en placas de 24 fosas sobre portaobjetos de vidrio
(Assistent, Alemania). Estos vidrios fueron previamente lavados con agua y detergente no
inico (Extran MAO2 neutro, Merck, Darmstadt, Alemania) y luego de un enjuague
exhaustivo con agua destilada, se colocaron en cajas de petri y se esterilizaron en autoclave.
Se realizaron ensayos de infeccin con Salmonella Enteritidis CIDCA 101 sin tratar y
preincubada con microorganismos o con sobrenadantes de suero fermentado mediante las
metodologas descriptas en las secciones 4.2 y 4.3. Luego las muestras fueron preparadas
para distintas observaciones microscpicas mediante las tcnicas descriptas a continuacin.
5.1.
Tincin de May Grnwald Giemsa
Las muestras se lavaron 3 veces con PBS y fijaron con etanol absoluto durante 5 minutos a 4
C. A continuacin, se repiti el lavado con PBS para quitar el fijador, se agregaron 0.5 ml de
solucin de colorante May Grnwald (Lab. Biopur, Argentina) a cada fosa y se dej actuar el
colorante durante 3 min. Las clulas se lavaron 3 veces con PBS y se aadi el colorante
Giemsa diluido 1/10, se incub durante 20 min y luego cada fosa se lav 3 veces con PBS.
Luego se montaron los vidrios invertidos sobre 7 l de glicerol 50 % en PBS con 0.1 % de
azida de sodio y se sellaron para su observacin en microscopio ptico. Para su observacin
se utiliz un microscopio de campo claro DMLB acoplado a una cmara DC 100 (Leica
Microscopy Systems Ltd., Heerbrugg, Suiza).
5.2.
Marcacin fluorescente del citoesqueleto con Isotiocianato de Fluorescena (FITC).
Las muestras se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron durante 2 min con paraformaldehdo 3
% p/v en PBS. Las muestras se trataron durante 10 min con NH4Cl 50 mM para bloquear las
funciones aldehdo libres. Luego fueron permeabilizadas mediante tratamiento durante 4
min con 0.2 % de Triton X -100 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), se agreg PBS y se
incub durante 10 min. Este ltimo paso fue repetido y luego las clulas fueron tratadas
durante 10 min con 0.2 % de gelatina en PBS. Se extrajo completamente el buffer y se
agregaron a cada fosa 20 l de faloidina fluorescente (Sigma Chemical, St. Louis, USA) en
concentracin 0.5 g/ml en PBS-gelatina. Las clulas se incubaron a temperatura ambiente

durante 45 min en cmara hmeda y al abrigo de la luz. Luego fueron lavadas 3 veces con
PBS e incubadas durante 10 minutos en PBS-gelatina. Los vidrios fueron retirados de las
fosas, escurridos y montados invertidos sobre 7 l de glicerol 50 % en PBS con 0.1 % de
azida de sodio. Las muestras fueron conservadas en oscuridad hasta su observacin en un
microscopio invertido de fluorescencia Nikon TI-Eclipse en combinacin con un software de
procesamiento de imgenes NIS-elements.
5.3.
Microscopa electrnica de barrido
Las muestras se lavaron 3 veces con PBS, se fijaron con glutaraldedo (Riedel de Han,
Seelze, Alemania) 1 % v/v durante 2 h a 4 C, se lavaron nuevamente con PBS y se
deshidrataron en soluciones crecientes de etanol absoluto (20, 50, 70, 90 y 100 %) en PBS,
colocndose las muestras 20 min en cada concentracin. Finalmente, las muestras fueron
deshidratadas por punto crtico usando CO2 lquido (Baltec CP-30), metalizadas por el
mtodo de pulverizacin catdica en un metalizador Balzers y examinadas empleando un
microscopio electrnico de barrido Philips SEM 505 que cuenta con un programa para la
obtencin de imgenes digitales (Digitalizador de Imagen Soft Imaging System ADDA II (SIS).
6. Ensayos in vivo
6.1 Animales de laboratorio y bioterios
Se emplearon pollos parrilleros raza Ross pm3 de 10 a 16 das de edad segn el ensayo. Los
mismos se dividieron en grupos de 6 individuos cada uno, que fueron distribuidos en 2
bioterios con un mximo de 2 grupos por bioterio por cada ensayo.
Los bioterios consistieron en salas de 3.7 x 3 m equipados con acondicionamiento trmico,
ingreso de aire forzado y conductos de extraccin, pisos presala con abertura de puertas
hacia el exterior (P-) y sala con abertura de puertas hacia el interior (P+), as como pisos y
paredes cubiertas con pinturas resistentes a desinfecciones. Los mismos fueron certificados
por la Direccin General de Veterinaria de Portugal (Largo da Academia Nacional de Belas
Artes N 2, 1249-105 LISBOA).
151
152
Se emplearon jaulas individuales de 62 cm de ancho, 38 cm de largo y 50 cm de alto con

bebederos y comederos propios (Figura 3.1). Los pollos se mantuvieron con iluminacin fra
fluorescente continua, a una temperatura de 24.8 1.3 C y una humedad ambiente relativa
de 56 8 %. La temperatura y humedad relativa se verific diariamente. Antes de comenzar
cada ensayo los animales se mantuvieron durante 3 das en los bioterios para su
aclimatacin. Los pollos consumieron alimento balanceado y agua ad libitum.
Figura 3.1: Fotografa de las jaulas empleadas con comederos y bebederos individuales.
6.2 Productos administrados

En distintos ensayos se evalu la administracin de los siguientes productos:
Suero fermentado con grnulos de kefir (SFG): se obtuvo de acuerdo a la metodologa
descripta en Materiales y mtodos del Captulo 1, seccin 2. Su contenido de BAL fue
de ~ 107 UFC/ml y su contenido de levaduras de ~ 106 UFC/ml (Captulo 1, Tabla 1.8), su
composicin qumica se present en el Captulo 1 (Tabla 1.11, suero bovino en polvo).
Suero fermentado empleando cultivo madre en suero (SFC): se obtuvo segn la

metodologa detallada Materiales y mtodos del Captulo 1, seccin 3.1.1. El objeto de
administrar este producto fue aumentar la cantidad de probiticos suministrada ya que
su contenido de BAL es de aproximadamente 108 UFC/ml y el de levaduras 107 UFC/ml
(Captulo 1, Tabla 1.14).
Microorganismos presentes en suero fermentado con cultivo madre en suero,
resuspendidos en solucin fisiolgica (MSF): el suero fermentado con cultivo madre en
suero se centrifug durante 10 min a 10000 x g. El sobrenadante se descart y el pellet
se resuspendi en el mismo volumen inicial de solucin fisiolgica.
6.3 Preparacin del inculo del patgeno

Para los ensayos in vivo se utiliz Salmonella enterica serovar Enteritidis 261D. El patgeno
se inocul en agua peptonada tamponada (ver Apndice) y se incub a 37 C. A distintos
tiempos se tomaron alcuotas, se midi la densidad ptica (DO) y la concentracin de
microorganismos viables mediante recuento en placa. A partir de los resultados obtenidos
se grafic la DO en funcin de la concentracin de microorganismos viables y los valores se
ajustaron a una recta. La ecuacin de dicha recta se utiliz durante los ensayos para calcular
la concentracin de Salmonella Enteritidis en el inculo a partir de la DO del cultivo. La
concentracin de microorganismos viables del inculo se determin luego mediante
recuento en placa.
6.4 Protocolos experimentales

Los experimentos fueron diseados de acuerdo con las pautas del Consejo Directivo
Europeo (86/609/EEC del 24 de noviembre de 1986) considerando las regulaciones y las
provisiones administrativas de los estados miembro con respecto a la proteccin de los
animales usados con fines experimentales u otros propsitos cientficos.
Todos los anlisis fueron llevados a cabo de acuerdo con las recomendaciones para el
bienestar animal de la Federacin de Asociaciones Europea de las Ciencias del Animal de
153
154
Laboratorio (FELASA) y fueron autorizados por la Direccin General de Veterinaria de

Portugal (Largo da Academia Nacional de Belas Artes N 2, 1249-105 LISBOA).
Ensayo 1. La finalidad de este ensayo fue analizar la inocuidad dos productos con distinta
concentracin de probiticos: suero fermentado con grnulos (SFG) y con cultivo madre en
suero en presencia (SFC) o ausencia (MSF) de sobrenadante. Este sobrenadante contiene los
productos del metabolismo microbiano.
Se realizaron por lo tanto 4 tratamientos mediante la administracin de:
1. Agua como placebo (control).
2. Suero fermentado con grnulos de kefir (BAL 1 x 107 UFC/ml, levaduras 4 x 106 UFC/ml).
3. Suero fermentado con cultivo madre en suero (BAL 1 x 108 UFC/ml, levaduras 1 x 107
UFC/ml).
4. Microorganismos de suero fermentado con cultivo madre en suero (BAL 1 x 108 UFC/ml,
levaduras 1 x 107 UFC/ml).
Luego de 3 das de aclimatacin de las aves a las condiciones del bioterio, los productos
fueron administrados en una dosis diaria de 1 ml por individuo por va oral en el pico de
cada individuo empleando una micropipeta (Figura 3.2) durante 10 das consecutivos
(Figura 3.3).
Figura 3.2: Fotografa que muestra el modo de administracin oral de los probiticos.
Figura 3.3: Esquema del protocolo experimental del ensayo 1.
Durante el perodo de administracin se registr diariamente el consumo de agua, el

consumo de alimento, la humedad de las heces y el peso de cada animal. Al inicio de las
mediciones la edad de los individuos fue 14 das. El agua de cada bebedero se renov
diariamente. Para determinar la humedad de las heces se recolect diariamente la totalidad
de la materia fecal de cada individuo, se homogeneiz, se tom una muestra de 5 g y se
midi la humedad en un analizador de humedad Sartorius MA 150 (Data Weighing Systems,
Elk Grove, IL, EEUU).
Ensayo 2. La finalidad de este ensayo fue evaluar la capacidad del suero fermentado con
grnulos de kefir (SFG), administrado en una dosis diaria de 1 ml por individuo, de disminuir
la colonizacin intestinal de S. Enteritidis 261D inoculada en una dosis nica de 10 6 UFC/ml.
Para esto se emplearon pollos de 13 das de edad que fueron sometidos a los tratamientos:
1. Control sin infectar
2. Control de infeccin
3. Suero fermentado con grnulos / infectado
Los individuos del grupo tratado con probitico recibieron una dosis diaria definida de 1 ml
de suero fermentado por va oral. El probitico se administr durante 6 das antes de
inocular el patgeno y se continu suministrando hasta el final del ensayo. Aquellos grupos
que fueron infectados con el patgeno se inocularon el da 6 del ensayo con una dosis nica
de 1 ml de S. Enteritidis 261D en concentracin 7 x 106 UFC/ml (Figura 3.4).
155
156
A partir del da siguiente al inicio de la administracin de los tratamientos se registraron

diariamente el consumo de agua, el consumo de alimento y el peso de cada animal durante
18 das consecutivos. El contenido de Salmonella en heces se analiz los das 2, 5, 7, 10 y 13
luego de la infeccin. El da 13 despus de la infeccin los pollos fueron sacrificados con
isofluorano y se determin si hubo translocacin del patgeno a bazo e hgado.
Ensayo 3. La finalidad de este ensayo fue evaluar la capacidad del suero fermentado con
cultivo madre en suero, administrado en una dosis diaria definida de 1 ml por individuo, de
disminuir la colonizacin intestinal de Salmonella Enteritidis 261D inoculada en dosis de 105
UFC/ml.
Para esto se emplearon pollos de 10 das de edad que fueron sometidos a 3 tratamientos:
1. Control sin infectar
3. Suero fermentado con cultivo madre en suero / infectado
Los individuos del grupo tratado con probitico (3) recibieron una dosis diaria de 1 ml de
suero fermentado con cultivo madre en suero por va oral. El probitico se administr
durante 7 das antes de inocularse el patgeno y se continu suministrando hasta el final
del ensayo. Aquellos grupos que fueron infectados con patgeno se inocularon el da 7 del
ensayo con una dosis nica de 1 ml de S. Enteritidis 261D en concentracin 2 x 105 UFC/ml
(Figura 3.5).
Diariamente se registr el consumo de agua, el consumo de alimento y el peso de cada

animal durante 20 das consecutivos. El contenido de Salmonella en heces se analiz los das
2, 4, 7, 9 y 13 luego de la infeccin. El da 20 luego de la infeccin los pollos fueron
sacrificados con isofluorano y se determin si hubo translocacin del patgeno a bazo e
hgado.
Ensayo 4. Este ensayo se llev a cabo a fin de evaluar el efecto de la administracin ad

libitum en el agua de bebida de suero fermentado con cultivo madre en suero o de sus
microorganismos sobre la colonizacin intestinal de S. Enteritidis 261D inoculada en dosis 2
x 105 UFC/ml.
Para esto se emplearon pollos de 16 das de edad que fueron sometidos a 3 tratamientos:
2. Suero fermentado con cultivo de suero en el agua de bebida / infectado
3. Microorganismos de suero fermentado con cultivo en suero en agua de bebida /
infectado
Al grupo 2 se le administr el suero fermentado con cultivo madre en suero diluido 1:100 en
el agua de bebida. Al grupo 3 slo los microorganismos de este producto suspendidos en
solucin fisiolgica tambin en dilucin 1:100. El agua de bebida con los correspondientes
tratamientos se renov diariamente.
157
158
Previamente al inicio del ensayo se estudi la supervivencia de los microorganismos en agua

mediante recuento de bacterias lcticas y levaduras viables inmediatamente despus de la
dilucin (1:100) y luego de 24 h de incubacin a 25 C. Durante el desarrollo del ensayo se
realizaron controles de pH y del contenido de microorganismos viables en el agua de los
bebederos de los grupos 2 y 3.
Todos los grupos fueron desafiados con una dosis de 1 ml de S. Enteritidis 261D en
concentracin 2 x 105 UFC/ml el da 7 del ensayo (Figura 3.6).
Se realizaron mediciones diarias de peso, consumo de alimento y consumo de agua de cada

individuo durante 18 das a partir del inicio de la administracin de los tratamientos. Se
analiz el contenido de Salmonella en heces los das 2, 5, 7, 10 y 12 luego de la infeccin
con el patgeno. El da 19 de ensayo los pollos fueron sacrificados y se determin si hubo
translocacin del patgeno a bazo e hgado.
6.5 Translocacin de Salmonella Enteritidis a bazo e hgado

A cada individuo se le extirparon el bazo y el hgado en condiciones aspticas. La presencia
de Salmonella fue determinada de acuerdo a la norma ISO 6579:2003/A1:2007 (Mtodo
horizontal para la deteccin de Salmonella spp. en heces de animales y muestras
ambientales en la etapa de produccin primaria).
Los rganos fueron pesados, diluidos 1:10 en agua peptonada tamponada y triturados en un
Stomacher (Seward Medical, modelo 400, U.K.). Se realiz un enriquecimiento durante 24 h
a 37 C. Trascurrido este tiempo se sembraron 3 gotas de este cultivo separadas formando
un tringulo sobre placas de Petri con medio semislido Rappaport-Vassiliadis Modificado
(Biokar Diagnostics, Beauvais, France). Las placas se incubaron durante 24 h a 41.5 C. Se
consideraron positivos aquellos tratamientos para los cuales las colonias correspondientes a
cada punto de siembra crecieron hacia el centro hasta superponerse.
6.6. Determinacin del contenido de Salmonella en heces

Veinticuatro horas antes de la recoleccin de las muestras se limpi el piso de cada jaula.
Transcurrido este tiempo se recolectaron las heces de cada individuo, se homogeneizaron y
se tom una muestra de 5 g. Se realizaron diluciones en triptona 0.1 %, se plaquearon en el
medio de cultivo selectivo y diferencial RAPID-Salmonella agar (BIO-RAD, Paris, France) y las
colonias magenta se contaron luego de 24 h de incubacin a 37 C.
6.7. Anlisis de la microbiota intestinal por electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante
A fin de analizar los cambios en la microbiota intestinal por la administracin de suero
fermentado con grnulos de kefir, se tomaron muestras del leon de 6 individuos luego de
ser tratados por administracin de una dosis diaria de 1 ml por va oral durante 10 das y de
6 individuos que no consumieron este producto (ver protocolo experimental en la seccin
3.4, ensayo 1). Los pollos fueron sacrificados y se realiz una incisin longitudinal de la
porcin distal del intestino delgado, antes de la desembocadura de los ciegos. La superficie
se enjuag suavemente con buffer fosfato esterilizado por filtracin para retirar los restos
de contenido luminal. Luego el epitelio de 5 cm de intestino se rasp con una esptula
estril recogindose el mucus con las bacterias adheridas al epitelio. Se extrajo ADN a partir
de 200 l de estas muestras empleando el kit comercial High Pure PCR Template
Preparation Kit (Roche, Sistemas de Diagnsticos, Lda.).
159
160
Las muestras fueron amplificadas empleando los primers universales 338fGC y 518r para
Eubacterias mediante la metodologa descripta en el captulo 1 (Materiales y mtodos,
seccin 10). Asimismo se utilizaron los primers Lac 1 (5-AGCAGTAGGGAAT CTTCCA-3) y GCLac2 (5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGATTYCACCGCTACAC ATG3) que amplifican una regin de 430 pb del ADNr 16S de Lactobacillus sp. El programa de
amplificacin empleado fue: 2 min de desnaturalizacin, 35 ciclos de 94 C por 30 s, 61 C
por 1 min y 68 C por 1 min; y elongacin final a 68 C por 7 min (Walter y col., 2001).
Los productos PCR fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa (10 g/l)
conteniendo bromuro de etidio y visualizados bajo luz UV. Luego se analizaron en geles de
acrilamida con gradiente desnaturalizante de urea formamida 40-60 % segn lo descripto
en el captulo 1 (Materiales y mtodos, seccin 11).
Para comparar los perfiles DGGE de distintos individuos se consideraron las bandas como
caracteres y a su presencia o ausencia como el estado de estos caracteres. La similitud entre
perfiles se calcul mediante el coeficiente de Jaccard y el agrupamiento se llev a cabo
mediante el mtodo de ligamiento promedio no ponderado (UPGMA) empleando el
programa SYSTAT versin 12. Los resultados se presentaron en forma de dendrograma.
6.8. Anlisis estadstico

En los ensayos in vitro los tratamientos se realizaron por triplicado (3 fosas) en 2 o 3
ensayos independientes. Los resultados se compararon luego mediante el test T de Student
(=0.05).
En los ensayos in vivo las diferencias entre tratamientos en cuanto al consumo de alimento,
el consumo de agua, la ganancia de peso y la conversin alimentaria fueron evaluadas
mediante anlisis de la varianza (ANOVA). Para analizar la concentracin de Salmonella en
heces se aplic una transformacin logartmica a fin de normalizar los datos y los mismos se
compararon mediante el Test T de Student (=0.05).
Captulo 3. Antagonismo sobre Salmonella
PARTE A: Antagonismo de suero fermentado sobre la adhesin e invasin de Salmonella
Enteritidis en modelos in vitro
Utilizando el modelo de clulas de epitelio intestinal Caco-2/TC7 se analiz la capacidad de
asociacin e invasin de distintos aislados de Salmonella enterica serovar. Enteritidis
(Salmonella Enteritidis) y la capacidad de adhesin de los microorganismos de kefir
presentes en distintos sueros fermentados. Se evalu luego el efecto antagnico de los
microorganismos de los sueros fermentados y de sus sobrenadantes sobre la asociacin e
invasin de Salmonella Enteritidis a epitelio intestinal.
1. Asociacin e invasin de Salmonella Enteritidis a clulas Caco-2/TC7

Se analiz en una primera etapa, la capacidad de distintas cepas de Salmonella Enteritidis
de adherirse e invadir (internalizar) clulas Caco-2/TC7 en cultivo. Para los estudios de
asociacin a las clulas se realiz un recuento del total de bacterias (adheridas +
internalizadas), mientras que para determinar el nivel de invasin fue necesario diferenciar
las bacterias adheridas de las que se encontraban dentro de las clulas utilizando
gentamicina.
Se evaluaron la concentracin de antibitico y el tiempo de incubacin adecuados para las
cepas de Salmonella Enteritidis empleadas en este estudio: 2713, 261D y CIDCA 101. La
viabilidad de las 3 cepas en presencia 100 g/ml de gentamicina disminuy
aproximadamente 4 rdenes logartmicos durante 1 h de incubacin, considerndose este
tratamiento apropiado para los estudios de invasin. Otros autores han utilizado 100 g/ml
de gentamicina durante 1 h en estudios de invasin de Salmonella a clulas Caco-2 (Mynott
y col., 2002; Golowczyc y col., 2007).
Se analiz la asociacin e invasin de 3 cepas de Salmonella Enteritidis empleando una
dosis infectiva de patgeno de 108 UFC/fosa, lo que representa una multiplicidad de
infeccin (mdi) de 100 bacterias por cada clula epitelial. Se hallaron porcentajes de
asociacin distintos para las 3 cepas con valores entre 0.3 y 6 %, mientras que los
161
162
porcentajes de invasin para las cepas CIDCA 101 y 2713 fueron similares con valores de ~
0.1 % (Tabla 3.1).
Cuando se infectaron las clulas Caco-2/TC7 con 106 UFC/fosa de S. Enteritidis CIDCA 101
(mdi=1) se obtuvieron porcentajes de asociacin e invasin similares a los obtenidos al
aplicar una dosis infectiva de 108 UFC/fosa (Tabla 3.1).
Tabla 3.1: Asociacin (adhesin + invasin) e invasin de distintas cepas de Salmonella
enterica serovar. Enteritidis a monocapas de clulas Caco-2/TC7.
Cepa
Inculo
Asociacin
Invasin
(UFC/fosa)
(UFC/fosa)
(%)
(UFC/fosa)
(%)
2713
1.0 0.1 x 108
1.0 0.9 x 106
1.0
1.1 0.6 x 105
0.11
261D
1.1 0.5 x 10
3.9 2.3 x 10
0.3
ND*
ND
0.8 0.2 x 10
4.4 0.4 x 10
CIDCA 101
CIDCA 101
1.1 0.2 x 10
6.6 2.1 x 10
5.5
6.0
0.9 0.3 x 10
0.11
0.09
9.4 2.9 x 10
Los valores corresponden al promedio de cuatro ensayos independientes.

*ND: no determinado
El porcentaje de asociacin e invasin de S. Enteritidis CIDCA 101 hallado en el presente

trabajo se corresponde con el informado previamente por Golowczyc y col. (2007). Estos
autores describieron que la asociacin de esta cepa a clulas Caco-2/TC7 es 6.5 % y la
invasin de 0.11 %.
Asimismo otros autores han informado valores de asociacin e invasin de Salmonella
variables entre cepas, similares a los hallados en el presente trabajo. Yim y col. (2010)
describieron valores de asociacin a clulas Caco-2 de 30 cepas de Salmonella Enteritidis
entre 0.99 y 3.45 % y de invasin entre 0.02 y 1.10 %. Shah y col. (2011) hallaron que la
capacidad de invadir clulas Caco-2 de 55 cepas de Salmonella Enteritidis aisladas de aves
era variable, encontrando que de las cepas evaluadas, 30 presentaron capacidad invasiva
alta (~ 0.6 %), 18 intermedia (~ 0.1 %), y 7 baja (~ 0.05 %). Considerando la clasificacin
descripta por estos autores la capacidad invasiva de las cepas 2713 y CIDCA 101 evaluada en
el presente trabajo fue intermedia.
La asociacin de Salmonella a las clulas epiteliales es un paso crucial para iniciar la
infeccin. Este patgeno establece un estrecho contacto con el borde en cepillo del epitelio
intestinal, cuando la bacteria se acerca a la superficie epitelial, las microvellosidades

circundantes empiezan a degenerarse con elongacin, edema y crecimiento en un proceso
llamado ruffling (rizado). Aqu, los efectores interactan con las protenas de la clula
hospedera para rearreglar el citoesqueleto de actina e inducir cambios morfolgicos que
causan que estas clulas, normalmente no fagocticas, internalicen la bacteria en un
proceso llamado invasin. Mediante el empleo de tcnicas microscpicas pudieron
estudiarse las alteraciones causadas por el patgeno a clulas Caco-2 luego de la infeccin.
El aspecto de la monocapa de clulas Caco-2/TC7 sin tratar (control) y de clulas infectadas
con Salmonella Enteritidis se observ mediante tincin de May Grnwald Giemsa. En la
Figura 3.7 A se puede observar que las clulas sin infectar presentan la forma polidrica
tpica de esta lnea celular, se encuentran unidas entre s y con un aspecto uniforme. Por el
contrario, cuando las clulas son infectadas durante 1 h con Salmonella Enteritidis (dosis de
infeccin 1 x 106 UFC/ml) se redondean y pierden su forma polidrica caracterstica (Figura
3.7 B).
A
Figura 3.7: Tincin por la tcnica de May Grnwald Giemsa de clulas Caco-2/TC7 sin tratar
(A) y luego de la infeccin durante 1 h con Salmonella enterica serovar Enteritidis CIDCA
101 (B). Se emple una multiplicidad de infeccin de 1 bacteria/enterocito. Aumento 400x.
Se ha descripto que luego de la entrada de Salmonella a los enterocitos las bacterias

internalizadas en vacuolas membranosas son rodeadas por estructuras densas de 5-10 m
conformadas por varios componentes del citoesqueleto. Estas estructuras consisten en
agregados de actina polimerizada, -actina y tropomiosina sobre y a los costados de la
bacteria invasora y son evidentes luego de la adicin de la bacteria patgena a clulas
163
164
epiteliales en cultivo, siendo detectadas luego de 20 a 60 min de incubacin dependiendo

de modelo de clulas empleado (Finlay y col., 1991).
A fin de estudiar las modificaciones en el citoesqueleto de las clulas Caco-2/TC7 luego de
su infeccin con Salmonella, se marc la red de filamentos de actina del citoesqueleto a
travs de la utilizacin de faloidina conjugada con isotiocianato de fluorescena (FITCfaloidina) que presenta alta afinidad por esta estructura.
SIN TRATAR
B
INFECTADAS CON SALMONELLA ENTERITIDIS

D
Figura 3.8: Marcacin de citoesqueleto de clulas Caco2-/TC7 sin infectar (A y B) y luego de

la infeccin durante 1 h con Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101 (C y D). Se
emple una multiplicidad de infeccin de 1 bacteria/enterocito. Aumento: 300x (A y C) y
600x (B y D), las barras en blanco indican 100 m.
En las clulas sin infectar la actina se distribuy de modo uniforme en los bordes de las
clulas y en las microvellosidades, asimismo se observ un patrn continuo de contacto
entre las clulas (Figura 3.8 A y B). Las clulas infectadas no presentaron una notoria
alteracin de la estructura del citoesqueleto, sin embargo en algunas zonas de la
monocapa se observ una distribucin menos homognea de la actina y mayor
concentracin de la misma en los contactos entre clulas (Figura 3.8 C y D).
Por microscopa electrnica de barrido se observ la apariencia de la monocapa de
clulas epiteliales sin infectar y luego de ser tratadas con el patgeno (Figura 3.9). Las
clulas intestinales infectadas con Salmonella mostraron una clara desorganizacin de
las microvellosidades en las proximidades de las zonas a las que se asoci el patgeno
(Figura 3.9 B) observndose asimismo la degeneracin y elongacin de las mismas para
rodear la bacteria invasora (Figura 3.9 C).
A
165
166
Figura 3.9: Microscopa electrnica de barrido mostrando la superficie de las clulas Caco2/TC7 sin tratar (A) y luego de la infeccin durante 1 h con 1 x 106 UFC/ml de Salmonella
enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101 (B y C). El aumento se indica al pie de cada
fotografa.
2. Adhesin de los microorganismos de kefir a clulas Caco2/TC7

Es generalmente aceptado que una caracterstica para seleccionar cepas probiticas es su
capacidad de adherirse al epitelio intestinal. Esto les permite un mayor tiempo de
residencia en el tracto gastrointestinal y mayor posibilidad de ejercer efectos
inmunomodulatorios e inhibir la adhesin de patgenos al epitelio intestinal (Fernandez y
col., 2003; Lee y col., 2003; Santos y col., 2003; Maldonado Galdeano y col., 2007; Flint y
Garner, 2009). Por este motivo se caracteriz la adhesin de los microorganismos presentes
en el suero fermentado con grnulos de kefir y con cepas aisladas de los mismos a clulas
Caco-2/TC7.
Tabla 3.2: Adhesin de bacterias lcticas y levaduras presentes en suero fermentado con
grnulos de kefir a monocapas de clulas Caco-2/TC7.
Inculo (UFC/fosa)
Levaduras
BAL
1.2 0.6 x10
2.5 1.0 x10
Adhesin (UFC/fosa)
Adhesin (%)*
1.3 0.8 x10
10.9
1.9 0.5 x10
0.8
*Adhesin (%): (clulas adheridas/clulas agregadas a la fosa) x 100

Los valores corresponden al promedio de tres ensayos independientes
BAL= bacterias cido lcticas
Las levaduras contenidas en el suero fermentado con grnulos de kefir presentaron mayor
capacidad de adhesin (10.9 %) que las bacterias cido lcticas (0.8 %) de este producto
(Tabla 3.2).
En comparacin con estudios previos de adhesin de levaduras de la industria alimentaria a
cultivos de clulas epiteliales, el valor de adhesin hallado para las levaduras del suero
fermentado (10.9 %) es alto. Van der Aa Khle y col. (2005) describieron que, de 18 cepas
de Saccharomyces cerevisiae y 8 de S. cerevisiae var. boulardii empleadas en la produccin
de alimentos y bebidas, slo 4 presentaron valores de adhesin a clulas epiteliales de
porcino IPEC-J2 superiores a 8 %, siendo para el resto de las cepas inferiores al 6 %.
Klingberg y col. (2008) informaron valores de adhesin a clulas Caco-2 entre 0.6 % y 6.2 %
para 6 cepas de S. cerevisiae. La alta capacidad de adhesin de levaduras de kefir haba sido
notada previamente por Kumura y col. (2004). Estos autores analizaron la adhesin de 4
cepas de levaduras aisladas de kefir a clulas Caco-2 hallando valores de 40 % para S.
cerevisiae, 28 % para Kluyveromyces lodderae, 4 % para Kluyveromyces marxianus y 2 %
para Candida humilis.
El porcentaje de adhesin descripto en el presente trabajo para las BAL presentes en el
suero fermentado con grnulos de kefir (0.8 %) es moderado a bajo en relacin a valores
descriptos por otros autores. Tuomola y Salminen (1998) hallaron valores de adhesin a
clulas Caco-2 entre 3 % y 14 % para 12 cepas de Lactobacillus sp. empleadas en la industria
lctea o en alimentos. Golowczyc y col. (2007, 2008) describieron valores de adhesin a
clulas Caco-2/TC7 entre 0.2 % y 7 % para 19 lactobacilos heterofermentativos y entre 0.97
% y 10.5 % para 11 cepas de Lactobacillus plantarum, todos ellos aislados de kefir. Debe
considerarse, sin embargo, que los valores reportados por estos autores corresponden a la
adhesin de cepas aisladas crecidas en medio de cultivo, mientras que en el presente
estudio se evala la adhesin de todos los microorganismos contenidos en el suero
fermentado. Tanto el medio de cultivo como la interaccin entre los microorganismos
pueden afectar su capacidad de adhesin (Xie y col., 2012; Kankaanp y col., 2001).
Para observar en detalle los lactobacilos y levaduras adheridos a la superficie de clulas
Caco-2/TC7, se emple microscopa electrnica de barrido. En distintos campos se
167
168
detectaron microorganismos aislados o agrupamientos entre bacilos o entre estos y

levaduras, as como tambin zonas descubiertas (Figura 3.10). Cabe destacar que no se
detectaron alteraciones en las clulas epiteliales en las zonas de contacto con los
microorganismos.
Figura 3.10: Microscopa electrnica de barrido mostrando la adhesin de bacterias y

levaduras de suero fermentado con grnulos de kefir a la superficie de clulas Caco-2/TC7.
El aumento se indica al pie de cada fotografa.
Se estudi tambin la adhesin de Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir

CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 aisladas de kefir crecidas durante 72 h
en cultivo mixto en suero, determinndose que las 3 cepas presentaron distinta capacidad
de adherirse a clulas Caco2/TC7 (Tabla 3.3).
Tabla 3.3: Adhesin de cepas aisladas de kefir crecidas en suero en cultivo mixto a
monocapas de clulas Caco-2/TC7.
Inculo (UFC/fosa) Adhesin (UFC/fosa)
K. marxianus CIDCA 8154
L. plantarum CIDCA 8327
L. kefir CIDCA 8348
1.9 1.7 x 10
4.6 3.1 x 10
3.0 1.1 x 10
Adhesin (%)
1.6 1.5 x 10
8.7
2.8 5.3 x 10
0.6
3.9 1.6 x 10
1.3
*Adhesin (%): (clulas adheridas/clulas agregadas a la fosa) x 100.

Los valores corresponden al promedio de cuatro ensayos independientes.
La capacidad de adhesin de la levadura fue mayor que la de los lactobacilos, en

concordancia con los resultados obtenidos para suero fermentado con grnulos de kefir.
Maccaferri y col. (2012) tambin describieron que K. marxianus B0399 presenta alta
capacidad de adhesin a clulas Caco-2 en relacin a cepas de lactobacilos.
Se ha descripto que L. plantarum CIDCA 8327 crecida en MRS presenta un porcentaje de
adhesin a clulas Caco2/TC7 de 1.75 (Golowczyc y col., 2008) y L. kefir CIDCA 8348 de 4.5
(Golowczyc y col., 2007). Estos valores son superiores a los hallados en el presente estudio
para las mismas cepas crecidas en cultivo mixto en suero, indicando que el medio de cultivo
y la interaccin entre los microorganismos afectan la capacidad de adhesin.
Figura 3.11: Microscopa electrnica de barrido mostrando la adhesin a la superficie de

clulas Caco-2/TC7 de K. marxianus CIDCA 8154, L. kefir CIDCA 8348 y L. plantarum CIDCA
8327 cultivadas conjuntamente en suero durante 72 h a 30 C. El aumento se indica al pie
de cada fotografa.
La adhesin de K. marxianus CIDCA 8154, L. kefir CIDCA 8348 y L. plantarum CIDCA 8327
cultivadas conjuntamente en suero, a la superficie de monocapas de clulas Caco-2/TC7 se
analiz tambin mediante microscopa de barrido (Figura 3.11). A diferencia de lo
169
170
observado para los microorganismos del suero fermentado con grnulos de kefir (Figura
3.10), los lactobacilos y levaduras aislados de kefir se agregaron sobre la monocapa
recubiertos por un material extracelular que podra corresponder a polisacridos o
protenas secretadas por los mismos microorganismos o bien algn componente del suero
que precipite junto a ellos durante la centrifugacin. Dado que el suero fue tindalizado
previamente a su fermentacin en los ensayos con cepas aisladas de kefir (Captulo 1,
Materiales y mtodos, seccin 3.2) es posible que correspondan a protenas de suero, ya el
tratamiento trmico y el bajo pH en conjunto desestabilizan las protenas de suero
ocasionando su precipitacin (Paulsson y col., 1985).
La formacin de agregados entre microorganismos (co-agregacin) es una caracterstica
considerada deseable ya que numerosos autores han sealado que contribuye a la
formacin de una barrera que previene la colonizacin de bacterias patgenas (Schachtsiek
y col., 2004; Schellenberg y col., 2006; Collado y col., 2007).
Result evidente en la observacin microscpica la co-agregacin entre K. marxianus y
lactobacilos, aunque no puede discriminarse si corresponden a L. plantarum y/o a L. kefir.
Los agregados densos de microorganismos formados sobre la monocapa podran actuar
como barrera para la interaccin entre patgenos y enterocitos, sin embargo tambin se
observaron zonas de epitelio descubierto que podran ser colonizadas por el patgeno.
3. Efecto de la presencia de microorganismos de kefir sobre la asociacin e invasin de

3.1 Preincubacin de la monocapa de enterocitos con microorganismos de kefir

Uno de los mecanismos a travs del cual los probiticos pueden proteger al hospedador de
patgenos intestinales es mediante el denominado efecto barrera. Este hace referencia al
proceso mediante el cual los microorganismos asociados a la monocapa impiden el contacto
del patgeno con las clulas epiteliales evitando as su asociacin e invasin.
A fin de evaluar si microorganismos contenidos en el suero fermentado con grnulos de
kefir son capaces de ejercer este efecto, los mismos fueron resuspendidos en PBS,
adicionados a clulas Caco-2/TC7 e incubados durante 1 h a 37 C. Durante este tiempo

quedaron adheridas a la monocapa levaduras en el orden de 10 5 UFC/fosa y bacterias cido
lcticas en el orden de 104 UFC/fosa (ver Tabla 3.2). Luego se adicion sobre la monocapa
Salmonella Enteritidis 2713, CIDCA 101 o 261D en concentracin 108 UFC/fosa y se evalu la
asociacin del patgeno.
Pudo observarse que la preincubacin de la monocapa con microorganismos de suero
fermentado con grnulos de kefir no disminuy la capacidad de asociacin de ninguno de
los 3 aislados de S. Enteritidis evaluados (Tabla 3.4).
Tabla 3.4: Asociacin de Salmonella Enteritidis 2313, CIDCA 101 y 261D a monocapas de
clulas Caco-2/TC7 preincubadas con microorganismos de kefir.
2713
(UFC/fosa)
CIDCA 101
(UFC/fosa)
261D
(UFC/fosa)
Control
1.0 0.9 x 106 a
4.4 0.4 x 106 a
3.9 2.3 x 105 a
SFG1
2.0 1.9 x 106 a
5.0 2.4 x 106 a
3.0 2.9 x 106 b
SFG 5x2
5.4 1.4 x 106 b
ND4
ND
6b
ND
ND
Tratamiento
Cepas
6.6 1.5 x 10
SFG: microorganismos presentes en suero fermentado 24 h a 20 C con 10 % p/v de grnulos de

2
3
kefir. 5x: concentracin de microorganismos cinco veces mayor. Lactobacillus plantarum CIDCA
8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 crecidos en cultivo
mixto en suero durante 72 h a 30 C. En todos los tratamientos los microorganismos fueron
separados del suero fermentado por centrifugacin y resuspendidos en PBS. Luego se incubaron 1 h
8
sobre la monocapa antes de la infeccin con 10 UFC/fosa de Salmonella Enteritidis.
4
ND: no determinado
Dentro de la misma columna letras distintas representan diferencias significativas evaluadas
mediante el test T de Student a un nivel de significancia de 0.05.
Los resultados hallados podran deberse a que, tal como se describi en la seccin 2, las
bacterias y levaduras se hallan dispersas o formando grupos sobre la monocapa, quedando
zonas descubiertas que pueden ser colonizadas por el patgeno (Figura 3.10). Otros autores
han reportado que, cuando los microorganismos adheridos a clulas epiteliales in-vitro no
forman una cubierta homognea, no impiden la asociacin del patgeno (Golowczyc y col.,
2009; Martins y col., 2010).
171
172
A fin de aumentar la cantidad de microorganismos de kefir adheridos y reducir as los

espacios libres para la colonizacin del patgeno se aument 5 veces la concentracin de
microorganismos adicionada a la monocapa. En contraposicin con el resultado esperado se
hall que la asociacin de Salmonella Enteritidis fue significativamente mayor que en el
control (Tabla 3.4). Un resultado similar se obtuvo al pre-incubar la monocapa con cepas
aisladas de kefir crecidas en suero. En este caso el nmero de microorganismos de kefir que
adhieren a la monocapa es ~ 10 veces superior que al pre-incubar la monocapa con los
microorganismos de suero fermentado con grnulos de kefir, ya que quedan adheridas
levaduras en el orden de 106 UFC/fosa y bacterias cido lcticas en el orden de 105 UFC/fosa
(ver Tabla 3.3). Sin embargo, la cantidad de
Salmonella asociada aumenta
significativamente (Tabla 3.4). Este resultado podra deberse a la capacidad de Salmonella

de formar agregados con algunos de los microorganismos de kefir previamente adheridos a
la monocapa.
En concordancia con los resultados hallados en este estudio, Golowczyc y col. (2007) no
hallaron efecto protector de la asociacin ni la invasin de S. Enteritidis por lactobacilos
aislados de kefir cuando estos eran incubados sobre la monocapa previamente a la
infeccin.
3.2 Preincubacin de Salmonella Enteritidis con microorganismos de kefir

Los probiticos tambin pueden interaccionar superficialmente con los patgenos antes de
su unin al epitelio intestinal afectando su asociacin por interferencia con receptores o
estructuras de adhesin implicadas en el proceso. Se estudi por consiguiente si la
incubacin previa de Salmonella Enteritidis con microorganismos de kefir afectaba la
capacidad del patgeno de asociarse y/o invadir la monocapa de clulas Caco-2/TC7. Para
esto, se preincub Salmonella durante 1 h a 37 C con los microorganismos del suero
fermentado y luego la mezcla se coloc sobre la monocapa, evalundose distintas
relaciones de concentracin entre el patgeno y los probiticos.
Cuando se preincub S. Enteritidis CIDCA 101 en concentracin 106 UFC/ml con los
microorganismos de suero fermentado con grnulos de kefir (107 UFC/ml de BAL y 106
UFC/ml de levaduras) la relacin fue de 1 levadura y 10 BAL por cada Salmonella. En estas
proporciones no se hallaron diferencias significativas en la asociacin ni la invasin del
patgeno a la monocapa (Figura 3.12).
Al realizar el mismo ensayo empleando la misma multiplicidad de infeccin del patgeno y
concentrndose 10 veces los microorganismos de kefir (108 UFC/ml de BAL y 107 UFC/ml de
levaduras) la asociacin del patgeno disminuy significativamente (Figura 3.12 A).
Asimismo se hallaron diferencias significativas en la invasin con esta relacin
probiticos/Salmonella (10 levaduras y 100 BAL por cada Salmonella) (Figura 3.12 B).
A
B
6
Salmonella
10
10
1 Salmonella
1 Levadura
10 BAL
1 Salmonella
10 Levaduras
100 BAL
10
10
Control
SFG
SFG 10x
UFC/fosa
UFC/fosa
10
10
10
10
10
10
10
Salmonella
1 Salmonella
1 Levadura
10 BAL
1 Salmonella
10 Levaduras
100 BAL
Control
SFG
SFG 10x
Figura 3.12: Asociacin (A) e invasin (B) de 1 x 106 UFC/ml de Salmonella Enteritidis CIDCA
101 a monocapas de clulas Caco-2/TC7 al ser preincubada con microorganismos de suero
fermentado con grnulos de kefir (SFG) y con estos microorganismos concentrados diez
veces (SFG 10x). Los valores corresponden al promedio de tres ensayos independientes. Las
barras indican desvo estndar. S. Enteritidis preincubada con PBS fue usada como control.
Se indica en cada caso la relacin numrica entre el patgeno y los microorganismos de
kefir.
La diferencia entre la relacin patgeno/probitico fue asimismo evidente al observar la

superficie de la monocapa por microscopa de barrido. Cuando la cantidad de probitico fue
slo 10 veces superior que la del patgeno, se observaron sobre la monocapa grupos
dispersos de bacterias y levaduras (Figura 3.13 A y B). Asimismo se hallaron zonas de
epitelio daadas posiblemente colonizadas por el patgeno (Figura 3.13 C y D).
173
174
Figura 3.13: Microscopa electrnica de barrido mostrando la superficie de clulas Caco2/TC7 luego de la infeccin con Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101
preincubada con microorganismos de suero fermentado con grnulos de kefir. El aumento
se indica al pie de cada fotografa. Las flechas rojas sealan zonas de epitelio daadas
posiblemente como consecuencia de la asociacin del patgeno.
Cuando se aument 10 veces la concentracin de microorganismos de suero fermentado se

observ la formacin de una cubierta compuesta por lactobacilos y levaduras sobre la
monocapa (Figura 3.14) y no se observaron zonas de epitelio daado por el patgeno.
Figura 3.14: Microscopa electrnica de barrido mostrando la superficie de clulas Caco2/TC7 luego de la infeccin con Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101
preincubadas con microorganismos de suero fermentado con grnulos de kefir
concentrados 10 veces. El aumento se indica al pie de cada fotografa.
La observacin microscpica de la morfologa y del citoesqueleto de los enterocitos indic

asimismo una proteccin contra los daos causados por el patgeno (Figuras 3.7 B y 3.8 C y
D) debido a los microorganismos del suero fermentado con grnulos de kefir concentrados
10 veces, ya que la monocapa no present alteraciones luego de la infeccin con el
patgeno (Figura 3.15).
A
Figura 3.15: Tincin por la tcnica de May Grnwald Giemsa (A) y marcacin de
citoesqueleto (B) de clulas Caco-2/TC7 luego de la infeccin durante 1 h con Salmonella
enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101 incubada previamente con microorganismos de
suero fermentado con grnulos de kefir concentrados diez veces. Se emple una
multiplicidad de infeccin de 1 bacteria/enterocito. Aumento: 400x (A) y 600x (B). La barra
en blanco indica 100 m.
175
Se estudi asimismo, el efecto de la preincubacin de S. Enteritidis CIDCA 101 con cepas

aisladas de kefir crecidas en suero. Cuando se ferment suero durante 72 h con un cultivo
mixto de L. kefir, L. plantarum y K. marxianus la concentracin de ambos lactobacilos en el
producto fue 1 x 108 UFC/ml y la de la levadura 1 x 107 UFC/ml (Captulo 1, Figura 1.28). Los
microorganismos de este producto fueron centrifugados y resuspendidos en igual volumen
de PBS. Luego esta suspensin se incub 1 h a 37 C con Salmonella en concentracin 106
UFC/ml en PBS. La relacin de concentracin entre el probitico y el patgeno fue por lo
tanto de 100 bacterias cido lcticas y 10 levaduras por cada Salmonella. Cuando se infect
la monocapa con Salmonella preincubada con las cepas aisladas de kefir tanto la asociacin
como la invasin disminuyeron significativamente respecto al control (p>0.05) (Figura 3.16).
A
B
Salmonella
1 Salmonella
10 Levaduras
100 BAL
Salmonella
10
10
10
1 Salmonella
10 Levaduras
100 BAL
UFC/fosa
10
UFC/fosa
176
Control
SFC
Control
SFC
Figura 3.16: Asociacin (A) e invasin (B) de Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA
101 a monocapas de clulas Caco-2/TC7 al ser preincubada con una suspensin de
Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154 (SFC) crecidas en cultivo mixto en suero. Salmonella preincubada
con PBS fue usada como control. Los valores corresponden al promedio de dos ensayos
independientes. Las barras indican desvo estndar.
Golowczyc y col., 2007 describieron que L. kefir CIDCA 8348 tiene la capacidad de coagregar con Salmonella Enteritidis y que esta habilidad est directamente relacionada con la
menor capacidad de invasin a clulas Caco-2 observada en Salmonella luego de ser
preincubada con el lactobacilo. Es por lo tanto probable que la co-agregacin de L. kefir con
Salmonella est implicada en el efecto protector de la invasin hallado en el presente
estudio. Por otro lado se ha descripto que L. plantarum CIDCA 8327 no co-agrega con
Salmonella Enteritidis (Golowczyc, 2008), pero su capacidad y la de K. marxianus CIDCA

8154 de antagonizar la asociacin de Salmonella a clulas epiteliales no ha sido
previamente estudiada.
Cuando se analizaron al microscopio de barrido los enterocitos luego de su tratamiento con
Salmonella Enteritidis preincubada con L. plantarum CIDCA 8327, L. kefir CIDCA 8348 y K.
marxianus CIDCA 8154, se observ sobre la monocapa la misma red de microorganismos
cubiertos por material extracelular (Figura 3.17) que cuando se analiz la adhesin de las
cepas de kefir en ausencia del patgeno (Figura 3.11). Como se describi anteriormente
este material posiblemente corresponda a protenas del suero y cuya implicancia en el
efecto protector observado sera interesante indagar.
Figura 3.17: Microscopa electrnica de barrido mostrando la superficie de clulas Caco2/TC7 luego de la adicin de Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101
preincubada con Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y
Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 crecidas en cultivo mixto en suero. El aumento se
indica al pie de cada fotografa.
177
178
Mediante observaciones microscpicas no pudieron detectarse alteraciones de la

morfologa de los enterocitos ni de la organizacin del citoesqueleto luego de la infeccin
de la monocapa con el patgeno preincubado con L. plantarum CIDCA 8327, L. kefir CIDCA
8348 y K. marxianus CIDCA 8154 crecidas en cultivo mixto en suero (Figura 3.18). Esto
refuerza las pruebas de que este tratamiento protege los enterocitos contra el dao
ocasionado por el patgeno sobre el epitelio intestinal.
A
Figura 3.18: Tincin por la tcnica de May Grnwald Giemsa (A) y marcacin de
citoesqueleto (B) de clulas Caco-2/TC7 luego de la infeccin durante 1 h con Salmonella
enterica serovar Enteritidis CIDCA 101 incubada previamente con Lactobacillus plantarum
CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154
crecidas en cultivo mixto en suero. Se emple una multiplicidad de infeccin de 1
bacteria/enterocito. Aumento: 400x (A) y 600x (B). La barra en blanco indica 100 m.
Se demuestra de este modo, un efecto protector de la asociacin e invasin de Salmonella

Enteritidis por levaduras y bacterias cido lcticas presentes en suero fermentado con
grnulos de kefir cuando su concentracin es 10 y 100 veces superior respectivamente a la
del patgeno. A esta misma relacin de concentracin se observa el efecto protector de
cepas aisladas de kefir crecidas en cultivo mixto en suero. Sin embargo debe notarse que la
reduccin de la asociacin e invasin de S. Enteritidis fue mayor (~ 2 rdenes logartmicos)
cuando se preincub el patgeno con los microorganismos presentes en el suero
fermentado con grnulos de kefir que con cepas aisladas de kefir (~ 1 orden logartmico).
An cuando se seleccionaron cepas aisladas de kefir con potencialidad para antagonizar la
accin de patgenos intestinales, no se logra reproducir el efecto protector del producto
obtenido a partir de la fermentacin con grnulos de kefir. El suero fermentado con

grnulos contiene especies que no se encuentran en el cultivo mixto, tales como
Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus parakefir, Lactococcus lactis, y Saccharomyces
cerevisiae (Captulo 1, Resultados y discusin, seccin 1.2). Asimismo debe considerarse
que el kefir contiene diversidad de cepas de cada especie que difieren en su capacidad
antagnica contra patgenos (Golowczyc y col., 2007; Garrote y col., 2010). La multiplicidad
de interacciones entre microorganismos que permite esta diversidad constituye la base del
poder del kefir como probitico, que no logr reproducirse mediante formulaciones
simplificadas.
Los resultados hallados en el presente trabajo indican que la accin protectora de los
microorganismos del suero fermentado sobre la asociacin de Salmonella Enteritidis a
enterocitos en cultivo es dependiente de la relacin numrica entre el patgeno y los
probiticos. Bernet y col. (1994) llegaron al mismo resultado utilizando Salmonella
Typhimurium y L. acidophilus. Mientras que a una relacin 1:10 de probitico:patgeno el
porcentaje de inhibicin de la invasin es 9 %, el mismo asciende a 37 % cuando la relacin
es 1:1. Coconnier y col. (1993) tambin reportaron que el efecto protector de la invasin de
S. Typhimurium por L. acidophilus es dosis dependiente.
Por otro lado se hall proteccin contra la asociacin de Salmonella Enteritidis a la
monocapa cuando los microorganismos de kefir fueron incubados con el patgeno
previamente a la infeccin, mientras que no hubo efecto protector cuando los mismos se
encontraron adheridos a la monocapa. Esto puede deberse a que cuando se adicionan
microorganismos de kefir a la monocapa antes de la infeccin, solo un pequeo porcentaje
(~ 0.5 a 10 %) de BAL y levaduras de kefir se adhieren a las clulas epiteliales, quedando
sitios descubiertos que podran ser colonizados por el patgeno. Cuando se incuba el
patgeno previamente a la infeccin con los microorganismos de kefir, la totalidad de
microorganismos presentes y no slo los que adhieren pueden interactuar con el patgeno
(Figura 3.19).
179
180
Figura 3.19: Esquema mostrando posibles interacciones entre Salmonella, microorganismos

de kefir y clulas epiteliales en cultivo Caco-2/TC7 en los 2 modelos experimentales
evaluados en este estudio: (A) preincubando la monocapa con microorganismos de kefir y
luego adicionando el patgeno y (B) preincubando Salmonella con microorganismos de
kefir.
4. Efecto de los sobrenadantes de suero fermentado sobre la asociacin e invasin de

Adems de analizar el efecto de los microorganismos de kefir se estudi si los metabolitos
producidos por los mismos durante la fermentacin de suero poseen algn efecto sobre la
asociacin e invasin de Salmonella Enteritidis. Para esto el patgeno fue preincubado
durante 1 h a 37 C con sobrenadantes de suero fermentado con grnulos de kefir o con
cepas aisladas de kefir.
Para evaluar la asociacin e invasin de Salmonella Enteritidis tratada con sobrenadante
de suero fermentado con grnulos de kefir y debido al efecto bactericida de este producto
descripto en el Captulo 2, el sobrenadante que presenta pH 3.6 debi ser llevado a pH 4.5.
De esta manera, no se afect la viabilidad de S. Enteritidis durante el tiempo de incubacin
(1 h a 37 C).
Cuando Salmonella Enteritidis CIDCA 101 fue tratada con sobrenadante de suero
fermentado con grnulos de kefir a pH 4.5 no se obtuvieron diferencias significativas en la
asociacin del patgeno a clulas epiteliales (Figura 3.20 A) pero si disminuy
significativamente su invasin (Figura 3.20 B).
A
B
5
UFC/fosa
UFC/fosa
10
10
Control
SFG
10
10
10
Control
SFG
Figura 3.20: Asociacin (A) e invasin (B) de 106 UFC/fosa de Salmonella enterica serovar.
Enteritidis CIDCA 101 a monocapas de clulas Caco-2/TC7 al ser tratada previamente con
sobrenadante de suero fermentado 24 h a 20 C con grnulos de kefir (SFG) a pH 4.5.
Salmonella preincubada con PBS fue usada como control. Los valores corresponden al
promedio de tres ensayos independientes. Las barras indican desvo estndar.
181
Se evalu tambin el efecto del sobrenadante de suero fermentado con cepas aisladas de
kefir. Durante la incubacin del patgeno con este sobrenadante que presenta pH 4.5 no se
observ disminucin de la viabilidad de Salmonella, no se obtuvieron diferencias
significativas en la asociacin (Figura 3.21 A) mientras que la capacidad invasiva del
patgeno se redujo significativamente (Figura 3.21 B).
A
B
10
UFC/fosa
182
10
Control
SF cepas
10
10
10
Control
SF cepas
Figura 3.21: Asociacin (A) e invasin (B) de 1 x 106 UFC/ml de Salmonella enterica serovar.
Enteritidis CIDCA 101 a monocapas de clulas Caco-2/TC7 al ser tratada previamente con
sobrenadante de suero fermentado 72 h a 30 C con Lactobacillus plantarum CIDCA 8327,
Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 (SF cepas). S.
Enteritidis preincubada con PBS fue usada como control. Los valores corresponden al
promedio de tres ensayos independientes. Las barras indican desvo estndar.
Cuando se evalu una mayor dosis infectiva de S. Enteritidis CIDCA 101 (108 UFC/fosa) se
obtuvieron los mismos resultados, hallndose proteccin de la invasin por el tratamiento
con sobrenadante de suero fermentado con cepas y no de la asociacin (Figura 3.22 A y B).
Para S. Enteritidis 2713 tambin se observ una reduccin de la invasin por el tratamiento
aunque el efecto protector fue menor que para la cepa CIDCA 101 (Figura 3.22 B vs. C).
Lin y col. (2008) tambin hallaron distinta proteccin de la invasin para 2 cepas de
Salmonella choleraesuis por Lactobacillus acidophilus. Estos autores atribuyeron las
diferencias a la distinta capacidad adhesiva e invasiva de ambas cepas patgenas ya que la
cepa con mayor capacidad de adhesin e invasin result menos protegida.
Asociacin
UFC/fosa
10
Invasin
Invasin
10
10
Control
SF cepas
10
10
Control
SF cepas
S. Enteritidis CIDCA 101
10
10
Control
SF cepas
S. Enteritidis 2713
Figura 3.22: Asociacin (A) e invasin (B y C) de 1 x 108 UFC/fosa de Salmonella enterica

serovar. Enteritidis a monocapas de clulas Caco-2/TC7 sin tratamiento previo (control) y
tratada con sobrenadante de suero fermentado 72 h a 30 C con Lactobacillus plantarum
CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 (SF
cepas). Los valores corresponden al promedio de tres ensayos independientes.
En correspondencia con los resultados antes presentados, el aspecto morfolgico (Figura

3.23) de las clulas Caco-2/TC7 luego de la infeccin con S. Enteritidis CIDCA 101 tratada
con sobrenadante de suero fermentado con grnulos de kefir y con cepas aisladas de kefir
no se vio alterada.
A
Figura 3.23: Tincin por la tcnica de May Grnwald Giemsa de clulas Caco-2/TC7 luego
de la infeccin durante 1 h con 1 x 106 UFC/fosa de Salmonella enterica serovar. Enteritidis
CIDCA 101 incubada previamente en sobrenadante de suero fermentado con grnulos de
kefir (A) y con un cultivo mixto de Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir
CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 (B). Se emple una multiplicidad de
infeccin de 1 bacteria/enterocito. Aumento: 400x.
183
184
En conjunto los resultados indican que los sobrenadantes ejercen un efecto protector sobre
la invasin del patgeno a la monocapa, mientras que no se observa efecto en la asociacin
del mismo a las clulas epiteliales. De manera similar a lo hallado en el presente estudio,
Hudault y col. (1997) demostraron que al tratar Salmonella Typhimurium durante 1 h con el
sobrenadante de un cultivo de L. casei GG, la invasin del patgeno a clulas Caco-2 se
reduce significativamente mientras que la asociacin no se modifica.
Es sabido que los cidos grasos de cadena corta (SCFAs) pueden interferir en la expresin de
genes asociados a la invasin de Salmonella, reprimiendo o induciendo el proceso de
acuerdo al tipo de cido y a la concentracin en que se produzca (Altier, 2005). Lawhon y
col. (2002) demostraron que una mezcla de SCFAs que replica las condiciones del leon
distal induce la expresin de genes SPI-1, implicados en la invasin, mientras que los
mismos cidos en las proporciones que se encuentran en el colon pueden reprimir los
mismos genes. El efecto sobre la invasin de Salmonella de cidos orgnicos que se
encuentran en altas concentraciones en el tracto gastrointestinal, tales como el actico, el
butrico y el propinico, ha sido bien caracterizado (Durant y col, 1999, 2000; Lawhon, 2002;
Van Immerseel, 2003, 2004, 2006). Menos se conoce sobre el efecto de otros como el cido
lctico. Hudault y col. (1997) observaron que el efecto protector de la invasin de S.
Typhimurium a clulas Caco-2 por el tratamiento con sobrenadante de un cultivo de L. casei
GG se perda al neutralizar el sobrenadante. Sin embargo, reportaron que el pH por s
mismo no era suficiente para reducir la invasin a los niveles hallados y en consecuencia
atribuyeron el efecto a algn metabolito producido por el lactobacilo que sea activo a bajo
pH sugiriendo que podra deberse a la presencia de cido lctico en concentracin subletal.
Makras y col. (2006) probaron que sobrenadantes de cultivo de 4 cepas pertenecientes al
gnero Lactobacillus sp. y medio de cultivo adicionado con la misma concentracin de cido
lctico presente en los sobrenadantes ejercan idntico efecto reductor de la invasin de S.
Typhimurium a clulas Caco-2/TC7, indicando que el cido lctico es responsable de la
inhibicin de la invasin de Salmonella a cultivos celulares. Sin embargo estos mismos
autores observaron que para 2 de las cepas estudiadas (L. johnsonii La1 y L. plantarum) la
reduccin de la invasin no poda explicarse slo por la presencia de este cido, sugiriendo
que habra implicada otra sustancia inhibitoria de naturaleza desconocida. Golowczyc y col.
(2007) tambin describieron que el efecto protector de sobrenadantes de 5 cepas de
Lactobacillus kefir sobre la asociacin e invasin de S. Enteritidis no poda explicarse slo
por la presencia de cido lctico. Estos autores hallaron que la protena de capa-S a la
concentracin en que se encuentra en sobrenadantes de cultivo de L. kefir es capaz de
asociarse a la superficie de Salmonella e interferir con su capacidad de invasin.
Asimismo alguno de los componentes del suero podra estar implicado en la proteccin
contra Salmonella observada en este estudio. Halpin y col. (2010) demostraron que el suero
protege contra la asociacin de S. Typhimurium a monocapas de clulas en cultivo y que al
ser hidrolizado aumenta significativamente su capacidad de prevenir la invasin de este
patgeno. Nascimento De Arajo y Giugliano (2000) describieron que el suero de leche
humana inhibe la asociacin de E. coli a clulas en cultivo y presentaron evidencias de que
la lactoferrina e inmunoglobulinas presentes en el mismo intervienen en este efecto.
En el presente estudio se demuestra que la incubacin de Salmonella en sobrenadante de
suero fermentado reduce su capacidad de invasin a clulas Caco-2/TC7, sin embargo ms
estudios son necesarios a fin de determinar en qu medida este efecto se debe a la
presencia de cidos orgnicos u otros metabolitos o a componentes del suero que
interfieran en los mecanismos de invasin del patgeno.
185
186
PARTE B: Antagonismo de suero fermentado sobre la adhesin e invasin de

Salmonella Enteritidis en modelos in vivo
Una vez demostrada la capacidad del suero fermentado de antagonizar la adhesin e

invasin de Salmonella Enteritidis in vitro, se procedi a evaluar el efecto de su
administracin a pollos parrilleros como tratamiento preventivo de la colonizacin
intestinal y translocacin de este patgeno.
Para los ensayos in vivo se seleccion la cepa Salmonella enterica serovar. Enteritidis
261D debido a que se haba aislado a partir de una reproductora COBB de un criadero de
Portugal vctima de un episodio grave de salmonelosis. La cepa haba mostrado alta
invasividad, produciendo importantes mortandades diarias y no responda a los
tratamientos, debiendo sacrificarse todo el lote de reproductoras.
En un ensayo inicial se analiz la inocuidad del suero fermentado y su efecto sobre la
microbiota intestinal de las aves. Luego se realizaron 3 ensayos en los cuales se vari la
cantidad y forma de administracin del probitico, as como la dosis infectiva de
Salmonella.
1. Inocuidad del suero fermentado sobre pollos parrilleros
Se determin si el consumo de suero fermentado con grnulos de kefir y con cultivo
madre en suero causa algn desorden alimentario u otro efecto negativo en pollos
parrilleros. Adems se analiz el efecto ejercido por los microorganismos presentes en el
suero fermentado con cultivo madre en suero resuspendidos en buffer fosfato, en
ausencia de los productos del metabolismo.
Los productos fueron administrados durante 10 das consecutivos registrndose
diariamente el aumento de peso, el consumo de agua y el consumo de alimento por
individuo como indicadores del estado de salud de los pollos. En base a estos datos se
calcul la conversin alimentaria que es una medida de la productividad de un animal y
se define como la relacin entre el alimento que consume cada pollo y el peso que gana.
Tambin se registr diariamente la humedad de las heces siendo este un parmetro
indicador de la respuesta de pollos ante modificaciones en la alimentacin (Eichner y
col., 2007; Namroud y col., 2008; Collett, 2012).
187
188
A fin de variar la dosis de probitico administrada se seleccionaron 2 productos con

distinto contenido de BAL y levaduras en base a resultados obtenidos durante este
trabajo, presentados en el Captulo 1. Se utilizaron: 1) suero fermentado con grnulos de
kefir con un contenido de BAL de 1 x 107 UFC/ml y de levaduras de 4 x 106 UFC/ml y 2)
suero fermentado con cultivo madre en suero cuya concentracin de BAL es 1 x 108
UFC/ml y de levaduras 1 x 107 UFC/ml. Asimismo se analiz el efecto de los
microorganismos de este ltimo producto resuspendidos en PBS en ausencia de los
productos de su metabolismo. Los productos fueron administrados en una dosis
definida de 1 ml diario aplicada en el pico de cada individuo.
El promedio y desvo estndar de la humedad de las heces de cada grupo, medidas para
cada individuo durante 10 das (60 mediciones por tratamiento) se presenta en la Tabla
3.5.
Tabla 3.5: Humedad de las heces promedio medidas durante 10 das de tratamiento.
Tratamiento
Humedad de las heces

promedio DS1 (%)
a2
Control
66.4 7.5
Suero fermentado con grnulos de kefir
69.3 10.8 a
Suero fermentado con cultivo madre en suero
66.7 6.9
Microorganismos de suero fermentado con cultivo

madre en suero
69.5 7.3
Se presenta el promedio el desvo estndar (DS) de los valores diarios registrados durante 10
das para 6 individuos por tratamiento (n=60). Edad de las aves: 14 a 24 das.
2
Letras iguales indican que no hay diferencias significativas (=0.05) entre tratamientos
analizadas mediante ANOVA.
No se observaron diferencias significativas en la humedad de las heces de los individuos

pertenecientes a distintos tratamientos. Este es un dato relevante ya que la humedad de
las heces adems de ser un indicador del estado de salud intestinal de las aves, reviste
importancia en la industria avcola al influir en el estado sanitario de la cama. La cama se
define como la combinacin del material del lecho, el excremento, plumas, alimento y
agua derramados. La humedad de la cama y el estado del excremento son los factores
ms importantes que determinan las condiciones de las mismas. Las condiciones de la
cama influyen significativamente en el rendimiento y en la rentabilidad de la produccin
de los pollos parrilleros, una excesiva humedad puede conducir a altas emisiones de
amoniaco, dermatitis plantar, prdidas en el procesamiento y decomisos (Weaver y

Meijerhof, 1991).
Los valores de consumo total de alimento y agua durante los 10 das de ensayo tampoco
resultaron significativamente diferentes (P>0.05) entre los pollos que se sometieron a
los distintos tratamientos (Tabla 3.6).
Tabla 3.6: Consumo total de agua y alimento por individuo en 10 das de ensayo
Tratamiento1
Consumo total de agua (L)
Consumo total de alimento (kg)
a2
1.19 0.12 a 2
Control
1.80 0.28
SFG
2.22 0.29 a
1.19 0.22 a
SFC
1.83 0.17 a
1.30 0.21 a
MSF
2.24 0.28 a
1.27 0.08 a
Se presenta el valor promedio desvo estndar de los 6 individuos de cada tratamiento. Edad:
14 a 24 das.
1
Administracin durante 10 das de 1 dosis diaria de 1ml por va oral de: placebo (control), suero
fermentado con grnulos de kefir (SFG), suero fermentado con cultivo madre en suero (SFC) y
microorganismos de suero fermentado con cultivo madre en suero (MSF).
2
Letras iguales en la misma columna significan que no hay diferencias significativas entre
tratamientos (=0.05).
El consumo de alimento aument constantemente en el tiempo, registrndose valores

de consumo de ~ 50 g por individuo al inicio del ensayo y de 140 a 200 g al final del
mismo (Figura 3.24 A). El consumo de agua por individuo, en cambio, se increment
levemente con el crecimiento de los pollos. Los primeros 5 das de ensayo el consumo
de agua promedio present valores entre 160 y 210 ml y los siguientes 5 das estuvo
entre 200 y 250 ml (Figura 3.24 B).
Consumo de alimento por individuo (g)
A
250
200
150
100
50
0
0
Tiempo (das)
10
189
B
0,4
Consumo de agua por individuo (L)
190
0,3
0,2
0,1
0,0
0
10
Tiempo (das)
Figura 3.24: Consumo de alimento (A) y agua (B) por individuo de pollos de 14 a 24 das
de edad medidos durante la administracin de 1 dosis diaria de 1ml por va oral de:
placebo (), suero fermentado con grnulos de kefir (), suero fermentado con cultivo
madre en suero () y microorganismos de suero fermentado con cultivo madre en
suero (). Los smbolos representan el promedio correspondiente a 6 individuos por
cada tratamiento y las barras el desvi estndar.
En cuanto a la ganancia de peso diaria y la conversin alimentaria no se hallaron

diferencias significativas entre tratamientos (Tabla 3.7), indicando que no hubo efectos
negativos en parmetros productivos de los pollos por la administracin de suero
fermentado o sus microorganismos. Por el contrario, se observaron valores levemente
mayores de ganancia de peso diaria para los individuos que consumieron estos
productos.
Tabla 3.7: Parmetros productivos de pollos Ross pm3 de 14 a 24 das de edad.
Tratamiento1
Peso inicial (g)
Peso final (g)
Ganancia de
peso diaria (g)2
Conversin
alimentaria3
Control
375 19 a
797 53 a
46.8 4.9 a
2.83 0.17 a
SFG
375 55 a
835 78 a
51.1 6.6 a
2.60 0.46 a
SFC
348 29 a
805 90 a
50.7 7.7 a
2.92 0.72 a
MSF
353 36 a
842 34 a
54.2 2.0 a
2.60 0.22 a
Se presenta el valor promedio el desvo estndar de los 6 individuos de cada tratamiento.

1
Administracin durante 10 das de 1 dosis diaria de 1ml por va oral de: placebo (control), suero
fermentado con grnulos de kefir (SFG), suero fermentado con cultivo de suero (SFC) y
microorganismos de suero fermentado con cultivo de suero (MSF)
2
Ganancia de peso diaria = (peso final-peso inicial)/das
3
Conversin alimentaria= alimento consumido/(peso final - peso inicial)
Letras iguales en la misma columna significan que no hay diferencias significativas entre
tratamientos (=0.05)
Se analiz tambin la evolucin del peso durante el periodo de administracin de los

distintos productos. A fin de evitar las diferencias entre tratamientos debidas a distintos
pesos iniciales los datos fueron normalizados dividiendo el peso por el peso inicial.
2,6
Peso normalizado (g)
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0
Tiempo (das)
Figura 3.25: Peso de los pollos durante el tiempo de administracin de 1 dosis diaria de
1ml por va oral de: placebo (), suero fermentado con grnulos de kefir (), suero
fermentado con cultivo madre en suero () y microorganismos de suero fermentado
con cultivo madre en suero ().
Se detect una tendencia a una mayor ganancia relativa de peso en los grupos que
consumieron suero fermentado (Figura 3.25). La comparacin estadstica entre el grupo
control y el tratamiento con suero fermentado con grnulos de kefir, que corresponde a
la menor dosis de microorganismos administrada, no revel diferencias significativas
entre ambos grupos. Mientras que, cuando se compararon los tratamientos con mayor
dosis de microorganismos, tanto en presencia como ausencia de sobrenadante, se
detect un aumento de peso significativamente mayor (P<0.05) los ltimos 3 das de
tratamiento con respecto al control.
Los antecedentes del efecto de la administracin de kefir sobre la productividad de aves
son escasos. Cenesiz y col. (2008) describieron mayor ganancia de peso en pollos que
consumieron kefir a ad libitum en concentracin 7.5 % en agua de bebida, mientras que
no observan diferencias significativas en este parmetro al administrarlo al 5 %. Zacconi
y col. (2003) demostraron que la administracin de kefir en una dosis nica de 1 ml el
primer da de vida o su consumo durante 12 das ad libitum diluido 1:1 en agua de
bebida, mejora la conversin alimentaria y la ganancia de peso de los pollos. Otros
191
192
autores han observado mejoras en parmetros productivos por administracin de kefir

en gansos (Anser anser) aunque las diferencias no resultan estadsticamente
significativas (Yaman y col., 2006; Hesna Sahin y Yardimci, 2009).
Considerando en conjunto los parmetros productivos analizados en el presente trabajo
no puede afirmarse que el consumo de suero fermentado presenta un efecto promotor
del crecimiento de las aves. Sin embargo, dada la tendencia observada, y considerando
las grandes desviaciones debido al pequeo tamao de muestra sera interesante
evaluar el efecto empleando mayor nmero de individuos a fin de garantizar una mejor
comprensin de la influencia de estos tratamientos en la productividad.
Telg y Caldwell (2009) analizando la influencia del consumo de un probitico en los
parmetros productivos de pollos observaron que la utilizacin de 20 individuos por
tratamiento no era suficiente para extraer resultados concluyentes ya que, dada la
desviacin entre individuos, obtenan diferencias comercialmente valiosas aunque no
estadsticamente significativas.
Esto mismo queda en evidencia al analizar las escasas diferencias en parmetros
productivos entre individuos control y tratados que resultan significativas en ensayos a
campo. Awad y col. (2009) hallaron que la administracin de un probitico constituido
por Lactobacillus sp. homofermentativos y heterofermentativos adicionados al alimento
(108 UFC/tonelada) produce mejoras en la ganancia de peso diaria y en la conversin
alimentaria. Las diferencias entre los valores presentados por estos autores entre el
grupo control y el tratado, calculado sobre un total de 200 individuos por tratamiento,
son de 0.33 g en la ganancia de peso y de 0.04 en la de conversin alimentaria. Alkhalf y
col. (2010) reportan que la administracin del probitico comercial Bactocell aumenta
significativamente el rendimiento de pollos parrilleros, hallando una diferencia en la
ganancia de peso entre el grupo control y el tratado de 4.3 g y de conversin alimentaria
de 0.14 calculados sobre un total de 200 individuos por tratamiento.
2. Anlisis de la microbiota intestinal por electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante (DGGE)
Se evalu mediante DGGE la diversidad de Eubacterias, empleando primers universales
(GC-338f/518r), y la de Lactobacillus sp., empleando primers especficos (Lac1/GC-Lac2),
del leon de pollos. Los ensayos se realizaron sobre muestras de animales tratados
durante 10 das con una dosis diaria definida de 1 ml de suero fermentado con grnulos
de kefir aplicada en el pico de cada individuo (tratados) y de individuos no tratados
(control).
Los perfiles DGGE de la comunidad bacteriana del leon de individuos control y tratados
se presentan en la Figura 3.26. Se observaron patrones de compuestos por 5 a 14
bandas dependiendo del individuo analizado. Aquellos pertenecientes al grupo que
consumi suero fermentado presentaron entre 7 y 14 bandas (Figura 3.26 A calles T1 a
T6). El nmero de bandas en los perfiles de los individuos control fue menor,
detectndose entre 5 y 8 en cada perfil (Figura 3.26 A calles C1 a C6). Algunas bandas
fueron comunes a todos los perfiles mientras que otras predominaron en los grupos
tratados o control. La similitud entre los perfiles de bandas de distintos individuos se
presenta en forma de dendrograma (Figura 3.26 B).
A
193
194
Figura 3.26: (A) Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN extrado
del leon de pollos tratados durante 10 das con una dosis diaria de 1 ml de suero
fermentado con grnulos de kefir (T1 a T6) y de individuos que no consumieron este
producto (C1 a C6) amplificado empleando los primers universales para Eubacterias GC338f y 518r. SF: suero fermentado con grnulos de kefir. (B) Dendrograma de los perfiles
DGGE de los individuos control (C) y tratados (T).
Los perfiles de bandas DGGE de individuos tratados agrupararon en un clster diferente

que las de los individuos control, a excepcin del individuo C1 que agrup con los
tratados. Esto indica que el tratamiento produjo variaciones en la composicin de
especies bacterianas de la comunidad microbiana del leon.
Se incluy en el gel una calle con el perfil de bacterias presentes en el suero fermentado
con grnulos de kefir a fin de analizar si poda detectarse la colonizacin intestinal de
alguna bacteria presente en este producto en los individuos tratados que no formara
parte de la microbiota habitual y que por consiguiente no estuviera en aquellos del
grupo control. Slo se hall coincidencia en la posicin de 4 bandas del suero
fermentado con bandas del perfil de todos los individuos, tanto pertenecientes al grupo
control como al grupo tratado, las mismas estn sealadas con nmeros del 1 al 4 en la
Figura 3.26 A. Debido a los estudios realizados previamente se sabe que las bandas 1 a 3
del perfil DGGE de suero fermentado corresponden a Lactobacillus kefiranofaciens,
mientras que la banda 4 corresponde a Lactobacillus kefir. Estas especies no forman
parte de la microbiota habitual del leon de pollos y por lo tanto su alineamiento con
bandas de individuos no tratados, y posiblemente tambin con las de aquellos tratados,
podra deberse a una superposicin de bandas entre especies diferentes, tal como fue
discutido en el Captulo 1. Debera completarse el anlisis determinando la identidad de

dichas bandas por secuenciacin.
Se analiz tambin la diversidad de microorganismos pertenecientes al gnero
Lactobacillus sp. en el leon de pollos tratados y control empleando los primers
especficos Lac 1 y GC-Lac2. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 3.27.
Los perfiles DGGE de Lactobacillus sp. del leon de individuos tratados con suero
fermentado presentaron mayor cantidad de bandas que los perfiles del grupo control
(Figura 3.27 A). Los perfiles de los individuos que recibieron el tratamiento presentaron
adems una similitud de 60 a 100 %, mientras que los pollos del grupo control tuvieron
perfiles DGGE dismiles entre s (Figura 3.27 B).
Por otro lado se observ coincidencia de 2 bandas del perfil de suero fermentado con
bandas de los perfiles de todos los individuos tratados, indicadas con los nmeros 1 y 2
en la Figura 3.27 A. La banda 1 del perfil DGGE de suero fermentado corresponde a
Lactobacillus kefiranofaciens, mientras que la banda 2 corresponde a Lactobacillus kefir
determinado por secuenciacin de cada banda. Estas bandas no se observaron en
ninguno de los perfiles de individuos del grupo control a excepcin del individuo C1. Este
resultado se corresponde con la similitud, previamente sealada, de la comunidad
microbiana del leon de este individuo con la de aquellos tratados (Figura 3.26 B).
A
195
196
Figura 3.27: (A) Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de ADN extrado
del leon de pollos tratados durante 10 das con una dosis diaria de 1 ml de suero
fermentado con grnulos de kefir (T1 a T6) y de individuos que no consumieron este
producto (C1 a C6) amplificado empleando los primers especficos para Lactobacillus sp.
Lac1 y GC-Lac2. SF: suero fermentado con grnulos de kefir. (B) Dendrograma de los
perfiles DGGE de los individuos control (C) y tratados (T).
Los resultados hallados empleando primers especficos para Lactobacillus sp. estn en
concordancia con los obtenidos por la utilizacin de primers universales para bacterias,
indicando la posibilidad de que L. kefir y L. kefiranofaciens presentes en el suero
fermentado colonicen el tracto gastrointestinal de los pollos que lo consumen. Sin
embargo debido a que es posible que bandas coincidentes no correspondan a la misma
especie, sera necesaria la secuenciacin de las bandas para confirmar esta observacin.
Los resultados obtenidos demuestran que el tratamiento con suero fermentado durante
10 das consecutivos modifica la comunidad bacteriana, y particularmente la de
lactobacilos, del leon de pollos.
La comunidad microbiana del leon est compuesta por aproximadamente 109 bacterias
predominando microorganismos anaerobios facultativos pertenecientes a los gneros
Lactobacillus, Streptococcus y Enterococcus (Lu, 2003; Yin y col., 2010). La diversidad de
bacterias de esta porcin del tracto intestinal ha sido extensamente estudiada debido a
que es afectada en gran medida por la ingesta (Gong y col., 2008). Los cambios en la
composicin microbiana del leon a su vez influyen en la funcin intestinal, incluyendo la
digestin y absorcin de nutrientes, que afectan la tasa de crecimiento (Apajalahti y col.,
2004).
Las modificaciones en la microbiota del leon halladas en el presente trabajo por la

administracin de suero fermentado no pudieron asociarse a una mejora en los
parmetros productivos de las aves. De manera similar a lo observado en el presente
estudio Yaman y col. (2006) demostraron que la administracin de kefir en dilucin 0.2 y
0.5 % en agua de bebida afecta el balance de la microbiota intestinal de gansos (Anser
anser). Estos autores hallaron una disminucin en la concentracin de bacterias
aerbicas totales y coliformes y un aumento de la concentracin de lactobacilos en
heces durante la administracin del probitico. Sin bien estos cambios se asociaron a
una mejora en el rendimiento productivo de las aves, las diferencias tampoco fueron
significativas (P>0.05).
La microbiota del leon y los ciegos tiene adems un rol importante en la proteccin
contra infecciones bacterianas, siendo estos sitios los preferidos para la colonizacin de
patgenos intestinales (Dunkley y col., 2009). Se estudi seguidamente el efecto de la
administracin de suero fermentado a pollos en la asociacin e invasin de Salmonella
Enteritidis.
3. Antagonismo del suero fermentado sobre la asociacin e invasin intestinal de

Salmonella Enteritidis
Una vez probada la inocuidad de los productos se procedi a evaluar el efecto de su
administracin sobre la infeccin causada por S. Enteritidis 261D. Se analizaron 2 formas
de administracin: aplicando una dosis diaria de 1 ml de producto fermentado en el pico
de cada individuo (dosis definida) o adicionando los productos en el agua de bebida (ad
libitum) (ver detalle en materiales y mtodos, seccin 6.4). En todos los ensayos los
productos fueron administrados durante 6 o 7 das antes de la infeccin y se
continuaron aplicando hasta el final del ensayo. Se evalu la concentracin del patgeno
en heces a distintos tiempos luego de la infeccin y su translocacin a bazo e hgado.
Paralelamente se analiz el consumo de alimento, el consumo de agua y el peso de los
pollos como parmetros indirectos de la salubridad de los mismos.
197
3.1 Efecto de la administracin de una dosis controlada de suero fermentado

Se realizaron 2 ensayos en los que se analizaron distintas dosis de probitico y de
Salmonella Enteritidis. En el primer ensayo se administr suero fermentado con grnulos
de kefir y se emple un una dosis infectiva de Salmonella de 7 x 106 UFC/pollo. En el
segundo ensayo se aument la dosis del probitico administrndose suero fermentado
con cultivo madre en suero que contiene 10 veces mayor concentracin de BAL
(Captulo 1, Tabla 1.8 vs. Tabla 1.14) y se disminuy la dosis de patgeno a 2 x 10 5
UFC/pollo.
La concentracin de Salmonella en heces fue mayor para los pollos infectados con una
dosis ms alta del patgeno (Figura 3.28 A vs. B). Cuando la dosis infectiva fue de 7 x 106
UFC/pollo la concentracin promedio del patgeno en heces de individuos del grupo
control se encontr entre 0.3 y 1 x 108 UFC/g en todos los tiempos evaluados. Al aplicar
una dosis de Salmonella de 2 x 105 UFC/pollo estos valores estuvieron entre 0.5 y 2 x 107
UFC/g. Los resultados indican que el patgeno coloniz el intestino y persisti en el
mismo durante 13 das despus de la infeccin.
B
10
10
10
10
10
Das despus de la infeccin
13
Salmonella sp. en heces (UFC/g)
A
198
10
10
10
10
13
Figura 3.28: Concentracin de Salmonella enterica serovar. Enteritidis 261D en heces.

Los barras representan el promedio y desvo estndar correspondiente a 6 individuos
para cada tratamiento: () control y () suero fermentado con grnulos de kefir (A) o
con cultivo madre en suero (B) administrados en una dosis definida de 1 ml diario. Las
dosis infectivas de Salmonella fueron 7 x 106 UFC/pollo (A) y 2 x 105 UFC/pollo (B).
Los individuos tratados con ambos productos fermentados presentaron valores

promedio de Salmonella en heces menores que los individuos control. Esta diferencia
fue mayor cuando se aument la concentracin de microorganismos probiticos
administrados y se disminuy la dosis infectiva de Salmonella (Figura 3.28 A vs. B). Si
bien los recuentos del patgeno en heces fueron sistemticamente menores en los
individuos que consumieron probitico, la diferencia no result significativa habiendo
una alta variabilidad entre individuos para el parmetro evaluado.
La dosis ms frecuentemente utilizada de probiticos en aves se halla en el rango de 108
a 109 UFC/pollo por da (Patterson y Burkholder, 2003). Sin embargo la misma vara
dependiendo del producto y resultados de distintos autores indican que un nivel mayor
de administracin no siempre conduce a un efecto ms acentuado. Los resultados
obtenidos en el presente estudio con suero fermentado indican que la proteccin
aumenta al elevar la dosis diaria de 107 UFC/pollo a 108 UFC/pollo.
Se analiz posteriormente el efecto de la administracin del suero fermentado en el
pasaje del patgeno a rganos internos. Se ha descripto que la capacidad de Salmonella
Enteritidis de colonizar el intestino y de invadir difiere entre cepas con distinta virulencia
(Gast y Benson, 1996). S. Enteritidis 261D present una alta capacidad de translocar a
bazo e hgado a las dos dosis infectivas ensayadas (Tabla 3.8). No se observ proteccin
de la translocacin de Salmonella Enteritidis a bazo, mientras que la prevalencia del
patgeno en hgado disminuy en individuos tratados con suero fermentado con
grnulos de kefir y con cultivo madre en suero (Tabla 3.8).
Tabla 3.8: Efecto de la administracin de suero fermentado en la prevalencia de
Salmonella enterica serovar. Enteritidis 261D en bazo e hgado.
Dosis infectiva
(UFC/pollo)
Tratamientos
Control
Suero fermentado con grnulos de kefir
Control
Suero fermentado con cultivo madre en
suero2
Bazo
Hgado
7 x106
5/6 (83 %)
5/6 (83 %)
5/6 (83 %)
1/6 (17 %)
7 x10
2 x10
3/6 (50 %)
6/6 (100 %)
2 x105
3/6 (50 %)
3/6 (50 %)
La prevalencia se midi como el N de individuos positivos / N total (%).

1
Administrado en 1 dosis diaria de 1ml en el pico a pollos de 13 das de edad durante 18 das.
2
Administrado en 1 dosis diaria de 1ml en el pico a pollos de 10 das de edad durante 20 das.
3
La infeccin se realiz el da 6 de tratamiento. La translocacin del patgeno fue medida el da
12 luego de la infeccin.
4
La infeccin se realiz el da 7 de tratamiento. La translocacin del patgeno fue medida el da
13 luego de la infeccin.
Se calcularon distintos parmetros de productividad a fin de evaluar el estado general de

las aves infectadas que consumieron suero fermentado respecto de aquellas que no
199
200
recibieron el tratamiento y fueron o no infectados con el patgeno. Se observ que la

infeccin con Salmonella no afect el rendimiento productivo de las aves. No se hallaron
diferencias significativas en la ganancia de peso diaria y la conversin alimentaria entre
los tratamientos a ninguna de las dos dosis infectivas de Salmonella Enteritidis evaluadas
(Tabla 3.9).
Tabla 3.9: Parmetros productivos de pollos tratados con suero fermentado e infectados con
Salmonella enterica serovar. Enteritidis 261D en relacin a pollos que no recibieron el
tratamiento y fueron o no infectados con el patgeno.
Tratamiento
SFG (ensayo 2)1
Control de
infeccin
Control sin
infectar
SFC (ensayo 3) 2
Control de
infeccin
Control sin
infectar
Dosis infectiva Peso inicial

(UFC/pollo)
(g)
Peso final
(g)
Ganancia de
Conversin
peso diaria (g)3 alimentaria4
7 x106
560 45 a
1327 59 a
59.0 3.3 a
2.83 0.48 a
7 x106
539 80 a
1298 152 a
58.4 6.7 a
3.36 0.84 a
641 60 a
1413 193 a
59.3 10.7 a
2.91 0.74 a
2 x105
483 69 a
1108 173 a
48.1 8.4 a
2.58 0.25 a
2 x105
469 67 a
1073 152 a
46.5 8.0 a
2.78 0.59 a
481 58 a
1084 161 a
46.3 8.7 a
2.87 0.32 a
Se presenta el valor promedio desvo estndar de los 6 individuos de cada tratamiento. Los parmetros
se calcularon luego de la infeccin. Letras iguales dentro de la misma columna correspondientes al mismo
ensayo significan que no hay diferencias significativas entre tratamientos (=0.05).
1
SFG: suero fermentado 24 h a 20 C con grnulos de kefir, administrado en 1 dosis diaria de 1ml en el
pico a pollos de 13 das de edad durante 18 das. La infeccin con Salmonella Enteritidis 261D se realiz el
da 6 de tratamiento.
2
SFC: suero fermentado 24 h a 20 C con cultivo madre en suero administrado en 1 dosis diaria de 1ml en
el pico a pollos de 10 das de edad durante 20 das. La infeccin con Salmonella Enteritidis 261D se realiz
el da 7 de tratamiento.
3
Ganancia de peso diaria = (peso final-peso inicial)/das
4
Conversin alimentaria= alimento consumido/(peso final-peso inicial)
Los valores de concentracin de patgeno en las heces y los altos porcentajes de

translocacin indican que Salmonella Enteritidis 261D coloniz el tracto gastrointestinal
con invasin a bazo e hgado.
Sin embargo no se observan modificaciones en
parmetros productivos de los individuos enfermos. Esto puede deberse a que la

mayora de los pollos mayores a 14 das de edad colonizados por S. Enteritidis se
transforman en portadores y permanecen asintomticos (Velge y col., 2005; Golden y
col., 2008). Al igual que lo hallado en el presente estudio, Vil y col. (2009) no
detectaron diferencias en parmetros productivos, analizados durante 42 das, entre
pollos infectados con Salmonella Enteritidis (106 UFC/pollo) respecto a pollos sin
infectar.
El consumo total de alimento y agua durante el ensayo tampoco se modific por el
tratamiento con suero fermentado, ni por la infeccin con Salmonella (Tabla 3.10).
Tabla 3.10: Consumo total de agua y alimento por individuo
Dosis infectiva
(UFC/pollo)
Consumo total de
agua (L)
Consumo total de
alimento (kg)
SFG (ensayo 2)1
7 x106
2.76 0.30a
2.16 0.33 a
Control de infeccin
7 x106
2.69 0.36 a
2.20 0.55 a
Control sin infectar
2.60 0.20 a
2.52 0.41 a
SFC (ensayo 3) 2
2 x105
2.53 0.45 a
1.79 0.27 a
Control de infeccin
2 x105
2.30 0.45 a
1.64 0.23 a
Control sin infectar
2.61 0.64 a
1.72 0.33 a
Tratamiento
Se presenta el valor promedio desvo estndar de los 6 individuos de cada tratamiento. Los
parmetros se calcularon luego de la infeccin.
1
SFG: suero fermentado con grnulos de kefir, administrado en 1 dosis diaria de 1ml en el pico a
pollos de 13 das de edad durante 18 das. La infeccin con Salmonella Enteritidis 261D se realiz
2
SFC: suero fermentado con cultivo de suero administrado en 1 dosis diaria de 1ml en el pico a
pollos de 10 das de edad durante 20 das. La infeccin con Salmonella Enteritidis 261D se realiz
Letras iguales dentro de la misma columna correspondientes al mismo ensayo significan que no
hay diferencias significativas entre tratamientos (=0.05).
3.2 Efecto de la administracin de suero fermentado ad libitum

Se evalu la administracin ad libitum del suero fermentado durante 19 das. Se
realizaron 2 tratamientos adicionando suero fermentado con cultivo madre en suero o
slo los microorganismos presentes en este producto resuspendidos en buffer fosfato.
Ambos productos se aplicaron en dilucin 1:100 en el agua de bebida. Como control se
emplearon individuos que bebieron slo agua. Todos los grupos fueron desafiados con
una dosis de 2 x 105 UFC/pollo de Salmonella Enteritidis 261D el da 7 del ensayo.
La supervivencia de los microorganismos en agua fue evaluada previamente al inicio del
ensayo, determinndose que no hubo variacin de la concentracin de bacterias ni
levaduras viables luego de 24 horas de incubacin a 25 C. La concentracin de BAL en el
agua en el agua de bebida fue 1 x 106 UFC/ml y la de levaduras 1 x 105 UFC/ml.
201
La dosis de microorganismos administrada aument progresivamente con el crecimiento

del animal debido a la variacin en el consumo de agua, entre 150 y 300 ml a lo largo del
ensayo. Se calcul que la cantidad diaria de de bacterias cido lcticas administrada fue
1.5 a 3 x 109 UFC/pollo y la de levaduras 1.5 a 3 x 108 UFC/pollo.
Respecto a la concentracin de Salmonella en heces no se hallaron diferencias
significativas entre el grupo control y el tratado con microorganismos del suero
fermentado con cultivo madre. Sin embargo el tratamiento con suero fermentado con
cultivo de madre en suero (microorganismos + productos metablicos de la
fermentacin) en agua de bebida disminuy significativamente el recuento de
Salmonella en heces respecto al control todos los das evaluados (Figura 3.29).
8
10
202
10
10
10
10
10
10
13
Figura 3.29: Concentracin de Salmonella enterica serovar. Enteritidis 261D en heces de

individuos control () y tratados por administracin de suero fermentado con cultivo
madre en suero () o de los microorganismos presentes en este producto en el agua de
bebida (). Los smbolos representan el promedio correspondiente a 6 individuos por
cada tratamiento por da.
La concentracin de Salmonella en heces en los individuos del grupo control fue, en las
30 determinaciones realizadas (5 das para 6 individuos) superior a 1 x 105 UFC/g,
mientras que en el grupo tratado con suero fermentado con cultivo madre de las 30
determinaciones realizadas, 26 se encontraron por debajo de 1 x 105 UFC/g y 13 por
debajo del lmite de deteccin (1 x 103 UFC/g) (Figura 3.30).
10
10
10
10
10
10
10
Lmite de
deteccin*
5
7
10
13
*Se asign un valor arbitrario a aquellos puntos por debajo del lmite de deteccin con la
3
finalidad de mostrar grficamente la cantidad de mediciones que presentan valores <1 x 10
UFC/g.
Figura 3.30: Concentracin de Salmonella en heces de individuos control () y tratados

por administracin de suero fermentado con cultivo madre en suero ad libitum en agua
de bebida (), ambos infectados con una dosis del patgeno de 2 x 105 UFC/pollo.
Estos resultados indican que la administracin de suero fermentado en agua de bebida

afecta la capacidad de Salmonella Enteritidis de colonizar y persistir en el tracto
gastrointestinal luego de la infeccin. Esto no se observ cuando se administraron slo
los microorganismos de este producto, lo que indica que los metabolitos presentes en el
suero intervendran en el efecto protector.
Tabla 3.11: Efecto de la administracin de suero fermentado ad libitum en agua de
bebida en la prevalencia de Salmonella enterica serovar. Enteritidis en bazo e hgado.
Tratamientos1
Bazo
Hgado
Control
4/6 (67 %)
6/6 (100 %)
Suero fermentado con cultivo madre de suero (SFC)
6/6 (100 %)
4/6 (67 %)
Microorganismos de SFC
5/6 (83 %)
2/6 (33 %)
La prevalencia se midi como el N de individuos positivos / N total (%).

Los tratamientos fueron administrados en agua de bebida en una dilucin 1:100 a pollos de 16
5
das de edad durante 19 das. La infeccin con 2 x10 UFC/pollo se realiz el da 7 del ensayo. La
translocacin del patgeno fue medida el da 13 luego de la infeccin.
1
La translocacin de Salmonella Enteritidis a bazo no se redujo por los tratamientos. Sin

embargo, en los grupos que consumieron tanto de suero fermentado como los
203
204
microorganismos de este producto en agua de bebida se observ una tendencia a una

menor translocacin de S. Enteritidis a hgado (Tabla 3.11) tal como se hall al
administrar los productos en una dosis controlada.
Con respecto a los parmetros productivos, para ninguno de los tratamientos, se
hallaron diferencias significativas (Tabla 3.12).
Tabla 3.12: Parmetros productivos y consumo de alimento de pollos de 16 das de
edad tratados durante 19 das por administracin ad libitum de suero fermentado con
cultivo madre en suero (SFC) o de los microorganismos de este producto (MSF) y
contaminados el da 7 de tratamiento con 2 x 106 UFC/pollo de Salmonella enterica
serovar. Enteritidis 261D.
Tratamiento
Peso inicial
(g)
Peso final
(g)
Ganancia de
peso diaria (g)1
Conversin
alimentaria2
Consumo total
de alimento (kg)
Control
409 48 a
1517 190 a
58.3 8.3 a
2.32 0.20 a
2.56 0.34 a
SFC
489 27 a
1648 134 a
61.0 7.6 a
2.38 0.26 a
2.74 0.31 a
MSF
455 54 a
1564 128 a
58.4 3.9 a
2.24 0.24 a
2.50 0.40 a
Ganancia de peso diaria = (peso final-peso inicial)/das.

Conversin alimentaria= alimento consumido/(peso final-peso inicial)
Letras iguales dentro de la misma columna significan que no hay diferencias significativas entre
tratamientos (=0.05)
2
El consumo de agua diario fue 30 a 50 ml menor para individuos que bebieron agua
adicionada con suero fermentado o con los microorganismos de este producto que para
individuos del grupo control, hallndose diferencias significativas en el consumo a lo
largo de todo el ensayo (Figura 3.31). Esto podra deberse al menor pH del agua
adicionada con suero fermentado (pH 4.8) y microorganismos (pH 5.5) que sin adicionar
(pH 7).
A pesar de esta diferencia en el consumo de agua, los parmetros productivos y el
consumo total de alimento no difirieron significativamente entre los grupos tratados con
suero fermentado o sus microorganismos ad libitum (Tabla 3.12).
Consumo de agua por individuo (ml)
400
300
200
100
0
1a3
4a6
7a9
10 a 12 13 a 15 16 a 18
Das
Figura 3.31: Consumo de agua por individuo. () Grupo control y grupos tratados por
administracin en el agua de bebida de () suero fermentado con cultivo madre en
suero o () de los microorganismos presentes en este producto. Se presenta el
promedio y desvo estndar de 6 individuos por tratamiento por da calculado cada 3
das.
De manera similar a lo hallado en este estudio Timmerman y col. (2006) describieron un

menor consumo de agua en individuos que injeran un probitico constituido por
lactobacilos aislados del intestino de aves por esta va, atribuyndolo al sabor de los
cidos orgnicos. Estos autores tambin describieron inconvenientes en la obstruccin
de los bebederos por metabolitos del producto que sedimentaban. Como solucin
administraron solo los microorganismos del probitico resuspendidos en buffer. En este
estudio, sin embargo, se demuestra que los metabolitos del suero fermentado
intervienen en el efecto protector del producto contra Salmonella Enteritidis.
Es posible que la presencia de cidos orgnicos en el suero fermentado intervenga en el
efecto protector. La adicin de cidos orgnicos en agua o alimento es una prctica
utilizada para controlar Salmonella en la industria avcola (Van Immerseel y col., 2003;
2006). Se ha descripto que la adicin de 0.5 % de cido lctico a agua de bebida de
pollos infectados con Salmonella durante las horas de ayuno previas al sacrificio reduce
la incidencia y concentracin del patgeno en el buche (Byrd y col., 2001). Tambin se
ha informado que el consumo de lactosa, disminuye la translocacin de Salmonella
Enteritidis a rganos internos de pollos causando cambios morfolgicos en la mucosa,
un descenso del pH luminal y un aumento de la concentracin de cido actico,
propinico, butrico y lctico (Tellez y col., 1993).
205
206
Los resultados hallados en este trabajo indican la importancia de la forma de

administracin del suero fermentado en la efectividad para reducir la infeccin por
Salmonella Enteritidis. Se encontr mejor efectividad por aplicacin del producto ad
libitum en el agua de bebida que en una dosis definida en el pico del ave. Asimismo se
demostr que el suero fermentado y no slo los microorganismos presentes en el
mismo son responsables del efecto antagnico observado sobre Salmonella.
CONCLUSIONES
El modelo experimental de monocapa de clulas intestinales Caco-2/TC7 permiti

estudiar la capacidad de adhesin de los microorganismos presentes en suero
fermentado con grnulos o cepas aisladas de kefir. Asimismo permiti caracterizar
la asociacin e invasin de tres cepas de Salmonella enterica serovar. Enteritidis.
La adhesin de las bacterias lcticas y levaduras presentes en el suero fermentado

a la monocapa no disminuye la asociacin de Salmonella Enteritidis.
La preincubacin de Salmonella Enteritidis con los microorganismos presentes en

el suero fermentado con grnulos de kefir protege a las clulas Caco-2/TC7 de la
asociacin e invasin del patgeno cuando la relacin es 100 bacterias cido
lcticas y 10 levaduras por cada Salmonella.
Cuando Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y

Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154, crecidos en cultivo mixto en suero, son
preincubados con Salmonella Enteritidis reducen su capacidad de asociarse e
invadir clulas Caco-2/TC7. Sin embargo la proteccin es menor que cuando el
patgeno se preincuba con la totalidad de la comunidad microbiana presente en
el suero fermentado con grnulos de kefir.
La preincubacin de Salmonella Enteritidis con sobrenadantes de suero

fermentado con grnulos de kefir y con el cultivo mixto de L. plantarum CIDCA
8327, L. kefir CIDCA 8348 y K. marxianus CIDCA 8154 disminuye significativamente
su capacidad de invadir clulas epiteliales intestinales.
El consumo de suero fermentado con grnulos de kefir y con cultivo madre en

suero no afecta la ingesta de alimento, el consumo de agua, la humedad de las
207
208
heces, ni la conversin alimentaria en pollos parrilleros, aunque modifica la

comunidad bacteriana, particularmente los lactobacilos, del leon.
La administracin de Salmonella enterica serovar. Enteritidis 261D en una dosis

nica de 105 o de 106 UFC/pollo a pollos Ross pm3 de 19 a 23 das de edad, no
afecta el consumo de agua, el consumo de alimento, ni los parmetros productivos
de los mismos, an cuando el patgeno coloniza el intestino y transloca a hgado y
bazo.
La administracin de suero fermentado con grnulos de kefir y con cultivo madre

en una dosis diaria controlada no disminuye significativamente la concentracin de
Salmonella en heces aunque reduce la translocacin del patgeno a hgado.
La administracin de suero fermentado con cultivo madre ad libitum en agua de

bebida resulta ms efectiva que su administracin en una dosis controlada,
reduciendo significativamente la concentracin del patgeno en heces y su
translocacin a hgado.
Los metabolitos presentes en el producto y no slo los microorganismos

contenidos en el mismo son responsables del efecto antagnico del suero
fermentado sobre Salmonella Enteritidis.
Captulo 4: Bioconservacin de pienso

para aves por adicin de suero fermentado
Captulo 4. Bioconservacin de pienso
INTRODUCCIN
El alimento es el principal componente del total de costos de la produccin de carne y
huevos en la industria aviaria. Asimismo es el principal agente a travs del cual las aves son
expuestas a una amplia variedad de factores a travs del tracto gastrointestinal.
Se han descripto que alimentos para pollos elaborados en nuestro pas presentan una alta
incidencia de hongos toxignicos. Los gneros que presentan mayor frecuencia son
Aspergillus (53-85 %), Penicillium (98 %) y Fusarium (70-87 %) (Dalcero y col., 1997; 1998).
Dalcero y col. (1997) describieron que las especies prevalentes son F. moniliforme (73 %), F.
subglutinans (35 %), F. graminearum (20 %), A. parasiticus (33 %) y A. flavus (8 %), y es
sabido que cepas de algunas de estas especies son capaces de producir algunas de las
micotoxinas ms nocivas conocidas. Astoreca y col. (2011) describieron la presencia de A.
flavus en el 48 % de las muestras de alimentos balanceados estudiados, siendo el 62 % de
los aislados capaces de producir aflatoxinas y el 80 % cido ciclopiaznico. Tambin se ha
informado una frecuencia alarmantemente alta de A. niger var. niger capaz de producir
ocratoxinas en alimentos para pollos en Argentina (Magnoli y col., 2005).
La presencia de estos hongos representa un riesgo potencial para la salud humana y animal,
ya que variaciones en las condiciones medioambientales durante la produccin,
almacenamiento o distribucin del alimento pueden desencadenar el desarrollo fngico y/o
la produccin de toxinas.
Las micotoxinas causan importantes prdidas econmicas en la industria avcola reduciendo
la tasa de crecimiento, los porcentajes de nacimiento, la eficiencia alimentaria y la
inmunidad contra enfermedades (Rawal y col., 2010). Se han reportado prdidas de $932
millones debidas a la contaminacin por micotoxinas y prdidas adicionales de $466
millones en esfuerzos por reducir la contaminacin (CAST, 2003). El problema de las toxinas
fngicas no slo incide en la economa de la produccin avcola, si no que residuos de las
toxinas consumidas por animales pueden aparecer en los productos derivados de los
mismos destinados al consumo humano (Dersjant-Li y col., 2003).
Los hongos y toxinas en alimentos de pollos pueden ser reducidos en distintos puntos de
control desde la materia prima al alimento elaborado. Actualmente el control fngico en
209
210
alimentos se lleva a cabo por la adicin de fungiostticos como cido propinico,

propionato de amonio, cido srbico y su sal potsica y cido frmico y sus sales clcica y
sdica (Gimeo y Martins, 2011).
Es de inters la bsqueda de mtodos de control alternativos. Las bacterias cido lcticas
son capaces de producir una amplia variedad de sustancias antifngicas que juegan un
importante rol en su capacidad de actuar como conservantes, tales como cido lctico,
cido actico, cido fenillctico, cido cprico, diacetilo, dixido de carbono, perxido de
hidrgeno, cido grasos 3-hidroxilados, reuterina y compuestos de naturaleza proteica
(Schnurer y Magnusson, 2005).
Se ha propuesto la aplicacin de BAL y metabolitos producidos por las mismas para la bioconservacin de vegetales frescos, panificados, crneos y lcteos (Garrote y col., 2010). Sin
embargo existen pocos estudios sobre su aplicacin para prevenir la contaminacin fngica
de alimentos para animales.
En este captulo se analiza la posibilidad de aplicar suero fermentado utilizando distintos
starters como aditivo para prevenir el crecimiento fngico en alimentos balanceados para
pollos.
OBJETIVOS
Analizar la potencialidad del suero fermentado como aditivo para prevenir el riesgo de
contaminacin fngica de alimento balanceado para pollos, as como para constituir un
vehculo de inclusin de microorganismos de kefir viables con potencialidad probitica a la
dieta de estos animales.
Estudiar el efecto de suero fermentado con grnulos de kefir, las cepas aisladas de kefir
Lactobacillus kefir CIDCA 8348, Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154 y un cultivo mixto conteniendo las 3 cepas antes mencionadas,
sobre la inhibicin de la germinacin conidial de hongos contaminantes de piensos para
aves y evaluar la implicancia de los cidos orgnicos en el efecto inhibitorio.
Evaluar la supervivencia de bacterias cido lcticas y levaduras en el alimento

balanceado para pollos adicionado con suero fermentado con grnulos de kefir y
analizar el efecto de la adicin en la prevencin de la contaminacin fngica.
211
212
MATERIALES Y MTODOS
1. Hongos
Se emplearon Aspergillus flavus AFUNL5 cedido por la Ctedra de Microbiologa de la
Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de Buenos Aires, y Aspergillus parasiticus
NRRL 2999 donado por la Universidad Nacional de Quilmes, Fusarium graminearum
concedido por Centro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones Industriales
(Conicet-UNLP) y Penicillium sp. donado por la Ctedra de Microbiologa de la Facultad de
Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata. Asimismo se emplearon Aspergillus
terreus, Aspergillus fumigatus, Trichoderma longibrachiatum y Rhizopus sp. aislados a partir
de alimento para pollos Nutrisur especificado para pollos de 0 a 28 das. Estos hongos se
seleccionaron por ser los que crecieron con mayor frecuencia en siembras realizadas a
partir del alimento en medio Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (Biokar Diagnostics,
Beauvais, France). Los mismos se determinaron segn Pitt y Hocking (2009). Los resultados
obtenidos fueron confirmados mediante secuenciacin de los espaciadores intergnicos
ITS1 e ITS2 y comparacin con la base de datos Genbank. Los hongos se conservaron en
agar-agua (ver Apndice) a 4 C hasta su utilizacin.
2. Preparacin de la solucin de esporas

Los hongos se cultivaron durante 7 das en tubos de agar papa dextrosa (Britania S.A.,
Argentina) inclinado a 30 C. En el caso de Fusarium graminearum la incubacin se realiz
durante 8 a 12 das en ciclos alternados de 12 h de luz blanca y 12 h de luz UV para
favorecer la esporulacin.
Al cumplirse el tiempo de incubacin se adicionaron 10 ml de solucin de esporos (ver
Apndice) a cada tubo y las esporas se despegaron mediante raspado de la superficie del
medio con un ansa en anillo. El nmero de esporas se determin por recuento empleando
una cmara de Neubauer. Se realizaron las diluciones necesarias para obtener la
concentracin de esporas deseada para cada experimento.
3. Inhibicin de la germinacin conidial por sobrenadantes de suero fermentado

El porcentaje de reduccin de la germinacin conidial (%RG) se determin mediante el
mtodo descripto por Lavermicocca y col. (2003). Se sembraron 190 l de los
sobrenadantes a evaluar en microplacas estriles de 96 fosas (Corning, NY, USA). A cada
fosa se aadieron 10 l de una suspensin conteniendo 10 4 conidios/ml. Las placas se
incubaron durante 48 h a 30 C y luego se midi a densidad ptica a 580 nm (DO 580) en un
lector de microplacas (ELISA Plate Reader SLT Rainbow Reader, Wien, Austria). El
porcentaje de reduccin de la germinacin se calcul de acuerdo con la siguiente frmula:
%RG = [(DO580 control positivo - DO580 tratamiento) / DO580 control positivo] x 100
Los controles positivos se realizaron sembrando la suspensin de conidios en
sobrenadante de suero sin fermentar. Asimismo se incluyeron en el anlisis controles de
esterilidad de los sobrenadantes.
4. Adicin de suero fermentado al alimento
4.1 Preparacin del alimento adicionado

Se ferment suero con grnulos de kefir al 10 % p/v de acuerdo a la metodologa descripta
en el captulo 1 (Materiales y mtodos, seccin 2). El mismo se adicion a alimento para
pollos de 0 a 28 das marca Nutrisur (Argentina) en proporcin 50 ml de producto
fermentado cada 50 g de alimento. Luego el alimento fue secado en una estufa de
conveccin a 50 C hasta que su humedad fue tal que la actividad acuosa (Aw) medida a
20 C fue 0.5 0.05 (AquaLab Serie 3 TE, USA).
Empleando la misma metodologa se adicion al alimento suero acidificado con cido
clorhdrico a pH 3.7 y suero acidificado con cidos orgnicos en la concentracin presente
en el suero fermentado (0.86 % de cido lctico y 0.08 % de cido actico). Como control se
utiliz alimento humedecido con agua y secado en estufa bajo las mismas condiciones.
Se calcul la composicin qumica del alimento adicionado. Se consider para ello, la
composicin del alimento balanceado declarada por el proveedor y la determinada en el
213
214
presente estudio para suero fermentado con grnulos de kefir (ver Captulo 1, Resultados y
discusin, seccin 2.2, Tabla 1.11, suero bovino en polvo).
4.2 Supervivencia del probitico en el alimento

Para evaluar la supervivencia de los probiticos (BAL y levaduras) en el alimento se
realizaron recuentos de microorganismos viables en placa los das 0, 15 y 30 de
almacenamiento a 20 C. Se tomaron muestras de 10 g de pienso adicionado con suero
fermentado, se colocaron en 90 ml de peptona 0.1 % con glicerol 20 % y se homogeneizaron
en un Stomacher (Seward Medical, modelo 400, U.K.). Luego se realizaron diluciones en
peptona 0.1 %, se sembraron en medios YGC para levaduras y MRS para bacterias cido
lcticas y las colonias se contaron luego de 48 h de incubacin a 30 C.
4.3 Resistencia del alimento a la contaminacin fngica

Para analizar la resistencia de los alimentos a la contaminacin por hongos se adapt el
mtodo descripto por Gerez y col. (2009) desarrollado para evaluar la vida til de panes
elaborados con bacterias cido lcticas. El alimento control y el adicionado con suero
fermentado, con suero con cido clorhdrico y con suero con cidos orgnicos, fue
fraccionado de a 10 g en cajas de petri estriles. Luego sobre cada caja se pulveriz 1ml de
una suspensin de esporos conteniendo 104 conidios/ml. Las placas se incubaron a 20 C y
se revisaron diariamente determinndose los das transcurridos hasta hacerse visible el
crecimiento del hongo. Se realizaron 3 ensayos para los 8 hongos descriptos en el apartado
2.4, en cada ensayo cada uno de los 4 tratamientos se evalu por triplicado.
1. Inhibicin de la germinacin conidial por sobrenadantes de suero fermentado
A fin de analizar la posibilidad de aplicar distintos sueros fermentados para el control de la
contaminacin por hongos de alimento para aves, se evalu inicialmente el efecto
antifngico in vitro de los sobrenadantes de estos productos.
Se analiz la capacidad antifngica de suero fermentado con grnulos de kefir; con las cepas
Lactobacillus kefir CIDCA 8348, Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 y Kluyveromyces
marxianus CIDCA 8154; y con el cultivo mixto de estas 3 cepas, todas ellas aisladas de kefir.
Se emplearon Aspergillus flavus AFUNL5, Aspergillus parasiticus NRRL 2999, Fusarium
graminearum, Penicillium sp., Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Trichoderma
longibrachiatum y Rhizopus sp., que han sido descriptos previamente como contaminantes
frecuentes de alimentos para aves (Dalcero y col., 1998; Krnjaja y col., 2010; Saleemi y col.,
2010; Magnoli y col., 2005; Azarakhsh y col., 2011). Algunas de las especies fngicas
empleadas en el presente estudio son capaces de producir micotoxinas. Entre las ms
importantes se pueden citar las aflatoxinas producidas por algunas cepas de A. flavus y A.
parasiticus, el cido ciclopiaznico por cepas de A. flavus, la gliotoxina por A. fumigatus,
ocratoxinas producidas por algunas especies de Penicillium sp. y tricotecenos por F.
graminearum (Gimeo y Martins, 2011). Asimismo hongos del gnero Aspergillus son
causantes de aspergilosis pulmonar aguda o crnica en aves, que presenta distintos grados
de severidad de acuerdo al estado fisiolgico del individuo siendo A. fumigatus el principal
agente causante de esta enfermedad (Beernaert, 2010).
El efecto antifngico del suero fermentado sobre los hongos antes mencionados se midi
mediante la evaluacin de la inhibicin de la germinacin conidial de acuerdo a lo descripto
por Lavermicocca y col. (2003). La germinacin conidial es un paso crucial en el desarrollo
de los hongos emplendose frecuentemente como indicador del poder antifngico de
distintos compuestos (Araujo y Rodrigues, 2004).
Se evalu el efecto inhibidor de la germinacin conidial de suero fermentado con grnulos
de kefir debido a que, entre otros sueros fermentados caracterizados en este trabajo, fue el
que present mayor efecto inhibitorio sobre enteropatgenos (Captulo 2, resultados y
215
discusin, seccin 2.1). De acuerdo a los resultados obtenidos en el Captulo 2 el poder

antibacteriano de este producto se relaciona fundamentalmente con su contenido de
cidos orgnicos. A fin de analizar si estos metabolitos estn tambin implicados en la
capacidad antifngica se incluy en el anlisis suero adicionado con cido lctico y actico a
la misma concentracin y al mismo pH en que se encuentran en el suero fermentado con
grnulos de kefir. Asimismo se evalu la incidencia del bajo pH en la inhibicin incluyndose
un tratamiento con suero acidificado con HCl hasta pH 3.7 correspondiente al del suero
fermentado con grnulos de kefir. La inhibicin se consider alta cuando el porcentaje de
reduccin de la germinacin (%RG) present valores mayores al 70 %, moderada cuando
estuvo entre 40 y 70 %, baja entre 20 y 40 % e inexistente cuando fue menor a 20 % (Gerez
y col., 2009).
El suero fermentado con grnulos de kefir y el suero acidificado con cidos orgnicos
presentaron porcentajes de inhibicin de la germinacin altos y similares sobre las 8
especies fngicas evaluadas (Figura 4.1). El suero acidificado con cido clorhdrico a pH 3.7
present capacidad inhibitoria alta slo sobre Fusarium graminearum y Penicillium sp., no
result inhibitorio para Rhizopus sp. y para el resto de las especies slo redujo la
germinacin conidial en porcentajes moderados y bajos.
Reduccin de la germinacion (%)
216
100
Inhibicin
alta
80
60
40
Inhibicin
moderada
Inhibicin
baja
20
No
inhibitorio
0
.
arum
m sp A. terreus A. flavusfumigatus achiatum arasiticusizopus sp.
mine Penicilliu
A.
Rh
gibr
A. p
F. gra
T. lon
Figura 4.1: Inhibicin de la germinacin conidial fngica por sobrenadantes de suero

fermentado con grnulos de kefir 10 % p/v (), suero acidificado con 0.83 % de cido
lctico y 0.08 % de cido actico () y suero acidificado con cido clorhdrico a pH 3.7 ().
Se estudi adems el efecto antifngico de suero fermentado con las cepas aisladas de
kefir (L. kefir CIDCA 8348, L. plantarum CIDCA 8327 y K. marxianus CIDCA 8154) en forma
individual o conjunta, y cuyos sobrenadantes presentan distinto pH y composicin de cidos
orgnicos. El suero fermentado con L. kefir CIDCA 8348 presenta pH 5.7 y baja
concentracin de cido lctico (0.11 %) y de cido actico (0.04 %). El suero fermentado
con K. marxianus CIDCA 8154 presenta similar pH (~ 5) que el obtenido con L. plantarum
CIDCA 8327, sin embargo a diferencia de este ltimo, posee cido mlico y otros 2 cidos
que no pudieron ser identificados y presenta menor concentracin de cido lctico y mayor
concentracin de cido actico. El suero fermentado con las 3 cepas en cultivo mixto
presenta pH 4.5 y mayor concentracin de cidos lctico y actico que los sueros
fermentados con cepas individuales (Captulo 1, Resultados y discusin, seccin 3.2.2). Los
sueros fermentados con cepas aisladas de kefir presentaron distinta capacidad de inhibir la
germinacin conidial. Puede notarse que, en general, el efecto antifngico fue mayor para
sobrenadantes de suero fermentado con L. plantarum CIDCA 8327 y con las 3 cepas
simultneamente. El suero fermentado con K. marxianus CIDCA 8154 present actividad
Reduccin de la germinacion (%)
inhibitoria intermedia y el obtenido empleando L. kefir CIDCA 8348 baja (Figura 4.2).
100
80
60
40
Inhibicin
alta
Inhibicin
moderada
Inhibicin
baja
20
0
No
inhibitorio
us . flavus asiticus iatum pus sp.

us
sp.
um
h
r
inear nicillium A. terreA. fumigat
A
m
a
r
Rhizo
e
A. pa longibrac
g
P
F.
T.
Figura 4.2: Inhibicin de la germinacin conidial fngica por sobrenadantes de suero

fermentado con Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 (), Kluyveromyces marxianus CIDCA
8154 (), Lactobacillus kefir CIDCA 8348 () y con las tres cepas inoculadas conjuntamente ().
217
218
Se observ que distintas especies fngicas presentaron diferente sensibilidad al mismo

producto fermentado. Por ejemplo, puede notarse en el grfico que el suero fermentado
con Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 inhibi a distintos hongos en porcentajes que
van desde 84 % para F. graminearum a 0 % para Rhizopus sp.
En general Fusarium graminearum y Penicillium sp. fueron los hongos ms sensibles y
Rhizopus sp. el ms resistente a todos los productos. Sin embargo otras especies mostraron
ms sensibilidad a un producto que a otro. Por ejemplo, A. flavus y A. fumigatus fueron
inhibidas de manera similar por sobrenadantes de suero fermentado con K. marxianus y L.
kefir; mientras que A. terreus, A. parasiticus y T. longibrachiatum fueron notoriamente ms
inhibidas por suero fermentado con K. marxianus que con L. kefir. Esto indicara que estas
ltimas 3 especies son particularmente sensibles a algn metabolito presente en el suero
fermentado con K. marxianus al que A. flavus y A. fumigatus son resistentes.
Del anlisis global de estos resultados puede destacarse que el suero fermentado con
grnulos de kefir, con cepas aisladas de kefir combinadas y con L. plantarum CIDCA 8327
presentan una notable capacidad de inhibir la germinacin conidial de hongos filamentosos.
Estos resultados son relevantes dado que hasta el momento el conocimiento de la
inhibicin de hongos filamentosos por kefir y cepas aisladas del mismo es escaso. Cevikbas y
col. (1994) describieron que el kefir presentaba actividad antifngica contra varios gneros
de levaduras y los hongos filamentosos Microsporum sp. y Trichophyton sp. En una
publicacin reciente se describe la capacidad del kefir de inhibir el crecimiento de Fusarium
graminearum y la germinacin y produccin de aflatoxinas de Aspergillus flavus (Ismaiel y
col., 2011). Asimismo se ha descripto que Lactobacillus paracasei K VI aislada de kefir inhibe
el crecimiento de Fusarium graminearum y es capaz de capturar la toxina desoxinivalenol
producida por este hongo (Franco y col., 2011).
El efecto inhibitorio obtenido para suero acidificado artificialmente con cido lctico y
actico, indica que estos cidos estn en gran medida implicados en el efecto antifngico
del suero fermentado con grnulos de kefir. El cido actico es efectivo en la prevencin del
crecimiento de numerosos hongos filamentosos mientras que el cido lctico tiene un
efecto antifngico limitado (Conkov y col., 1993; De Reu y col., 1995; Araujo y Rodrigues,
2004; Pundir y Jain, 2010). Se ha descripto que la concentracin inhibitoria mnima de cido
lctico es aproximadamente 10 veces superior a la de actico para hongos filamentosos
(Gerez y col., 2009; Len Pelez y col., 2012). Sin embargo, se ha demostrado que estos dos
cidos presentan efecto sinrgico, potencindose su actividad antifngica cuando se
encuentran combinados (Cabo y col., 2002; Len Pelez y col., 2012).
La variabilidad en la sensibilidad de distintos hongos al mismo producto fermentado con
cepas aisladas de kefir, no invalida la posibilidad de que el efecto inhibitorio se deba a la
presencia de cidos orgnicos dbiles. Segn la teora clsica acerca del mecanismo de
accin de estos compuestos la sensibilidad debera ser similar para distintas especies dado
que la inhibicin es inespecfica. De acuerdo a esta teora, a bajo pH los cidos dbiles se
hallan no disociados y pueden atravesar la membrana celular fngica por difusin. Una vez
en el interior de las clulas los cidos se disocian y no pueden retornar al exterior,
permaneciendo dentro de las clulas, acidificando el citoplasma y alterando as diversas
funciones celulares (Krebs y col., 1983). Sin embargo esta teora se halla en revisin en el
caso de hongos dado que existen evidencias que prueban que los cidos orgnicos no
afectan a los hongos esporulados de acuerdo al mecanismo de accin clsico (Stratford y
Anslow, 1996; Plumridge y col., 2004). Segn la teora clsica el cido srbico y el actico
que presentan el mismo pKa deberan producir la misma acidificacin citoplasmtica, sin
embargo el srbico es substancialmente ms txico que el actico. Ms an, ciertos hongos
esporulados han mostrado notablemente mayor resistencia a algunos cidos orgnicos que
a otros. La diferencia en la sensibilidad a los cidos orgnicos entre especies fngicas se ha
explicado por distintos mecanismos de accin y de resistencia a los mismos. A modo de
ejemplo, se ha descripto que la inhibicin de Aspergillus niger por cido srbico ocurre por
un dao en la membrana celular (Stratford y col., 2009). Tambin se ha sugerido que este
cido interfiere con el transporte de nutrientes, al menos de uridina, al interior de los
conidios de Aspergillus niger posiblemente interactuando con transportadores de
membrana (Melin y col., 2008). Como ejemplo de mecanismo de resistencia puede
mencionarse que sobre Saccharomyces sp. y Candida albicans los cidos dbiles activan
219
220
factores de transcripcin War1 que inducen el bombeo activo de aniones fuera de las
clulas. Tambin se han descripto enzimas que degradan los cidos orgnicos, cambios en la
superficie celular que minimizan la difusin de los cidos al interior de las clulas y la
expresin de porinas que facilitan la difusin al exterior de cidos no disociados (Piper y
col., 2011).
Se puede decir por lo tanto, que las diferencias observadas entre los productos
fermentados en cuanto a su capacidad de inhibir distintos hongos podran deberse a su
distinta composicin cualitativa y cuantitativa de cidos orgnicos as como a mecanismos
de accin y resistencia particulares de cada especie fngica. Sin embargo no puede
descartarse la presencia de otros metabolitos antifngicos adems de los cidos orgnicos.
Es destacable el alto poder antifngico hallado para el suero fermentado con L. plantarum
CIDCA 8327. Este producto presenta pH 5 y una concentracin de cido lctico de 0.23 % y
de actico de 0.04 %. Su capacidad inhibitoria fue similar, excepto sobre A. flavus y Rhizopus
sp., a la del suero fermentado con las 3 cepas conjuntamente que presenta menor pH (4.5)
y mayor concentracin de cido lctico (0.46 %) y actico (0.19 %). Esto sugiere la
produccin de otros metabolitos antifngicos, adems de cidos orgnicos, por L.
plantarum CIDCA 8327 en suero. Distintas cepas de esta especie son capaces de producir
sustancias antifngicas de bajo peso molecular tales como cido fenillctico e
hidroxifenillctico (Laverimocca y col. 2000; Strm y col., 2002), dipptidos cclicos tales
como ciclo(Gly-L-Leu), ciclo(L-Phe-L-Pro) y ciclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) (Strm y col.,
2002), cido benzoico, metilhidantoina y mevalonolactona (Niku-Paavola y col., 1999).
Debido a su capacidad para sintetizar compuestos fungicidas se ha sugerido la aplicacin de
L. plantarum como cultivo iniciador en masas para aumentar la vida til de productos
panificados (Lavermicocca y col., 2000; Dal Bello y col., 2007; Gerez y col., 2009; Coda y col.,
2011) y para bio-preservar vegetales frescos (Sathe y col., 2007). El crecimiento de L.
plantarum en suero, sumado a la produccin de compuestos antifngicos y antibacterianos
en este sustrato, demostrados a lo largo del presente trabajo, sugieren la potencialidad de
esta especie para su aplicacin en el desarrollo de ingredientes bio-preservantes de bajo
costo elaborados a base de suero.
2. Adicin de suero fermentado al alimento para su conservacin

Considerando que el mayor efecto antifngico in vitro fue demostrado para suero
fermentado con grnulos de kefir, este producto fue seleccionado para evaluar su adicin a
alimento balanceado para aves, con la finalidad de obtener un producto que contenga
microorganismos probiticos viables y sea adems resistente a la contaminacin por
hongos.
El suero fermentado con grnulos de kefir fue mezclado con el alimento balanceado en
proporcin 1 L por cada 1 kg de alimento. Luego fue secado en una estufa a conveccin a
50 C hasta alcanzar una humedad tal que la actividad acuosa (Aw), medida a 20 C, fuera
semejante a la Aw del alimento sin adicionar (0.5 0.05). Mediante la misma metodologa y
a modo de controles, se prepararon alimentos adicionados de suero con igual contenido de
cidos orgnicos que el producto fermentado y suero acidificado con HCl.
La adicin de suero fermentado al alimento no modific su contenido de protenas,
minerales totales, ni fsforo aunque s present mayor contenido de calcio (Tabla 4.1).
Tabla 4.1: Composicin qumica calculada para el alimento balanceado adicionado.

Composicin Centesimal
Tenor mn. de protena bruta
Tenor mx. de minerales totales
Tenor de calcio mn-mx
Tenor de fsforo mn-mx
Alimento
balanceado
Suero
fermentado
Alimento
adicionado
22.80 %
0.87 %
21.50 %
6%
0.71 %
6.10 %
0.9-1.1 %
0.4-0.6 %
1.3-1.7 %
0.45-0.55 %
< 0,01 %
0.45-0.55 %
Por otro lado sin variar el contenido de protenas totales, aportara aminocidos tales como
lisina, metionina, triptfano y otros azufrados que se encuentran en suero (Smithers, 2008)
y son relevantes en la alimentacin de aves (Baker y Han, 1994). Asimismo se estaran
agregando al alimento 3.5 g% de lactosa. Se ha descripto que la adicin de lactosa a la dieta
de pollos causa un descenso del pH y un aumento de la concentracin de cidos orgnicos
en los ciegos protegindolos contra la invasin de Salmonella Enteritidis (Tellez y col., 1993;
221
222
Corrier y col., 1997) y reduciendo los signos de la enfermedad causada por Clostridium
perfrigens (McReynolds y col., 2007).
2.1 Supervivencia de bacterias cido lcticas y levaduras en el alimento balanceado

Se evalu la resistencia de los microorganismos al proceso de incorporacin al alimento y su
supervivencia durante el almacenamiento. La concentracin de las BAL y levaduras en el
pienso se analiz mediante recuentos realizados inmediatamente luego del secado (da 0) y
despus de 15 y 30 das de almacenamiento a 20 C (Tabla 4.2).
Tabla 4.2: Concentracin de bacterias cido lcticas (BAL) y levaduras en el alimento

adicionado con suero fermentado con grnulos de kefir 10 % p/v durante su
almacenamiento a 20 C.
Das de almacenamiento
BAL (UFC/g)
Levaduras (UFC/g)
5.9 2.3 x 106
5.0 1.9 x 105
15
1.1 0.9 x 105
6.8 1.4 x 104
30
1.0 0.9 x 105
6.0 2.5 x 104
Los valores corresponden al promedio el desvo estndar de 4 ensayos independientes.
El suero fermentado con grnulos de kefir posee una concentracin de BAL de 1 x 10 7

UFC/ml y de levaduras de 4 x 106 UFC/ml (Captulo 1, Resultados y discusin, seccin 1.2). Al
adicionar este producto, si no hubiera prdida de viabilidad, el pienso debera contener una
concentracin de BAL de 9.1 x 106 UFC/g y de levaduras de 3.6 x 106 UFC/g. Respecto a
estos valores, la supervivencia al proceso de secado realizado a 50 C por aproximadamente
120 min, fue del 64 % para las BAL y del 13 % para las levaduras adicionadas (Tabla 4.2).
En concordancia con estos resultados se ha descripto mayor resistencia al tratamiento

trmico para BAL que para levaduras aisladas de kefir (Golowczyc y col., 2010). Golowczyc
(2008) describi que luego del tratamiento trmico a 55 C durante 50 min el nmero de
microorganismos viables de Lactobacillus kefir CIDCA 8348 desciende 2 rdenes
logartmicos y el de Lactobacillus plantarum CIDCA 83114 desciende 5 rdenes logartmicos,
mientras que Saccharomyces lipolytica CIDCA 812 expuesta durante 70 min a 50 C

disminuye 6 rdenes logartmicos. En el presente estudio se obtuvo una reduccin de la
concentracin de microorganismos viables inferior a 1 orden logartmico tanto de BAL como
de levaduras durante el tratamiento a 50 C por 120 min, hallndose mayor termotolerancia
en este sistema que la descripta previamente para cepas aisladas de kefir en un entorno
diferente.
La resistencia al tratamiento trmico de los microorganismos se encuentra influenciada por
el medio y las condiciones de cultivo as como por la exposicin previa a otros factores de
stress (Annous y col., 1999; Desmond y col., 2001; Piper, 1993). Se ha descripto que la
escasez de nutrientes, la presencia de cidos orgnicos y la exposicin a pH cido pueden
inducir termotolerancia en levaduras (Cotte y col., 1991; Carmelo y col., 1998) y en
bacterias cido lcticas (Annous y col., 1999; Zotta y col., 2008; Fernndez y col., 2009). Es
posible, por lo tanto, que el crecimiento de los microorganismos de kefir en suero que
presenta deficiencia de nitrgeno, o el alto contenido de cidos orgnicos y el bajo pH del
suero fermentado, representen factores de stress que induzcan resistencia al tratamiento
trmico.
Por otro lado los microorganismos de kefir que fueron tratados trmicamente se
encontraron embebidos en la matriz slida del pienso. Se ha descripto que variables como
el tamao y distribucin de tamao de los granos del alimento, as como la actividad acuosa
y el pH pueden afectar la eficiencia de inactivacin trmica de microorganismos contenidos
en matrices de alimentos balanceados (Mackey y col., 2006; Okelo y col., 2006). Tambin la
presencia de suero podra interferir en la termotolerancia. Se ha descripto que la
inmovilizacin de Lactobacillus rhamnosus en una matriz de protenas aisladas de suero
desnaturalizadas o hidrolizadas lo protegen contra el stress trmico (Doherty y col., 2010).
Los microorganismos de kefir adicionados fueron adems notoriamente resistentes al
almacenamiento a 20 C, se observ una prdida de viabilidad de 1 orden logartmico
durante los primeros 15 das de almacenamiento y luego la concentracin se mantuvo
constante hasta los 30 das de almacenamiento (Tabla 4.2).
223
224
Luego del almacenamiento el producto contuvo 1 x 108 UFC/kg de BAL y 6 x 107 UFC/kg de
levaduras. La dosis efectiva de probiticos incluidos en alimento balanceado de aves
reportadas por otros autores se halla generalmente entre 108 y 109 UFC/kg de alimento
(Apata, 2008; Kim y col, 2011; Mountzouris y col., 2010) aunque vara segn el producto.
En los ensayos in vivo realizados en este trabajo (Captulo 3, parte B), se obtuvo una mayor
proteccin contra la colonizacin intestinal por Salmonella al administrar suero fermentado
en agua de bebida en una concentracin de 108- 109 UFC/pollo por da. En base al consumo
de alimento registrado durante los ensayos in vivo, esta dosis es mayor que la que se
lograra por administracin del alimento adicionado de suero fermentado (1-2 x 107
UFC/pollo por da). Sin embargo la efectividad puede variar segn la forma de
administracin. Los ensayos in vivo realizados en este trabajo indicaron que el suero
fermentado es ms efectivo en el control de la infeccin con Salmonella al ser administrado
ad libitum en agua de bebida que en una dosis diaria controlada. De manera similar que la
administracin en agua de bebida, la inclusin de probiticos en el alimento tendra la
ventaja de que el consumo es constante y se incrementa con la edad del individuo. Por lo
tanto la efectividad del suero fermentado con grnulos de kefir bajo esta forma de
administracin as como la dosis requerida para conseguir el efecto deseado debe ser
evaluada en ensayos futuros.
2.2 Resistencia a la contaminacin fngica

La resistencia a la contaminacin fngica se analiz contaminando artificialmente el pienso
por pulverizacin de suspensiones de conidios fngicos. Luego el alimento contaminado se
almacen a 20 C y se determin la cantidad de das transcurridos hasta hacerse visible el
crecimiento del hongo.
b
b
30
Tiempo (das)
b b
b
a a
20
a a
a
a
a
a
a a
a a
a
10
s
m
u s sp
igatu
hiatu
ibrac
A . fu m
g
n
o
l
T.
p
Rhizo
A. ter
reus
m sp
illiu
Penic
A. pa
cus
rasiti
A. fla
vus
Figura 4.3: Das trascurridos hasta hacerse visible el crecimiento fngico luego de la
contaminacin artificial de pienso para pollos. Referencias: pienso control () y pienso
adicionado con suero y cido clorhdrico hasta pH 3.7 (), suero y 0.83 % de cido lctico +
0.08 % de cido actico () y suero fermentado con grnulos de kefir 10 % p/v (). Letras
iguales entre barras pertenecientes a la misma especie fngica indican que no hay
diferencias significativas evaluadas mediante ANOVA (=0.05).
Para este ensayo se emplearon los hongos: A. flavus AFUNL5, A. parasiticus NRRL 2999;
Penicillium sp., T. longibrachiatum, A. fumigatus, Rhizopus sp. y A. terreus, las ltimas 4
especies aisladas a partir de alimento balanceado para pollos.
Todos los piensos adicionados con suero fermentado con grnulos de kefir presentaron una
notoria resistencia a la contaminacin fngica (Figura 4.3).
Puede notarse que en los alimentos sin tratar hubo crecimiento visible de los hongos luego
de 7 a 11 das de almacenamiento. Cuando el alimento fue adicionado con suero acidificado
con cido clorhdrico a pH 3.7 no se observ un retardo significativo (=0.05) en la aparicin
del crecimiento.
El agregado de suero adicionado con cidos orgnicos prolong significativamente la
aparicin visible de crecimiento fngico slo para T. longibrachiatum, A. terreus y A.
fumigatus. Para estas 3 especies el tiempo promedio de almacenamiento sin crecimiento
fngico visible se duplic respecto al control.
225
226
En la Figura 4.4 se muestra a modo de ejemplo una fotografa de la apariencia del alimento
contaminado con Penicillium sp. luego de 20 das de almacenamiento.
Figura 4.4: Alimento balanceado para pollos sin tratar (control) y adicionado con suero
acidificado y cido clorhdrico (suero + HCl), suero adicionado con cidos orgnicos (Suero +
AO) y suero fermentado con grnulos de kefir, contaminado artificialmente con Penicillium
sp. y almacenado durante 20 das a 20 C.
Puede observarse un importante desarrollo fngico en el alimento control, el comienzo del

desarrollo del hongo en el alimento adicionado de cido clorhdrico o cidos orgnicos y
ausencia de contaminacin en el alimento adicionado con suero fermentado con grnulos
de kefir.
Para las 7 especies evaluadas el tiempo de almacenamiento promedio sin presencia fngica
visible de los alimentos tratados con suero fermentado fue de 23 a 29 das, prolongndose
de este modo, 2 a 4 veces la vida til del alimento respecto al control. A modo de ejemplo
se muestran fotografas del aspecto de los alimentos control y adicionados con suero
fermentado contaminados con A. flavus y A. parasiticus luego de distintos tiempos de
almacenamiento (Figura 4.5).
Figura 4.5: Aspecto del alimento balanceado para pollos control y tratado con suero
fermentado con grnulos de kefir (+SFG), ambos contaminados artificialmente con A. flavus
(A) o A. parasiticus (B) y almacenados a 20 C.
Todos los hongos, a excepcin de T. longibrachiatum, A. terreus y A. fumigatus, resultaron

ms inhibidos por la adicin de suero fermentado que de suero acidificado con cidos
orgnicos. Esto indicara que los cidos lctico y actico no son los nicos responsables de la
inhibicin. En los ensayos de inhibicin de la germinacin realizados con sobrenadantes in
vitro (apartado 4.1) se obtuvo un efecto similar del suero fermentado respecto al
acidificado con cidos orgnicos. En este ensayo adems de la germinacin se evala el
crecimiento ya que, para evidenciar macroscpicamente la presencia del hongo, debe haber
desarrollo del micelio. Los resultados podran indicar que el efecto inhibitorio del
crecimiento fngico del suero fermentado es mayor que el del suero adicionado con cidos
orgnicos. La diferencia tambin podra deberse a la produccin in situ de metabolitos por
los microorganismos de kefir que se hallan viables en el alimento.
227
228
Las BAL y sus metabolitos han sido evaluados como biopreservantes en distintos alimentos,
tales como vegetales frescos, productos crneos, panificados y lcteos (Garrote y col.,
2010). Sin embargo su aplicacin para la conservacin de alimentos balanceados para
animales no ha sido estudiada an en profundidad. Murry y col. (2004) estudiaron la
inhibicin del crecimiento en un medio de cultivo slido formulado con componentes de
alimento balanceado y sugirieron que Lactobacillus salivarius y Lactobacillus plantarum
podran ser tiles para controlar el crecimiento de enteropatgenos en pienso para aves.
Asimismo, Heres y col., (2003) demostraron que la fermentacin de alimento para aves con
Lactobacillus plantarum previene su contaminacin con enteropatgenos.
En el presente trabajo se demuestra que la adicin de suero fermentado con grnulos de
kefir a alimento balanceado para pollos es efectiva en el control de la contaminacin
fngica, aportando adems al alimento bacterias cido lcticas y levaduras con
potencialidad probitica. Estos resultados abren perspectivas futuras acerca de la aplicacin
de este y otros productos similares en la bio-preservacin de alimentos para animales.
CONCLUSIONES
El suero fermentado 24 h a 20 C con 10 % p/v de grnulos de kefir reduce de 75 a

100 % la germinacin conidial de hongos contaminantes de pienso para aves:
Aspergillus flavus AFUNL5, Aspergillus parasiticus NRRL 2999, Fusarium graminearum,
Penicillium
sp.,
Aspergillus
terreus,
Aspergillus
fumigatus,
Trichoderma
longibrachiatum y Rhizopus sp.
El efecto antifngico del suero fermentado con grnulos de kefir se asocia a su

contenido de cido lctico y cido actico no disociados.
La capacidad inhibitoria de los productos obtenidos por fermentacin de suero con

Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 o Lactobacillus kefir CIDCA 8348 vara de
acuerdo a la especie fngica evaluada. Aquellos obtenidos por fermentacin con
Lactobacillus plantarum CIDCA 8327 o con las tres cepas conjuntamente, reducen ms
del 70 % la germinacin conidial de 5 y 6 de los 8 hongos evaluados respectivamente.
El pienso para pollos adicionado con suero fermentado con grnulos de kefir contiene
bacterias cido lcticas (1 x 108 UFC/kg) y levaduras (6 x 107 UFC/kg) potencialmente
probiticas viables an luego de 30 das de almacenamiento y presenta alta resistencia
a la contaminacin por hongos deteriorantes.
229
Conclusiones generales
Las crecientes restricciones en el uso de antibiticos como profilcticos y factores de

crecimiento en la industria avcola debidas a la diseminacin de genes de resistencia, han
propiciado la bsqueda de alternativas para el control de microorganismos patgenos.
Entre los mtodos de control, el uso de probiticos est cobrando cada vez mayor
importancia.
Atendiendo a la inquietud de desarrollar a bajo costo nuevos alimentos funcionales que
contribuyan de manera natural al buen estado de salud de aves de corral y/o eviten
contraer enfermedades, se plante en el presente trabajo el aprovechamiento de un
subproducto de la industria lctea como es el suero de quesera, para la obtencin de un
producto probitico para aves empleando microorganismos de kefir.
Se demostr que los grnulos de kefir mantienen su integridad durante numerosos
subcultivos en suero a 20 C. Se analiz adems la utilizacin de cultivos madre y cepas
aisladas de kefir como starters alternativos interesantes para la produccin industrial.
Los distintos sueros fermentados se caracterizaron qumica y microbiolgicamente y se
analiz su capacidad de inhibir in vitro cepas de Escherichia coli y Salmonella enterica
aisladas de pollos infectados o alimentos derivados, dada la relevancia de estos patgenos
como causantes de enfermedades en aves de corral. Se determin que distintos sueros
fermentados con 10 % de grnulos de kefir presentan efecto bactericida, siendo su
contenido de cido lctico no disociado el principal metabolito responsable de la inhibicin.
Asimismo, los sueros fermentados con Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus
kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 inhiben el crecimiento de
Escherichia coli y Salmonella enterica, siendo este efecto mayor para el producto obtenido
con estas cepas en cultivo mixto.
Utilizando el modelo de epitelio intestinal Caco-2/TC7 se demostr que la interaccin de
Salmonella enterica serovar. Enteritidis con las bacterias cido lcticas y levaduras del suero
fermentado disminuye su asociacin e invasin, y que la preincubacin del patgeno en el
sobrenadante de este producto afecta su capacidad invasiva. El suero fermentado con
grnulos de kefir presenta mayor efecto inhibitorio y capacidad de proteger a enterocitos
de la adhesin e invasin de Salmonella Enteritidis que el producto obtenido fermentando
231
232
suero con cepas aisladas de kefir, indicando la importancia de la diversidad microbiana en el

efecto antagnico.
Finalmente se evalu la administracin de suero fermentado a pollos parrilleros
determinndose que su consumo no afecta la humedad de las heces, la ingesta de alimento
y agua ni los parmetros productivos de las aves, aunque s se detecta una variacin en la
comunidad bacteriana, particularmente de Lactobacillus sp., del leon. Pudo determinarse
que el producto administrado ad libitum en el agua protege a los pollos contra la
colonizacin de Salmonella Enteritidis ya que la concentracin del patgeno en heces
disminuye significativamente.
Por otra parte, se estudi la posibilidad de adicionar este producto a pienso para aves con la
finalidad de utilizarlo como vehculo para introducir microorganismos de kefir con
potencialidad probitica y prevenir su contaminacin con hongos deteriorantes y/o
toxignicos. En este sentido, se determin que el alimento adicionado con suero
fermentado presenta una notable resistencia a la contaminacin fngica y posee bacterias
cido lcticas y levaduras viables, an luego de 30 das de almacenamiento, en
concentraciones recomendadas para alimentos probiticos.
De este modo, en el presente trabajo se obtuvieron distintos productos por fermentacin de

suero con microorganismos de kefir capaces de inhibir microorganismos patgenos,
antagonizar la accin de Salmonella in vitro e in vivo y/o de actuar como bioconservantes.
Apndice
Apndice
1. Medios de cultivo
Todos los medios de cultivo, excepto los casos indicados, se esterilizaron en autoclave a
120 C, durante 15 minutos.
Caldo MRS (Difco, Detroit, USA).
Peptona
Extracto de carne
Extracto de levadura
D(+) glucosa
K2HPO4
Tween 80
Citrato cido de amonio
Acetato de sodio
MgSO4
MnSO4
pH = 6.5 0.2
10
10
5
20
2
1
2
5
0.1
0.05
g/L
g/L
g/L
g/L
g/L
g/L
g/L
g/L
g/L
g/L
Agar MRS
Caldo MRS adicionado con agar en concentracin 1.5 g/L.
Caldo nutritivo (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)
extracto de carne
3
peptona de carne
5
pH = 7 0.2
g/L
g/L
Agua peptonada tamponada (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)

Peptona
10.0 g/L
Cloruro de sodio
5.0
g/L
Difosfato de sodio
3.5
g/L
Fosfato de potasio
1.5
g/L
pH = 7.2 0.2
Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar (Merck, D-64271 Darmstadt, Germany)
5.0 g/L
Glucosa
20.0 g/L
Cloranfenicol
0.1 g/L
Agar
14.9 g/L
pH = 6.5
233
234
Apndice
Yeast peptone dextrose (YPD)

Peptona
Glucosa
10
20
20
g/L
g/L
g/L
Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)

3.0
g/L
L-lisina
5.0
g/L
Lactosa
7.5
g/L
Sacarosa
7.5
g/L
Xilosa
3.5
g/L
Desoxicolato de sodio
2.5
g/L
Cloruro de sodio
5.0
g/L
Tiosulfato de sodio
6.8
g/L
Citrato frrico de amonio
0.8
g/L
Rojo fenol
80.0 mg/L
Agar
13.5 g/L
pH = 7.4 0.2
Triptona Bilis X-Glucuronido (TBX) agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)
Triptona
20
g/L
Sales biliares
1.5
g/L
BCIG
75
mg/L
Agar
9
g/L
pH = 7.2 0.2.
Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)
Triptona
4.59 g/L
Hidrolizado cido de casena
4.59 g/L
Cloruro de sodio
7.34 g/L
Dihidrogeno fosfato de potasio
1.47 g/L
Cloruro de magnesio anhidro
10.93 g/L
Oxalacetato verde de malaquita
37.0 mg/L
Novobiocina
10
mg/L
Agar
2.70 g/L
pH = 5.2 0.2
Apndice
Mller Hinton agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)

Infusin de carne
2
g/L
17.5 g/L
Almidn soluble
1.5
mg/L
Agar
17
g/L
pH = 7.4 0.2
Rose Bengal Chloramphenicol agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)
Peptona de soja
5.0
g/L
Glucosa
10.0 g/L
Fosfato monopotasico
1.0
g/L
Sulfato de magnesio 7 H2O
0.5
g/L
Rose Bengal
50.0 mg/L
Cloranfenicol
0.1
g/L
17.5 g/L
Infusin de carne
2.0
mg/L
Almidn soluble
1.5
g/L
Agar
13.0 g/L
pH = 7.4 0.2
Caldo LB
Triptona
NaCl
pH = 7
10
5
5
g/L
g/L
g/L
Agar papa glucosado (Britania S.A., Buenos Aires, Argentina)

Infusin de papa
4
g/L
dextrosa
20
g/L
Agar
15
g/L
pH = 5.6 0.2
Rapid-Salmonella (BIO-RAD, Paris, France)
Peptona de casena
Extracto de carne
Agentes selectivos
Mezcla cromognica
Agar
pH = 7.2 0.2
5
5
14
310
12.7
g/L
g/L
g/L
mg/L
g/L
235
236
Apndice
Medio Dulbecco modified Eagles minimal essential medium (DMEM) completo

Dulbecco modified Eagles minimal essential medium 1000
ml
(DMEM), Gibco, Grand Island, N.Y., USA
13
ml
Penicilina/ Streptomicina (1000 IU, 1000g/ml)
Suero fetal bovino
180
ml
Aminocidos no esenciales
13
ml
Gentamicina (50 mg/ml)
10
ml
Fungizona
5
ml
HNaCO3
2
g/l
pH = 7 0,2
El suero fetal bovino se inactiva 30 minutos a 60 C. Una vez preparado, el medio se
esteriliza por filtracin a travs de una membrana de 0.22 m.
Medio DMEM de adhesin
Dulbecco modified Eagles minimal essential medium
(DMEM), Gibco, Grand Island, N.Y., USA
1000 ml
NaHCO3
2 g/l
pH = 7 0,2
Una vez preparado, el medio se esteriliza por filtracin a travs de una membrana de 0.22
m.
2. Buffer y reactivos
Buffer fosfato
KH2PO4 (0.1M)
NaOH (0.1M)
Agua
pH = 7 0.2
50 ml
29.1 ml
c.s.p 100ml
Buffer TE
Tris-HCl (pH 8.0)
EDTA (pH 8.0)
pH = 8.0
10
1
1.0
mM
mM
g/L
Buffer PBS
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
8.02 g/l
0.231 g/l
1.17 g/l
0.2 g/l
Apndice
Buffer TAE 50x

Tris-base
cido actico glaciar
EDTA 0.5 M (pH 8)
Agua miliQ
242
57.1
100
c.s.p
g/L
ml/L
ml/L
1000 ml
Buffer liticasa
Sorbitol
Tris-HCl (pH 8)
EDTA
0.9
0.1
0.1
M
M
M
50
50
5
mM
g/L
mM
Buffer lizosima o TES

Tris-HCl
Sacarosa
EDTA
pH = 8
Reactivo de Antrona
Antrona (9, 10 dihidro-9-oxoantraceno, Mallinckrodt)
H2SO4
Agua destilada
0.5
66 %
c.s.p
g/L
p/v
1L
Para la obtencin del reactivo de Antrona se prepar primero una mezcla 66 % v/v de H2SO4
en agua. Debido a la naturaleza fuertemente exotrmica de la disolucin se trabaj en bao
de agua-hielo. Cuando la solucin anterior estuvo a una temperatura de aproximadamente
70 C, y para facilitar su disolucin, se agreg antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno,
Mallinckrodt) en concentracin final de 0.5 g/L. El reactivo se conserv de 0 a 4 C y utiliz
dentro de los 15 das posteriores a su preparacin.
Solucin de esporos
Lauril Sulfato de Sodio
Glucosa
0.001 g/L
0.1
g/L
Solucin TSS-2X (para preparacin de clulas competentes de Escherichia coli)

PEG 8000
2
g
DSMO
1
ml
MgCl2 1M
0.7
ml
Medio LB estril
c.s.p 10 ml
Filtrar con membrana de 0.22 m y conservar a -20 C
237
238
Apndice
Solucin de tripsina
Tripsina
EDTA
PBS
0.75
0.2
c.s.p
g/L
g/L
1L
3. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante: reactivos, preparacin de geles y

tincin
3.1 Reactivos
Solucin de Acrilamida-bisacrilamida 40 %
Acrilamida
38.93 g
Bisacrilamida
1.07 g
Agua destilada
c.s.p 100 ml
Filtrar con membrana 0.45 m y almacenar a 4 C
Soluciones para preparar geles de acrilamida 8 % con gradiente desnaturalizante
Acrilamida-Bis 40%
Buffer TAE 50X
Urea
Formamida deionizada
Agua destilada
0 % desnaturalizante
20 ml
2 ml
c.s.p 100 ml
80 % desnaturalizante
20 ml
2 ml
33.6 g
32 ml
c.s.p 100 ml
Soluciones desnaturalizantes de trabajo

Concentracin
desnaturalizante
30 %
40 %
60 %
70 %
Solucin 0 %
desnaturalizante
7,19 ml
5,75 ml
2,87 ml
1,45 ml
Persulfato de amonio 10 %
Persulfato de amonio
Agua destilada
Fraccionar y almacenar a -20 C
0.1
c.s.p
Solucin 80 %
desnaturalizante
4,31 ml
5,75 ml
8,63 ml
10,05 ml
g
1.0 ml
Apndice
Buffer muestra
Azul de bromofenol 2 %
Xileno cianol 2 %
Glicerol 100 %
Agua destilada
Solucin stacking
Acrilamida 0 %
Temed
Persulfato de amonio 10 %
Soluciones colorantes
1. Bromuro de etidio
2. Sybr Gold
0.25
0.25
7.00
2.50
ml
ml
ml
ml
5
5
5
ml
l
l
2
0.2
g/ml en buffer TAE

l/ml en buffer TAE
3.2 Preparacin de los geles y siembra

Los geles con gradiente desnaturalizante se prepararon empleando un sistema con 2 vasos
comunicantes conectados a una bomba peristltica. Se prepararon 2 soluciones con distinta
concentracin
de
urea-formamida,
indicadas
anteriormente
como
soluciones
desnaturalizantes de trabajo. Inmediatamente antes de su utilizacin, se agregaron a cada

solucin 4.4 l de TEMED y 44 l de persulfato de amonio 10 %. Las mismas se colocaron en
los vasos comunicantes, aquella con mayor concentracin de urea-formamida se coloc en
el vaso ms cercano al conducto de salida y se agit durante la preparacin del gel con un
agitador magntico. Las soluciones fueron luego vertidas entre vidrios mediante una bomba
peristltica empleada a la mnima velocidad. Se coloc el peine formador de calles y el gel
de dej polimerizar. Posteriormente se complet el espacio, generado por la contraccin
del gel causada por la gelificacin, con solucin stacking.
Una vez formado el gel, los vidrios conteniendo el mismo se montaron sobre el soporte
correspondiente y se colocaron en la cuba con buffer TAE a 60 C. Luego se sembraron en
cada fosa 20 l de muestra con 5 l de buffer muestra para productos PCR obtenidos a
partir de ADN proveniente de comunidades microbianas y 7 l de muestra + 3 l de buffer
muestra para amplicones de ADN de cepas aisladas.
239
240
Apndice
3.3 Tincin
Una vez finalizada la electroforesis los soportes conteniendo los geles fueron retirados de la
cuba y desmontados. Los vidrios se separaron cuidadosamente de manera que el gel quede
sobre uno de ellos. Luego el gel sobre el vidrio se coloc durante 30 min en un recipiente
conteniendo buffer TAE con bromuro de etidio o con Syber Gold (Invitrogen, USA) en las
concentraciones indicadas anteriormente. Los geles se observaron en un transiluminador
(DyNA Light UV Transilluminator, LABNET TM-26) con longitud de onda 320 nm y se
fotografiaron con una cmara Panasonic DCM-228.
A
Soporte gel
Bomba peristltica
Vasos comunicantes
formadores de gradiente
Figura A.1: Material para el armado de los geles con gradiente (A) y Equipo de
electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (B).
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Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Exactas

Trabajo de Tesis Doctoral

Lic. Alejandra Londero

A Nachito, a Cami y a Yani por su compaa durante la escritura de la tesis.

Valorizacin del suero

Propiedades funcionales de componentes del suero

Produccin de suero en la Argentina

Alimentos funcionales en aves: Probiticos

Microbiota intestinal y su rol en la salud

Productos probiticos y su aplicacin

Mecanismos de accin de los probiticos

Consideraciones para la administracin de los probiticos

Enfermedades causadas por enteropatgenos en aves

Mecanismos de patognesis de Salmonella

Mtodos de control de salmonelosis en aves

Probiticos para el control de Salmonella en aves

Uso de antimicrobianos en la conservacin de pienso para aves

Mtodos de control de microorganismos en el pienso

Uso de bacterias cido lcticas y sus metabolitos como conservantes de

Descripcin del producto

Fermentacin de suero con grnulos de kefir

CAPTULO 1. CARACTERIZACIN DE SUEROS FERMENTADOS CON GRNULOS O

Sueros de quesera y medios de cultivo

Obtencin de leche y suero fermentados con grnulos de kefir

Obtencin de suero fermentado empleando otros cultivos iniciadores

Empleo de cultivos madre como starters

3.1.1 Cultivo madre en suero

3.1.2 Cultivo madre en leche

Empleo de cepas aisladas de kefir como starters

Aumento de biomasa de grnulos de kefir

Anlisis de la composicin qumica de grnulos de kefir y productos

Determinacin del contenido de lactosa

Determinacin del contenido de protenas totales

Cinticas de acidificacin y produccin de cidos orgnicos

Enumeracin de microorganismos viables

Microscopa electrnica de barrido (MEB)

Extraccin de ADN de grnulos de kefir

Extraccin de ADN de productos fermentados

Extraccin de ADN de cepas de referencia

Amplificacin mediante reaccin de polimerizacin en cadena (PCR)

Anlisis por electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

Identificacin de bandas DGGE

Fermentacin de suero con grnulos de kefir

Similitud de grnulos de kefir crecidos en leche y suero

Anlisis de leche y suero fermentados con grnulos de kefir

Efecto de la variacin del porcentaje de grnulos de kefir inoculados, el tipo

Fermentacin de suero con distintos porcentajes de grnulos de kefir

Empleo de distintos sueros como sustrato

Fermentacin de suero a distintas temperaturas

2.3.1 Grnulos de kefir en suero a distintas temperaturas

2.3.2 Caracterizacin de suero fermentado con grnulos de kefir a diferentes

Fermentacin de suero con cultivos iniciadores alternativos

Fermentacin de suero con cultivos madre en suero y en leche

Fermentacin de suero con microorganismos aislados de kefir

3.2.1 Crecimiento de los microorganismos en suero en cultivos puros y mixtos

3.2.2 Acidificacin de suero y produccin de cidos orgnicos

CAPTULO 2. EFECTO INHIBITORIO DE SUERO FERMENTADO CONTRA PATGENOS