Riesgo de Enfermar Asociado Al Consumo de Lechuga Expuesta A La Contaminacion Por Salmonella

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO
FACULTAD DE QUMICA
PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL

CENTRO DE LA REPBLICA
(PROPAC)
MAESTRA EN CIENCIA Y TECNOLOGA DE
ALIMENTOS
RIESGO DE ENFERMAR ASOCIADO AL CONSUMO DE
LECHUGA EXPUESTA A CONTAMINACIN POR Salmonella
TESIS
Que como parte de los requisitos para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS
Presenta
SANDRA GUADALUPE GARCA GALVN
Quertaro, Qro. Enero del 2009
RESUMEN
La participacin de las hortalizas como vehculo de microorganismos
patgenos se ha incrementado en las ltimas dcadas en diversos pases. El
objetivo de este estudio fue determinar la incidencia de Salmonella y E. coli en
lechuga expendida en mercados de la ciudad de Quertaro, estimar el patrn de
consumo y determinar el comportamiento de Salmonella en esta hortaliza a partir
de un modelo de contaminacin cruzada. Se analizaron 647 muestras de lechugas
colectadas entre octubre del 2007 y junio del 2008. A 50g de lechuga, se
adicionaron 200 ml de caldo soya tripticasa y se homogenizaron. La mezcla se
dividi en dos porciones iguales: 1) para la deteccin de Salmonella por PCR y 2)
para estimar el contenido de E. coli por la tcnica de NMP. El volumen restante de
la segunda porcin se almacen en refrigeracin (~24h) para cuantificar
Salmonella (NMP) en las muestras positivas por PCR. Se detect E. coli en el
14.9% de las muestras con niveles de 0.2 a 62 NMP/g y Salmonella en 0.6% con
lmites de <0.06 a 28 NMP/g. En la temporada clida (marzo a junio) la positividad
para Salmonella y E. coli fue de 1.9 y 25.3% respectivamente y, para la temporada
fra (octubre a febrero) las cifras fueron de 0 y 1.4%. Para determinar el
comportamiento de Salmonella en lechuga, se inocul una tabla de madera para
picar con una torunda previamente sumergida en jugo de carne cruda de cerdo
inoculado con Salmonella (7 Log ufc/ml) resistente a rifampicina. Se colocaron 100
g de lechuga picada y se manipularon sobre la tabla inoculada durante 30-40 s.
Porciones de lechuga contaminada (10 g) se almacenaron a 30, 22 y 4 C,
sumergidas o no en agua. Se efectuaron recuentos peridicos en agar soya
tripticasa suplementado con rifampicina. No se observ diferencia significativa (p<
0.05) entre el comportamiento de Salmonella en la lechuga sumergida y no
sumergida en agua. A 30 C el patgeno increment su poblacin cerca de 3 Log
UFC/g en 8 h, mientras que a 22 C solamente 1.5 Log UFC/g en 12 h. A 4 C
nicamente sobrevivi. El estudio sobre el consumo de lechuga revel que el
grupo de la poblacin con mayor exposicin al producto oscila entre 25 y 64 aos
de edad e ingiere porciones de 10 a 25 g una a dos veces por semana.
Considerando la cantidad de alimento consumida, puede inferirse que en los
casos de positividad a Salmonella estas personas llegan a ingerir entre 1.3 y 100
clulas del patgeno en una ocasin. Conocer la incidencia de patgenos en
alimentos que se consumen crudos, as como la frecuencia y cantidad con la que
se ingieren, son elementos que permiten estimar el riesgo al que se expone el
consumidor y constituyen la base de los nuevos enfoques de prevencin.
(Palabras clave: lechuga, contaminacin cruzada, Salmonella)
SUMMARY
The incidence of vegetables constituting a vehicle for pathogenic microorganisms
has increased during the last few decades in different countries. The objective of
this study was to determine the incidence of Salmonella and E .coli in lettuce sold
in markets in the City of Queretaro, to calculate the consumption pattern and to
determine the behavior of Salmonella on this vegetable using a crosscontamination model. 647 lettuce samples collected in October 2007 and June
2008, were analyzed. 200 ml. of tryptic soy broth was added to 50 g of lettuce and
was homogenized. The mixture was divided into two equal portions: 1) for the
detection of Salmonella by PCR and 2) to estimate the content of E. coli using the
MPN technique. The remainder of the second portion was stored in refrigeration
(approximately 24 h) in order to quantify Salmonella (MPN) in the samples that
were found to be positive by PCR. E. coli was found in 14.9 % of the samples with
levels of 0.2 to 62 MPN/g and Salmonella in 0.6% with limits of <0.06 to 28 MPN/g.
In the hot season (March to June), positive testing for Salmonella and E. coli was
1.9 and 25.3 %, respectively. For the cold season (October to February), the
figures were 0 and 1.4%. In order to determine the behavior of Salmonella on
lettuce, a wooden cutting board was inoculated using a swab previously
submerged in raw pork juice inoculated with Salmonella (7 Log CFU/ml) which was
resistant to Rifampicin. 100 g of chooped lettuce was placed and moved around on
the inoculated board for 30-40 s. Portions of the contaminated lettuce (10 g) were
stored at 30, 22 and 4 C, some submerged in water and others not. Periodic
counts were carried out in tryptic soy agar supplemented with rifampicin. No
significant difference (p <0.05) was observed between the behavior of Salmonella
on the submerged lettuce and the lettuce not submerged. At 30 C, the pathogens
population increased close to 3 Log CFU/ g in 8 h, while at 22 C, it only increased
1.5 Log CFU/ g in 12 h. At 4 C it only survived. The study of lettuce consumption
showed that the population group with the greatest exposure to the product varies
from 25 to 64 years of age, and this group ingests portions of 10 to 25 g once or
twice a week. Considering the amount of lettuce consumed, it can be inferred that
in the cases positive to Salmonella, these people ingest between 1.3 and 100 cells
of the pathogen on each occasion. Knowing the incidence of pathogen on food
eaten raw, as well as the frequency and quantity in which they are ingested, are
factors that make possible an estimate of the risk to which the consumer is
exposed and form the basis for new prevention focuses.
(Key words: Lettuce, cross-contamination, Salmonella)
ii
AGRADECIMIENTOS
- A CONACYT por el financiamiento otorgado para la realizacin de

esta investigacin.
- A la Universidad Autnoma de Quertaro.
- Al Dr. Escartn por el apoyo brindado y el tiempo dedicado durante
la elaboracin de esta tesis.
- A los integrantes del comit de tesis por sus valiosos comentarios
- Gracias a la Dra. Montserrat por asesorarme en la redaccin de la
tesis, por tenderme la mano siempre que lo necesite, por su crtica
siempre constructiva.
- A Betty por el apoyo brindado dentro y fuera del trabajo y por ser la
chispa del laboratorio.
- A Polo por la capacitacin en las tcnicas moleculares, y por
ayudarme a resolver dudas siempre que lo necesite.
- A la Sra Martha y Erika por su compaa durante mi estancia en el
laboratorio, por su ayuda desinteresada, por los buenos momentos.
- A todas y cada una de las personas que de alguna forma colaboraron
en la fase experimental de este trabajo.
iii
NDICE GENERAL
Pgina
RESUMEN
SUMMARY
ii
AGRADECIMIENTOS
iii
DEDICATORIA
iv
NDICE
NDICE DE CUADROS
ix
NDICE DE TABLAS
NDICE DE FIGURAS
xi
I. INTRODUCCIN
II. ANTECEDENTES
2.1. Frutas y hortalizas
2.1.1. Produccin y consumo
2.1.2. Riesgos asociados al consumo de frutas y hortalizas
2.1.3. Brotes asociados a el consumo de frutas y hortalizas
2.1.4. Incidencia de Salmonella en frutas y hortalizas
2.1.5. Fuentes y mecanismos de contaminacin
2.1.5.1. Contaminacin cruzada
2.2. Lechuga
2.2.1. Brotes asociados a su consumo
10
2.3. Enfoques para lograr y preservar la inocuidad microbiana de los alimentos
12
2.3.1. Prcticas sanitarias agrcolas
12
2.3.2. Anlisis de peligros y puntos crticos de control
13
2.3.3. Anlisis de riesgos
14
2.3.3.1 Evaluacin de riesgos microbiolgicos (ERM)
14
2.3.3.1.1. Identificacin del peligro
16
2.3.3.1.2. Caracterizacin del peligro
16
2.3.3.1.3. Evaluacin de la exposicin
17
2.3.3.1.4. Caracterizacin del riesgo
21
2.4. Tcnicas de deteccin de Salmonella en los alimentos
22
2.4.1. Deteccin por cultivo
22
2.4.2. Deteccin por PCR
23
2.5 Microbiologa predictiva
24
2.5.1 Modelo de Baranyi
24
III. OBJETIVOS
26
IV. MATERIALES Y MTODOS
27
4.1. Material biolgico
27
4.1.1 Equipo
27
4.1.2 Medios de cultivo
27
4.1.3 Soluciones
28
4.1.4 Reactivos
28
4.2 Material biolgico
28
4.3. Sitios de muestreo
29
4.4. Validacin de la tcnica de cultivo para la determinacin de Salmonella
29
4.4.1 Evaluacin del caldo de preenrequecimiento en lechuga

4.4.1.1 Preparacin del inculo
29
29
4.4.1.2 Determinacin del desarrollo de Salmonella en lechuga con

tres caldos de preenrequecimiento
30
4.5 Validacin de PCR para la determinacin de Salmonella

4.5.1 En cultivo puro
30
30
vi
4.5.2 En lechuga
31
4.5.2.1 Determinacin de Salmonella con extracto de lechuga
31
4.5.2.2 Determinacin del lmite de deteccin
30
4.6 Comparacin del cultivo y PCR para la determinacin de Salmonella
30
4.7 Determinacin del NMP de Salmonella en lechuga
30
4.8 Determinacin de E. coli
30
4.9 Modelo de contaminacin cruzada
32
4.9.1 Preliminares
32
4.9.1.1 Inoculacin de la tabla de madera

4.9.1.2
32
Influencia del nivel de inculo en la recuperacin de
Salmonella a partir de la tabla de madera
32
4.9.1.3 Determinacin de la variabilidad de contaminacin de la

lechuga por medio de la tabla de la madera
4.9.2 Dinmica de Salmonella en lechuga
32
33
4.10 Estimacin del patrn de consumo de lechuga
33
4.11 Anlisis estadsticos
33
V. RESULTADOS Y DISCUSIN
35
5.1. Sitios de muestreo
35
5.2. Validacin de la tcnica de cultivo para la determinacin de Salmonella
35
5.2.1. Evaluacin del caldo de preenrequecimiento en lechuga
35
5.3. Validacin de PCR para la deteccin de Salmonella en cultivo puro

5.3.1 Especificidad y sensibilidad de los iniciadores para la deteccin de
37
37
Salmonella (invA)
5.3.2. Validacin de la tcnica de PCR para la deteccin de Salmonella
38
en lechuga
5.4. Incidencia de Salmonella y E. coli en lechuga
40
5.5. Contenido de Salmonella y E. coli en lechuga
42
5.6. Asociacin entre la deteccin de Salmonella y E. coli
45
5.7. Incidencia de Salmonella y E. coli segn poca del ao
46
5.8. Comportamiento de Salmonella en lechuga a travs de un modelo de
vii
contaminacin cruzada
48
5.8.1. Estudios preliminares
49
5.8.1.1. Efecto del nivel de inculo en la recuperacin de Salmonella en

las tablas de madera
51
5.8.1.2. Contaminacin de la lechuga
52
5.8.2. Comportamiento de Salmonella en lechuga sumergida y no
53
sumergida en agua
5.9. Estimacin del patrn de consumo de lechuga
59
5.10. Estimacin del riesgo de enfermar por Salmonella asociado al consumo
65
de lechuga
VI. CONCLUSIONES
69
VII. BIBLIOGRAFA
71
viii
NDICE DE CUADROS
Cuadro
Pgina
2.1
Fuentes de contaminacin de microorganismos patgenos en frutas

y hortalizas crudas y condiciones que influyen en su sobrevivencia
y crecimiento
2.2
Informacin generada y requerida para la evaluacin de la

exposicin
19
5.1
Algunos estudios de Evaluacin de Riesgos Microbiolgicos

realizados en pases desarrollados
67
ix
NDICE DE TABLAS
Tabla
Pgina
en
lechuga
de
tres
sitios
de
41
5.1
Positividad de Salmonella
comercializacin
5.2
Positividad de E. coli en lechuga de tres sitios de comercializacin
41
5.3
Contenido de Salmonella
comercializacin
44
en lechuga de tres sitios de
5.4
Contenido de E. coli en lechuga de tres sitios de comercializacin
45
5.5
Asociacin entre la deteccin de Salmonella y E. coli en lechuga
46
5.6
Recuentos de Salmonella en lechuga contaminada a partir de la

tabla de madera
53
5.7
Valores de F y significancia estadstica en el anlisis de varianza

para la variable velocidad de desarrollo de los factores de estudio
y su interaccin
57
5.8
Velocidad de desarrollo de Salmonella en lechuga

picada
sumergida y sin sumergir en agua y almacenada a 4, 22 y 30 C
58
5.9
Porcentajes de frecuencia sobre la encuesta de consumo de

lechuga cruda
61
NDICE DE FIGURAS
Figura
Pgina
2.1
Tendencia anual en brotes por frutas y hortalizas
2.2
Promedio de casos por brote segn tipo de alimento
2.3
Fuentes y mecanismos de contaminacin durante la obtencin y

procesamiento de frutas y hortalizas crudas
2.4
Patgenos en brotes de frutas y hortalizas
11
2.5
Marco general de la Evaluacin de Riesgos
16
2.6
Evaluacin de la exposicin- del campo a la mesa
20
4.1
Formato de la encuesta sobre el consumo de lechuga
34
5.1
Cintica de Salmonella en lechuga con tres caldos de

preenrequecimiento
36
Cintica de Salmonella en cultivo puro con tres caldos de

preenrequecimiento
36
Especificidad de los iniciadores invA para detectar Salmonella en

cultivo puro
37
Sensibilidad de la tcnica de PCR para la deteccin de Salmonella

en cultivo puro
38
5.5
Sensibilidad de iniciadores invA en lechuga
39
5.6
Cintica de Salmonella y BMAs en CST a 35 C
39
5.7
Salmonella y E. coli en muestras de lechuga durante dos pocas

del ao
47
5.8
Recuperacin de Salmonella en tablas de madera
50
5.9
Influencia del nivel de inculo en la recuperacin de Salmonella en

tabla de madera
50
Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sumergida en

agua y almacenada a diferentes temperaturas
55
5.2
5.3
5.4
5.10
xi
5.11
Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sin sumergir en

agua y almacenada a diferentes temperaturas
56
5.12
Grupos de poblacin entrevistadas segn edad
62
5.13
Frecuencia de sitios de consumo de lechuga cruda
62
5.14
Frecuencia de consumo de lechuga cruda
63
5.15
Frecuencia de cantidad de lechuga cruda consumida por ocasin
64
5.16
Frecuencia de padecimientos de diarrea al ao por persona
64
5.17
Probabilidad de exposicin de Salmonella en funcin de su

incidencia, frecuencia y cantidad de lechuga consumida
68
xii
I. INTRODUCCIN
Como consecuencia de la publicidad que reciben por parte de autoridades

sanitarias nacionales e internacionales y como parte de una dieta saludable,
actualmente se observa un incremento en el consumo de frutas y hortalizas
crudas. No obstante, se ha demostrado que este grupo de alimentos suele ser
vehculo de patgenos (Beuchat, 1996). Los brotes causados frutas y hortalizas
provocaron un promedio de 48 casos por brote en un periodo de 15 aos en
E.E.U.U., colocndose por arriba de alimentos como pollo y mariscos (CSPI,
2007). El enfoque ms moderno para la prevencin de las enfermedades
microbianas asociadas al consumo de alimentos es la evaluacin de riesgos. Este
enfoque se lleva a cabo en cuatro etapas: identificacin del peligro, caracterizacin
de peligro, evaluacin de la exposicin y caracterizacin del riesgo. Durante la
etapa de evaluacin de la exposicin se utiliza la informacin sobre la incidencia,
concentracin y comportamiento de un patgeno en un alimento particular en las
diferentes etapas del campo a la mesa. Es igualmente necesario conocer la
cantidad y frecuencia con la que se consume este alimento. Es posible as,
estimar el nmero de clulas que ingiere una persona al momento de su consumo
mediante el uso de la microbiologa predictiva que considera las condiciones de
manejo del alimento previo al consumo. El presente trabajo tuv como objetivo
determinar la incidencia de Salmonella en lechugas comercializadas en mercados
pblicos de la ciudad de Quertaro, estudiar el comportamiento del patgeno en la
hortaliza a travs de un modelo de contaminacin cruzada y conocer la tendencia
de consumo como recurso para estimar la probabilidad de exposicin a
Salmonella asociado al consumo de lechuga.
II. ANTECEDENTES
2.1. FRUTAS Y HORTALIZAS

2.1.1. PRODUCCIN Y CONSUMO
Las frutas y hortalizas son parte fundamental de la dieta del hombre;
representan una apreciable fuente de nutrientes para el adecuado funcionamiento
del organismo. En general, su contenido de protenas y lpidos es muy reducido; el
agua, fibra, almidones, algunas vitaminas y minerales son sus componentes
primarios (Fernndez, 2000).
Durante las ltimas tres dcadas el consumo de frutas y hortalizas crudas en

los Estados Unidos (E.E.U.U.) se ha incrementado en cerca de 50%
(Sivapalasingam et al., 2004). Actualmente es notable una ms amplia distribucin
global, variedad de productos y disponibilidad a lo largo de todo el ao (Beuchat y
Ryu., 1997). A partir del 2000 en E.E.U.U., los productores de frutas y hortalizas
orgnicos representan el 2 % de la venta, y se espera que este mercado siga
aumentando hasta 10-12% anual (Natvig et al., 2002).
La produccin agrcola alimentara desempea un importante papel en la

economa de muchos pases. Mxico cuenta con 23 millones de hectreas para el
cultivo es decir el 11.7% de la superficie total del pas. La variacin del clima de
tropical a templado permite cultivar una gran variedad de frutas y casi cualquier
hortaliza (FDA/CFSAN, 2001). En nuestro pas el 4% de la tierra para cultivo es
empleada para producir frutas y hortalizas. Un 20% de la produccin de frutas y
hortalizas se destina a la exportacin, el resto para el mercado nacional.
Las exportaciones de frutas y hortalizas constituyen un amplio porcentaje de

los ingresos de muchos pases de Latinoamrica (Huang, 2004). Mxico ocupa el
10 lugar de exportadores a nivel mundial; son importantes los ingresos por las
actividades agropecuarias ya que un tercio de la poblacin econmicamente activa

obtiene sus ingresos trabajando en este rubro.
2.1.2.
RIESGOS ASOCIADOS AL CONSUMO DE FRUTAS Y HORTALIZAS
Las frutas y hortalizas frescas constituyen un problema de salud pblica

desde el punto de vista de la seguridad alimentaria. En 1980 Hauschild y Bryan
estimaron que los casos de enfermedades transmitidas por alimentos y agua en
los EUA era de 1.4 a 3.4 millones por ao. Se estima que cada ao afectan de 6 a
8 millones de personas, causan 9,000 muertes y tienen un costo estimado en 5 mil
millones de dlares (Alterkruse et al., 1997; Mead et al., 1999).
El escenario de los brotes ha pasado de afectar a pocas personas debido al

mal manejo del alimento, al actual, nivel bajo de contaminacin de un alimento
producido en gran escala y ampliamente distribuido (Rushing, 2001). Por tanto, los
brotes aparecen diseminados y extensos (Tauxe y Hughes, 1996). Algunos
factores que pueden estar afectando la transicin de las ETAs incluyen cambios
en las prcticas agrcolas (Alterkruse et al., 1997), redes de distribucin ms
amplias (Naimi et al., 2003) y productos y sistemas de distribucin y preservacin
mas complejos (Taietjen y Fung, 1995).
El problema seguramente no es excepcional en pases como el nuestro en

donde an se observan (aunque cada vez menos frecuentes) prcticas insalubres
en su cultivo, cosecha, transporte, comercializacin y preparacin. Si los reportes
de brotes no son frecuentes, probablemente se deba ms a deficientes servicios
de epidemiologa que a una ausencia real de incidentes. Pero aun en pases
desarrollados que no suelen utilizar aguas negras en el riego de hortalizas, se
cuenta con reportes de brotes en la poblacin.
Bacterias enteropatgenas como E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni,

Listeria monocytogenes y Salmonella, aparte virus, protozoarios y helmintos, son
3
transmisibles a travs de verduras o frutas que se consumen crudas. Las llamadas

ensaladas verdes que contienen verduras como lechuga, brcoli, zanahoria,
jitomate, apio y otras, y que suelen ofrecerse en las barras de restaurantes y
prepararse en casi toda cocina, incluidos los hogares, constituyen un riesgo
especial (Sivapalasingam, 2004).
2.1.3. BROTES ASOCIADOS A EL CONSUMO DE FRUTAS Y HORTALIZAS
Debido a que las frutas y hortalizas se han visto involucradas en brotes de

enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs), ha surgido la necesidad de
conocer la distribucin de microorganismos patgenos en este tipo de alimentos.
Algunos vehculos frecuentes en brotes en Estados Unidos son los jitomates,

lechuga, germinados de alfalfa, perejil, cebollines, meln, as como jugos de
manzana
naranja
sin
pasteurizar,
zarzamoras
fresas
congeladas
(Beuchat,1996).
Una revisin de los brotes asociados a frutas y hortalizas desde 1990 a 2005
mostr que hubo un incremento importante de brotes a partir de 1998 (figura 1);
sin embargo este incremento se debi probablemente a una mayor vigilancia por
parte de el Centro para el Control y Prevencin de Enfermedades (CDC) (Smith y
Bhuiya, 2007).
Dentro de este mismo estudio se realiz una revisin de brotes en los que se
identific la fuente de alimento. Los brotes ocasionados por frutas y hortalizas
crudas comprendieron el 13% (713/ 5,416) de los brotes y el 21% de los casos de
enfermedades en el periodo de 1990 a el 2005, de acuerdo con el Centro de
Ciencias para el Inters Pblico (CSPI).
Brotes
Casos
Brotes
Casos
Ao
Figura 2.1. Tendencia anual en brotes por frutas y hortalizas (CSPI, 2007).
Frutas y
hortalizas
pollo
Crnicos
Pescados y
mariscos
Figura 2.2. Promedio de casos por brote segn tipo de alimento (CSPI,
2007).
2.1.4. INCIDENCIA DE Salmonella EN FRUTAS Y HORTALIZAS
La mayora de la personas asocian apropiadamente a Salmonella con las

aves. Sin embargo, una investigacin de los brotes por alimentos realizada por
CSPI, revel que las frutas y hortalizas crudas estn alcanzando las mismas cifras
que alimentos como el pollo como principales responsables de las infecciones por
Salmonella (CSPI, 2005).
Se ha demostrado la presencia de Salmonella en frutas y hortalizas diversas

como alcachofa, remolacha, germinados de semilla, calabaza, coliflor, perejil,
chiles, cilantro, lechuga, endivia, apio, pimiento, ensalada de verduras, espinacas
(Beuchat, 2002), jitomate (Rico, 2002) melones, sandia (CDC, 1991), naranja,
coliflor y cebollines (FDA/CFSAN, 2001).
En Espaa, Garca-Villanova et al. (1987) encontraron Salmonella en 7.5%

verduras de mercado. En un estudio realizado en la FDA se recuper el patgeno
(1%) de la cscara de melones y sandas (CDC, 1991).
Algunos estudios de frutas y hortalizas han revelado la presencia de diversos

serotipos de Salmonella capaces de causar enfermedad. Tamminga et al. (1978)
aislaron Salmonella en 23 de 103 muestras de coliflor, lechuga, endibia, berenjena
y pimientas cultivadas en Netherlands. Ercolani (1976) report que el 68% de 120
muestras de lechuga y el 72% de 89 muestras de hinojo, obtenidas en comercios
de Italia, encontr cinco diferentes serotipos de Salmonella. Entre 1981 y 1983,
Garca-Villanova Ruiz et al. (1987) analizaron 345 muestras de hortalizas
colectadas en el campo, mercados y supermercados en Espaa para detectar la
presencia de Salmonella. Encontraron este microorganismo en alcachofa,
remolacha,
apio,
lechuga,
calabaza,
coliflor,
espinaca
perejil.
Otros
investigadores como Jerngklinchan y Saitanu en 1993 realizaron en Bangkok una

encuesta en brotes de frijol. Revelaron que 30 de 344 (8.7%) muestras contenan
Salmonella.
6
2.1.5. FUENTES Y MECANISMOS DE CONTAMINACIN
La configuracin de los riesgos microbianos en los alimentos se inicia con el

proceso de contaminacin, es decir, con el mero ingreso de microorganismos al
alimento (Fernndez, 2000). Las frutas y hortalizas pueden contaminarse en
cualquier punto durante su cultivo, cosecha, procesamiento, transporte y
preparacin final (Beuchat et al., 2003).
Cuadro 2.1 Fuentes de contaminacin de microorganismos patgenos en frutas y

hortalizas crudas y condiciones que influyen en su sobrevivencia y crecimiento
(Beuchat, 1996).
Precosecha
Poscosecha
Heces
Heces
Suelo
Manejadores de alimentos (trabajadores o
Agua de riego
Aire (polvo)
Equipo de poscosecha
Animales domsticos
Aire (polvo)
y silvestres
Contenedores para transporte (del campo
consumidores)
hasta el empacado)
Manejo humano
Agua de lavado y enjuague
Vehculos de transporte
Hielo
Almacenamiento inapropiado (temperatura,

medio ambiente fsico)
Contaminacin cruzada (otros alimentos en

almacenamiento,
preparacin
reas
expuestas)
Manejo inadecuado durante la venta al

mayoreo y menudeo.
Dentro de las principales fuentes de contaminacin durante su cultivo se

encuentran el agua de riego, la tierra, el abono, animales domsticos y silvestres y
los agricultores. Durante la precosecha son de inters la manipulacin humana, la
maquinaria y el equipo, el agua de lavado y enjuague, el aire y una posible
contaminacin cruzada (Beuchat, 1996).
Los mecanismos, o bien, la manera y trminos en los que ocurre la

contaminacin en las frutas y hortalizas son diversos. Durante la poscosecha
puede ocurrir por medio del material de transporte, el agua de lavado y por
contaminacin cruzada con otros alimentos (Watchel, 2002).
heces
Ambiente durante el
cultivo, cosecha y
procesamiento
drenaje
ANIMALES
FRUTAS Y
HORTALIZAS
agua
suelo
HUMANOS
Contaminacin
cruzada
Carne, leche, huevo
Figura 2.3 Fuentes y mecanismos de contaminacin durante la obtencin y

procesamiento de frutas y hortalizas crudas (Beuchat, 1996).
2.1.5.1. CONTAMINACIN CRUZADA
Este mecanismo consiste en la transferencia de un material contaminado a

otro. Las posibilidades de contaminacin cruzada durante la preparacin de
alimentos en las cocinas son muy amplias. Esta constituye probablemente el factor
principal como determinante de la presencia de microorganismos patgenos en los
alimentos que se preparan en sitios como el hogar o restaurantes (Fernndez,
2000).
La contaminacin cruzada puede ocurrir en las cocinas por el contacto con

las manos de alimentos crudos de origen animal, o bien, con las superficies de
tablas de cortar y utensilios que se emplean durante la preparacin de estos
alimentos. La inadecuada manipulacin de alimentos en los hogares es uno de los
principales factores que contribuyen al desencadenamiento de enfermedades
bacterianas (Zhao et al.,1998).
Los datos epidemiolgicos sobre las enfermedades transmitidas por los

alimentos reportados por el CDC en el periodo de 1972 a 1987, comprendieron
7,458 casos, de los cuales 21% ocurrieron en los hogares (Bean, 1990). Sin
embargo, el porcentaje real de los brotes que ocurren en los hogares puede ser
mucho mayor, debido a que estos pequeos brotes generalmente no son
reportados o investigados (Tauxe, 1996).
2.2.
LECHUGA
La lechuga (Lactuca sativa C) es la hortaliza ms importante del grupo de los
vegetales de hoja que se consumen crudos. Ampliamente conocida, se cultiva en

casi todos los pases durante todo el ao, al aire libre o bajo invernaderos. Es una
planta anual y autgama, su raz no llega nunca a sobrepasar los 25 cm de
profundidad, es pivotante, corta y con ramificaciones; las hojas estn colocadas en
roseta, desplegadas al principio, en unos casos siguen as durante todo su
9
desarrollo (variedades romanas), y en otros se acogollan ms tarde. El borde de

los limbos pueden ser liso, ondulado o aserrado, su tallo es cilndrico y ramificado.
Su hbito de crecimiento determina su clasificacin en tres tipos principales,

que incluyen todas las variedades comerciales: la lechuga de hoja suelta
corresponde a la variedad botnica crispa; la de cabeza, a la variedad capitata; las
lechugas arrepolladas que forman cabezas son las de mayor demanda comercial
(SIAP, 2008).
La temperatura ptima de germinacin oscila entre 18 y 20C, en fase de
crecimiento el cultivo requiere temperaturas entre 14 y 18C por el da y 5 a 8C
por la noche, pues exige que haya diferencia de temperaturas entre el da y la
noche. Durante el acogollado se requieren temperaturas en torno a los 12C por el
da y 3 a 5C por la noche, como temperatura mxima puede soportar hasta los
30C y como mnima hasta -6C. Los suelos deben ser ligeros, arenoso-limosos,
con buen drenaje, situando el PH ptimo entre 6.7 y 7.4. (SIAP, 2008)
Esta hortaliza es la base de cualquier ensalada y es un ingrediente bsico en
dietas bajas en caloras, aporta minerales y vitaminas. De acuerdo con los datos
proporcionados por el Instituto de la Nutricin en Mxico, en 100 gramos de peso
neto la porcin comestible de la lechuga es de 69%, aporta 19 caloras, 1.3
gramos de protenas, 0.1 gramos de grasa y 4.1 gramos de carbohidratos;
adems, es rica en vitaminas y minerales (Hernndez et al., 1974).
2.2.1. BROTES ASOCIADOS A SU CONSUMO
La lechuga fue una de las hortalizas ms comnmente implicada en los

brotes de ETAs en E.E.U.U. entre 1973 y 1997 (Sivapalasingam et al., 2004).
En los ltimos aos, varios brotes de Escherichia coli O157: H7 han sido
causados por el consumo de lechuga o ensaladas contaminadas despus de la
cosecha. (Watchel, 2002). La CDC inform que entre 1998 a 2005 se presentaron
10
20 brotes y 634 casos de enfermedad asociados a esta bacteria por el consumo

de lechuga.
En Oklahoma EE.UU., se present un brote de campylobacteriosis debido

al consumo de lechuga. La contaminacin de esta hortaliza fue debido al mal
manejo de carne cruda de pollo, propiciando as, una contaminacin cruzada hacia
la lechuga (MMWR, 1997).
As mismo en Australia en 2001, se present un brote de salmonelosis
asociado al consumo de lechuga. La falta de mantenimiento en los equipos de
corte de la lechuga fue un factor clave en este brote (Stafford et al., 2002). De
acuerdo con el estudio realizado por CSPI en 2007, la lechuga es la segunda
hortaliza asociada a brotes, seguida de las ensaladas verdes. Salmonella es uno
Brotes
de las principales patgenos asociados a brotes por este alimento (Figura 2.4).
Ensaladas
Lechuga
Papa
Frutas
Vehculos
Figura 2.4. Patgenos en brotes de frutas y hortalizas (CSPI, 2007).
11
Col
2.3.
ENFOQUES
PARA
LOGRAR
PRESERVAR
LA
INOCUIDAD
MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS
2.3.1. PRCTICAS SANITARIAS AGRCOLAS
El llevar alimentos a la mesa del consumidor desde el campo involucra

muchos procesos (siembra, desarrollo del cultivo, cosecha, transporte a la planta,
empaque, almacenamiento, transporte a mercados terminales y distribucin) en
los que los productos se encuentran expuestos al manejo humano y al contacto
con material y equipo que aumentan el riesgo de contaminacin con agentes de
riesgo.
Aunque los alimentos pueden llegar a ser contaminados por agentes
qumicos u otros cuerpos extraos que pueden tener acceso a ellos durante su
manejo y empaque, las probabilidades de contaminacin por adulteracin son
menores. El principal problema para los productos alimenticios, en general, es
evitar los riesgos por contaminacin microbiolgica y su descomposicin.
Por lo tanto, es importante que durante las operaciones de campo y

empaque se sigan ciertos lineamientos, normas y controles que aseguren que el
crecimiento de la flora normal del producto est controlado, y que exista un
programa preventivo de contaminacin por microorganismos patgenos (Siller et
al, 2002).
La disminucin de la probabilidad de contaminacin puede alcanzarse a

travs de adecuadas maniobras durante el cultivo y cosecha. Estas prcticas se
han derivado a partir del conocimiento del hbitat de patgenos, su
comportamiento en frutas y hortalizas y la eficiencia de tratamientos dirigidos a
cancelar/ reducir su presencia o desarrollo y se conocen como prcticas agrcolas
sanitarias (PSAs); no deben confundirse con las buenas practicas agrcolas
(BPAs) o con las buenas practicas de manufactura (BPMs). Mientras las dos
ltimas tienen como meta la calidad del alimento, las PSAs cuidan el aspecto de
12
inocuidad. Las prcticas sanitarias no se limitan al campo de cultivo y es necesario

que se apliquen durante la produccin, transporte y procesamiento.
2.3.2. ANALISIS DE PELIGROS Y PUNTOS CRITICOS DE CONTROL
El sistema de anlisis de peligros y puntos crticos de control (APPCC) es

un enfoque moderno con fundamentos cientficos cuya pretensin primaria
consiste en eliminar de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su
consumo (Fernndez, 2000).
El sistema APPCC funciona ms eficazmente cuando se aplica de manera

concurrente con los programas de aseguramiento de la calidad. Elementos
implcitos fundamentales del sistema son las operaciones sanitarias de produccin
y distribucin, la adecuada sanidad, y el diseo y mantenimiento del equipo. Por lo
tanto, requiere la satisfaccin de ciertos prerrequisitos y acciones preliminares.
Algunos ejemplos de estas ltimas son la capacitacin del personal y la
disponibilidad de recursos elementales, como la dotacin de agua potable,
proteccin contra la fauna y la implementacin de las PSAs, as como BPAs.
Despus de realizar las acciones anteriores es necesario identificar los

peligros especficos para implementar medidas de control que se monitorean de
manera continua o peridica. Finalmente, si las acciones en el proceso de
elaboracin del alimento no cancelan las oportunidades de contaminacin,
sobrevivencia y desarrollo de agentes patgenos, se recomienda modificar el
proceso. Un plan de APPCC es especfico para cada producto y proceso. Puede
ser desarrollado para asegurar la inocuidad de una ensalada de fruta en un
restaurante o de una salchicha en una planta procesadora de productos crnicos
(Fernndez, 2000).
13
2.3.3 ANLISIS DE RIESGOS
El anlisis de riesgos es un proceso que comprende los siguientes

elementos: evaluacin de riesgos: evaluacin cientfica de los efectos adversos
conocidos o potenciales en la salud; gestin de riesgos: evaluacin, seleccin, y
aplicacin de alternativas de carcter normativo; y comunicacin de riesgos:
intercambio de informacin entre todas las partes interesadas. Aunque la
separacin funcional entre estos tres componentes es importante, hay un
reconocimiento cada vez mayor de la necesidad de interaccin entre ellos
(FAO/OMS, 2002; OMS 2000).
2.3.3.1 EVALUACIN DE RIESGOS MICROBIOLOGICOS (ERM)
La evaluacin de riesgos es un proceso que provee una estimacin de la

probabilidad e impacto de un efecto adverso a la salud. Este sistema se introdujo a
finales de los 70s y fue desarrollado como un medio para normalizar la base
reguladora para la toma de decisiones, especficamente en las reas relativas a la
exposicin humana a sustancias qumicas (American Chemical Society, 1998).
En la actualidad la metodologa de evaluacin de riesgos es usada para
evaluar los riesgos en diferentes reas, desde la toxicologa y ecologa hasta
ingeniera e investigacin econmica. Es recientemente que la evaluacin del
riesgo se ha aplicado a los peligros microbianos, y las tcnicas para su aplicacin
estn en plena evolucin (Lammerding, 1997).
Dentro de este enfoque un peligro se define como un agente biolgico,
fsico o qumico presente en un alimento con potencial de causar un efecto
adverso. As mismo, el riesgo se define como la probabilidad de enfermar y la
severidad de esta, como consecuencia de la exposicin a un peligro en el alimento
(Lammerding y Fazil, 2001).
14
La ERM puede considerarse un instrumento aplicable en la gestin de

riesgos ocasionados por los patgenos transmitidos por los alimentos y en la
elaboracin de normas para el comercio internacional de productos alimenticios.
No obstante, se reconoce que la realizacin de una ERM, particularmente de tipo
cuantitativo, es una actividad que consume abundantes recursos y exige un
enfoque multidisciplinario. As mismo,
las enfermedades transmitidas por los
alimentos son uno de los problemas de salud publica mas frecuentes, y generan
cargas sociales y econmicas, adems de sufrimiento, por lo que deben
enfrentarse a el todos los pases (FAO/OMS, 2004a).
La ERM nos permite estimar el riesgo para la salud de las personas

derivado de la presencia de determinados microorganismos en los alimentos.
Aunado a esto, sirve de instrumento con el que se puede comparar y evaluar
diferentes situaciones, y determinar que tipos de datos se necesitan para
determinar cuales son las medidas de control ms eficaces y aplicarlas de forma
ptima (FAO/OMS, 2004b)
Dado que la evaluacin de riesgos puede utilizarse tambin para justificar la

introduccin de normas ms restrictivas para los alimentos importados, su
conocimiento es importante para fines comerciales, y es necesario proporcionar a
los pases, instrumentos para que puedan comprender y, si es posible, realizar
evaluaciones de riesgos microbiolgicos (FAO/OMS, 2004a).
La comisin del Codex Alimentarius define la evaluacin de riesgos

asociados a los peligros microbiolgicos en los alimentos como un proceso con
una base cientfica formado por cuatro componentes (Figura 2.5): Identificacin del
peligro, evaluacin de la exposicin, caracterizacin del peligro, y caracterizacin
del riesgo.
15
Identificacin del
peligro
Evaluacin de la
exposicin
Caracterizacin del
peligro
Caracterizacin del
riesgo
Evaluacin DosisRespuesta
Figura 2.5. Marco general de la Evaluacin de Riesgos.
2.3.3.1.1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO
La primera actividad en la evaluacin de riesgos es la identificacin del

peligro. Tradicionalmente, en la evaluacin de riesgos qumicos, este paso tiene
como objetivo determinar si una sustancia qumica podra causar algn tipo de
efecto adverso en la salud (cncer, por ejemplo). En la evaluacin de riesgos
microbiolgicos, el microorganismo es usualmente ya identificado como un
patgeno capaz de causar enfermedad (ICMFS, 1998).
La identificacin del peligro es en gran medida una evaluacin cualitativa de

la informacin disponible, y considera en gran parte la misma informacin que se
analiza con ms detalle en los siguientes pasos del proceso de evaluacin.
Los peligros pueden identificarse a partir de fuentes de datos pertinentes,

tales como la literatura cientfica, investigaciones epidemiolgicas, estudios
clnicos, entre otros (Lammerding y Fazil, 2001).
2.3.3.1.2. CARACTERIZACIN DEL PELIGRO
El propsito de esta etapa es proporcionar una descripcin cualitativa o

cuantitativa de la gravedad y duracin de los efectos adversos que pueden resultar
16
de la ingestin de un microorganismo o sus toxinas con los alimentos. Deber

efectuarse una evaluacin de la dosis-respuesta, cuando es posible disponer de
datos necesarios (Teunis et al., 1996).
Existen varios factores importantes que deben tomarse en cuenta en la

caracterizacin del peligro. stos se relacionan tanto con el microorganismo como
con el husped humano. En relacin con el primero revisten importancia los
siguientes aspectos: 1) los microorganismos son capaces de multiplicarse; 2) la
virulencia puede cambiar en funcin de su interaccin con el husped y el medio
ambiente; 3) el material gentico se puede transferir de un microorganismo a otro,
lo que conlleva la transferencia de caractersticas como la resistencia a los
antibiticos y factores de virulencia; 4) los sntomas clnicos pueden presentarse
bastante tiempo despus de la exposicin; 5) los microorganismos puede perdurar
en determinados individuos, causando una excrecin continua del microorganismo
mismo y un constante riesgo de difusin de la infeccin; 6) en algunos casos,
dosis bajas de ciertos microorganismos pueden provocar un efecto grave; y 7) los
atributos de un alimento pueden modificar la patogenicidad microbiana, por
ejemplo en caso de alto contenido de grasa de un vehculo alimentario.
En relacin con el husped pueden revestir importancia los siguientes

factores: genticos; caractersticas individuales de susceptibilidad del husped
como
edad,
embarazo,
nutricin,
salud
medicamentos
administrados,
infecciones simultneas, estado de inmunidad e historial de exposicin previa

(Coleman y Marks, 1998).
2.3.3.1.3. EVALUACIN DE LA EXPOSICIN
La evaluacin de la exposicin se refiere a la estimacin de la probabilidad

de enfermar tras el consumo del alimento, y el nmero probable, o la dosis del
agente patgeno al que los consumidores pueden estar expuestos al ingerir ese
17
alimento. En una evaluacin cuantitativa, la mayor parte del modelado y

simulacin de estudio se encuentra en esta etapa (ICMSF, 1996).
Durante esta etapa se debe estimar la prevalencia y el alcance de la

contaminacin microbiana en el alimento al momento de su consumo, la
probabilidad de que un individuo consuma el alimento en cierto periodo de tiempo,
el sitio implicado (casa, restaurantes, comedores industriales, etc.) y la cantidad de
alimento consumido.
Entre los factores que deben tomarse en cuenta para la evaluacin de la

exposicin figuran la frecuencia de la contaminacin de los alimentos por el agente
patgeno, y el nivel de ste en dichos alimentos a lo largo del tiempo (Cuadro 2.2).
Influyente tambin son las caractersticas del agente patgeno, la ecologa
microbiana del alimento y la contaminacin inicial de la materia prima
(Lammerding y Fazil, 2001).
18
Cuadro 2.2 Factores necesarios para la evaluacin de la exposicin.
Qu
concentracin
microorganismos
ingiere
de
el
Fuentes
de
contaminacin:
frecuencia y concentracin, y
consumidor?
estimacin de la probabilidad de
concentracin
Que tan frecuente y en qu cantidad
que
ser
consumida.
ingiere el individuo el alimento?
Distribucin,
desarrollo,
inhibicin o inactivacin desde la

contaminacin primaria, a travs
del
proceso,
manipulacin
durante el comercio, prcticas de

preparacin.
Estudios
de
comportamiento,
modelos predictivos
Datos de fabricacin del alimento
Datos de vigilancia del alimento
Composicin del alimento- pH,

Aw,
contenido
presencia
de
nutricional,
sustancias
antimicrobianas,
microflora
competitiva
Poblacin demogrfica
Patrones de consumo
Fuente: Lammerding et al., 2001
Todas las posibles fuentes de contaminacin con microorganismos

patgenos en los productos alimenticios deben ser evaluadas. Debido a que no es
posible medir con precisin la poblacin de los patgenos presentes en un
alimento al momento de su consumo, se deben desarrollar modelos o hiptesis
19
para estimar la exposicin probable. En el caso de las bacterias, el crecimiento y

la muerte del organismo en los alimentos deben tomarse en cuenta, en virtud de
poder predecir las prcticas de manipulacin y preparacin, tales como
temperatura, tiempo, la composicin qumica del alimento, as como la
competencia de la microflora que pudieran afectar al crecimiento y las tasas de
mortalidad de los agentes patgenos (ICMSF, 1998).
Los modelos de prediccin microbiana son cada vez ms sofisticados, y

proporcionan herramientas valiosas para la obtencin de
estimaciones de
probabilidad de exposicin.
Un modelo completo del campo a la mesa proporciona la mayor parte de la

informacin relativa a la inocuidad de los alimentos en la gestin de riesgos
(Figura 6). Este tipo de evaluacin permite el anlisis de una amplia gama de
opciones de gestin de riesgos que podran aplicarse en una o varias etapas que
pudieran contribuir a el resultado de un riesgo inaceptable. Algunos ejemplos
recientes de este enfoque son cuantitativos para la evaluacin de los riesgos tales
como Escherichia coli O157:H7 en carne para hamburguesas, Salmonella
Enteritidis en huevo fresco (Baker et al., 1998) y huevo pasteurizado (Whiting y
Buchanan, 1997) y Listeria monocytogenes en quesos suaves hechos con leche
cruda (Bemrah et al., 1998).
Prevalencia
PC
PP
PROCESO
CAMPO
CC
PC
HOGAR
COMERCIALIZACIN
CC
CP
Probabilidad
de exposicin
RIESGO
Probabilidad
de infeccin
Concentracin
Figura 2.6. Evaluacin de la exposicin del campo a la mesa (CMMEF, 2001)
20
Sin embargo, la realizacin de una evaluacin desde el campo a la mesa es

compleja y requiere gran densidad de informacin; en general, exige importantes
aportaciones de expertos en diversas reas de investigacin. Por lo tanto, podra
ser conveniente concentrarse en slo una parte de la cadena alimentaria, con el
propsito de intentar entender y reducir el riesgo de exposicin en ese punto de la
cadena.
2.3.3.1.4. CARACTERIZACIN DEL RIESGO
sta es la etapa concluyente en la evaluacin de riesgos. La caracterizacin

del riesgo representa la integracin de los resultados de etapas previas
(identificacin del peligro, la caracterizacin del peligro y la evaluacin de la
exposicin) a fin de obtener una estimacin del riesgo. Proporciona una
estimacin cualitativa y cuantitativa de la probabilidad y gravedad de los efectos
adversos que podran presentarse en una poblacin dada, incluida la descripcin
de las incertidumbres asociadas con estas estimaciones. Tales estimaciones
pueden evaluarse por comparacin con datos epidemiolgicos independientes que
establecen una relacin entre los peligros y la prevalencia de la enfermedad
(PCCRARM, 1997).
La caracterizacin del riesgo rene toda la informacin cualitativa o

cuantitativa de las etapas anteriores a fin de proporcionar una estimacin de
riesgos con base slida para una poblacin dada. Dentro de esta etapa, se debe
de responder al menos a las siguientes cuestiones:
Cul es la naturaleza y magnitud del riesgo?

Cul es la incertidumbre acerca de la naturaleza del riesgo?
Qu individuos o grupos de poblacin estn en situacin de riesgo?
Qu tan graves son los efectos adversos en la exposicin al peligro?
Cules son las evidencias y que tan slidas son?
21
La caracterizacin del riesgo depende de los datos y opiniones de expertos.

Es posible que el peso de la evidencia obtenida integrando los datos cualitativos y
cuantitativos slo permita efectuar una estimacin cualitativa de los riesgos
(Lammerding et al., 2001).
2.4. TCNICAS DE DETECCIN DE Salmonella EN LOS ALIMENTOS

2.4.1. DETECCIN POR CULTIVO
El anlisis de los alimentos para Salmonella requiere de mtodos distintos a

los utilizados en los laboratorios clnicos. Generalmente los microorganismos se
encuentran en nmeros bajos en los alimentos, lo que exige el anlisis de una
cantidad ms grande de muestra en comparacin con las que se utilizan con
materiales clnicos.
Emplear una cantidad grande de alimento directamente en un medio de

cultivo selectivo, tiende a reducir su selectividad. Aunado a esto, los
microorganismos generalmente se encuentran en una condicin fisiolgica de
estrs en los alimentos. Estos dos problemas son eliminados por un
preenriquecimiento de la muestra en un medio no selectivo que permite la
reanimacin de microorganismos en condicin de estrs (Wallace et al., 2001).
Las caractersticas de los patgenos en alimentos, como son su

generalmente baja concentracin e incidencia, distribucin heterognea y
condicin de estrs, requieren de un procedimiento prolongado (tres a siete das)
para la deteccin del patgeno. El procesar un gran nmero de muestras el
aislamiento de Salmonella puede resultar arduo, y consumir mucho tiempo,
equipo, material y medios de cultivo.
La
(Holt
identificacin
de
Salmonella
segn
el
Manual
de
Bergey
et al., 1994) sigue criterios feno y genotpicos sobre un cultivo axnico
aislado en diferentes materiales. Esta definicin contina siendo el estndar de oro

22
y se ha expresado en procedimientos de identificacin validados para una

diversidad de materiales ambientales y especimenes clnicos.
En los alimentos, los mtodos de cultivo para la deteccin de bacterias

patgenas e ndice se apoyan en forma casi exclusiva en los mtodos de cultivo
de la AOAC y el Bacteriological Analytical Manual (BAM) (Andrews y Hammack,
1998; AOAC, 1984). El anlisis es una prueba cualitativa y determina la presencia
o ausencia de Salmonella en una muestra dada. Sin embargo, mediante el anlisis
de muestras idnticas en una serie de diluciones, es posible obtener una
estimacin cuantitativa, es decir, un nmero ms probable (Wallace et al., 2001).
2.4.1.2. DETECCIN POR PCR
Desde su desarrollo en 1983, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa

(PCR, por sus siglas en ingles), ha llegado a ser una herramienta esencial en
biologa molecular, y su empleo va en ascenso en la microbiologa de alimentos
(Entis et al., 2001).
La introduccin de la PCR en el diagnstico microbiano se ha establecido

en los laboratorios de investigacin como una valiosa alternativa a los mtodos
tradicionales. Importantes ventajas de esta tcnica son la rapidez, selectividad,
especificidad y sensibilidad (Malorny et al., 2003).
La PCR es una tcnica que permite la amplificacin in vitro de una

secuencia especfica de ADN usando un par de oligonucletidos (para iniciar la
replicacin) que hibridiza los extremos opuestos de ambas cadenas del ADN
blanco y delimita la seccin del ADN que ser repetidamente copiada.
Comnmente, se selecciona como blanco un gen de secuencia exclusiva a la
especie microbiana de inters, y con frecuencia es un gen de virulencia. Despus
del PCR, el producto de amplificacin (que es de tamao definido y contiene la
secuencia de los iniciadores en sus extremos) puede ser detectado de varias
23
formas, siendo la ms comn, la electroforesis. La PCR puede amplificar

especficamente la secuencia del ADN blanco en una mezcla de ADN de clulas
asociadas al material analizado (Fratamico, 2001).
2.5 MICROBIOLOGA PREDICTIVA
La microbiologa predictiva inici como una ciencia puramente emprica,

cuyos fundadores son probablemente Esty y Meyer. En 1922 describieron la
muerte trmica de Clostridium botulinum con un modelo logartmico lineal, el cual
se emplea para calcular el tratamiento que debe aplicarse en el procesamiento de
productos crnicos de baja acidez. Este modelo simplemente indica que a una
temperatura determinada la velocidad relativa de muerte de las bacterias es
constante con el tiempo (Baranyi y Roberts, 1994).
El conocimiento de la presencia de agentes patgenos en los alimentos es

el punto de partida para calcular los niveles y probabilidad de exposicin de los
potenciales consumidores. Sin embargo, para evaluar el riesgo de enfermedad es
esencial conocer la cantidad actual del patgeno en el alimento al tiempo de ser
consumido. Este problema se intenta resolver a travs de la microbiologa
predictiva (Buchanan y Whiting, 1996).
La microbiologa predictiva es una disciplina cientfica basada en la premisa

de que el crecimiento, sobrevivencia e inactivacin de los microorganismos puede
ser cuantificado y expresado con ecuaciones matemticas, y que bajo un conjunto
de condiciones ambientales especificas el comportamiento microbiano es
reproducible (Ross y McMeekin, 1994).
2.5.1 MODELO DE BARANYI
El modelo de Baranyi ha sido subsecuentemente citado en ms de 300

artculos, y ha llegado a ser el modelo de crecimiento primario ms ampliamente
24
utilizado (Baranyi y Roberts, 2004). Aunque es til para ajustar varias curvas
(semi-sigmoideas, fase lineal precedida o seguida por fases estacionarias) el
principal paso en el modelo fue su origen dinmico. Principalmente describe las
fases de transicin, tanto para la situacin de crecimiento como para la de muerte
(Baranyi y Pin, 2001), de manera que puede ser tambin utilizado para un
ambiente fluctuante. El modelo se expresa de la siguiente manera:
Donde: x es el nmero de clulas al tiempo t, xmax es la mxima densidad

de poblacin,
q(t) representa la concentracin del substrato limitante, la cual
cambia con el tiempo. El valor inicial q(0) es una medida del estado fisiolgico
inicial de las clulas. El parmetro m representa la curvatura antes de la fase
estacionaria.
El modelo se expresa mediante una funcin que ajusta el estado fisiolgico

de las clulas y la modelacin de las fases de crecimiento microbiano de una
forma ms contina; adems permite predecir el crecimiento bajo fluctuaciones de
temperatura (Baranyi y Roberts, 1994). Elfwing et al., (2004) validaron de manera
experimental la fase lag descrita matemticamente en el Modelo de Baranyi, para
lo cual emplearon una cmara de flujo y un analizador automtico de imgenes
para posibilitar la observacin de divisiones de miles de clulas individuales y
derivar distribuciones estadsticas de ellas.
25
III. OBJETIVOS
GENERAL
Determinar la incidencia y comportamiento de Salmonella en lechuga como

herramienta para estimar el riesgo de enfermar del consumidor.
ESPECFICOS
1.- Determinar la incidencia y concentracin de Salmonella y E. coli en lechugas

colectadas de sitios de comercializacin.
2.- Determinar el comportamiento de Salmonella en lechuga a travs de un

modelo de contaminacin cruzada.
.3.- Determinar la frecuencia y cantidad de lechuga consumida en diferentes

grupos de poblacin a fin de conocer la exposicin a Salmonella.
26
IV. MATERIALES Y MTODOS

4.1 Materiales
4.1.1 Equipo
Autoclave elctrica de mesa, 121 C (Market-Forge, Sterilimatic)
Balanza analtica digital, 120g x 0.0001g (Sartorius)
Balanza granataria, sensibilidad 0.1 g, Modelo No. CT200-S (OHAUS)
Bao Mara de precisin de 43 0.2 C, Modelo 251 (Precision Scientific)
Bao Mara de precisin de 44.5 0.2 C Modelo 251 (Precisin Scientific)
Bolsas de polietileno en rollo sin marca comercial diferentes tamaos
Bolsas de polietileno capacidad 500 ml (Whirl - Pack)
Campana de flujo laminar (Alder y Veco)
Centrifuga de mesa (Hermle)
Cuenta colonias (Qubec Reichert-Jung)
Higrmetro de bulbo seco y hmedo (cole parmer instrument company)
Homogenizador (Stomacher, Seward 400)
Horno para esterilizacin (Shel-lab)
Incubadora de 35 (Pecision Scientific, Seward 400)
Incubadora de 22 (Pecision Scientific, Seward 400)
Lmpara de luz U.V. Modelo 56 (Blas-Ray)
Micropipetas 5-1000 l (Labsystems)
Microscopio. ZEISS. Axiostar plus
Potencimetro, modelo 410 (Orion)
Vortex, modelo G650 Scientific Industries Inc (Daiger Vortex Genie 2)
4.1.2 Medios de cultivo

Agar sulfito bismuto (ASB), (Bioxon)
Agar xilosa lisina desoxicolato de sodio (XLD), (Bioxon)
Agar soya tripticasa (AST), (Bioxon)
Agar soya trpticasa suplementado con rifampicina (100 mg/L) (ASTR)
Agar hierro y triple azcar (TSI), (Bioxon)
Agar hierro lisina (LIA), (Bioxon)
27
Caldo lactosado (CL), (Bioxon)

Caldo lauril sulfato mas MUG (CLF), (Bioxon)
Caldo selenito cistina (CSC), (Bioxon)
Caldo tetrationato (CTT), (Bioxon)
Caldo Rappaport Vassiliadis (CRV), (Bioxon)
4.1.3 Soluciones
Diluyente de peptona 0.1% (Peptona de casena, Bioxon) (DP)
Solucin salina isotnica 0.85% (cloruro de sodio, Productos Qumicos Monterrey)
4.1.4 Reactivos
Antisuero polivalente A-I & Vi para Salmonella (DIFCO)
4.2 Material biolgico

Cepas. Se utilizaron tres serovares de Salmonella enterica: S. Agona, S.
Gaminara y S. Montevideo obtenidas de la American Type Culture Collection. Se
obtuvieron mutantes resistentes a rifampicina de los tres serovares siguiendo el
mtodo descrito por Kaspar y Tamplin (1993). Los cultivos se mantuvieron en
tubos con agar base sangre a 4 C con transferencias mensuales.
Lechuga. Se obtuvo lechuga romana (Lactuca sativa C) de mercados pblicos y
central de abastos de la ciudad de Quertaro.
4.3 Sitios de muestreo.

Las lechugas se colectaron de la central de abastos y dos mercados
pblicos de la ciudad de Quertaro. Las hortalizas fueron colocadas en bolsas de
plstico libres de microorganismos de inters sanitario y transportadas al
laboratorio a temperatura ambiente.
28
4.4 Validacin de la tcnica de cultivo para la determinacin de Salmonella

Para el aislamiento de Salmonella se sigui la tcnica especificada en el
CMMEF (Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods)
(Andrews et al, 2001). La muestra preenriquecida se utiliz para las dos pruebas
cualitativas (cultivo y PCR), por lo que fue necesario evaluar el caldo de
preenrequecimiento para determinar el desarrollo de Salmonella a niveles
detectables con la tcnica de PCR.
El enriquecimiento selectivo se realiz transfiriendo 1 ml de la muestra
preenriquecida a caldo tetrationato y caldo Rappaport-Vassiliadis incubados a
43C por 18 a 20 h en un bao de agua de precisin. Para el aislamiento del
patgeno se estri una asada de cada caldo en dos medios selectivos y
diferenciales: agar xilosa lisina desoxicolato y agar sulfito bismuto.
De cada placa se seleccionaron al menos dos colonias sospechosas de
Salmonella, a las cuales se les realizaron pruebas bioqumicas para su
identificacin: fermentacin de lactosa y glucosa, descarboxilacin de lisina,
produccin de acido sulfhdrico y gas. Las cepas aisladas se confirmaron con
antisuero polivalente especfico para Salmonella.

4.4.1.1 Preparacin del inculo
La activacin de las cepas se realiz transfiriendo una asada de cada una
de las cepas a caldo soya tripticasa suplementado con rifampicina (100 ppm) y se
incubaron a 35C por 24 h. se realizaron dos transferencias sucesivas cada 24 h y
a las 18-20 h de incubacin del ultimo cultivo, las clulas se cosecharon por
centrifugacin a 3500 X g/ 15 min. Los paquetes celulares se lavaron dos veces
con solucin salina isotnica, resuspendindose despus en esta misma solucin.
Se mezclaron volmenes iguales de cada cepa y se prepararon diluciones
decimales en DP para obtener el nivel de inoculo deseado. El recuento de la
suspensin celular se realizo en AST suplementado con rifampicina (100 ppm)
mediante la tcnica de vaciado en placa. Las placas se incubaron a 35C por 24 h.
29
4.4.1.2 Determinacin del desarrollo de Salmonella en lechuga con 3 caldos

de preenrequecimiento
Se inocularon 10 UFC de Salmonella en porciones de 25 g de lechuga.
Posteriormente se preenriquecieron con 225 ml de cada uno de los caldos: caldo
lactosado, caldo soya tripticasa y caldo infusin cerebro corazn. Se incubaron a
35C por 24 h y peridicamente se realizaron recuentos en ASTR mediante la
tcnica de vaciado en placa.
4.5 Validacin de PCR para determinacin de Salmonella

Se emplearon los iniciadores invA diseados por Liu y col. (2002). La
tcnica fue parcialmente validada en cultivo puro y en la lechuga.
El
procedimiento general de la tcnica consta de tres partes:

1.- Lisis celular. A partir de la muestra preenriquecida incubaba a 35C/20 h se
tomo 1 ml y se centrifug a 4,500 X g/15 min. El botn resultante fue resuspendido
en 1 ml de agua destilada estril y se coloco en un bao de agua a 100C por 20
min.
2.- PCR. La mezcla de reaccin (supermix) fue preparada en un microtubo
introducido en una cama de hielo para evitar la accin exonucleasa de la Taq
polimerasa, una vez finalizada se distribuyeron 19 l en microtubos y se agreg 1
l de la muestra lisada. La reaccin se llevo a cabo en un termociclador bajo las
siguientes condiciones: 93C/5 min; 30 ciclos de 93C/ 10 s, 42C/ 10 s y 72C/ 45
s; y una extensin final a 72C/ 10 min.
3.- Electroforesis. Los productos de la amplificacin fueron detectados por
electroforesis en gel de agarosa 1.5%, 90 V durante 90 min. El gel se revelo en
bromuro de etidio (10mg/ml) por 20 min. Se empleo un marcador de peso
molecular de 100 pb para determinar el peso molecular de los productos de la
amplificacin. La imagen del gel fue capturada con el sistema Kodak EDAS 290.
4.5.1 En cultivo puro

Se determino la especificidad de los iniciadores seleccionados con 5
serovares de Salmonella entrica y 14 cepas de especies distintas de Salmonella
30
en cultivo fresco de CST (35C/24 h). El limite de deteccin se determino

realizando diluciones decimales de la suspensin de ADN obtenida de la lisis
celular de un cultivo de S. Gaminara Rif+.
4.5.2 En lechuga
4.5.2.1 Determinacin del lmite de deteccin
Se inocularon porciones de 25 g de lechuga con tres niveles de inoculo: 5,
10 y 20 UFC de Salmonella. Las unidades experimentales fueron preenriquecidas
con 225 ml de CST a 35C/20 h. Paralelamente se realiz la determinacin por
PCR y recuento de la poblacin final en ASTR (35C/24 h)
4.6 Comparacin del cultivo y PCR para la determinacin de Salmonella

Veinte muestras de lechuga fueron inoculadas con Salmonella Rif+ y
analizadas mediante las tcnicas de cultivo y PCR. Se determino la especificidad,
sensibilidad y el ndice Kappa del PCR (Malorny y col., 2003). Este mismo
procedimiento fue llevado a cabo en 300 lechugas colectadas de los diferentes
sitios de comercializacin y sin inocular.
4.7 Determinacin del NMP de Salmonella en lechuga

Se cuantifico Salmonella en muestras de lechuga positivas a PCR. La
combinacin de volumen a preenriquecer fue de 20, 20, 20, 10, 1, 1, 1, 1, 0.1 y
0.01 en tubos de caldo lactosado, que permiti una sensibilidad de 0.06 a 65
NMP/g. De cada tubo se sigui el procedimiento descrito en 3.3
4.8 Determinacin de E. coli

Las lechugas muestreadas fueron examinadas para la cuantificacin de E.
coli mediante el procedimiento descrito por Kornacki y Jonson (2001). Se empleo
la tcnica de nmero ms probable (NMP) y los valores fueron calculados
empleando la aproximacin de Thomas (Swanson y col., 2001): alcuotas de 20,
10 y 1ml, as como diluciones decimales de las muestras, fueron inoculados en
tubos con CL con campana de Dirham e incubados a 35C/24 h.
31
A partir de tubos con produccin de gas fueron transferidas alcuotas de 40

l a tubos con caldo lactosado fluorocult (CL-MUG, BD Difco) e incubados a
44.5C/48h en bao de agua de precisin. Los tubos que mostraron produccin de
gas, reaccin positiva de indol y fluorescencia bajo luz ultravioleta (para evidenciar
actividad de la enzima -glucoronidasa) fueron consideraras positivas a E. coli.
4.9 Modelo de contaminacin cruzada

4.9.1 Preliminares
4.9.1.1 Inoculacin de la tabla de madera
El vehculo para inocular la tabla fue jugo de carne. ste se preparo con
50g de carne de cerdo cruda y 100 ml de DP. Se homogeniz por 2 min en
Stomacher y se filtr con gasa. La tabla fue inoculada con un nivel de inculo de 5
Log UFC/ml de Salmonella Rif+ sumergiendo una torunda en la suspensin de
jugo de carne. La torunda se desliz horizontalmente en la superficie de la tabla
hasta cubrir el rea de contaminacin. Inmediatamente despus de contaminar la
tabla se realiz el recuento de UFC de Salmonella en 5 reas de 3 x 3 cm2
mediante frotacin con una torunda en ASTR.
4.9.1.2 Influencia del nivel de inculo en la recuperacin de Salmonella a

partir de la tabla de madera
Se inocularon tablas de madera de la manera descrita previamente con tres
niveles de Salmonella: 3.5, 4.5 y 5.5 Log UFC/ml. Para determinar el nmero de
UFC de Salmonella recuperadas se frot mediante una torunda 3 reas de 3 x 3
cm2. El recuento se realiz en ASTR.
4.9.1.3 Determinacin de la variabilidad de contaminacin de la lechuga por

medio de la tabla.
Se inocularon dos tablas de madera con el nivel de inculo que presento
mayor recuperacin de UFC de Salmonella. En cada una de las tablas se
colocaron 100 g de lechuga y se mezclaron de tal manera que la mayor parte de la
lechuga estuviera en contacto con la superficie de la tabla. Este paso se repiti
32
hasta completar 400 g. Finalmente las dos porciones de 400g se mezclaron en un

recipiente y se tomaron 10 porciones de 10g y 10 porciones de 1g para su
recuento en ASTR.
4.9.2 Dinmica de Salmonella en lechuga

Se tomaron porciones de 10g de lechuga contaminada como se indic
anteriormente. Se almacenaron a distintas temperaturas (30, 22 y 4 C) y en dos
diferentes condiciones: sumergida y no sumergida en agua. Peridicamente se
realizaron recuentos en ASTR.

Se realizaron 600 entrevistas a diferentes grupos de poblacin para conocer
con qu frecuencia y qu cantidad de lechuga consumen.
4.11 Anlisis estadsticos

Se efectu un anlisis de varianza para los valores de velocidad de
desarrollo () resultantes de las diferentes combinaciones de almacenamiento. La
significancia de la diferencia entre las medias de los tratamientos se determino
mediante la prueba de Tukey (Montgomery, 1991) usando el programa JMP 5.1
33
Encuesta sobre el consumo de lechuga

1.- Con que frecuencia consume lechuga?
a) nunca
b)1 a 2 veces a la semana
c) 2 a 3 veces a la semana
d) 1 vez al mes
2.- Donde consume la lechuga?
a) hogar
b) fuera del hogar
c) ambos
3.- Cual es el tamao aproximado de porcin consumida?
a) menos de 10g
b) de 10 a 25 g
c) mas de 25 g
4.- Lava o lava/desinfecta la lechuga?

a) lavar
b) lavar y desinfectar
c) ninguno
5.- Cuantas veces al ao padece usted de diarrea?
a) ninguna
b) 1 a 2 veces
c) 3 a 6 veces
d) mas de 6 veces
6.- Grupo de poblacin en la que se encuentra:
a) menor de 6 aos
b) 6 a 12 aos
c) 13 a 24 aos
d) 25 a 64 aos
e) mayor de 64 aos
Figura 4.1 Formato de la encuesta sobre el consumo de lechuga
34
V. RESULTADOS Y DISCUSIN
5.1 Sitios de muestreo
La lechuga fue monitoreada en mercados pblicos y en la central de abastos de
la ciudad de Quertaro. Se realizaron 20 muestreos a lo largo del ao, cubriendo de
esta manera dos pocas del ao (fra y clida). Las muestras se colectaron en la
central de abastos de camiones, de establecimientos cerrados e incluso del suelo sobre
pliegos de plstico. En todos los casos, esta hortaliza presentaba suciedad visible, y
ocasionalmente insectos. En los mercados pblicos, la lechuga fue adquirida en
establecimientos en donde el producto es manipulado por los comerciantes que
remueven las hojas externas no comestibles, y en la mayora de los casos el tallo.
Ocasionalmente las lechugas eran muy pequeas por remocin excesiva de las hojas
externas.
5.2 Validacin de la tcnica de cultivo para la determinacin de Salmonella
Existen varias razones por las cuales es necesario el preenrequecimiento
en la investigacin de patgenos en los alimentos. Una de ellas es restaurar a las
clulas estresadas y otra es permitir el desarrollo de estos microorganismos a
niveles detectables a partir de nmeros iniciales muy bajos.
El Bacteriologycal Analytical Manual (1995) y el Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods (2001) recomiendan el caldo
lactosado (CL) para el preenrequecimiento (PE) de Salmonella en frutas y
hortalizas. Sin embargo, como se indic en la metodologa, en este trabajo el PE
se empleo para la deteccin del patgeno por el mtodo de cultivo tradicional y por
medio del PCR. Por lo tanto se efectu el estudio de la cintica de crecimiento de
Salmonella en lechuga con tres caldos de PE (BHI, CST y CL), para seleccionar
el que permitiera el desarrollo del patgeno en el menor tiempo, facilitando as la
aplicacin de la tcnica de PCR. Con los caldos BHI y CST la mxima poblacin
alcanzada despus de 24 horas de incubacin fue de 7.7 y 7.6 Log UFC/ml,
respectivamente (Figura 5.1). Con el CL el mximo nivel alcanzado fue de 5.9 Log
UFC/ml. Sin embargo, cuando los estudios se llevaron a cabo en cultivo puro
35
(Figura 5.2), no se encontr diferencia significativa (P > 0.05) en el desarrollo del

patgeno con los tres medios de cultivo.
10
9
8
Log UFC/g
7
6
CST
BHI
CL
3
2
1
0
0
10
15
20
25
30
Tiem po (h)
Figura 5.1 Cintica de Salmonella en lechuga con tres caldos de

preenrequecimiento
10
9
8
Log UFC/g
7
6
CST
BHI
CL
3
2
1
0
0
10
15
20
25
30
Tiem po (h)
Figura 5.2 Cintica de Salmonella en cultivo puro con tres caldos de

preenrequecimiento
36
5.3 Validacin de PCR para la deteccin de Salmonella en cultivo puro

5.3.1 Especificidad y sensibilidad de los iniciadores para la deteccin de
Salmonella (invA)
Para la validacin de la tcnica de PCR en cultivo puro se determin la
especificidad de los iniciadores de Salmonella. Se emplearon cultivos puros de
S. Agona, S. Gaminara, S. Typhimurium, S. Montevideo, S. Thompson y 14 cepas
de otras 11 especies. Todas las cepas de Salmonella presentaron una banda
cercana a 400 pb (Figura 5.3, carril 16 al 20). En el caso de las cepas de gneros
distintos a Salmonella no hubo ninguna amplificacin con los iniciadores
empleados (Figura 5.3, carril 2 al 15). La identificacin de Salmonella en la
lechuga (siguiendo el protocolo de PCR) requiere de preenriquecimiento de la
muestra; esto implica que
el microorganismo de inters (en casos positivos)
encuentre oportunidad para su desarrollo. Si los iniciadores no son los adecuados

pueden generarse amplificaciones inespecficas.
1 2 3
4 5
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 5.3 Especificidad de los iniciadores invA para detectar Salmonella en cultivo
puro.
Adicionalmente, la sensibilidad de la tcnica de PCR se determin

utilizando diluciones para obtener desde 9 hasta 3 log UFC/ml del ADN de
37
Salmonella Gaminara Rif +. De esta manera la tcnica puede detectar Salmonella

desde 4 log UFC/ml, tal como se observa en la Figura 5.4.
103 104 105 106 107 108
109
Figura 5.4 Sensibilidad de tcnica de PCR para la deteccin de Salmonella en

cultivo puro.
5.3.2 Validacin de la tcnica de PCR para la deteccin de Salmonella en

lechuga
Siguiendo la tcnica descrita en la metodologa se efectu su verificacin
inoculando tres niveles (5, 10 y 15 UFC/25 g) de Salmonella en 225 ml de CST. El
producto de amplificacin de PCR se present con los tres niveles de inculo y la
mxima poblacin alcanzada en los tres casos fue de 6 log UFC/ ml (Figura 5.5).
38
15
6
10
6
5
6
UFC/25 g
log UFC/ ml
Figura 5.5 Sensibilidad de iniciadores invA en lechuga.
Se determin el tiempo mnimo para que el cultivo alcance 6 log/ ml

requeridos en la deteccin del patgeno por la tcnica de PCR y de esta manera,
optimizar el tiempo del preenrequecimiento. Los resultados muestran que
Salmonella alcanza esta poblacin a las 20 horas de incubacin (Figura 5.6).
10
9
8
Log UFC/ml
7
6
Salmonella
BMAs
4
3
2
1
0
0
10
15
20
25
30
Tiem po (h)
Figura 5.6 Cintica de Salmonella y BMAs en CST a 35 C.
39
5.4 Incidencia de Salmonella y E. coli en lechuga

Diversos estudios se han reportado con el fin de conocer la incidencia de
patgenos en las frutas y hortalizas (Satchell et al.,1990; Houang et al.,1991;
Castillo et al., 2004; Johnston et al., 2005). Todos ellos coinciden en el bajo
porcentaje detectado. Pese a estos resultados, las frutas y hortalizas en las
ltimas dcadas, son los alimentos que ms enfermedades causan en E.E.U.U.,
colocndose por arriba del pollo, res y mariscos, tal como mostr el estudio de la
CSPI (2007). De ah el inters por conocer la incidencia de Salmonella en lechuga,
una hortaliza de uso comn en la comida mexicana, siendo Quertaro un estado
importante como productor lechuga en nuestro pas.
Se analiz un total de 647 muestras, 421 adquiridas de la Central de

Abastos y el resto en dos mercados pblicos. Salmonella se encontr en solo
0.6 % de las muestras, todas provenientes de la central de abastos (Tabla 5.1). La
baja incidencia sugiere que las condiciones y lineamientos para su cultivo,
cosecha y transporte de esta hortaliza son aceptables. Debe aclararse que la
porcin de lechuga analizada (50 g), fue retirada de la parte externa, es decir, de
las hojas que se encuentran expuestas a una mayor contaminacin. Un estudio
similar en hojas extradas en diferentes niveles de la lechuga ya ha sido realizado
previamente en nuestro laboratorio. Se demostr entonces, que la poblacin de
BMA del nivel superior es estadsticamente diferente al nivel ms interno de la
lechuga, disminuyendo de 6 hasta 4 log UFC/g (Ruiz, 2007). En nuestro caso, el
analizar las hojas externas representara el escenario del peor de los casos.
Dentro del mismo estudio de Ruiz (2007), el patgeno no se detect en 37
muestras de lechuga colectadas en el campo.
40
Tabla 5.1 Positividad de Salmonella en lechuga de tres sitios de comercializacin

Sitio
N*
n*
Central de
Abastos
421
0.9
Mercado 1
126
Mercado 2
100
647
0.6
Total
*N= muestras analizadas; *n= muestras positivas
Por otra parte, la presencia de E. coli se detect en 14.9% de 368 muestras

(Tabla 5.2). Los mayores porcentajes de positividad se obtuvieron en unidades
colectadas de mercados pblicos. Es posible que las hortalizas en este punto del
comercio se encontraran mas expuestas a la contaminacin. A diferencia de la
central de abastos, en estos lugares las lechugas eran despojadas de las primeras
hojas, es decir, aquellas que presentaban tierra visible y que generalmente no son
consumidas. As el comerciante estara transfiriendo la contaminacin de esas
hojas externas a las que visiblemente se encuentran limpias; y que finalmente
fueron las utilizadas para el anlisis tanto de E. coli como de Salmonella.
Tabla 5.2 Positividad de E. coli en lechuga de tres sitios de comercializacin

Sitio
N*
n*
Central de
Abastos
264
38
1.4
Mercado 1
65
10
1.5
Mercado 2
39
18
Total
368
55
N= Muestras analizadas; n= muestras positivas
41
14.9
La cuantificacin de coliformes, Enterobacteriaceae, y E. coli en los

alimentos pretende conocer acerca de los antecedentes de las condiciones
higinicas prevalentes durante la elaboracin de los alimentos (Kornacki y
Johnson, 2001).
E. coli es considerado como el indicador ms confiable de
contaminacin fecal en los alimentos (Cox et al., 1988).
Se puede inferir entonces que la presencia de E. coli en estas muestras de

lechuga resulta de una deficiente condicin en la higiene de los establecimientos,
incluido el mal manejo del personal. No se descarta en tales condiciones la
contaminacin por materia fecal. Hay que destacar que la lechuga en estos puntos
de venta (central de abastos y mercados pblicos), no dispone de alguna barrera
de proteccin, a diferencia de lo que ocurre en los supermercados, donde con
frecuencia se exhiben envueltas individualmente en bolsas de plstico.
En general, la incidencia de E. coli en este estudio fue baja para la central

de abastos y el mercado pblico 1 (1.4 y 1.5 %, respectivamente). Estos
resultados son prximos a los reportados en Espaa donde se encontr E. coli en
el 3.4 % de muestras de lechuga (Abadias, et al., 2007).
5.5 Contenido de Salmonella y E. coli en lechuga

Conocer el nmero de clulas de patgenos en los alimentos, sobre todo en
aquellos que se consumen crudos, resulta relevante en la estimacin del riesgo de
enfermar al tiempo del consumo.
A fin de poder estimar el nivel de exposicin a Salmonella asociada al

consumo de lechuga, se cuantific su concentracin en las muestras positivas
detectadas por PCR. La cuantificacin de un patgeno en un producto que se
espera discretamente contaminado, como es el caso de la lechuga requiere de
una tcnica de alta sensibilidad como es la de NMP. Tpicamente se inoculan
diluciones decrecientes de la muestra en tubos en los que individualmente deber
42
detectarse la presencia del patgeno o el germen de inters. A mayor abundancia

del microorganismo mayor es el nmero de tubos positivos inoculados con los
menores niveles de muestra. Alternativamente se recurre a una formula que ofrece
resultados muy prximos a la del NMP por dilucin en tubo. Para conseguir la
mayor confiabilidad en el resultado, en cualquier caso es fundamental seleccionar
el nmero de tubos inoculados o en el caso de la formula la cantidad de muestra
inoculada en los tubos seleccionados. Se trata de evitar que los resultados sean
indeterminados cuando todos los tubos resulten positivos o negativos. Utilizando el
procedimiento de la formula seleccionamos cantidades de muestra en los
diferentes tubos que condujeran a la deteccin de 0.06 o ms, hasta 66 o menos
salmonelas por gramo. Cuatro muestras resultaron positivas a Salmonella, de las
cuales tres mostrarn valores menores a 0.06 NMP/g y solo una (28 NMP/g) se
encontraba dentro de los lmites de deteccin que impusimos al seleccionar el
nmero de tubos inoculados (Tabla 5.3). De esta manera se obtiene una media de
7 salmonelas/g.
Contenido relativamente elevado si se considera que: 1) la
lechuga puede no recibir un tratamiento efectivo de desinfeccin, 2) que una

persona puede consumir ms de un gramo en una ocasin y 3) la dosis mnima
infectante llega a ser 10 clulas de Salmonella (DAoust et al., 1985).
Existen escasos estudios de cuantificacin de patgenos en frutas y

hortalizas. La mayora se enfoca a determinar su presencia o ausencia. Sin
embargo, con esa informacin es posible tan solo especular acerca del riesgo a la
salud que existe al consumir el alimento, es decir, que si una muestra resulta
positiva a Salmonella, esta puede ser positiva lo mismo con una clula que con
cien, y el riesgo de enfermar por supuesto ser mayor con la segunda cifra. En un
estudio realizado en E.E.U.U, se encontr que el nivel promedio de Salmonella en
un brote de salmonelosis fue de 1.3 NMP/ 100g en almendras (Danyluk et al.,
2006).
43
Tabla 5.3 Contenido de Salmonella en lechuga de tres sitios de comercializacin

Sitio
Central de
Abastos
421
Mercado 1
126
Mnimo
Mediana
Mximo
Mercado 2
100
0
N= muestras analizadas; n= muestras positivas
< 0.06
< 0.06
28
ND
ND
ND= no determinado
La tcnica que hemos utilizado para la deteccin de E. coli ofrece algunas

ventajas. A partir de la muestra preenriquecida en caldo lactosado, y
posteriormente en diluciones decimales sobre caldo florocult, es posible disponer
de informacin sobre
el contenido de clulas de E. coli (NMP/g o ml) en el
alimento, sin necesidad de aislar la bacteria. Los lmites de deteccin que

seleccionamos fueron de 0.2 a 70 NMP/g. Se observaron niveles discretos de E.
coli en los tres sitios de comercializacin estudiados con una mediana de 4 y
limites de 0.2 a 9 NMP/g. Solamente en el caso de la central de abastos se
obtuvo una poblacin elevada en una muestra de lechuga (62 NMP/g), lo cual
sugiere una contaminacin masiva puntual (Tabla 5.4).
En el estudio previo de Ruiz (2007), los valores de E. coli en 37 muestras

de lechuga durante su cultivo, se encontraron por debajo del limite de deteccin
(<3 NMP/g). En E.E.U.U., Valentn-Bon (2007) report que de 39 muestras de
lechuga, 9 resultaron positivas para E. coli con niveles de 3 a 9.2 NMP/g.
44
Tabla 5.4 Contenido de E. coli en lechuga de tres sitios de comercializacin

Sitio
Central de
Abastos
Mercado 1
Mercado 2
Medida
264
38
Mnimo
Mediana
Mximo
0.2
4
62
10
Mnimo
Mediana
Mximo
1
4
9
Mnimo
Mediana
Mximo
3
4
9
65
39
NMP/g
5.6 Asociacin entre la deteccin de Salmonella y E. coli

Idealmente, microorganismos ndice como E .coli, mostraran en el alimento
la eventualidad de la presencia concurrente de un patgeno intestinal como
Salmonella. Esta pretencin generalmente no existe, y es posible estar ante
muestras de alimento en los que se demuestra la presencia de E. coli y no de
Salmonella (Miskimin, et al., 1976; Silliker y Gabis, 1976; Solberg, et al., 1977); la
situacin contraria tambin es observable: deteccin de Salmonella en ausencia
de E. coli. En cualquier caso el empleo de E. coli sugiere, como no lo encontramos
en otros microorganismos ndice, la presencia de materia fecal en el material
analizado (Brodsky, 1995).
En nuestros estudio, el hallazgo de E. coli estuvo correlacionado en tres de

las cuatro muestras positivas a Salmonella (Tabla 5.5), de manera que, 86% de
los resultados fueron coherentes (considerando ambos negativos o ambos
positivos). No obstante, estas muestras no son representativas para afirmar que E.
coli es un adecuado indicador de Salmonella.
45
El problema central no consiste en detectar E. coli en ausencia de

Salmonella, lo cual constituye una situacin prctica nada extraa, sino el hallazgo
del patgeno en ausencia del indicador.
Tabla 5.5. Asociacin entre la deteccin de Salmonella y de E. coli en lechuga

Salmonella / E. coli
N*
368
+/+
3
+/1
-/+
52
-/312
% de frecuencia
0.8
0.3
14
85
* Nmero de muestras analizadas
5.7 Incidencia de Salmonella y E. coli en funcin de la poca del ao

El muestreo de la lechuga se llev a cabo entre octubre de 2007 y junio de
2008, lo cual nos permiti valorar la incidencia de estos microorganismos en dos
temporadas del ao. Los porcentajes de positividad para E. coli fueron de 1.4 y
25.3 para la temporada fra y clida, respectivamente, mientras que para
Salmonella fueron de 0 y 1.9 % (Figura 5.7). Entre los valores para cada
microorganismo se observa una diferencia significativa (p< 0.05), lo cual refleja
(como era de esperar) que el aumento de la temperatura ambiental influye
positivamente en la sobrevivencia de los microorganismos. Resultados similares
reportaron en diferentes grupos de hortalizas Ruiz
(1987).
46
(2007) y Garca-Villanova
Figura 5.7 Salmonella y E. coli en muestras de lechuga durante dos pocas del
ao.
47
5.8 Comportamiento de Salmonella en lechuga a travs de un modelo de

contaminacin cruzada
La
seguridad
alimentaria
sigue
siendo
una
preocupacin
de
los
consumidores y punto de atencin para la industria alimentaria y organismos

reguladores, segn el consejo internacional de informacin alimentaria (Brewer y
Rojas, 2007). Datos de numerosos estudios provenientes de diferentes ciudades
de E.E.U.U. muestran la presentacin de brotes que se originan en los hogares
(Knabel, 1995; Scott, 1996; Beumer et al., 1998; Mead et al., 1999). Una
manipulacin inapropiada de los alimentos en los hogares, deficientes practicas de
preparacin y consumo (FSAI, 1998; Bryan, 1988; Gorman et al., 2002), prcticas
de higiene inadecuadas, tales como el mal lavado de manos (Cogan et al., 2001),
uso de utensilios mal higienizados (Altekruse et al., 1995; Knabel, 1995; Beumer y
Giffel, 1999), consumo de comida cruda o insegura (CAST, 1994; Redmond y
Griffiths, 2003), as como contaminaciones cruzadas a travs de superficies
manipuladas con alimentos crudos (Roberts, 1982; Ryan et al., 1996), son algunos
factores y prcticas que han estado implicadas en brotes por alimentos
preparados en los hogares.
El conocimiento de la presencia de agentes patgenos en los alimentos es
el punto de partida para evaluar los niveles y probabilidad de exposicin de los
potenciales consumidores. Sin embargo, para evaluar el riesgo de enfermedad es
esencial conocer la cantidad actual del patgeno en el alimento al tiempo de ser
consumido. Por lo tanto, el propsito de este estudio consisti en reproducir una
prctica cotidiana que ocurre en las cocinas de hogares y restaurantes, que
permitir estimar el grado de exposicin a Salmonella entre los consumidores. El
escenario se inicia con la carne cruda de cerdo contaminada con Salmonella,
condicin que no es extraa en este tipo de carne. Se ha reportado una incidencia
de 3.3% en Irlanda (Prendergast et al., 2008), 4.9% en Italia (Busani et al., 2005),
9.6% en E.U. (Duffy et al., 2001), 1.7% en Taiwan (Kuang-Sheng et al., 2005),
93.3% en Brasil (Borowsky, et al., 2007), 73.3% en Alemania (Sinell, et al., 1990) y
91.8% en Mxico (Escartn, 1995). Ya en el sitio de preparacin del alimento la
48
carne es manipulada en una tabla de madera, se retira y se corta la lechuga en

esta misma tabla sin ningn tratamiento de lavado o desinfeccin previo. En
algunos casos, la lechuga se conserva sumergida en agua. As
permanece
durante toda la jornada del servicio de alimentos en una fonda o restaurantes.

Dentro de este mismo escenario, la lechuga puede almacenarse en refrigeracin
(en el mejor de los casos), o bien a temperatura ambiente. Se puede llegar al
abuso de temperatura si el recipiente que contiene la lechuga se encuentra cerca
de las parrillas o estufas. La evaluacin del peligro implicado
requiere de un
modelo en el que se siga el comportamiento de la Salmonella desde la carne

hasta la hortaliza.
5.8.1 Estudios preliminares

La primera etapa en este estudio consisti en definir una metodologa
confiable para determinar el comportamiento de Salmonella dentro este modelo.
Se evaluaron diversos factores a fin de lograr reproducir estos resultados en el
experimento definitivo. El primer factor a
evaluar se refiere a la forma de
inoculacin del patgeno a la tabla de madera. Se sumergi una torunda de gasa

en el jugo de carne inoculado con 5 Log UFC/ml de una mezcla de Salmonella
Rif+ (4.8.1.2) y se extendi horizontalmente hasta cubrir el rea de contaminacin
(15 x 20 cm2). Inmediatamente despus, se frotaron cinco cuadros de 3 x 3 cm2
por medio de torundas, las cuales se colocaron en 5 ml de DP para el recuento de
Salmonella. Este estudio se realiz por duplicado simultneamente.
En la Figura 5.8 se muestra la media en Log UFC/ml de Salmonella de los
cinco recuadros muestreados en cada una de las tablas. Se observ una ligera
diferencia en la recuperacin de la salmonela (3.4 y 3.2 log UFC/ 9 cm2) entre las
tablas, aunque no significativa (p<0.05). En consecuencia, la forma de inocular
descrita para la tabla qued establecida para los ensayos subsecuentes.
49
Log UFC/9cm
Tabla 1
5 log/ml
5 log/ml
Tabla 1
Tabla 2
Figura 5.8 Recuperacin de Salmonella en tablas de madera.

Se ha demostrado que la penetracin y capacidad de absorcin de un
material que se inocula con un microorganismo influye en los recuentos
bacterianos (Schnwlder et al., 2002). Las fibras de madera poseen propiedades
capilares, y la penetracin de un inculo lquido arrastra las clulas bacterianas al
interior de la estructura de madera, facilitando as la adhesin a la matriz de la
madera (Abrishami et al., 1994; Boucher et al., 1998) Diversos autores sugieren
que la absorcin de la suspensin del medio al momento de tener contacto con la
superficie conduce a la desecacin del ambiente celular, el cual juega un papel
importante en la reduccin de la viabilidad de las clulas, particularmente en las
superficies porosas (De Cesare et al., 2003; Kusumaningrum et al., 2003; Moore et
al., 2003). Por otra parte, se ha planteado que la presencia de sustancias
antimicrobianas de la madera afecta los niveles de la poblacin viable del
microorganismo (Ak et al., 1994; Schnwlder et al., 2002). As mismo, se ha
demostrado que mientras ms largo sea el tiempo de contacto con la superficie,
un nmero menor de microorganismos ser recuperado (Moore et al., 2007).
50
5.8.1.1 Efecto del nivel de inculo en la recuperacin de Salmonella en las

tablas de madera
Se consider de inters evaluar este factor, ya que constituye de hecho la
fuente nica de contaminacin de la Salmonella a la lechuga. Se utilizaron niveles
bajo, medio y alto (3.5, 4.5 y 5.5 log UFC/ml) en el jugo de carne. La tabla se
inocul en la forma descrita y se recuperaron las clulas de Salmonella como se
mencion en 4.8.1.2 y 4.8.1.3. Para cada nivel de inculo en la Figura 5.9 la
primera barra representa la poblacin inicial de bacterias depositadas en la tabla.
El porcentaje de recuperacin de las salmonelas fue de 29, 56 y 76% para
los niveles bajo, medio y alto respectivamente, que representan la media de los
cinco recuadros muestreados en cada tabla, considerando la mayor consistencia
una menor dispersin de los valores. Debido a esto, se decidi utilizar el inculo
alto para el experimento final. Este estudio adquiere mayor consistencia ante
niveles ms altos de recuperacin con la menor varianza.
6
76%
Log UFC/g
5
4
3
56%
29%
2
1
0
Bajo
Medio
Alto
Nivel de inculo
Nivel inoculado en la tabla
Poblacin recuperada
Figura 5.9 Influencia del nivel de inculo en la recuperacin de Salmonella en tabla

de madera
51
5.8.1.2 Contaminacin de la lechuga

Una vez establecidas la forma y nivel de inculo en la tabla, la siguiente
etapa consisti en determinar la homogeneidad de la contaminacin de la lechuga
por exposicin a la tabla contaminada. Se emplearon 800 g de la hortaliza
manipuladas para su contaminacin en dos tablas. En consecuencia, se consider
conveniente colocar 100 g (mxima cantidad que se poda manejar en la tabla) y
se frot sobre la superficie aproximadamente 30 segundos, se retir y se repiti
esta operacin hasta completar la contaminacin de 400 g en cada una de las dos
tablas. El nivel de inculo en el jugo de carne fue de 7 log UFC/ ml. Despus de
contaminar 800 g de la hortaliza se mezclaron en un recipiente las ocho porciones
de 100 g. A partir de esta mezcla se retiraron porciones de 10 g para el recuento
de Salmonella. Los resultados mostraron que la lechuga qued contaminada con
un nivel medio de 4.2 log UFC/g y con un mximo y mnimo de 4.12 y 4.29 log
UFC/g respectivamente (Tabla 5.6). Entre estas 10 porciones no se observ una
diferencia significativa (p<0.05), lo que significa que la metodologa propuesta para
la contaminacin de la lechuga es homognea y el nivel de salmonelas por gramo
resulta muy apropiado para iniciar el estudio de su comportamiento.
52
Tabla 5.6 Recuentos de Salmonella en lechuga contaminada a partir de la tabla de

madera.
Rplica
Log UFC/g
4.19*
4.25
4.29
4.21
4.28
4.12
4.18
4.19
4.16
4.22
*Letras iguales indican que no existe diferencia significativa.
5.8.2 Comportamiento de Salmonella en lechuga sumergida y no sumergida

en agua
Las oportunidades de contaminacin cruzada durante la preparacin de
alimentos en las cocinas son muy amplias, siendo un factor principal como
determinante de la presencia de microorganismos patgenos en los alimentos que
se preparan en el hogar y restaurantes (Fernndez, 2001). Sin embargo, y a pesar
de que la contaminacin en s ya es un hecho indeseable, el peligro se incrementa
si el patgeno es capaz de sobrevivir y desarrollar en el alimento prevalente. En
consecuencia
el
objetivo
de
este
estudio
consisti
en
determinar
el
comportamiento de Salmonella en funcin de los factores ambientales.

La lechuga contaminada se almacen como se indic anteriormente;
encontrndose sumergida o no en agua tanto a 30 como a 22 y 4 C. El tiempo de
almacenamiento se defini en funcin del eventual deterioro de la lechuga. A
30 C la hortaliza conserv sus caractersticas organolpticas durante un tiempo
53
menor que a las otras dos temperaturas. La mejor condicin de almacenamiento

se observ a las 24 h a T de 4 C.
Los datos obtenidos se ajustaron usando el programa DMFit. Este
programa tiene como base el modelo primario de Baranyi (Baranyi y Roberts,
1994). Mediante este modelo se obtuvieron los parmetros de crecimiento:
velocidad de desarrollo () y mxima poblacin alcanzada. En general el ajuste del
modelo para la lechuga sumergida (Fig. 5.10) y sin sumergir (Fig. 5.11) fue bueno,
ya que el error estndar del ajuste fue de 0.158.
A 4 C no se observ desarrollo del patgeno. Este hecho ya se ha
demostrado en diversos estudios, en alimentos como huevo (Clay y Board, 1993),
productos crnicos (Goepfert y Chung, 1970) y queso (Tucker et al., 1946); en
donde se consigna que a temperaturas inferiores a 6 C la salmonela tan solo
sobrevive. Incluso en un estudio en fresas congeladas se demostr que diversos
serovares de Salmonella, incluyendo Typhi, sobrevivieron hasta por 14 meses a 18 C (McCleskey y Cristopher, 1941).
Por otro lado, a 22 y 30 C la Salmonella increment su poblacin hasta
cerca de 1.5 y 3 log UFC/g respectivamente. Estos resultados coinciden con los
reportados por Koseki e Ikobe (2005), quienes empleando el modelo de Baranyi
estudiaron el comportamiento de Salmonella y E. coli O157:H7 en lechuga. As,
las curvas de crecimiento mostraron que Salmonella puede llegar a desarrollar
hasta 2.5 log UFC/g en 20 horas a
25 C. En otro estudio realizado en col
almacenada a 20 C se observ que S. Hadar increment su poblacin hasta en

2.5 log UFC/g en 24 h. (Piagentini, 1997). Existen adems otras investigaciones
donde se reporta un comportamiento similar de Salmonella en diversas frutas y
hortalizas, tales como: mango (Branquinho et al., 2006), jitomate (Asplund y
Nurmi, 1991), papaya, sandia y jcama (Fernndez et al., 1989).
54
SGG_LH_4_1
(4, soaked i)
10
SGG_LH_22_2
(22, soaked i)
4 C
15
20
25
SGG_LH_30_2
(30, soaked i)
10
22 C
15
20
25
30 C
0
0
10
15
20
25
Tiempo (h)
Figura 5.10 Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sumergida en

agua y almacenada a diferentes temperaturas. Las marcas azules representan los
datos obtenidos y la lnea roja el ajuste del modelo de Baranyi.
55
SGG_LS_4_1
(4, no soake)
SGG_LS_22_2
(22, no soake)
4 C
22
B C
D
0
0
10
15
20
25
10
15
20
25
SGG_LS_30_3
(30, no soake)
30 C
6
0
0
10
15
20
25
Tiempo (h)
Figura 5.11 Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sin sumergir en

agua y almacenada a diferentes temperaturas. Las marcas azules representan los
datos obtenidos y la lnea roja el ajuste del modelo de Baranyi.
La es uno de los parmetros de crecimiento ms importantes que

describen el comportamiento de un microorganismo en un ambiente determinado
y su clculo es un elemento importante para poder hacer una estimacin objetiva
del riesgo. Algunos de los factores que afectan este parmetro son la temperatura,
la humedad relativa y la disponibilidad de nutrientes, entre otros. Con el propsito
de comparar el efecto de la temperatura y del tipo de almacenamiento empleado
se efecto el anlisis de varianza de las velocidades de desarrollo obtenidas. La
56
temperatura resulto ser el factor determinante en el desarrollo del microorganismo

(p < 0.05), mientras que mantener la lechuga sumergida o no en agua no fue
trascendente (p > 0.05) (Tabla 5.7). El desarrollo de Salmonella en lechuga picada
indica que este alimento es un buen substrato, ya que posee un alto contenido de
agua (Aa de 0.97) y nutrientes disponibles. Sin embargo es importante mencionar
que el jugo de carne que se utiliz como vehculo de los microorganismos tambin
puede ser una fuente de nutrientes.
Tabla 5.7. Valores de F y significancia estadstica en el anlisis de varianza para la

variable velocidad de desarrollo de los factores de estudio y su interaccin
Factor
Inmersin (a)
Temperatura (b)
Interaccin a x b
1
F*
0.2121
34.89
2.74
Valor de P
0.653
0.0001*
0.104
Media de 3 replicas
* Valores menores a 0.05 indican diferencia significativa
Se efecto la comparacin de las medias (Tabla 5.8) de las velocidades de

desarrollo obtenidas para las diferentes temperaturas y tipo de almacenamiento
(sumergida y sin sumergir en agua) mediante la prueba de Tukey. De forma
esperada, la de Salmonella aumenta conforme se incrementa la temperatura de
almacenamiento. La velocidad mxima observada correspondi a la lechuga no
sumergida en agua y almacenada a 30 C. A excepcin de la temperatura de 4 C,
las para 22 y 30 C en lechuga no sumergida en agua fueron ligeramente
mayores que para las sumergidas. Esto podra deberse a que los nutrientes que
se encuentran en el jugo de carne que se utiliz como vehiculo de las bacterias se
diluyen en el agua de inmersin de la lechuga. Otro factor que pudo haber
afectado los niveles del patgeno es la tcnica de recuento, ya que la
recuperacin de Salmonella nicamente se realiz en la hortaliza y no en el agua
de inmersin, dando como resultado ese ligero decremento en las poblaciones.
57
Tabla 5.8 Velocidad de desarrollo de Salmonella en lechuga picada sumergida y

sin sumergir en agua y almacenada a 4, 22 y 30 C
Tipo de almacenamiento
Sumergida en agua
No sumergida en agua
Temperatura
(C)
4
1
(Log UFC/ h)
0.04622 d
22
0.2112 c
30
0.3065 b
0.0023 d
22
0.3115 b
30
0.4480 a
= velocidad de desarrollo
Media de tres rplicas. Valores seguidos de letras diferentes son estadsticamente
significativos.
2
El comportamiento de S. enterica en otros productos ha sido reportado por

algunos investigadores. Nutt et al. (2003), evaluaron la capacidad de desarrollo de
una cepa de S. Typhimurium inoculada en extractos de vegetales frescos
incubados a 37 C. Las velocidades de desarrollo ms altas se observaron en
extractos de chile jalapeo, seguido de los extractos de brcoli, lechuga, jitomate y
pimiento. La capacidad de S. Typhimurium para desarrollar en extractos de
pimiento y brcoli es consistente con otros estudios donde se ha demostrado que
E. coli O157:H7 sobrevive en pimiento y brcoli picados (Richert et al., 2000).
El desarrollo de bacterias patgenas como E. coli O157:H7, Salmonella spp
y L. monocytogenes en trozos de lechuga iceberg fue evaluado por Koseki e Isobe
(2005). En uno de los experimentos que realizaron se estudio el comportamiento
de los patgenos a temperatura constante de 5 a 25 C, obteniendo los
parmetros de desarrollo (fase lag, y mxima poblacin alcanzada) mediante el
modelo primario de Baranyi; la observada fue de 0.5037 log UFC/h para trozos
de lechuga almacenados a 25 C.
58
Las para Salmonella en lechuga que se obtuvieron en nuestro estudio son

inferiores a la reportada por Koseki e Isobe (2005). Esta diferencia podra deberse
en parte a las cepas de Salmonella utilizadas en los estudios, al tipo de flora nativa
de la lechuga y a la flora microbiana presente en el jugo de carne (vehculo
utilizado en nuestro estudio). Est demostrado que el nmero y tipo de
microorganismos puede retrasar y/o limitar el desarrollo de microorganismo
patgenos (Fernndez, 2001).
Estos comportamientos ponen de manifiesto los riesgos en los que se
puede incurrir con las frutas y hortalizas en condiciones que propicien una
contaminacin cruzada al preparar los alimentos, o directamente por el manejador
de alimentos portador del patgeno.

El patrn de consumo de un alimento es necesario para estimar el nivel de
exposicin a un patgeno contaminante. Por ejemplo, en E.E.U.U. se determin la
exposicin y el riesgo de enfermar por S. Enteriditis por consumo de huevo. La
estimacin se realiz sobre la base de que una persona consume 190 huevos al
ao y de que se registran 30 brotes asociados al consumo de huevo debidos a S.
Enteritidis. Se concluy que en ese pas ocurre un brote por cada 1.38 mil millones
de huevos consumidos (Mason, 1994).
Sin embargo en nuestro pas existe escasa informacin acerca del consumo
per capita de un alimento en particular. Se intent disponer de informacin
mediante un estudio de campo que incluy 600 entrevistas directas entre la
poblacin de la ciudad de Quertaro. El objetivo consisti en estimar el nivel de
consumo de lechuga como recurso para estimar la probabilidad de la exposicin a
Salmonella por la ingesta de esta hortaliza, conociendo el nivel de contaminacin
en el alimento.
59
Los cuestionamientos en la entrevista se referan a la frecuencia, cantidad,

sitio de consumo y tratamientos de lavado y desinfeccin aplicados a la lechuga, y
finalmente la frecuencia de episodios de diarrea que las personas manifestaron
padecer al ao.
Como toda encuesta que se realiza sobre la poblacin acerca del patrn de
consumo de un alimento, encontramos diversas variables que pueden afectar los
resultados. Se incluyen el tiempo disponible, as como la concentracin, seriedad y
confianza que muestren los encuestados al responder. Por tal razn, se tuvo el
cuidado de discriminar las respuestas de las personas que no reunan estas
caractersticas y por tanto desechar a tales personas en el computo final. Solo 500
de 600 entrevistas cumplieron con dichas condiciones.
La edad de los entrevistados se agrup en seis categoras (Tabla 5.12). Las
respuestas obtenidas de las dos primeras, es decir, menores de 6 aos y de 6 a
12 aos, fueron atendidas por el padre o madre de la familia. El 43% de las
entrevistas fueron aplicadas a personas de entre 26 a 64 aos de edad.
60
Tabla 5.9 Porcentajes de frecuencia sobre la encuesta de consumo de lechuga

cruda
Factor
Frecuencia (%)
Genero
Mujer
Hombre
Edad
< 6 aos
6 12 aos
13 24 aos
25 64 aos
> 64 aos
Frecuencia de consumo
Nunca
1 2 veces / semana
3 4 veces / semana
1 al mes
Tamao por porcin
< 10 g
10 25 g
> 25 g
Sitio de consumo
Hogar
Fuera del hogar
Ambos
Tratamiento antes de su consumo
Lavado
Lavado y desinfectado
Ninguno
Desconocido
Frecuencia del tratamiento
Ninguna
1-10
11-19
20
Cuadros diarreicos al ao
Ninguno
1-2
3-6
>6
61
62.3
37.7
10.0
9.6
26.6
43.2
10.6
0.00
51.0
12.6
36.4
24.4
60.2
15.4
21.0
42.0
37.0
18.4
39.0
2.6
40.0
1.8
2.6
4.4
48.6
22.0
40.0
20.0
18.0
250
200
150
100
50
0
<6aos
612
aos
1324
aos
2564
aos
>64
aos
Figura 5.12 Grupos de poblacin entrevistadas, segn edad.

La tendencia sobre el sitio donde mayoritariamente se consume la lechuga
en la poblacin encuestada correspondi a restaurantes, fondas, comedores
industriales, mercados y puestos ambulantes, entre otros (Figura 5.13). Es
pertinente destacar que, en un estudio realizado en E.E.U.U se observ que en un
periodo de 15 aos, 50% de los brotes ocasionados por frutas y hortalizas
ocurrieron en restaurantes y establecimientos de comida (CSPI, 2007).
250
200
150
100
50
0
Hogar
FueradelHogar
Ambos
Figura 5.13 Frecuencia de sitios de consumo de lechuga cruda

62
La mayor frecuencia de consumo oscil entre una y dos veces por semana.
En ningn caso se obtuvo la respuesta de nunca (Figura 5.14).
300
250
200
150
100
50
0
nunca
1vezalmes
12veces/semana 34veces/semana
Figura 5.14 Frecuencia de consumo de lechuga cruda

Otro factor motivo de exploracin fue la cantidad de lechuga consumida en
cada ocasin. Para facilitar la respuesta nos auxiliamos de una imagen a escala
con diferentes cantidades de lechuga correspondientes a 10, 25 y 50g.
Evidentemente en algunos casos la lechuga se consuma en forma de ensalada,
pero en otra era un ingrediente de otros alimentos tales como: enchiladas, pozole,
tortas y hamburguesas. La mayora de las personas (60.2%) aseguro consumir
entre 10 y 25 g de lechuga (Figura 5.15).
63
350
300
250
200
150
100
50
0
<10g
1025g
>25g
Figura 5.15 Frecuencia de cantidad de lechuga cruda consumida por ocasin

El 39% de los entrevistados de entre los 300 que la consuman en el hogar
en forma regular o espordica afirmaron que la lechuga era objeto de lavado y
desinfeccin. La respuesta la consignamos a sabiendas de la imposibilidad de
verificar el cumplimiento de este sealamiento. Similar situacin se aplica a la
respuesta sobre la frecuencia de la presentacin de cuadros diarreicos entre las
personas encuestadas, en donde la respuesta predominante fue de una a dos
cuadros diarreicos al ao (Figura 5.16).
250
200
150
100
50
0
Ninguna
12
36
>6
Figura 5.16 Frecuencia de padecimientos de diarrea al ao por persona
64
5.10 Estimacin del riesgo de enfermar por Salmonella asociado al consumo

de lechuga.
La estimacin de la exposicin a la Salmonella asociado a la ingesta de
lechuga se realiz considerando la incidencia del patgeno en la lechuga, la
frecuencia y cantidad de consumo. Puede expresarse mediante la ecuacin:
incidencia (I) * frecuencia (F) * cantidad (C)= Probabilidad de exponerse a la
ingesta de salmonelas cuando se consume lechuga.
La incidencia encontrada fue de 4/647 en porciones de 25g, la frecuencia
de consumo se refiri a una a dos, tres a cuatro veces por semana y una vez al
mes. Para el clculo de la frecuencia de consumo se consider el nmero de
veces que las personas manifestaron consumir la lechuga y la cantidad consumida
que seleccionaron fue de 10, 25 y 50g. Cuando este clculo se realiz para cada
persona se obtiene una respuesta como la que muestra la Figura 5.18, en la cual
se relaciona el nmero de personas y la probabilidad de exposicin a Salmonella
en la forma sealada. La figura ilustra en que trminos se distribuyen las
probabilidades de exposicin al patgeno entre las 500 personas entrevistadas.
De las 500 personas encuestadas, para 187 la probabilidad de exponerse a
Salmonella es de 1 en 1000. En el otro extremo, la probabilidad mas baja de
exposicin al riesgo (0.00003) se observ en 14 personas.
Si bien el clculo anterior tiene un principio racional, debido al bajo nmero
de positivos entre el total de muestras analizadas, es de esperar mrgenes
amplios de variabilidad en estudios similares repetidos. El valor prctico del
clculo es limitado. Adicionalmente, las respuestas pueden considerarse poco
consistentes en las condiciones en las que se llevaron a cabo las entrevistas.
Por otra parte, se dispone de un dato cuantitativo acerca del contenido de
salmonelas en las muestras de lechuga; como se indic la media es de 7
salmonelas/g de manera que en porciones de 25 g (base del clculo en la
65
ecuacin anterior) la cantidad de salmonelas sera de 175 clulas. Esta cifra

puede integrarse al clculo anterior si se multiplica por la cantidad de lechuga
ingerida. Ante las personas que consumieron, por ejemplo para el nivel mximo de
exposicin (0.002355) correspondera una ingesta de 350 clulas por 25 g de
alimento consumido.
Existen ciertas limitaciones en los pases en desarrollo que afectan la
capacidad de llevar a cabo una evaluacin de riesgos. Para que la implementacin
de este sistema sea factible es indispensable contar con una serie de condiciones.
Desafortunadamente, los sistemas de inocuidad de los alimentos se encuentran
an en etapas muy tempranas de desarrollo, o en todo caso, son inexistentes.
Como consecuencia, estos sistemas presentan ciertas debilidades, tales como: la
falta de organizacin, programas incompletos e ineficaces que afectan de manera
negativa la inocuidad y calidad de los alimentos. Otras limitaciones incluyen la falta
o insuficiencia de tecnologa, infraestructura, recursos humanos y financieros,
capacitacin tcnica, y laboratorios bien equipados (Cahill y Jouve, 2004).
En Mxico no existe la suficiente informacin acerca de la incidencia y
concentracin de patgenos en los alimentos, una vigilancia epidemiolgica y
mucho menos los patrones de consumo de la poblacin. Por lo que realizar una
evaluacin de riesgos, como las que ya se han realizado en pases
industrializados (Cuadro 5.1), es algo que todava esta fuera de nuestro alcance.
Sin embargo nuestro estudio arroja informacin que puede contribuir a las futuras
investigaciones de la evaluacin de riesgos.
66
Cuadro 5.1 Algunos estudios de Evaluacin de Riesgos Microbiolgicos realizados

en pases desarrollados
E. coli Enterohemorragica (ECEH) en carne y productos crnicos
Salmonella en huevo y pollos para asar
Listeria monocytogenes en alimentos listos para su consumo
Vibrio parahaemolyticus en ostras crudas consumidas en Japn, Nueva

Zelanda, Canad, Australia y E.E.U.U.
Vibrio parahaemolyticus en almejas rojas consumidas en Tailandia
67
200
180
160
Nmero de personas
140
120
100
80
60
40
20
0
0.000029
0.000073
0.000235
0.000471
0.000588
0.001177
0.002355
Probabilidad de exposicin a Salmonella
Figura 5.17 Probabilidad de exposicin a Salmonella en funcin de su incidencia, frecuencia y cantidad de lechuga
consumida.
68
VI. CONCLUSIONES
* De 647 muestras de lechuga adquiridas en mercados la incidencia de Salmonella

fue 0.06%, mientras E. coli se detect en 14.9 % de 368 muestras.
* La media de salmonelas en las muestras positivas fue de 7 NMP/g. La de E. coli

fue de 4 NMP/g
* Una mezcla de tres serovares de Salmonella mostr una cintica de desarroll

similar en CST, BHI y CL. En la lechuga pre-enriquecida en el CL el desarrollo fue
discretamente menos pronunciado.
* La tcnica de PCR utilizando como iniciador invA permiti una ntida reaccin en
el gel de electroforesis especfica para Salmonella. As mismo, permiti detectar
por lo menos 5 UFC de Salmonella en 25 g de lechuga.
* La incidencia tanto de Salmonella como de E. coli en la lechuga mostr un mayor

nivel en la poca calurosa que en la fra con un porcentaje de 1.9 y 25.3%
respectivamente.
* El modelo de contaminacin cruzada de la lechuga a partir de jugo de carne

contaminado en el laboratorio condujo a resultados consistentes, con variaciones
menores entre los replicados.
* Los porcentajes de recuperacin de Salmonella en las tablas contaminadas se

incrementaron en proporcin directa con el nivel de inculo inicial; 29% para 3.5
log UFC/ Salmonella y 76% para 5.5 log UFC/Salmonella.
* Una vez contaminada la lechuga por contacto con la Salmonella inoculada en las
tablas, la mezcla de salmonelas no modific su numero a 4C despus de 24 h.
69
Almacenada a 30 y 22 el microorganismo desarroll hasta cerca de 3 y 1.5 log

UFC/g, respectivamente.
* No se observ diferencia entre la capacidad de desarrollo del patgeno en

lechuga escurrida o sumergida en agua almacenada a las tres temperaturas.
* La poblacin encuestada (aparentemente entre niveles econmicos de clase

media baja y clase media alta), manifest en general una frecuencia de consumo
de lechuga de una a dos veces por semana en cantidades variables entre 10 y
25 g.
* La estimacin de la exposicin a la Salmonella por concepto de consumo de

lechuga no conduce a resultados consistentes fundamentalmente debido a dos
factores: la baja incidencia de Salmonella en las muestras analizadas (0.06%), y la
pobre credibilidad de las respuestas de las personas encuestadas en los trminos
en los que se realiz el estudio.
70
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Riesgo de Enfermar Asociado Al Consumo de Lechuga Expuesta A La Contaminacion Por Salmonella

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO

PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL

Que como parte de los requisitos para obtener el grado de

Quertaro, Qro. Enero del 2009

(Palabras clave: lechuga, contaminacin cruzada, Salmonella)

(Key words: Lettuce, cross-contamination, Salmonella)

- A CONACYT por el financiamiento otorgado para la realizacin de

2.1. Frutas y hortalizas

2.1.1. Produccin y consumo

2.1.2. Riesgos asociados al consumo de frutas y hortalizas

2.1.3. Brotes asociados a el consumo de frutas y hortalizas

2.1.4. Incidencia de Salmonella en frutas y hortalizas

2.1.5. Fuentes y mecanismos de contaminacin

2.1.5.1. Contaminacin cruzada

2.2.1. Brotes asociados a su consumo

2.3. Enfoques para lograr y preservar la inocuidad microbiana de los alimentos

2.3.1. Prcticas sanitarias agrcolas

2.3.2. Anlisis de peligros y puntos crticos de control

2.3.3. Anlisis de riesgos

2.3.3.1 Evaluacin de riesgos microbiolgicos (ERM)

2.3.3.1.1. Identificacin del peligro

2.3.3.1.2. Caracterizacin del peligro

2.3.3.1.3. Evaluacin de la exposicin

2.3.3.1.4. Caracterizacin del riesgo

2.4. Tcnicas de deteccin de Salmonella en los alimentos

2.4.1. Deteccin por cultivo

2.4.2. Deteccin por PCR

2.5 Microbiologa predictiva

2.5.1 Modelo de Baranyi

IV. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Material biolgico

4.1.2 Medios de cultivo

4.2 Material biolgico

4.3. Sitios de muestreo

4.4. Validacin de la tcnica de cultivo para la determinacin de Salmonella

4.4.1 Evaluacin del caldo de preenrequecimiento en lechuga

4.4.1.2 Determinacin del desarrollo de Salmonella en lechuga con

4.5 Validacin de PCR para la determinacin de Salmonella

4.5.2.1 Determinacin de Salmonella con extracto de lechuga

4.5.2.2 Determinacin del lmite de deteccin

4.6 Comparacin del cultivo y PCR para la determinacin de Salmonella

4.7 Determinacin del NMP de Salmonella en lechuga

4.8 Determinacin de E. coli

4.9 Modelo de contaminacin cruzada

4.9.1.1 Inoculacin de la tabla de madera

Influencia del nivel de inculo en la recuperacin de

Salmonella a partir de la tabla de madera

4.9.1.3 Determinacin de la variabilidad de contaminacin de la

4.10 Estimacin del patrn de consumo de lechuga

4.11 Anlisis estadsticos

5.1. Sitios de muestreo

5.2. Validacin de la tcnica de cultivo para la determinacin de Salmonella

5.2.1. Evaluacin del caldo de preenrequecimiento en lechuga

5.3. Validacin de PCR para la deteccin de Salmonella en cultivo puro

5.5. Contenido de Salmonella y E. coli en lechuga

5.6. Asociacin entre la deteccin de Salmonella y E. coli

5.7. Incidencia de Salmonella y E. coli segn poca del ao

5.8. Comportamiento de Salmonella en lechuga a travs de un modelo de