DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD

DE LAS BACTERIAS A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCIN
La resistencia de las bacterias es el principal obstculo para la eficacia teraputica de los
antibiticos, pues no slo puede anular la accin curativa si se manifiesta en el curso del
tratamiento, sino que tiene a la larga consecuencias todava ms graves para el con junto
de la poblacin, ya que provoca la desaparicin de las cepas susceptibles y la propagacin
de las re sistentes. Ese es el motivo por el cual la determinacin de la sensibilidad de las
bacterias a los antibiticos haya adquirido tanta importancia y sea indispensable para hacer
de los antibiticos un uso racional y para preservar la eficacia de este grupo tan valioso
de agentes teraputicos.El conocimiento de la sensibilidad a los antibiticos, del
microorganismo causante de una enfermedad, no es slo importante para hacer la seleccin
inicial del agente teraputico correspondiente, sino que adems en aquellos casos en los
cuales el paciente presente intolerancia a determinado frmaco, permite seleccionar el ms
adecuado para ese paciente en particular.Los antibiogramas son mtodos in vitro que
determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes
antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio especfica y estandarizada. La meta
principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clnico algunas recomendaciones sobre
la terapia que puede ser ms apropiada en pacientes con una infeccin especfica.
Entre los factores podemos resaltar:
-Factores del agente antimicrobiano

- Vas de

administracin
-Farmacocintica
bacteriosttica o bactericida
-Enfermedad

-Accin
-Factores del husped

-Estado inmunolgico

-Formacin de

absceso
-Presencia de cuerpo extrao

-Funcin renal y

heptica
-Cumplimiento del tratamiento

-Factores del

microorganismo
-Virulencia

-Alta concentracin de

microorganismos
-Infeccin mixta

-Desarrollo de resistencia durante

el tratamiento
Existen diversos mtodos para determinar la sensibilidad bacteriana a los
antibiticos, presentando adems cada uno de estos mtodos, mltiples variantes.
Cualquiera que sea el mtodo seleccionado, el medio de cultivo a emplear ha de
ser aquel que permita un buen desarrollo del microorganismo cuya sensibilidad se
determina y adems no debe ejercer ningn efecto inhibidor sobre la actividad
antibacteriana de los antibiticos o quimioterpicos ensayados.
Usualmente se utiliza el agar de Mueller-Hinton en las pruebas de sensibilidad de
microorganismos aerbicos de rpido crecimiento. Cuando se trata de
estreptococos u otros microorganismos exigentes, se le aade al Mueller-Hinton,
5% de sangre desfibrada.
OBJETIVO
Realizar un ensayo de sensibilidad de un cultivo bacteriano a los antibiticos,
usando el mtodo de Kirby Bauer. Interpretar los resultados y hacer el informe
correspondiente.
FUNDAMENTO
En el mtodo de Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de
una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una
concentracin conocida del antibitico. Las placas se incuban por 16-18 horas a
3537C. Durante la incubacin, el antibitico difunde radialmente desde el disco a
travs del agar, por lo que su concentracin va disminuyendo a medida que se
aleja del disco. En un punto determinado, la concentracin del antibitico en el
medio es incapaz de inhibir al germen en estudio.

QU ES EL ANTIBIOGRAMA
El antibiograma es la prueba microbiolgica que se realiza para determinar la susceptibilidad
de una colonia bacteriana a un antibitico o grupo de antibiticos. El antibiograma permite
definir para cada antibitico, si la bacteria es sensible (antibitico eficaz), medianamente
sensible (antibitico eficaz en ciertas condiciones) o resistente (antibitico ineficaz). El

antibiograma permite medir la capacidad de un antibitico a inhibir el crecimiento

bacteriano. Por tanto, permite evaluar la eficacia de un antibitico sobre una bacteria.
Las tcnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiologa para
estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las
infecciones.
Se considera como antimicrobiana cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos
de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilizacin como
tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintticos o semisintticos (modificacin
qumica de un compuesto natural). La historia moderna de los antibiticos comienza con el
descubrimiento de sustancias presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros
microorganismos. La utilizacin de antibiticos supuso un avance enorme en la esperanza de
vida de las personas que padecan procesos infecciosos, aunque tambin supuso un
aumento en los niveles de resistencia antibitica.
El antibiograma tiene cuatro utilidades principales:
La utilidad bsica del antibiograma es la instauracin de un tratamiento antibitico correcto
al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infeccin posee
mecanismos que le confieran inmunidad frente a algn antibitico para no incluirlo como
terapia.
En cuanto al tratamiento el antibiograma no slo es necesario en la instauracin, tambin
resulta til en el seguimiento e incluso en la confirmacin de tratamientos empricos. En
ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de
conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El antibiograma tiene que confirmar, o en su
caso corregir el tratamiento.
Existen multitud de antimicrobianos en el mercado y el nmero sigue creciendo porque el
desarrollo de ms mecanismos de resistencia por parte de los microorganismos se traduce
en un esfuerzo mayor por fabricar ms y mejores antibiticos. No es necesario contrastar la
eficacia de todos los antibiticos para cada aislamiento bacteriano. Los criterios que se
siguen para seleccionar que antimicrobianos se ensayan respondes a factores de diversa
ndole:
-Factores microbiolgicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia
descritos previamente en su especie.
-Factores farmacolgicos: Tipo de antimicrobiano y parmetros de absorcin, distribucin
y eliminacin.
-Factores del paciente: Tipo de infeccin. Factores de riesgo y
estado general de salud. Situacin inmunolgica e hipersensibilidad.
EL ANTIBIOGRAMA
Por qu realizar un antibiograma?
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que
se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios antibiticos. En efecto, la
sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento
antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones teraputicas
individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias
bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro

de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la antibioterapia

emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y adoptarse ciertas
decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevencin en los
hospitales. Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico.

CUNDO REALIZAR UN ANTIBIOGRAMA?

Siempre que una toma bacteriolgica de finalidad diagnstica haya permitido el aislamiento
de una bacteria considerada responsable de la infeccin.
Establecer esta responsabilidad exige una colaboracin entre el bacterilogo y el clnico. En
microbilogo no podr determinar con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un
antibiograma, sin los datos clnicos que le aporta el mdico. Por ejemplo, una bacteria no
patgena puede ser responsable de la infeccin de un enfermo inmunodeprimido o en un
lugar determinado del organismo. La presencia de signos clnicos puede ser tambin
determinante para la realizacin de un antibiograma (por ejemplo: la infeccin urinaria con
un nmero reducido de grmenes).
SENSIBILIDAD BACTERIANA A LOS ANTIBITICOS
La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la medida de la
sensiblidad de una bacteria a un determinado antibitico. La CIM se define como la menor
concentracin de una gama de diluciones de antibitico que provoca una inhibicin de
cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite
establecer una escala de actividad del antibitico frente a diferentes especies bacterianas.
Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera
semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos automatizados o
semiautomatizados). Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta
cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se
denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitco.

Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la:

-Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un tratamiento
a la doss habitual.
-Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy
reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
-Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto
teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la
posologa).
Ciertas molculas son representativas de
un grupo de antibiticos.
INTERPRETACIN DE UN ANTIBIOGRAMA
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan dbilmente in vitro, cuando se inscriben en el
DNA bacteriano. El antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir,
a travs de la comparacin de las respuestas para cada antibitico, un mecanismo de
resistencia incluso dbilmente expresado. El resultado de Sensible debe ser corregido a
Intermedio o Resistente, ya que la utilizacin de estos antibiticos correra el riesgo de
provocar un fracaso teraputico).
RESISTENCIA BACTERIANA
Cada antibitico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este
espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una

inhibicin de su crecimiento por concentraciones de su antibitico susceptibles de ser

alcanzadas in vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a dicho
antibitico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de dicho
espectro se denominan naturalmente resistentes.
El antibitico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes eliminando las
sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presin de seleccin. El aumento de la
frecuencia de las cepas resistentes va unido cas siempre al uso intensivo del antibitico en
cuestin.
-La resistencia natural es un carcter constante de todas las cepas de una misma especie
bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite prever la inactivdad de la
molcula frente a bacterias identificadas (despus del crecimiento) o sospechosas (en caso
de antiboterapia emprica). En ocasiones, constituye una ayuda para la identificacin, puesto
que certas especies se caracterizan por sus resistencias naturales. Ejemplos: Resistencia
natural del Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la colistina. Resistencia natural de la
Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina).
-La resistencia adqurida es una caracterstica propia de ciertas cepas, dentro de una
especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio gentico ha sido modificado por
mutacin o adquisicin de genes. Contrariamente a las resistencias naturales, las
resistencias adquiridas son evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilizacin de
los antibiticos. En el caso de numerosas especies bacterianas, y teniendo en cuenta la
evolucin de las resistencias adquiridas, el espectro natural de actividad no es ya suficente
para guiar la eleccin de un tratamiento antibitico. En ese caso, se hace indispensable el
antibiograma.
-Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de resistencia. En
general, afecta a varios antibiticos dentro de una misma familia (Ejemplo: La resistencia a
la oxacilina en los estafilococos se cruza con todas los -lactmicos). En ciertos casos, puede
afectar a antibiticos de familias diferentes (Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a
las ciclinas se cruza con la resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).
-Una resistencia asociada es cuando afecta a varios antibiticos de familias dferentes. En
general, se debe a la Asociacin de varios mecanismos de resistencia (Ejemplo: La
resistencia de los estafiolococos a la oxacilina va frecuentemente asociada a las quinolonas,
aminoglicsidos, macrolidos y ciclinas).
Con el fin de tener
en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas y, por consiguiente, proporcionar a los
mdicos datos tiles cuando deben proceder a la eleccin emprica de una antibioterapia, la
nocin de espectro clnico completa la de espectro natural.
MECANISMOS DE LA RESISTENCIA ADQUIRIDA
El mecanismo gentico de adquisicin de una resistencia puede ser:
- La mutacin de un gen implicado en el modo de accin de un antibitico: Este mecanismo
afecta preferentemente a ciertos antibiticos: quinolonas, rifampicina, cido fusdico,
fosfomicina, antituberculosos y a veces cefalosporinas (Ejemplo: La resistencia a las
quinolonas por modificacin del ADN grasa en las enterobacterias).
- La adquisicin de genes de resistencia transferidos a partir de una cepa perteneciente a
una especie idntica o diferente: Ciertos Antibiticos estn particularmente afectados por
este mecanismo: -lactmicos, aminoglicsidos, tetraciclinas; cloranfenicol, sulfamidas
(Ejemplo: Resistencia a la ampicilina E. coli y del Proteus mirabilis).

el mecanismo bioqumico de la resistencia puede ser:

-una produccin por la bacteria de enzimas que inactivan el antibitico. Ejemplo: Penicilinasa
de los estafilococos, lactamasa de amplio espectro (BLAE) de las enterobacterias.
- una modificacin del blanco del antibitico. Ejemplo: Modificacin de las Protenas de
Enlace con la Penicilina (PBP) de los estafilicocos resistentes a la oxacilina (llamados
estafilococos "Meti-R"). Neumococos resistentes a la penicilina.
- una impermeabilidad de la pared bacteriana por modificacin o por disminucion
cuantitativa de las porinas. Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa resistente a la imipenem.
- un mecanismo de efusin: expulsin de la molcula por un transporte activo. Ejemplo:
Estafilococos resistentes a las tetraciclinas.
El mtodo estndar utilizado para las pruebas in vitro fue el de dilucin en caldo, que
proporcionaba un resultado cuantitativo de la concentracin de agente antimicrobiano
necesaria para inhibir el desarrollo de un organismo dado.
- MTODO BASE DE DILUCIN EN CALDO
En los mtodos de dilucin en caldo, base de casi todos los mtodos utilizados en la
actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano,
generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendr el desarrollo del
microorganismo. El caldo ms comnmente usado para estas pruebas es el de MuellerHinton suplementado con los cationes magnesio y calcio.
Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se
diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.
El microorganismo crecer en el tubo control y en todos los otros que no contengan
suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su desarrollo. La concentracin de
antibitico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando
al control negativo), se designa como la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI).
Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un microorganismo (CMB) se
debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilucin en
caldo que para medir la sensibilidad.
Actualmente son varios los
mtodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibiticos y
todos ellos se realizan en los laboratorios de microbiologa bajo condiciones entandarizadas
por organismos internacionales. Entre todos, tres son los que, por su sencillez y fiabilidad, se
han impuesto como sistemtica de rutinaria en la mayora de los laboratorios:

-MTODO DE DIFUSIN EN AGAR

Una vez demostradas las grandes ventajas de las tcnicas de dilucin en caldo, el paso
siguiente, pensando sobre todo en poder realizar fcilmente pruebas de sensibilidad de un
microorganismo frente a mltiples antibiticos a la vez, consisti en buscar la manera de
aplicar la idea directamente a las placas de agar.
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su
superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibiticos. Se incuban las
placas durante 16-24 horas a 35C y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en
ellas. Se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco y

se compara con las referencias oportunas publicadas por el NCCLS. Con esta referencia
podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada
uno de los antibiticos ensayados en las placas.
ANTIBIOGRAMA REALIZADO POR EL MTODO DE DIFUSIN EN AGAR
En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el mtodo de
difusin en agar por medio de discos.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento
bacteriano y con seis discos de antibiticos. La zona de color claro que ocupa la mayor parte
de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Los crculos negros que
rodean a cinco de los seis discos marcan las zonas en que los respectivos antibiticos han
inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El sexto
disco (AM-10) no tiene a su alrededor halo de inhibicin lo que indica la resistencia del
microorganismo a ese antibitico. La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad
superior de la placa, permite observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior.

-MTODO DE E-TEST
Es uno de los mtodos ms recientes que se han presentado en el mercado y resulta de una
curiosa combinacin de caractersticas de los mtodos anteriores. Una de sus grandes
ventajas, dadas sus caractersticas, es que resulta un mtodo ideal para estudiar cualquier
tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o
los que tengan requerimientos especiales para crecer.
El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del
antibitico (o antibiticos) a ensayar. Tras la incubacin de 16-24 horas a 35C se observan
las placas y se valora la zona de inhibicin, de forma elptica, alrededor de cada tira.
-ANTIBIOGRAMA REALIZADO POR EL MTODO DE E-TEST
En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el mtodo de E-test.
En la fotografa de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento
bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color ms claro que ocupa la mayor parte de
la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses ms oscuras que
rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos
antibiticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a
estudio.

-MTODOS AUTOMATIZADOS
La mayora de estos novedosos mtodos utilizan sistemas de microdilucin en medio lquido
sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los
diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia)
o, en el caso de los sistemas ms sencillos, por simple lectura ptica del tcnico a travs de
un visor invertido de espejo.
Su manipulacin suele ser fcil y rpida, generalmente automatizada o semiautomatizada, lo
que los convierte en mtodos ideales para grandes volmenes de trabajo. Una de sus
grandes limitaciones es que slo ofrecen garanta para investigar microorganismos de
crecimiento rpido y que no tengan requerimientos especiales.

CUL ES LA IMPORTANCIA DE REALIZAR UN ANTIBIOGRAMA

Todos los antibiticos no son eficaces contra todas las bacterias y el antibiograma ayuda al
mdico en la eleccin del antibitico que hay que prescribir. Permite determinar el antibitico
ms eficaz en caso de una infeccin bacteriana.

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Prof. Magaly Pedrique de Aulacio
Febrero 2002