LINFOMAS CANINOS

Estudio ptico, electrnico e inmunohistoqumico

Proferacin y ploida

Tesis presentada por:

Cannen Sanz Rivas
Directores:
Maa Castao
Horacio Oliva

Dpto. de Patologa Animal II

Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid
Dpto. de Anatoma Patolgica
Fundacin Jimenez Daz
Universidad Autnoma de Madrid
Facultad de Medicina

Madrid, 1998

>

Fundacin Jimnez Daz

CLNICA DE NUESTRA SEORA DE LA CONCEPCION

UNIVERSiDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA

Avda. de los Reyes Catlicos, 2 (Ciudad Universitaria>

28040- MADRID

INFORME SOBRE EL TRABAJO:

LINFOMAS CANINOS. Estudio ptico, electrnico e inmunohistoquinnico.
Proliferacin y ploida.
Presentado por Carmen Sanz Rivas para optar al titulo de Doctora en Veterinaria

Los linfomas constituyen una de las neoplasias frecuentes en perros. Su estudio,

al igual que en humanos, necesita de una metodologa mltiple y de una correlacin
clnico-evolutiva.
En el presente trabajo se han abordado los distintos aspectos de diagnstico
morfolgico e inmunofenotipico. As mismo se han estudiado dos factores pronstico
interesantes, la proliferacin y la ploidia con distintos anticuerpos y diferentes citometrias.
Dada la alta agresividad en el grupo de tumores elegido, la correlacin clnicoevolutiva ha sido acorde con la presentada en las neoplasias agresivas y el estudio
estadstico ha sealado puntos de inters a considerar en nuevos enfoques.
El presente trabajo ha sido realizado con metdica actualizada y rigor cientfico,
por lo que creemos que rene las condiciones exigidas para ser presentado como Tesis
Doctoral.

Madrid, octubre de 1998

Ci
Maria Castao
Catedrtica de Anatoma Patolgica
Directora de Tesis

Horacio OJiva
Catedrtico de Patologa
Director de Tesis

AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos
Es dificil, despus de realizarun trabajo largo y complejo cano es una TESIS DOCTORAL, recordar
y citar a todas las personas que habra que incluir en los agradecimientos finales, ya que cualquier olvido
podra ser mal interpretado.
Por esa razn es quizs ms adecuado hacerlo en principio a las Instituciones que me han permitido
y proporcionado material y metodologa para la realizacin del estudio.
La Facultad de Veterinaria de la UCM y a su Departamento de Patologa Animal II, en especial
Anatoma Patolgica e Histologa con todos los facultativosy tcnicos, como Elena de Patologa Mdica, han
de ser los primeros citados, por la faclitacin en la realizacin de necropsias y la recogida de historias
clnicas. Soy consciente de que sin el apoyo de Pedro, Pilar, Beln, Antonio, Eduardo, Laura y los dems todo
hubiera sido ms costoso.
En segundolugar el Departamento de Patologa de la Fundacin Jimnez Daz UAM, donde realic
toda la metodologa aplicada, al Servicio de Inmunologia por los datos de la CMF y a la Fundacin Conchita
Rbago que fmanci parte de mi estancia en dicho Centro.
En cuanto a las personas, sin olvidar a los directores de Tesis, Horacio Oliva y Mara Castao,
quisiera recordara todos: facultativos veterinarios, mdicos y bilogos, tcnicos de laboratorio general e IHQ,
sobre todo a Trinidad Carrizosa, por sus consejos, enseanzas y simpata.
A Pilar Ralicio por su eterna sonrisa, cario, constancia y confianza incondicional. Sin ella el paso
por la Fundacin no habra tenido t punto de comparacin.
Mis mejoresdeseos y total gratitud para las onclogas Ana Ageitos y Lola Prez de Alenza, las cuales
me ensearon a comprender la correlacin clnico-patolgica de la enfermedad con seriedad cientfica y el
respeto por el enfermo. Espero que la Sanidad, tanto humana como animal, se llene de personas asi.
Un recuerdo especial para las amigas Beatriz y Gema (las mejores para el desarrollo tcnico) y la
familia, en especial a ini hermana Elena, porque un trabajo de Tesis es tarea que a veces dificulta las
relaciones normalesy slo gandes dosis de tolerancia y cario pueden llevarla a buen fin. Tambin recordar
a todos mis amigos que han soportado mis rarezas durante casi cuatro aos con gran paciencia. En conato,
gracias a Macarena por dar forma a todos estos textos realizando la edicin final del manuscrito y por estar
siempre ah.
Ami ta Fanfl por la confianza que ha puesto en mi desde el principio y todas las enseanzas en el
arte de la citologa y de la vida

Agradecimientos

Mi madre es la ltima citada, porque no creo que existan palabras para definir lo que ha hecho por
estelrabajoypormi. Hasidolanicaenconflarenquetodoesteesfuerzoseplasmaraenalgo,yenpoder
combinar con xito la ecuacin madre-jefa-profesora. Fue mi principal impulsora y espero que esta tesis
eonstituya lo que ella habra esperado.
Soy veterinaria por el amor que siento hacia los animales. Agradezco a todos ellos lo que me han
enseado y espero que este trabajo, unido a los muchos actuales, les proporcionen a corto plazo mejores
posibilidades de supervivencia.
A todos los que de alguna forma han cooperado conmigo y he olvidado nombrar.

ABRE VIATURAS

Abreviaturas
Ag = Antgeno
ABC> Complejo ABC: Avidina-Biotina.
c = Anticuerpo.
AcMo Anticuerpo monoclonal.
AcPo = Anticuerpopoliclonal.
ADN = cido desoxirribonucleico.
El

Clula B sin memoria inmunolgica.

B2 = Clula B con memona inmunolgica

bcl-l = Oncogen.
bcl-2

Oncogen.

CD = Centroblasto.
CC = Centrocito.
CME= Citrometria esttica.
CMF

Citometria de flujo.

C3b = Fraccin 3b del complemento.

DRC = Clulas dendriticas del centro del folculo.
drc

Clulas dendriticas del manto folicular.

EBV Virus de Ebstein-Barr.

ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay.
FAIDS = Ver SIDA.
FeLV Virus de la Leucemia felina.
FeSV Virus del sarcoma felino.
flV = Virus de la imnunodeficienca felina.
FOCMA = Antgeno de la membrana celular del oncoinavirus felino /.Feline oncornavirus cel membrane
antigen.
HM = Clulas histiomonociticas.
IB = Inmunoblasto.
IDC = Clulas interdigitantes.
ff1 = mmunofiuorescencia indirecta.
lg = Inmunoglobulina.
IgFC = Zona de fijacin antignica de las inmunoglobulinas (fraccin constante).
gil = Cadena pesada de Ig.
IHQ

Inmunolstoquimica.

IL = Interleukina.
L = Linfoma.
LO!! = Lctico-dehidrogenasa.
LLA = Leucemia aguda linfoblstica.
al

Abreviaturas
LLC = Leucemia linftica ermea.
LMF = Linfoma del manto folicular.
LNH-B = Linfoinas no Hodgkin B.
LpI = Linfoplasmocitario.
MALT
ME

Tejido linfoide asociado a mucosas.

Microscopia electrnica.

MF = Micosis fiangoide.
PAAF= Puncin aspiracin con aguja fina.
PI = indice proliferativo (?Proliferation mdcx).
PO = Peroxidasa.
QDA= Programa de Anlisis del ADN (Quantitative DNA Analysis Programme).
QT = Quimioterapia.
RC = Remisin completa.
RP = Remisin parcial.
RN = Receptores nucleares.
RER = Retculo endoplsmico rugoso.
RP = Remisin parcial.
SIDA = Sndrome de Inmunodeficiencia adquirida (FAJUS: PeIne adquired immunodefiiciency syndrome
-SIDA Felino).
SNC = Sistema Nervioso Central.
SN? = Sistema Nervioso Perifrico.
STABC= Complejo Streptavidina-Biotina.
TVT = Tumor venreo transmisible.
VIII = Virus de la inmunodeficiencia humana (HlV: human mmunodefficiency virus).

a2

NDICE

Indice
AGRADECIMIENTOS
ABREVIATURAS
1.- PROPSITOS Y OBJETIVOS

11.-INTRODUCCIN:
A.- SISTEMA LINFOIDE; ORGANIZACION

B.- AREA B; FOLCULO LINFOIDE SECUNDARIO

C.- EL REA T O INTERFOLICULAR..

D.- CONTRAPARTIDAS TUMORALES

lo
lo
11

Dl.LinfomasB
D2. Linfoznas T

E.- BIOPATOLOGA DE LAS NEOPLASIAS LINFOIDES

11

F.- PROCESOS LINFOPROLIFERATIVOS EN ANIMALES DOMESTICOS

13

F. 1. Presentacin en e/perro
F.2. Presentacin en otras especies; linfoma-leucemia en elgato
F.3. Clasificacin clnico-anatmica en animales domsticos
F.4. Estadios clnicos en mam4feros
F.5. Historia clnicay diagnstico
F.6. Tratamiento. Quimioterapia
G.- TECNICAS ESPECIALES DE ESTUDIO

13
13
17
17
18
20
23

III.- MATERIAL Y MTODOS

A.- CASUISTICA

25

B.- MORFOLOGIA PTICA.

25

C.- MICROSCOPIA ELECTRNICA.

D.- INMIJNOHISTOQUMICA.

26

28

..

Dl. Procedimiento manual

D.2. Procedimiento automtico
D.3. Consideraciones tcnicas para la realizacin y valoracin de la JHQ
D.4. Anticuerpos utilizados en 1119

il

28
31
32
33

Indice
E.- ACTIVIDAD PROLIFERATIVA NUCLEAR

35

E. 1. Anticuerpos inonoclonales de prohferacn.

36

E.2. Analizador de imagen

37

F.- ESTUDIO CITOMETRICO

39

F. 1. Citometria esttica
F.2. Citometria deflujo
3. Valoracin del ciclo celular en cirometria

40
43
44

..

O.- ANLISIS ESTADSTICO

45

IV.- RESULTADOS

y.-

A.- HALLAZGOS CLNICOS

46

B.- AFECTACIN NECRPSICA TUMORAL

47

C.- MORFOLOGA PTICO-ELECTRONICA

50

D.- PATRONES DE TINCIN EN INMUNOHISTOQUIMICA

51

E.- CINETICA TUMORAL

54

F.- ESTUDIO ESTADSTICO

55

ICONOGRAFA
A.- TABLAS
B.- FIGURAS

58
65

VI.- DISCUSIN.
A.- CONSIDERACIONES GENERALES

107

B.- CONSIDERACIONES DEL GRUPO DE ESTUDIO

111

C.- CONSIDERACIONES BIODINMICAS

VII.- CONCLUSIONES

...

113

...

VIII.- BIBLIOGRAFA

118
120

i2

1.- PROPSITOS Y OBJETIVOS

Propsitos y Objetivos

Los procesos linfoproliferativos, dentro de las neoplasias malignas muestran una incidencia
ascendente en los humanos, que se rolaciona en partecon el aumento de la inmunodepresin, sobretodo la
adquirida: trasplantes y SIDA. La dificultad que acompaa a este grupo tumoral englobadistintos conceptos
de diagnstico y tratamiento; a pesar de una investigacin continua, los linfomas continan siendo actualidad
porque su conocimiento completo est unido al avance inmunolgico y teraputico.
La semejanza del sistema linfoide humano y animal, no slo mamferos sino tambin especies
inferiores,hace a priori muy interesante la consideracin comparativa de sus neoplasias. As mismo puede
servir para constatar la ayuda que los datos a nivel humano aportan en cl conocimiento de estos tumores.
El presente trabajo estudia los linfomas en la raza canina, de una incidencia superior a la humanay
con etiologa y epidemiologa no conocidas. No se han encontrado en ellos oncogenes causantes de
traslocaciones repetitivas, pero s una probable implicacinde los genes supresores. Ninguno de los virus
linfotropos responsables de linfomas en el hombre acta en el perro (t el virus de Epstein-Barr (EBV)
relacionado con el linfoma endmico africano dc naturaleza B o linfoblstico tipo Burkitt, ni el HTLV-I,
retrovirus condicionante del linfoma-leucemia agresivo de linfocitos T, endmico del Japne islas del Caribe).
Aunque en el gato se conoce que los virus de la leucemia felina (FeLV) y de la inmunodeficiencia felina (FW)
estn implicados en linfomas y leucemias por la induccin previade un estado de inmunodeficiencia, seduda
de una etiologa viral relacionada con los tumores linfoides del perro.
Para la consideracin de estapatologa animal, interesante y dificil, seutilizan conceptos semejantes
a los descritos en patologa humana. Existen discretas variantes en la clnica, estadiaje y terapia, y para su
correcta evaluacin morfolgica se han de incluir de forma necesaria nuevas metodologas.
En cuanto a la clasificacin dc los tumores, en el presentetrabajo se ha seguido la modalidad humana,
quizs no totalmente adecuada, porque estas neoplasias en la mayora de las sedes publicadas y en los casos
que aqu se consideran, son casi siempre de alta agresividad. No obstante, las clasificaciones de Le y
Working-Fonnulation, que consideran los linfomas segn los distintos grados de malignidad, parece que
cumplen de forma adecuada los objetivos de esta tesis.
Dado que no hay que olvidar que parte de los linfomas caninos no slo surgen en ganglios, sino en
piel, timo o aparato digestivo, se recogen tambin los conceptos de la escuela inglesa de los linfomas
extraganglionares (Isaacson), la revisin europea-americana REAL, y la ltima propuesta de la OMS &ara
clasificar los linfomas) que engloban linfomas nodales y extranodales. No obstante, dado que los distintos
subtipos descritos en las clasificaciones generales humanas, resultan con frecuencia poco superponibles con
los hallazgos encontrados a nivel animal, parece que los linfomas animales, todos no Hodgkinianos, se
deberan considerar porel lugar anatmico donde surgen, por la semejanza con las clulas que los originan
1

Ikqp4sitas y Objetivos
y por las caractersticas biolgicas de las mismas, las cuales incluyen mtodos biodinmicos para la
valoracin objetiva de la agresividad.
Los estudios de linfomas animales realizados hasta la actualidad, abarcan las caractersticas clnicas,
morfolgicas e inmunohistoquimicas (1H03 con anticuerpos monoclonales (AcMo) en congelacin, dirigidos
anti-anilgenos (Ag) animales. Faltan trabajos en los que la IHQ serealice con mtodos y anticuerpos (Ac) en
cortes parafinados, semejantes a los utilizados en patologa humana, casi todos comerciales y con alta
definicin, que por su probable reaccin cruzada, o por ser extensivos a mamferos, pennitan un mejor
reconocimiento celular y as una correcta tipificacin del tumor.
El presente estudio tiene como objeto entender la biologa neoplsica en el annal y saber silos
distintos linfomas muestran rasgos diferenciales o comunes en su presentacin clnica, diagnstico
morfolgico, inmunofenotpico, biodinmico y respuesta al tratamiento. Para ello se han elegido casos
representativos que anen material idneo para el diagnstico morfolgico multidisciplinario, lo que exige
tomas rpidas post mortem o bipsicas, as como protocolos completos clnico-evolutivos.
El material procede del Departamento de Patologa Animal II de la Facultad de Veterinaria de la
Universidad Complutense de Madrid-UCM Si las tcnicas se han realizado en el Departamento de Anatoma
Patolgica de la Fundacin Jimnez Din, Universidad Autnoma de Madrid-UAM, Centro de Referencia
de Patologa Linfoide, con experiencia adecuada en el diagnstico actualizado morfolgico ganglionar.
Los objetivos concretos especificados se citan a continuacin:
1.- Estudio clnico evolutivo
-

2.- Estudio morfolgico necrpsico, con tcnicas de rutina, microscopia electrnica e

inmunohistoquimica, con marcadores mono y policlonales.
3.-

Estudio biodinmico de las biopsias con marcadores proliferativos para posterior cuantificacin

en un analizadorde imagen CAS 200.

4.- Estudio del ADN con citometra de flujo y esttica.
5.- Estudio estadstico de los resultados.

II. INTRODUCCIN
-

Introduccin
-

SISTEMA

LINFOIDE; ORGANIZACIN.

Para una correcta comprensin de la inmunopatologa de los procesos linfoproliferativos, se deben

conocer los cambios tanto morfolgicos como inmunofenotpicos que ocurren durante la transformacin
linfocitaria, la anbriognesis y diferenciacin fisiolgica as como la divisin de los linfocitos en subgrupos
fimcionales, con el patrn de circulacin y anidamiento de los mismos /Taylor CR, 1982].
Desde que se hicieron las primeras descripciones del linfocito en 1774 hasta los ltimos aos, se ha
avanzado mucho en el conocimiento dinmico del sistema celular linfoide, no hay que olvidar que hacia 1958
scdudaba de la funcin linfocitaria, o

aquella clulacon atributos morfolgicas poco definidos /Mchell

Jet al, 1978].

Las clulas del sistema inmune, sobre todo los linfocitos, se distribuyen en rganos linfoides, donde
forman micr~ambientes intercomunicados con alta especializacin, que facilitan el atrapamiento antignico,
su catabolismo, cl trfico linfocitario y la estimulacin y diferenciacin ordenada de clulas efectoras [Kay
NR a al, 1979; Banks WJ, 1993].

Se pueden diferenciar tres compartimentos dc maduracin linfoide: A) clulas germinales, B) rganos

linfoides centrales de maduracin linfocitaria T oB antgeno-independientes (timo y equivalentes humanos
de la Bm-sa de Fabricio de las aves) y C) rganos linfoides perifricos, de generacin y dbsin de respuesta
inmune post-estimulo antignico (ganglios linfticos, bazo y sistema linfoide asociado a mucosas: MALT)
[LinchPC et al, 1982; Isaacson PG et aL 1983; Spencer Jet al, 1986].

La clula madre, totipotencial hematopoyticao clula STEM, se origina en los islotes hematopoyticos
del saco vitelino del embrin, en el hgado fetal y despus del nacimiento en la mdula sea (MO), dando
lugaralas diferentes series hematopoyticas, incluida la linfoide, objeto de este trabajo [RyseriEetal, 1974;
Mitchelliet al, 1978; KayNEetaL 979; Miller JFA.P, 979; QuesenberryPet al, 1979; Magrithflj
981; Sanchez Fayos Jet al, 1982;Nichols WSet al, 1983;Kempin U 1984; Sanchez Fayos Jet al, 1984;
FialkowPj 1988; Ban/cs WJ 1993].

La serie linfoide T madura en el timo. El contacto precoz de los linfocitos con las clulas epiteliales
timicas esfundamental para la adquisicin de la autotolerancia. Alrededorde un 5% de la produccin diaria
tmica surge de la zona crtico-medular para despus salir a la sangre y ser distribuida en las regiones Tdependientes de los rganos linfoides perifricos. Esta distribucin ocurre en virtud de factores
microambientales no totalmente conocidos, que en parte dependende las agresinas o molculas de adhesin
y de la accin del endotelio de las vnulas de las reas T. Los linfocitos T constituyen un 70-80% del total
linfocitario de sangre perifricay un 90% dc la linfa del conducto torcico [Lewne (3D et al, 1975; Rosai J
eta), 1976, Mflhler-HermelinkHx, 1986, Knapp Wc a), 1989; Henry X, 1992].
3

Introduccin
Scdiscute cual es el equivalente de la Bursa,rgano linfOide central de la serie B. En rasgos generales
se acepta que debe su la MO sobretodo niel individuo adulto. En ella maduran linfocitos B que constituyen
un 12-15%de los linfocitos circulantes en sangre perifrica, un 50% dc los linfocitos esplnicos y un 75%
deles de laMO /MitchellJflal, 1978; KayNA etal, 1979;MIIIerJFA.P, 1979;Nehols HS e: aL 1983;
Parks DE et al, 1983; Roitt1, 1988).

Los rganos linfoides perifricos presentan reas B y T dependientes, con una disposicin especfica
en cada rgano. En el ganglio linftico el rea T corresponde a las zonas paracorticales, centradas por la
vnula postoapilar; el rea B-dcpendiente corresponde a los folculos linfoides y a los cordones medulares,
y en ella las clulas B muestran distinta morfologa, modulaciny funcin. En el bazo (dentro de la pulpa
blanca o folculos de Malpighio) las reas 1 son las varnas celulares periarteriolares, y las B las rodean
formando folculos distintos a los del ganglio, ya que presentan un cenizo con vascularizacin capilaroarteriolar, mantoy rea marginal. En el sistema MALT los folculos o reas B se estructuran como en el bazo
(sin vasos en su interior) y el rea T es perifrica a los mismos, con una disposicin semejante a la que existe
en los ganglios linfticos [RivasC et aL 1975; Rivas C et al, 1980; lsaacson PC et al, 1983; Rivas C et al,
1983; Fujita Tet al, 1985].

En cada rgano sealado, las clulas linfoides estn en una malla o estromacon distintos tipos celulares,
que a su vez tienen diversas funciones. La funcin de sostn corresponde a elementos de hbito fibroblstico.
Otras clulas, de estirpemonocitaria, o fagocitan o inducen la respuesta y los cambios linfoides de alrededor
al atrapar en su superficie los antgenos; son las clulas presentadoras de antgeno, dendrticas foliculares
(DRC) en el rea B,o los complejos interdigitantes-clulas de Langerhans (DC) de las reas T [LinchDC
et aL 1982; Rivas C et aL 1983; FellerAC, 1985; Fujita Tet al, 1985].

B.- REA B; FOLCULOLINFOIDE SECUNDARIO.

Como ya se ha comentado, los folculos linfoides son unos agregados nodulares situados en la cortical
de los ganglios linfticos u otros rganos linfoides. Para su desarrollo se necesita una poblacin 1 timodependiente nomial. No ocurre una activacin completa o correcta en estado alterado de la inmunidad [Roa
1, 1988].

Cuando no ha existido un estimulo antignico previo, el folculo es homogneo y est constituido por
clulas linfoides de pequeo tamao y aspecto maduro (celulas B 1 sin memoria inmunolgica), es el llamado
folculo primario. Post accin del antgeno se constituyen los folculos secundarios, de mayor tamao, con

dos zonas bien definidas: una perifrica estrecha de clulas pequeas con ncleos densos, que constituye el
manto folicular, y otra central o ncleo claro porposeer clulas mayores, de ncleos con menor densidad
cromatrca, por lo que se destaca claramente del resto de la pulpa. Esta zona se llamaba antes germinal,
porque seinterpretaba como el lugar donde nacan en su mayor partelos linfocitos B [Fupta Te: al, 1985].
4

Introduccin
En el sistema MALT o en loo ganglios mesentricos el folculo se rodea de una tercera capa concntrica
semejante a la que prwann las zonas B de los folculos de Malpighio esplnicas, el rea marginal /Millkin

PD, 1969;Lnch DC e: al, 1982; FellerAC, 1985; Fujila Tet al, 1985; WoJfBC e: aL 1989].
Centro Folicular
Presenta clulas linfoides de gran tamao resultado de la modulacin de los elementos vrgenes
linfocitarios B1, con una morfologa caracterstica que las identifica como clulas del centro folicular. Las
ms pequeas o ms maduras son los cites (centrocitos CC) que miden de lOa 12 micras. Las mayores o
blastos (centroblastos CB) miden de 15 a 25 micras. Los CC tienen un ncleo hendido o de contorno
irregular con cromatina densa, nucleolo pequeo y escasas cisternas de retculo endoplsnco rugoso (RER)
intracitoplsmicas. Los CB tienen ncleos de contorno liso, forma ovalada, cromatina lan y nucleolos
hiperplsicos generalmente marginados; el citoplasma es escaso con mnima cuanta de RE [Rivas C et al,
1980].

La inmunohistoquimica en tejido humano demuestra positividad para los anticuerpos monoclonales

(AcMo) pan-B (CD19, CD2O, CD79a) as como para los Ac policlonales (Po): IgM, kappa y lambda,
expresando tambin el AcMo CD 10 En tejido animal fimciona bastante bien el AcMo CD79a y los AcPo
.

kappa y Lambda.
Las clulas de estirpe histiomonoctica (HM) modificada constituyen las dendrticas del centroo DRC.
Comparten marcadores con esa estirpe as como otros especficos (CD2 l-CD23). En tejido animal exhiben
casi en su totalidad la protena S-100, ya que otros Ac HM como el MAC 387 tien histiocitos sinusales.
Son en las DRC donde comienzan los cambios del centro folicular. Ante la llegada de ciertos antgenos,
cambian su morfologa y se hacen estrelladas, con cuerpo pequeo y largas prolongaciones que atrapan en
superficie abundantes complejos antgeno-anticuerpo (gracias a que poseen receptores para IgFc de las
inmunoglobulinas y complemento C3b) los cuales permanecen largo tiempo en su membrana, y facilitan la
transformacin de los linfocitos a blastos del centro: centroblastos y centrocitos (CB y CC) como un primer
paso para 1 formacin de la clula plasmtica o elemento especializadopara la formacin de anticuerpos.
Probablemente existen otras clulas intermedias en la respuesta B, como son los inmunoblastos (IB) y
las clulas linfoplasmocitarias (Lpl); tambin hay una serie de clulas B que tras su contacto con las DRC
quedan sin transfonnar, pero conservando la memoria inmunolgica (B2) y presentando la morfologa de
linfocito maduro. Las clulas CB mueren rpidamente y sus restos apoptticos son fagocitados por
macrfagos,responsables de la imagen en cielo estrellado del centro reactivo.
En estos foliculos secundarios ocurre la activacin B timo-dependiente. El macrfago capta el antgeno
(por medio de sus receptores de membrana) y lo elabora en su citoplasma, presentndolo despus a la clula
5

Introduccin
CD4 a colaboradora, en su superficie est unido al complejo de histocompatibilidad clase II (clase 1 silo
presenta al linfocito CDS citotxico). Con estos procesos as como con la produccin de interleukina (IL)-!,
cl macrfago estimula al linfocito cooperador, que a su vez produce la IL-il, determinando la proliferacin
B y T. Este es un mecanismo inmunolgico general Roitel, 1988; OrflzMasllorens F 1997], que est
ausente en estados de inmunodefletenca
Tambin se admite una activacin timo-independiente que ocurre con algunos tipos especiales de
artgenos (polmeras D-aminocidos, polisacridos, polivinilpirrolidona, etc...) que son capaces de estimular
las clulas E sin que las T estn involucradas. Parece que en concentracin suficiente, algunas sustancias
persisten durante un tiempo prolongado en la superficie de macrfagos especializados (probablemente
situados en el seno subcapsular ganglionar y en la zona marginal esplnica) consiguiendo transformaciones
E efectivas pero no cuantitativamente suficientes.
En el ganglio linftico no se conoce exactamente silos cambios descritos se producen en la pulpa
subsinusal o en la periferia de los folculos, en la zona del manto, donde las clulas HM (drc) constituyen la
trama dendrtica del mismo, actuando tambin como clulas presentadoras antignicas [RoJa!, 1988].

Manto Folicular
En el folculo secundario la zona clara central se rodea de una periferia densa, con peculiaridades
morfolgicas e inmunofenotipicas. Si la morfologa ptica era suficiente para definir las clulas CE, CC y
DRC del centro, no ocurre lo mismo con los tres elementos del manto. Su clula dendritica (clic) es menos
caracterstica que la DRC, con prolongaciones ms cortas y gruesas, ms vecinas a los histiocitos; las clulas
linfoides parecen elementos mayores que un linfocito, con ncleo de contorno irregular, cromatina densa y
nucleolo llamativo.
La inmunohistoquniicaproporciona en tejido humano un inmunofenotipo distintivo del manto. Las drc
son positivas con AcMo HM y negativas o dbilmente positivas con AcMo anti-DRC aunque, en ocasiones
muestranpositividad con desminay vimentina, careciendo, como las DRC, de fenmenos de fagocitosis. Las
clulas linfoides son positivas para IgM, pero adems muestran IgD, as como kappa y lambda, siendo
negativas con CD1O. Dichas clulas linfoides del manto pueden marcarse con el anticuerpo T restrictivo CD5
[Vteisemburger
D et aL 1985].

La actividad proliferativa tras el estmulo antignico difiere en centro y manto: en el primero la

positividad con ciclinas MIB1 (Ki67 en parafma) o PdO puede ser casi de un 100% y en el segundo de un
5 a un 10%. Los valores obtenidos en tejido animal son algo ms bajos [Gerdes.1, Dallenbach Fe:aL 1984;
Cerdes Lemke He: al, 1984; Gerdes Sabartiniketa 1993].

Introduccin
LaMicroscopia Electrnica (ME)malta las diferencias celulares entrecl centroy el manto. Las DRC
son de cuerpo pequeo y triangular, a veces doble, con cromatina fina y nucleolo poco llamativo; su
citoplasma es escaso y no muestra lisosomas secundarios, prolongndose en finas extensiones unidas por
desinosomas o hemidesmosomas que rodean estrechamente cada CB y CC. Las dendrticas del manto, drc,
son menores, con prolongaciones anchas que siguen a un citoplasma ms amplio que el de las DRC, con
ocasionales microflbrillas o cuerpos densos que recuerdan a mioflbrablastos; en las zonas ms perifricas
dichas prolongaciones se entremezclan tanto con las extensiones de las DRC como con los procesos
citoplsmicos de las clulas interdigitantes (DC) del rea T.
Las clulas linfoides del manto (10 micras) tienen ncleo redondo o hendido, cromatina densa y nucleolo
llamativo con citoplasma moderado y escasas cisternas de RER Se diferencian ultraestructuralmente de los
CC del centro, que son mayores (12 micras), con cromatina ms dispersa y nucleolo menor, siendo
excepcional el RER El CB del centro esel blasto mayor (15-18 micras) con ncleo liso de cromatina dispersa
y nucleolos prominentes, nicos o mltiples, generalmente marginados; su citoplasma es escaso con
abundantes polirribosomas y despolarizacin mitocondrial [Man Y et aL 1966; Millikin PO, 1969;
Kaiserling E. 1977; Rivas C, 1980].

La formacin del folculo secundario es la expresin morfolgica de la activacin del sistema inmune
en respuesta al contacto con el antgeno. La estimulacin de la clula B supone una proliferacin y
diferenciacin hacia la clula plasmtica, especializada en la formacin de anticuerpos especificas para el
antigeno en cantidad suficiente. La secuencia celular que va desde un linfocito virgen, sin contacto con el
antgeno, hasta la plasmtica, es discutida. Probablemente un linfocito B 1 pequeo da lugar a un CB que
rpidamente muere, siendo sus restos eliminados por macrfagos del centro reactivo. Los inmunoblastos (IB)
son muy similares a los CB pero poseen ms cisternas de RER y nucleolo central; parece que estas dos clulas
estn muy relacionadas tanto por su morfologa como por su inmunofenotipo. El CC es probablemente la
primera clula efectora, aunque de corta duracin. El siguiente escaln es la clula linfoplasmocitaria. Las
clulas del manto tienen un desarrollo inicial de retculo endoplsmico rugoso RER, adoptando una
morfologa similar a la linfoplasmocitaria.
Experimentos animales han determinado que en las DRC permanecen los complejos antgeno-anticuerpo
que condicionaran los cambios CB y CC. Clulas B2 de memoria llegaran al manto contactando con un
nuevo antgeno en las drc, lo que a su vez estimulara los cambios hacia clula plasmtica. Estos resultados
en conejos no parecen totalmente extrapolables al hombre [Kaiserling E 1977].
El manto es una zona polimorfa donde, adems de las mencionadas, existen otras B 1 y algunas B2
recirculantes. Podra ser el lugar de la transformacin B timo-independiente, donde antgenos especiales
permaneceran en las dic condicionando la diferenciacin a plasmtica. Es evidente que, en parte es un rea
residual del folculo primario, pero la morfologa descrita implica una funcin activa, y que es tanto mayor
7

Introduccin
cuanto ms grande es la respuesta centrofolicular.
En cuanto a las clulas efectoras o plasmticas, en ganglio son muy escasas en el folculo, ms
abundantes en el manto y predominantes en la pulpa terciaria. Van de la cortical a los senos medulares donde,
probablemente por un mecanismo holocrino, segregan inmunoglobulinas al sistema de senos medulares y de
ah al torrente linfticoy sanguneo.
El folculo espredominantemente B, pero tambin tiene clulas T. stas se sitan entrecentro y manto;
las CIX (Helper cooperadoras) son aproximadamente el doble de las CDB (Citotxicas supresoras) en
-

respuestas ganglionares inespecificas, pudiendo invertirse este cociente en situaciones no tumorales o

tumorales. No se conoceexactamente cul es su funcin [WofBCet aL 1989]. Es importante recordar que
la activacin morfoinmunolgica no es superponible a la inmunolgicamente conocida, de las clulas B oT
[Roa 1, 1988; Ortz-Masllorens F, 1997].

Area Marginal.
En reas extranodales, bazo (pulpa blanca) y sistema asociado a mucosas (MALT - placas de Peyer),
se observa una tercera zona externa al manto: la zona marginal [lsaacson PC et al, 1983; Spencer i, Fnn
Tet <4 1986; Nonon A, Isaccson PC, 1994]. Est formada por clulas 8 recirculantes con fisiologa an no
totalmente conocida. Su fomm esredondeada o estrellada, sin dendrticas intennedias, montonas en la ptica,
de ncleo redondo, con citoplasma claro. La electrnica demuestra un contorno irregular, moderado
citoplasma, con escaso RER y ncleo poco activo.
La ll-IQ del rea marginal es compartida parcialmente con el centro, toma los marcadores 8 pero no el
CDIO y expresa IgM. Es negativa con CD5 e IgD, marcadores del manto folicular.
C.- REA T O INTERFOLICULAR
En la zona cortical y entre los folculos se encuentra el rea timo-dependiente o interfolicular. Est
constituida por linfocitos T de predominio maduro, con distintas formas blsticas intermedias, hasta
inmunoblastos T.
En muchos ganglios esta zona tiene una apariencia nodular que representa una reaccin 1 con histiocitos
no fagocitantes que recuerdan al folculo, porello algunos autores la llaman folculo terciario. Su hiperpasia
ocurre en muchos procesos, sobre todo los de origen viral y en enfermedades inmunolgicas [Knapp W a aL
1989]. En su seno hay dos estructuras especializadas que condicionan la morfologa de esta zona: la vnula

post-capilar y el complejo de clulas interdigitantes.

Introduccin
La vnula post-capilar est revestida por clulas endoteliales altas de forma trapezoidal, con riqueza en
orgnulos citoplsmicos y microfibrillas semejantes a las de los elementos que revisten los sinusoides
ganglionares. Parece que estos endotelios contienen un receptor de ubiquitina [Roa1. 1988] que acta como
una lectma que reconoce complejos fosfatados de la superficie del linfocito, por lo cual existe una interaccin
entre ellas y los linfocitos que lleva a un adhesin de ambos elementos. Despus de la unin y merced a la
formacin de pseudpodos,el linfocito seintroduce en el citoplasma endotelial, serodea del mismo, desciende
a la basal, y sale a la pulpa por debajo del pericito. Este paso intraendotelial o emperipolesis que ocurre
tambin en los capilares venulares Rivas C, 1980], es caractersticodel linfocito, ya que los polinucleares
atraviesan la pared por las uniones inter-endoteiales.
Los linfocitos llegados por va venular colonizan la pulpa T y se modifican por los antigenos expresados
en superficie por las clulas interdigitantes.
El complejo de clulas interdigitantes-Langerhans (DC) son a la zona 1 lo que las DRC al centrodel
folculo. Estn constituidos por un grupo de clulas monocitarias transformadas cuya funcin es mantener
distintos complejos antignicos en la superficie de sus prolongaciones. Dichas proyecciones son gruesas y
cortas y se extienden en ocasiones hasta los linfocitos del manto folicular [Rivas C, 1991]. El citoplasma es
amplio, con abundantes organelas, lisosomas sin signos de fagocitosis y cuerpos de Birbeck(caractersticos
de este elemento, de funcin discutida, situados en las vecindades de la membrana plasmtica o en las
cercanias del Ciolgi).
Las DC expresan en membrana el antgeno CDL que comparten con los timocitos corticales, y se tien
tambin con el Ac anti-protena S- 100. Su dinmica es grande y cuando se introducen en la luz de los senos
se hablade las clulas veiled o escondidas, slo detectadas por IHQ. Fue descrita porVeldman [Lennert
Ka aL 1978] en conejos y su nombre se debe a las interdigitaciones que relacionan estos elementos entre si
y con los lmfocitos vecinos.
Entrelas clulas 1 hay abundantes elementos B transformndose a plasmticas que caminan a los senos
medulares para vertir en ellos los anticuerpos secretados; hay una clula no totalmente conocida, la llamada
clula T plasmocitoide, caracterstica en algunas respuestas del rea 1 en linfadenitis (sobre todo la
dermatoptica), que separece a las plasmticas desde el punto de vista electrnico, por el desarrollo del RER
aunque no forma inmimoglobulinas, y que es una modificacin de los linfocitos 1, que expresan anticuerpos
CD3 y CD4 [Lennert K a aL 19781.

Intmduccin
O.- CONTRAPARTIDAS TUMORALES
D.1) LINFOMASR

En patologa humana el centro, manto y rea marginal dan lugar a distintas neoplasias:
1. Del centro y por la accin del oncogen bcl-2, que en un porcentaje alto lleva a la traslocacin t(14,18),
surgen los linfomas CENTROFOLICULARES de bajo y alto grado [Peralta E et aL 1990]. Es probable que
puedan tambin originarse los linfomas II4MUNOBLASTICOS ya que CB e IB, como se ha comentado
previamente, son dos clulas relacionadas. Asimismo, se ha cuestionado si los linfomas LB tipo Burkitt
pudieran serdel centrofolicular, ya que los blastos EBV relacionados son parecidos al CB de menor tamao
que el reactivo con el mismo inmunofenotipo [LennerrK, 1978; Rivas C, 1982].
2. En el manto, debido a la traslocacin (11,14) por la accin del oncogen bcl- 1 surgen las neoplasias
aceptadas slo en humanos [JaifeES 1987; Weisenburger DD, 1987] conocidas como linfomas del manto,
llamados de diferenciacin intermedio no comprobadas en animales. Esta neoplasia corresponde al
,

linfoma centrocitico de la clasificacin de Kiel [Lennert K et aL 1983].

3. Parece que el rea marginal es la responsable de los linfomas extranodales del MALI (de los cuales los
gastrointestinales son los ms ftecuentes). De reacciones extranodales inflamatorias o inmunes que
estructuran tejido linfoide extranodal reactivo en el seno de distintos rganos (como piel, tejido tiroideo,
pulmonar etc..), surgen as mismo linfomas superponibles a los MALI de predominio B. Sus clulas son
diferentes a las del rea marginal reactiva, modulndose desde linfocitos y plasmticas a blastos medianos
hendidos (CC-like) y otros de mayor tarnalio (CB-like) que reciben esa denominacin porque recuerdan
al centrocitoy al centroblasto con microscopia ptica. No obstante, con ME exhiben un desarrollo del RER
superior a cualquier linfoma nodal de esa morfologa, siendo los blastos mayores, semejantes a plasmablastos.
Las clulas ms maduras muestran epiteliotropismo en el cuello de las glndulas (estmago e intestino)
constituyendo las lesiones linfoepiteliales, caractersticas para el diagnstico flsaacson et aL 1983; Spencer
ji McDonald Ter aL 1986; Isaacson PC eral, 1989; Castrillo .LVI el al, 1990 ; Isaacson PC, 1990; Rivas
Cer aL 1990, Rivas Cer aL 1991; Rivas CetaL 1991; Castrillo JMetaL 1992; NortonAier al, 1994;
Norron XI et aL 1994; Montalbn C et aL 1995].

4. Clulas B precursoras semejantes a las de la MO seran las responsables de los linfomas-leucemias B

linfoblasticas. El linfoma LB B tipo Burkitt se consider en un principio constituido por estos mismo
elementos; en la actualidad y como sc ha comentado previamente, parece relacionado con el centro folicular
[LennertKetal 1978 y 1981].

lo

Introduccin
A2) LINFOMAS E
Los lnlbmas 1 son neoplasias polimorfas de clulas 1 perifricas o precursoras /Stein JI 2olksdorfG
er aL 1981; Rivas C et aL 1982; Vicente J, 1982;Montalbn C et al, 1993], de localizacin primitiva o
nodal, o extranodal. Para su identificacin es imprescindible el estudio inmunohistoquimico, ya que la
morfologa citolgica por s misma puede llevar a entres diagnsticos. No se puede hablar de alto y bajo
grado de forma comparativa a los t2~lH-B, dado que globalmente son siempre ms agresivos. Entre los LNH1 perifricos, CD4+ y CDS+, hay que destacar: 1) Los NODALES, de mayor o menor agresividad, con
clulas semejantes al linfocito 1 perifrico pero con ncleo irregular, y 2) Los EXTRANODALES de
predominio cutneo, entrelos cuales hay que incluir en la actualidad parte de los linfomas citotxicos, algunos
CDS [FranksPTetal, 1986; WellmanML etaL 1989;MoorePFetal, 1994; WJJO 1997].
E.- BIOPATOLOGIA DE LAS NEOPLASIAS LINFOIDES.
Se dice que los procesos linfoproliferativos, leucemias o linfomas, suelen presentarse exhibiendo un
inmunofenotipo que reproduce en cierta manera a la biologa de las clulas normales, dentro de la secuencia
de modulacin funcional de los sistemas linfoides B y 1. De ahi parten las hiptesis de que las neoplasias
constituyen una expansin clonal de un elemento celular mutado con un stop madurativo a nivel de un
momento de su ontogenia [SnchezFayos Jet al, 1982; WrightDHetat 1983; HabeshawiA eta! 1988].
Esta idea que resulta de utilidad para la comprensin de los linfomas, no es siempre exacta. Es bien
conocidoque en la mayora de las neoplasias linfoides de clulas pequeas o bien diferenciadas, los elementos
tumorales suelen reproducir la morfoinmunologia normal o reactiva (aunque se demuestra que las clulas
presentan alteraciones citogenticas importantes),pero no sucede as en las ms agresivas o desdiferenciadas,
donde se observan fenotipos aberrantes o defectivos. As mismo la citogentica expresa alteraciones
cromosmicas importantes incluso en las ms diferenciadas [Gardo R et aL 1994].
Para considerartodas estas neoplasias, durantemucho tiempo sehan establecido distintas clasificaciones
[RappaporH,1966; Gerard-MarchantRetaL 1974; KimHet al, 1974; LennertKet al, 1975; LukesRi,
1975; Dorfman R~ 1977; Lennert 1< eta!. 1978; Weissman IL eta!, 1978; Lennert K et aL 1981; RobbSmith AHet aL 1981;WeisenburgerDD et aL 1981; Working Formulation <National Cancerntiruw
1982; StansfeldAGetaL 1988; LennertKeta 1990; REAL: HarrisNetaLI993; RE4L: Chan JKetaL
1994; WHO 1997], mucbas de ellas adaptadas a Medicina Veterinaria [CarterRFet al, 1986; Parodi AL,
1988; GreenleePGetaL 1990; TeskeE, 1993; FisherD.Jet al, 1995; Fournel-FleuryCetat 1997]. En

este trabajo se ha elegido de un lado la clasificacin de Kiel [LennertK et aL 1975; Lennert Ka aL 1981;
LennenKetal, 1990j dado que en ella se perfilan rasgos morfolgicos y clnicos dentro de los linfomas B,
bajo y alto grado de agresividad, y tambin la WF [Working Fonnulation - Naflonal Cancer Intitute 1982]
muy utilizada en Patologa Veterinaria [CarterRFet aL 1986; Couto CG 1985; Couto CG et aL 1995] en
-

11

Introduccin
su evolucin natural sin terapia, que aade junto a los grados bajo y alto, el concepto de agresividad
intennedia, aunque engloba sin embargo, de forma unitaria, los linfomas de estirpe B, T nodales y
extranodales [CattoretfiGeta), 1992] (labias 1,11 y III>.
Un infamo de bajo grado o & evolucin favorable es aquel que, desde su diagnstico hasta que causa
la muerte, tiene una evolucion lenta; se presenta con extensinconsiderable y en estadios avanzados. Los
portadores (datos en medicina humana) no responden totalmente a la terapia mltiple; los casos de edad
avanzada o mal estado general pueden manejarse con tratamientos poco agresivos o sintomticos, dado que
el pacientepuede convivir con su neoplasia.
El lmnfoina de alto grado sin tratamiento provoca la muerte en un plazo corto; puede estar localizado
en el momento del diagnstico, si el individuo acude pronto a consulta (estadios bajos), responde rpidamente
a las terapias, pero tiende a recidivar si no se utilizan protocolos agresivos. Puede alcanzar remisiones
completas en un 60% de los casos.
El grado intermedio remneda en la clnica ms a los linfomas de bajo grado, con una dinmica mayor que
ellos y poca respuesta a terapias convencionales, con recidivas mltiples y curso trpido.
El conocimiento de estos linfomas en la actualidad, se ha perfeccionado gracias a la aportacin del
mmunofenotipo o expresin en sus clulas de marcadores monoclonales de ncleo y citoplasma, indicativos
de la estirpe y agresividad tumoral asi como de la proliferaciny diferenciacin. Muchos casos, sobre todo
en los de bajo grado se puede conservar el inmunofenotipo habitual de las contrapartidas celulares no
tumorales, pero en el alto grado, los tumores presentan un inmunofenotipo variable que puede ono recordar
a las clulas originarias o tan slo expresar la estirpe B, 1 y signos proliferativos de agresividad.
La dinmica tumoral estudiada con marcadores proliferativos [CenSesji Dallenbach En aL 1984;
Gerdesi, LemkeHe al, 1984; Srein H, Gerdes Jet al, 1987;GarciaRL eraL 1989; ial! PA eraL 1990;
KameOFVer al, 1991; Gerdesi SabaninlEetaL 1993; Fournel-FleuryCetaL 1991] es importante para

conocer la respuesta a la terapia, la tendencia a las recidivas y la correlacin con el estudio del ADN. Esta
parte, ms experimental seconsiderar con citometrade flujo y esttica [JoensuuH et al, 1990; Manen 4
eraL 1993; BraylanRC, 1993;Marcos B etal, 1993; WojcikEMet al, 1993;GarciaR etaL 1994; LeeS
a aL 1994; Marcos RetaL 1998; Sanz C et aL1998]. A priori, si serelacionan los conocimientos y avances

de las diploidas y aneuploidias en el pronstico de estos linfomas, intuiramos peor pronstico en los casos
aneuploides y mejor en los diploides, pensando que deberan corresponder a tumores linfoides ms o menos
agresivos respectivamente.
La correlaciny los valores estadsticos de agresividad, morfologa y posible supervivencia sern datos
considerados y valorados dado que su conocimiento es imprescindible como factor pronstico en la evolucin
12

Introduccin
de la enfermedad.

F) PROCESOS LINFOPROLIFERATIVOS EN ANIMALES DOMSTICOS

FJ) PRESENTAClON EN EL PERRO

El linfoma en el perro es una de las neoplasias ms ftecuentes con una presentacin anual de 30:
100.000, lo que supone el doble de la incidencia humanay 2/3 de la presentada en gatos. Segn los datos
publicados fl-Jardyir WD a aL 1989; Moulton JE eta?, 1990; Keller E?, 1992; Teske E, 1993; Vall VEO
et aL 1993; Conto GC et aL 1995], existe una predisposicin racial en el caso del Boxer, Basset Hound, San

Bernardo, Scottish Ten-ier, Airedale terrier y Bulldogs. La edad media de presentacin es de 6-7 aos (edad
media adulta) a diferenciade la presentacinjoven del gato, con un rango desde los 6 meses hasta los 15 aos.
No se observa una mayor incidencia por sexo que sea conclusiva, con una presentacin similar en ambos
[1-lardyir WD a al, 1989;Mmdfon JE et a!, 1990; Teste E, 1993; Va/li VEO a al, 1993]. Aunque la
etiologa exacta del linfoma y leucemia linfoide canina es an desconocida, sehan hecho numerosas hiptesis
de sus distintas posibilidades: infecciosas (sobre todo vricas), ambientales (carcingenos y co-carcingenos:
herbicidas en linfomas [CotranR et aL 1990; Teske E et aL 1993]), deficiencias en el sistema mmune,
genticas, etc.... Parece que los retrovirus estn implicados en el desarrollo de linfoma/leucemia en numerosas
especies como peces, serpientes, aves, roedores, gatos, vacas, primates y humanos. Diversos estudios
muestran con ME partculas retrovricas y niveles superiores a los normales de transeriptasa inversa en
cultivos celulares de estos linfomas, hallazgos que podran relacionarse con una posible etiologa vrica,
aunque no de forma concluyente [1-Jardyir 7/1) et aL 1989; Teske E, 1993], ya que parecen haberse
encontrado tambin en tejido linfoide de animales sanos.

E 2) PRESENTACIN EN OTRAS ESPECIES; LINFOMA/LEUCEML4 EN GATO.

La presentacin del linfoma en otras especies es, en unos casos espontanea, y en otros inducida por virus.
Vamos a centrar el inters en la especie felina, la cual, junto a la humanaha sido tomada como elemento
comparativo, para as intentar encontrar semejanzas morfolgicas, clnicas o cinticas, con respecto a tumores
linfoides caninos [Hardyir WD eta), 1989; Couto GC eta), 1995].
En el gato la etiologa del linfoma/leucemia viene dada por la infeccin persistente, e incluso latente, del
virus de la Leucemia Felina (EeLV), perteneciente a la familia Retroviridae, que se caracteriza por tener la
capacidad de copiar su cadena simple de ARN a una doble de ADN gracias a la accin de una enzima
conocida como rranscriptasa inversa. La copia de ADN vrico se integra dentro del genoma de la clula
infectada. Hay dos subfamilias con trascendencia clnica,los oncovirus y los lentivirus. La subfamilia de
oncovirus incluye virus inductoresde leucemiasy sarcomas en diversas especies como aves, mridos, flidos

13

Intrtduccin
(FeLVy FeSV), primates y hombre, y tambin carcinomas en mridos y primates. Los lentivirus engloban
distintas acciones: ananiognica (quidos), nairotrpica (virus Visna&Maedi en vidos) e inmunosupresora,
de gran importancia actual porel sndrome de inmunodeficencra adquirida (SIDA) por el virus H1V humano
[Cui LX et al, 1995], con su homnimo en flidos, primates y bvidos. El cuadro de inmunodeficrencia
adquirida sepresenta en gatos asociado a la infeccin por dos retrovirus, aislados o combinados: el oncovirus
FeLVy el lentivirus flV.

NOCIONES GENERALES DEL VIRUS FeL V

*

VIROLOGIA DEL FeLV: Existen dos grupos de formas vricas: las formas endgenas y exgenas.

Las secuencias endgenas se transmiten genticamente y no tienen ciclo de replicacin en el hospedador,

pero se pueden combinar con la forma ms comn del virus (FeLVA) para dar las otras variantes (B,C).
Estn presentes en el genoma d.c todos los individuos. Las formas infectivas exgenas del virus
probablemente se formaron por infeccin cruzada de un retrovirus de rata con un ancestro del gato domstico,
como ya se ha demostrado en medicinahumana. Hay tres formas principales de virus FeLV, identificadas por
la proteina gp7O de la envuelta. Se forman por recombinacin de la forma A con las secuencias endgenas
relacionadas, El virus, en s mismo, no tiene un oncogen transformadorconocido. El genoma est formado
por tres grupos de genes que transcriben las protenas estructurales, Iranscriptasa inversa y envuelta,
respectivamente /1-Jardyir 7/1) etal, 989; Moulton JE et al, 1990; Buracco 1> et aL 1992; Teste E, 1993;
Va/Ii VEO eta?, 1993; Cal/unanJier aL 1996].

CICLO BIOLGICO: Las formas de exposicin, y tipos de infeccin se detallan en el siguiente

esquema [Hardyir 7/1) et al, 1989]:

VIRUS F.LV
Fones de apoaioiMr

aalivu, Ihgtn aln nasal

EXPOSICIN DEL CATO Multwlioacin en linfocito.
dcl ganglio regional
GATO INMUNIZADO

INFECCION

ACNV,ACFQCMA en .anglt
PERSISTENTE

LATENTE

.Extansina MOy ganglio..

?to,in,a;

,mdt~lincin ncluis

LINFOMAFLV .2

nucleadas d. la amia
linfoide. anieblas ytolde.
aalh~ aacno, nasal

EXTENSION GENERALIZADA -

TRMSMISION HORIZONTAL

tu~ ledas

TRANSMISION VERTICAl.

Para la deteccin de Acen sangre se utilizan dos mtodos: la IFI (inmunofluorescencia indirecta)y la
14

Introduccin
ELISA (enzimelinked immunosorbcnt assay). La ff1 indica positividad (infecciosidad) en un 97% de los
casos, y la ELISA produce un 30-50% de falsos positivos, ya que no tienen el virus en plasma ni en saliva,
por lo que no se transmite.
*

RESPUESTA INMUNE AL FeLV: Para una correcta valoracin de la respuesta inmune del

hospedador frente a la infeccin por FeLV, hay que teneren cuenta los ttulos del anticuerpo neutralizador
del virus y del antgeno FOCMA.
a An&wapofrenteal antgeno FOCMA (Felineoncornavirus ce]] membrane antigen / Antgeno en
membrana celular del onconiavirus felino): Se aisl de la superficie de clulas del linfoma B y T (FeLV+/-),
leucemia linfoide, nneloide y entrode, y tambin en la superficie de las clulas del fibrosarcoma inducido por
FeSV (Feme Sarcoma virus). No seencontr en los linfocitos normales ni incluso en los infectados por FeLV
A/B. Se supuso que dicho Ag se podra considerarcomo un Ag especifico tumoral inducido porel FeLV 1
FeSV. Serolgicamente era distinto, aunque relacionado, a la glicoproteina gp7O de la envoltura del virus.
Pareca que altos ttulos de Ac frente al FOCMA produca resistencia frenteal desarrollo de tumor FeLV- o
FcSV-inducido, pero no frente a las infecciones virus-dependientes y enfennedades no neoplsicas. Hoy en
dia tambin sehan aisladoen tejidos del animal mfectado (de forma activa o latente) en tejidos no tumorales
[Hardyir 7/1) et al, 1989; Mou/on JE e: al, 1990; ValIl VEO e: al, 1993].

it Anticuerpo

neutralizador del virus (VNntihody): corresponde al Ac contra la glicoproteina viral

gp7O. Ttulos altos generan resistencia al efecto inmunosupresor y, por tanto, a las infecciones secundarias,
pero no frente al desarrollo de tumor virus-inducido.
*

ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR EL FeLV: En la siguiente tabla sc detallan las posibles

enfermedades producidas por el FeLV, tanto prohferativas como degenerativas y los rganos que ms
frecuente implica.
a. Mecanismo de induccin tunsoral del FeL 4 No es del todo conocido; estudios moleculares
muestran que los FeLV aislados del tumor contienen genes celulares progenitores c-myc (proto-oncogen)
transducidos o transformados a Y-mr (con secuencias de codificacin para el gen celular). Ya que e]
retrovirus en s tiene una transformacin lenta y que carece de oncogen propio para una tumorognesis, la
capacidad de adquirir oncogenes celulares adquiere gran importancia para la posible tranformacin maligna
sin que necesariamente produzca inmunosupresin, asimismo ocurre con el lugar de insercin en el ADN
celular, activacin de genes vecinos y tipo de secuencias (p.c. altamente repetitivas, regiones constantes, que
se expresen en gran medida,.. etc). Dicho proceso se ha verificado en el caso de linfomas B tipo Burkitt
humano EBV relacionado y plasmocitomas de ratn; en el caso de linfomas B humanos se conocen las
traslocaciones que envuelven al cromosoma 8 donde se localiza el c-myc y los que contienen los genes para
las cadenaspesadas y ligeras lambda y kappa de las inmunoglobulinas (14, 2 y 22 respectivamente). El c-myc
15

Introduccin
se sita en la banda q24 del cromosoma 8; la protena codificada (myc protein) tiene una funcin
desconocida; se ha visto que aumenta en clulas en estado quiescente por estimulacin con factores de
accnmento, aunque permanece constante en divisin celular. La induccin turnoral se produce con varios
mecanismos, como la transduccin del c-myc a un cus no funcional de la cadena pesada de las Ig. Otra
explicacin sera por la accin de la protena myc, nunca alterada en las traslocaciones y encontrada a altos
mveles en los linfomas tipo Burkitt, y que es capaz de estimular a las clulas en estado quiescente; otro
supuesto es la proximidad del c-myc a los genes de las Ig: as podran influenciarse de los puntos de rotura
de la traslocacin, la orientacin de los genes, uso de los promotores de las Ig para el c-myc,... etc. La
explicacin ms plausible de la implicacin constante de los genes de las Ig con el c-myc en la induccin
tumoral es que dichos genes son muy activos a nivel transcripcional, y las traslocaciones ocurren muy
frecuentemente en los mecanismos de recombinacin para la reconstruccin de los genes de las Ig[Hopkins
N~ 1988; Hardy ir WD et al, 1989; Mange AP et al, 1990; Mou/ton iR et al, 1990; Va/li VEO a al,
1993].

El virus de la Leucemia T humano HTLV 1 es tambin un oncovinis, pero tiene un mecanismo de

mduccin tumoral totalmente distinto; no seintegra en zonas concretas del ADN ni cerca de proto-oncogenes,
sino pormedio de un gen transformador conocidocomo 0<0 br [HopkinsNH, 1988; Cotran R et aL 1990;
Mange AP a aL 1990].
tipo celular

saL proliferetva

enf degenentiva

linfocitos

liafon

atrofie tncsflnfopenia./SDA felino

Mdula sea:
prandva mesenquinial

retsculocndoteloaush,st,ocsto.is

mene euitroide

toleucenis.

meas nueloade

lencenna nueloade

Hipe- /.plauia/.peruias

.30

megacsnobatzca
mene n,onocites

leucemia mnonocitoide

.stent-ffibroblatoa 4- oateoblaaroa

sndrome ostco,nieloprolifeostzvo

rin

glonienilonefiitis por EcLV.raunoconwle,oe

tero

Alnto/reabuorcuone.

b. Las enfermedades no neoptsicas inducidas por el virus seran secundarias al estado de

inmunosupresin en la que se sume cl animal infectado con FeLV y FN. El mecanismo de dicha
inmunosupresin FAIDS-FeLV asociada no es totalmente conocido, pero se cree que tiene distintas bases:
1. El proceso de replicacin viral y exocitosis en el que el virus serecubre de la membrana celular, produce
la lisis o sensibilizacin de la clula para su posterior destruccin por el sistema inmune. Las clulas T
dependientes del timo son las primeras clulas diana.
2. Los Ag solubles, as como los inmunocomplejos que circulan en sangre pueden causar por s mismos la

16

Introduccin
inmunosupresin; in vito las protenasde la envuelta como la piSE disminuyen la transformacin blstica
e mtaten en la produccin de 1L2, con consiguiente supresin de las clulas T helper. Hardy JrWD et al,
1989]
Aunque el mecanismo expuesto se ha demostrado slo en gatos, nos ha parecido interesante insistir en
su dinmicaya que las especiescanina y felina estn ntimamente relacionadas, a pesar de que como ya se ha
comentado, no est demostrado a nivel canino.

F.3) CLASIFICACIN CLNICO-ANATMICA ENANIMALES DOMSTICOS.

*

Multicntrico

Alimentaria

Tmico o mediastiruco

leucemia verdadera (mdula sea-sangre slamente)

Solitario (Cutneo, renal, SNC-SNP, ocular,...)

Orden segn frecuencia de aparicin:

PERRO: multicntrico, Alimentario, Timico y extranodal (cutneo

GATO: tmico, alimentario, multicntrico, forma leucmica y resto de presentaciones extranodales : ocular,
del tracto respiratorio superior, renal, cutnea, SNC y SNP,. etc [Cauto CG a al, 1989; Hardy ir *7) a
al, 1989; Moukon iR el al, 1990;Teske E, 1993; Va/li VEO e: al, 1993; Couto CG el al, 1995].
.

E 4) ESTADIOS CLNICOS EN MJ4MFERO&

ESTADIAJE EN VETERINARIA:
1: Afectacin de un ganglio, o tejido linfoide de un rgano, sin incluir la mdula sea.
II: Afectacin de varios ganglios dentro de un rea regional (con/sin afectacin amigdalar).
III: Mectacin generalizada de ganglios linfticos.
IV: Afectacin de hgado y/o bazo (con/sin estadio III).
V: Extensin a sangre y mdula sea (con/sin los estadios 1-1V).
Y cada estadio se divide a su vez en: A) sin sntomas sistmicos, B) con sntomas sistmicos [Hardy
ir VI) et aL 1989; Maulton JI? et al, 1990; Teske E, 1993; ValIl VEO et al, 1993; Cauto CG ej aL 1995].

ESTADIAJE EN MEDICINA: (Clasificacin de Ann Arbor)

1: Enfermedad limitada a una nica regin ganglionar o una localizacinextralinftica (E).
II: Enfermedad que afecta a dos o ms regiones ganglionares a un lado del diafragma o con afectacin limitada
de un rgano o tejido extralinftico adyacente.
17

Intmduooin
III: Enfermedad que afecta a regiones ganglionares a ambos lados del diaagina (110, lo que puede incluir
afectacin del bazo (lll~) o afectacin limitada de un tejido u rgano linftico adyacente (ffl~).
IV: Enfermedad diseminada, que afecta a uno o ms rganos exlralinfticos, con o sin afectacin linftica
[Carbone
PP et al, 1971; PetoR gr al, 1977; Fis/ter RL 1981; DIaz Rubio E et al, 1991; GonzlezBaron
AL 1992; Espaa P, 1993; Sauham RL et al, 1993].

ES) HISTORL4 CLNICA YDL4GNSTICO

Para el diagnstico correcto de esta neoplasia y su fbrma de presentacin, se valora la exploracin fisica,
la citologa por puncin aspiracin con aguja fina (PAAF) [CarterRFet al, 1988; DelverderM et al, 1988;
Hawkins EG et aL 1993; flsherD.Jet aL 1995; CannianiMer al, 1996], la analtica sangunea,radiografla,

ecografla abdominal y en ltimo caso la biopsia.

Las formas mu ticdJdrica, alimentaria y mediastin ca del linfoma son las ms frecuentes, suponiendo
cl 90% de todas las presentaciones [DobsonJMet al, 1993]. Las fonnas cutnea, epiduraly renal son poco
frecuentes en ambas especies, constituyendo un 10%de todas las formas de presentacin. En su totalidad las
localizaciones extranodales que aparecen en perro y gato son: cutnea, renal, ocular, del tracto respiratorio
superior, del sistema nervioso central y perifrico -linfoma epidural- [Spodnic/c0.1 a al, 992], o de
cualquier rgano o tejido del organismo.
En la exploracin fsica, e! animal con la forma mulucntrica del linfoma presenta infadenopata
superficial generalizada de todos los ganglios palpables (submandibular, cervical, preescapular, axilar,
inguinal y poplteo, y ms excepcionalmente del facial, retrofarngeo e ilaco) con extensin frecuente a
amgdalas incluidas las palatinas. Al tacto los ganglios son duros e indoloros, con un aumento de 5 a 10 veces
su tamao original, con temperatura normal (linfadenopata fra)y frecuentemente se presentan adheridos
a planos profundos. La linfadenopatia generalizada puede asociarse a otros sntomas como apata, cansancio,
anorexia, prdida de peso y actividad fisicaEn la necropsiade un linfoma multicntrico se observa que los
ganglios mesentricos, sublumbares y frecuentemente el bazo suelen tener las mismas caractersticas, aunque
su afectacin depende del estadio clnico de linfoma en el que sea diagnosticado. Es frecuente que el animal
acuda a consultaen un estadio filo IV, donde todos los ganglios internos, bazo e hgado estn afectados, o
incluso en estadio y, con extensin a rganos vecinos, mdula sea y/o sangre [Dobson.JM et al, 1993;
TeskeEet al, 994].

La forma alimentaria o digestiva suele presentar malabsorcin, obstruccin intestinal, vmitos, y

diarrea (en un 80%de los casos, incluso hemorrgica con sangre en heces). Los ganglios superficiales
y el bazo pueden no estar involucrados. En estadios avanzados puede afectar todo el tacto digestivo,
bazo, hgado, rin, corazn,amgdalas, pncreas y mdula sea. Hay descritas metstasis en piel, ojo,
msculo esqueltico, SNC,... etc [CouroCGer al, 1989; HartiR eraL 1994].
18

Introduccin
La forma timica o metastinica es poco frecuente en el perro pero ms habitual en gato; en su
extensin pueden afectarse los ganglios estemales y mediastnicos, la pleura adyacente y el pulmn.
Presentan sntomas generales: abatimiento, anorexia y prdida de peso, as como respiratorios: tos,
disnea o taquipnea. Muestran disminucin de la tolerancia al ejercicio, disfagia o regurgitacin y
compromiso cardio-circulatodo con cianosis, desplazamiento del sonido cardiaco dorso-caudal, liquido
serohemorrgico/hemorrgico, distintos grados de hidrotrax o quilotrax como resultado de la
infiltraciny ocupacin del espacio torcico porel crecimiento tumoral en la regin antero-superior del
mediastino [ShimodaT, 1993].
En la forma curnea se diferencian dos grupos segn su localizacin topogrfica: dermorrpicos o
epidermotrpicos. Los primeros estn caracterizados por lesiones en piel a modo de placas que

engloban la dermis papilar y en ocasiones la reticular, con inclusiones focales en la epidermis para
formar los abscesos de Pautrier caractersticos de la micosis fungoides (MF) descrita en patologa
humana. Los linfomas con epidermotropismo causan un marcado adelgazamiento de la capa epidrmica
con infiltracin difusa de la capa crnea como en la enfermedad de Woringer Polopp en medicina
humana/Rivas C, 1980;BurgGetaL 1983;Lever WF 1990;NortonA etal, 1994]. El cuadro clnico
vara dependiendo del estadio y del animal. Generalmente se presenta como eritrodennia generalizada,
dennatitis exfoliativa, placas drmicas o ndulos, y lceras mucocutineas confluentes que pueden darse
en cualquier fase de la enfermedad [BakeriLet aL 1989; Moore PFet al, 1994; Couto CG et al, 1995;
DayMj 1995; French RA eral, 1996].
La forma epidural se presenta con parlisis del tercio posterior (sndrome de neurona motora
supenor,...etc) por infiltracin de mdula espinal o espacioepidural [TurnerJL et al, 1989; Spodniclc
GieraL 1992].

La forma solitaha renal puede darse en ambas especies aunque con mayor incidencia en el gato.
Presenta sntomas asociados a obstruccin urinaria renal y postrenal, insuficiencia renal
aguda/crnica,.. .etc, ya que suele crecer de forma difusa sin respetar la fisiologa del parnquima
[Moulton JI? et al, 1990].

La analtica sangunea que comprenda frmulas leucocitaria y eritrocitaria, perfil bioqumico, enzimas
hepticas y renales, as como un aspirado de mdula sea, puede presentar una gran gama de alteraciones
hematolgicas. La leucocirosis es un signo de aparicin relativamente constante, a veces como neurrofihia
hacia la izquierda por un incremento de neutrfilos circulantes, o como linfocitosis, debida a una leucemia
linfocitica sin masa tumoral reconocible (representa menos del 10%de los linfomas en el peno); en estadios
avanzadospuede observaituna poblacin linfoide inmadura en sangre en peno, en gatos tambin se da dicha
forma leucmica en un 12% de los casos. Tambin es posible encontrar una marcada linfopenia en un 50%
de los linfomas felinos. La anemia es el signo ms comn dentro del sndrome paraneoplsico asociado a
19

Introduccin
procesos lmfoprohferabvos. Suele ser no regenerativa, normocrmica y normoctica en perro y
iam&maeroctica en gato; en la fonna digestiva es fcil hallarlapor ulceracin de la mucosa digestiva, y a
veces con neutrofilia; se acompaa de trombocitopenia en casos de reemplazo de la mdula sea por
infiltracin tumoral, e incluso pancitopenia. La anemia autoinmune se da en casos de infecciones por
retrovirus en gatos o en neoplasias primarias de mdula sea en ambas especies. La patogenia de la
hipercalcemia (20%; paco frecuente en gatos) es confusa porque no presenta hiperpasia de la paratiroides,
ni hipervitaminosis D ni ruptura sea por metstasis seas; puede deberse a la produccin endgena de una
pseudohormona paratiroidea (parathonnona ectpica) con accin hipercalcerniante; se asocia a las formas
mediastnica y multicntrica, y con mayor frecuencia a linfomas de estirpe T. La nefropata por hipercalcemia
con posterior insuficiencia renal es un cuadro muy frecuente en los gatos con linfoma, que produce, entre
otros, sintonias como polidipsia y poliuria. La hiperglobulinemia monoclonal ocurre en penos con leucemia
linftica crnica y ocasionalmente en perros con linfoma. La policlonal tambin puede darse en linfomas
[CornoCG, 1985; Teske E et al, 1990; Dobson iMel al, 1993; Furie WS, 1993; Teske E, 1993; Teske E,
994; TesAr E e aL 994; Cotila CG eta!, 1995].

Las pruebas diagnsticas de mtina bajo la sospecha de un linfoma son la radiografia, sobre todo la
torcica latero-lateral, para evaluar posible compromiso mediastnico o pulmonar adems de posibles
desplazamientos del esfago, trquea o corazn; la ecografia abdominal, para el estudio del tracto digestivo,
ganglios mesentricos, periportales, etc.., cualquier rgano con ecogenicidad anormal en e] que pueda estar
metastatizando el linfoma. La citologia suele ser la forma ms fiable para un diagnstico definitivo de
linfoma, caracterizndose en la mayora de los casos por un infiltrado monomorfo de clulas linfoides
inmaduras de tamao superior al linfocito maduro, con la cromatina ms laxa, y uno o varios nucleolos
evidentes. La biopsia de ganglio se utiliza cuando la citologa ha sido poco conclusiva, y para realizar el
diagnstico histolgico exacto, base necesaria para aplicar un posible tratamiento quiniioterpico [I-Jardyir
WD et al, 1989; TesAr E, 1994; Couto CG el al, 1995].

E 6) TRATAMIENTO. QUIMIOTERPL4
La quimioterapia (QT) ha sido el principal mtodo de tratamiento del cncer en los ltimas cincuenta
aos. Ms dc cincuenta agentes (incluidas las hormonas) tienen gran utilidad en medicina humana, pero el
nmero utilizado en la prctica veterinaria es mucho menor [Crow SE, 1982; Hardy ir WC> et al, 1989;
Espaza P, 1993; TesAre E, 1993; Rosenha) RC eta!, 1995].

La ciruga es el tratanilento de eleccin para muchos tumores slidos y en alguna ocasin la radioterapia
es efectivapara neoplasias localizadas, pero en ningn caso pueden aplicarse en enfermedades generalizadas
o con metstasis.

20

Introduccin
La finalidad de la QTes curar al paciente, pero la obtencin de una cura real en medicina veterinaria es
muy dudosaEl Tumor Venreo Transmisible (TVT) parece serla excepcin a esta afirmacin por obtenerse
una curacin total con distintas drogas ant-cncer [Rosenthai RC, 1995]. En medicina Veterinaria la QT se
aplica para obtener otros beneficios como el control de enfermedades generalizadas imposibles de operar o
radiaraumentando el periodo librede enfermedad, prevencin de la progresin de una neoplasia tratando de
evitar las metstasis tempranas, y produce una mejora sintomtica del paciente que presenta un sndrome
paraneoplsicoaadido.
Los farmacos anti-cncer sesuelen utilizarcombinados, ya que cada uno produce la destruccin de una
fraccin constante de las clulas tumorales que es independiente a la destruida por otro frmaco, as se
combinan las drogas para que acten en las distintas fases del ciclo celular. Con ello tambin se intenta evitar
la aparicin por mutacin, de cepas resistentes a los frmacos antitumorales (resistencia rumorao. Este
fenmeno se desarrolla por vanas razones, entre otras se cree debido a la desactivacin de las clulas
tumorales, impermeabilidad de las mismas a los frmacos, as como aparicin de rutas alternativas de
metabolismo y reparacin celular.
A la horade disear un protocolo de quimioterapia hay que aplicar los siguientes principios bsicos en
la utilizacin de fnnacos: que sean efectivos en solitario, con distintos mecanismos de accin, con diferente
toxicidad y con protocolo de tratamiento intermitente.
Previamente a la aplicacin del tratamiento quimioterpico,hay que valorar una serie de factores como:
1. Historia clnica y exploracin fisica detallada.
2. Diagnstico histolgico de malignidad.
3. Seleccin de drogas efectivas frente al tumor y conocimiento de su mecanismo de accin (factores
como concentracin necesaria, ruta de administracin, biotransformacin, interacciones, resistencias y
toxicidades, as como su eliminacin).
4. Anlisis de efectos adversos; toxicidad; dosis en las especies canina y felina.
5. Entendimiento y cooperacin del dueo.
Para obtener el xito teraputico hay que hacer entender al dueo que la curacin (RC) no es la finalidad
del tratamiento, sino inducir remisiones prolongadas, parciales (Rl) o totales, que conlleven la menor
toxicidad posible, intentando conservar la calidad de vida del paciente oncolgico. Esta calidad de vida, ms
que la cantidad, se convierte en la consideracin primordial en la prctica veterinaria a la hora de aplicar la
QT como mtodo realista de tratamiento contra el cncer [CoutoCG, 985; Hardyir WD eta!, 989; Couto
CG et al, 1995].

21

Introduccin
La estrategia quiniioterpicase divide en cuatro fasesprincipales:
1. Induccin a la remisin,
2. Intensificacin,
3. Mantenimiento,
4. Reinduccin de la remisin o rescate.
En la induccin seutiliza una terapia intensiva porcombinacin de drogas encaminadas a conseguir una
remisin completa (RC) reducindo de froma significativa la masa tumoral. Es un tratamiento fuerte y
frecuente comparado con el impuesto en el peado de mantenimiento. Si no se produce la RC, el animal se
somete a la terapia de intensificacin. En medicina veterinaria se utilizan distintos protocolos para la
induccin en los linfomas, como las terapias COl> (ciclofosfamida PO, vincristina IV y prednisona PO),
COAI> (ciclofosfamida PO, vincristina IV, citosina arabinsido IV/SQ y prednisana PO), CHO?
(ciclofosfamida PO, adriamicina IV, vincristina IVy prednisona
o basados en PEG-L-Asparaginasa/LAsparaginasa en el perro, y COAP, CHOPo DOMAC (dexametasona PO, vincristina IV, mitoxantrona
IV, citosina arabinsido PO y ciclofosfamida PO) en el gato [Cauto CG, 1985; I-Iardy ir WD et al, 1989;
McEwen EG, 1990; Teske E et al, 1990; TesAre E, 1994; TesAre E et al, 1994; Cauto CG et al, 1995].

La intensificacin se aplica cuando no se obtiene una RC en el peado anterior; es un tratamiento

agresivo continuado normalmente a base de L-asparaginasa SQ y Doxonubicina, siempre bajo control de
toxicidades paralelas -frmacos no mielotxicos o que ataquen a una fase celular distinta- [Hardyir WC> et
al, 1989; Cauto CG et al, 1995].
La fase de mantenimiento se aplica cuando se ha alcanzado la RC y se basa en un protocolo de
agresividad moderada, como el LMP (clorambucil, metotrexate y prednisona; oral y ms cmodo) o el
COAP, ambos para penos y gatos.
En el caso de que la enfennedad se reproduzca de forma progresiva (recidiva), se empieza la siguiente
fase de la QT,la reinduccin de la remisin o rescate, donde se aplican las mismas drogas utilizadas para
la induccin si hubo RC (o combinaciones con doxormbicina o adriamicina) aunque es mucho ms fcil
mentener la primera remisin que producir la segunda. Si la RC no se alcanza, debe seguir el mismo
tratamiento hasta que no haya una evidencia clara de la progresin tumoral. En el perro normalmente se
utilizan los protocolos ADIC y O-MAC. ambos efectivos pero con mayor toxicidad que el COAP [Hardyir
WC> er aL 1989; Teskeket al, 1990; Teske E, 1994; TeskeEet al, 1994; Cauto CG et al, 1995; Rosenthal
RCetal, 1995].

22

Introduccin

G) TCNICAS ESPECIALES DE ESTUDIO

Uno de los objetivos principales de esta tesis es el conocimiento de la cintica y del ciclo celular de los
linfomas caninas para comprender su comportamiento biolgico y, por tanto, clnico rresfr E et al, 1993;
Teske E 1994]. La agresividad podr condicionar la terapia administrada as como orientar al pronstico de
la enfermedad [Garca R et al, 1989; Marcos B et al, 1993; Garca R et al, 1994; Obeso Oet al, 1994;
Marcos B et aL 1997]. As pues se utiliza la proliferacintunioral y la citometria.

Laproliferacin de un tumor se expresa por el tanto por ciento de clulas que se considera que estn
dividindose o bien estn prximas a ello (Gb, G~, M); dicho porcentaje seobtiene gracias a los marcadores
proliferativos PC 10 y MIB 1, ciclinas nucleares que seexpresan en todas las fases del ciclo celular a excepcin
de

(JO

(fase de reposo). La cuantificacin del rea nuclear positiva a estos marcadores se realiza con el

programa proliferation ndex del analizadorde imagen CAS-200 sobre la preparacin, con ello se pretende
reducirel tiempo empleado y el posible error de medida a mano, ya que el nmero total de campos estudiados
(10campos analizadaspor cada preparacin) hace la labor antlua y densa; adems ofrece la expresin de los
resultados estadsticos de forma automtica.
El estudio citomtrico informa sobre el contenido de AUN de una muestra problema. Es sabido que las
clulas diploides en fase 0~G~ poseen una cantidad de AUN que va aumentando a medida que la clula
progresa hacia la fase S, hasta que llega a la 02-vM. En esta ltima fase, la clula tiene el doble de cantidad
de ADN que en la fase 01. Atendiendo a los distintos contenidos de AUN,el citmetro permite identificar la
proporcin de clulas en cada fase del ciclo celular, as como la ploidia.
El uso prctico de la citometra se basa en tres principios bsicos: 1) que las clulas tienen distintas
cantidades de AUN en cada estadio del ciclo celular; 2) la disponibilidad de tcnicas en las que se utilizan
reactivos que se unen estequiomtricamente con al ADN; 3)la gran mayora dc clulas normales son diploides
[Lee Setal, 1994].

Actualmente, la citometria (de flujo y esttica) de tumores slidos puede efectuarse sobre clulas
recuperadas del material parafinado [Hedley0W et al, 1985] adems del tejido fresco convencional con
prcticamente el mismo resultado, lo que supone una gran ventaja a la hora de utilizar material retrospectivo
[VanenKA, eta!, 1989; C!audRDetat 1989; Bauer TWera 990;Alanen 4 eta!, 1993; Rowman R
el aL 1993; Bray!an RC, 1993; BclngA eL aL 1995; BoudryR eL aL 1997j.

La citometria deflujo se basa en una suspensin celular donde los ncleos son teidos con loduro de
propidio, fluorocromo que se une a los pares de bases del AUN. Al pasarlo al citmetro, un haz de luz lser
excita la fluorescenciade los ncleos teidos, donde la intensidad de la fluorescencia emitida es directamente
proporcional al contenido de ADN, que es recogida y medida por un ordenador. Los resultados seexpresan
23

Intmduocin
ccxx curvas que equivalen al porcentajede clulas con contenidos de AUN diferentes [FriersonMF 1988 y
1991].
En la citonuesria esttica se parte de extensiones celulares o improntas, cuyos ncleos se marean en la
tincin de Feulgen, donde el cido clorbidrico hidroliza las bandas nbosa-purina dando residuos azcaraldehdo; El reactivo de Schiff (colorante azul) reacciona con dicho residuo, dando un precipitado de color
azul (Mure A) que es reconocido por el analizador de imagen CAS-200 (programa de ploidia QUNA quantitative DNA analysis-). Los resultados son expresados con curvas semejantes a las de citometria de
flujo, nubesde punto5~..ete Mascas el aL 19971
En ambas citometras los valores estn referidos a los de ganglio controlde perro y de gato procesados
al mismo tiempo, ya que ambos programas estn diseados peara linfocitos humanos, y se ha tratado de
mminuzar al maximo el posible error /Marcos B et al, 1993; Marcos B et al, 997; Sanz C et al, 1998].

24

III.- MATERIAL Y MTODOS

Material y Mtodos
A..- CASUSTICA
El material utilizado procede del archivo del servicio de Anatoma Patolgica e Histologa del
departamento de Patologa Animal IIde la Facultad de Veterinariade la Universidad Complutense de Madrid;
asimismo tambin secuenta con biopsias llegadas al departamento de Anatoma Patolgica de la Fundacin
Jimnez Dez de Madrid (Universidad Autnoma de Madrid).
Partimos de 30 linfomas caninos (Tabla IV), de los cuales 4 son slo biopsias, y 26 son necropsias
seriadas, del periodo 1995-1997. Los casos en que se ha podido realizar necropsia proceden de dos fuentes
distintas: 19 casos del servicio de Patologa Mdica (Patologa Animal II) de la facultad de Veterinaria de
Madrid, y los 7 restantesde centros privados (los cuales cuentan con una historia clnica reducida). Todas las
necropsias se realizan en el servicio de Anatoma Patolgica del dpto. de Patologa Animal 11 de la Facultad
de Veterinaria de Madrid. En ellas se recoge tejido linfoide y tejido hamatopytico,y distintos rganos en
funcin de la afectacin porel linfoma. Posterionnente sefijan en formaldehido tamponado al 10% e incluyen
en bloques de parafma.
Para el estudio proliferativo y comprobacin de su fiabilidad, serecogen adems 15 biopsias ya incluidas
en parafma, pertenecientes al periodo 89-94.
Ue la historia clnica se recoge la informacin posible sobre distintos factores relativos al animal o a la
propia enfermedad, como edad, sexo, sintomatologa (asociada o no al linfoma), tumores secundarios, estadio
clnico, analtica sangunea bsica,posibilidad de tratamiento, con tipo de respuesta y supervivencia.
Como controles se utilizan 8 linfomas felinos para verificar analogas o diferencias con las contrapartidas
caninas. Se utilizan 7 ganglios control de perro y 3 de gato para consideracin morfolgica, ptica
emmunohistoqumica.
B.- MORFOLOGIA PTICA
EJ estudio morfolgico de rutina serealiz tras la inclusin del tejido en paraflna y en secciones de cuatro
micras teidas con tcnicas de: Hematoxilina Eosina (HE) convencional y Qienisa modificado (Lennert K,
1978).

TINCINDE GIEMSJ4 MODIFICADO (LENNER2)

Reactivos:

1.

Solucin Giemsa: 80% agua destilada, 20% Oiemsa puro (Merk,Alemania, ref. 9204)

2.

100 ml H20 destilada con 5 6 gotas de cido actico glacial.

3. Alcohol Isoproplico.
25

Material y Mtodos
Procedindento:

1.

Desparafinar los corteshistolgicos (pasndolos porxilol, alcohol al 100% -

2.

e hidratarlos en agua destilada.

SesumergmenlasolueindeGiansaduranteunahora(laduracintieneunrangovariableentre20min.

96% - 70%

sucesivamente)

y 1 h. en modificaciones posteriores).
3.

Se sacan los cortes de la solucin de Giemsa para pasar al H20 destilada acetilada, agitando unos 2 3
segundos para su diferenciacin (se debe controlar muy bien este paso).

4.

Se pasan inmediatamente por alcohol de 960, dejndolos hasta obtener el color deseado (controlar con
microscopio ptico).

5.

El proceso de diferenciacin se para sumergindo 3 veces (2 mm. cada vez) los cortes en alcohol
isoproplico.

6. Se pasan por xilol tres veces (2 mm. cada vez)

7. Se montan en Eukitt.
C.- MICROSCOPIA ELECTRNICA
Todos cortes electrnicos estudiados han sido seleccionados sobre secciones pticas de control de una
micra dc grosor, teidas con Giemsa.
Material y Reactivos:
1. Gelatine capsules. (size l/6.Smm dianxetro/0.5m1). Cod. C089. TAAB.
2.

Acetona.

3.

Vestopal-W resin. Cod. VOOS. TAAB.

Solucin de trabajo:
Solucin madre de Vestopal:
Vestopal-W
10 ce
Iniciador

alce

Activador
0.2 ce
Mezclar el Vestopal-W con el iniciador, agitar con una varilia de vidrio antes de aadir el activador.
4.

Iniciador del V-W: Tert-butyl perbenzoate. Cod. 8035. TAAB.

5.

Activador del V-W: Cobalt napthenate (6% cobalt). Cod. C031. TAAB.

6. Rejillas: (specinien grids-PKT/100). Ccxi. 4629A-4. LKB.

7.

Tetrxido de osmio. Cod. 24505. Merck.

8.

BuiferCacodilato:
Cacodilato sdico
Agua destilada

85.6 gr
400 ce

Solucin de trabajo:

Dela solucin anterior se toman 400 ce, en 1.600 cc de agua destilada. pH 7.3.
26

Materialy Mtodos
9.

<llutaraldehido 25%. CocL 49630. Flulca.

10. Citrato de plomo, pH 12 (en lOOcc) segnReynolds:

11. Acetato deUranilo. 3%en agua destilada.
12. Solucin de Palade:
Mezclar partes iguales de tetrxido de osmio al 2%y buifer cacodilato.
13. Otros: material de laboratorio fungible e inventariable: pipetas Pasteur, balanza, agitador magntico,
estufa, knife-marker para cuchillas de vidrio, tiras de vidrio, lamparilla de alcohol, ultramicrotomo etc.

PROCEDIMIENTO
Fijacin:
1. Fijar en glutaradebido al 1.5 2.5% un mnimo dedos horasen nevera a 40C.
2. Seccionar la muestra, en bloques de 2 mm. 3 aproximadamente. Se aconseja un mnimo de 8 bloques de
cada biopsia.
3. Lavar los bloques mediante varios cambios de buifer cacodilato. Dejar lavandodurante media hora.
4. Aadir tetrxido de osmio (solucin de Palade) de 1 a 2 horas a 40C en nevera.
5. Lavar en buffet cacodilato de 5 a 10 minutos.
Inclusin:
6. Deshidratar los bloques hacindolos pasar durante 30 minutos por soluciones acuosas de acetona de
concentraciones crecientes (50%, 70%, 80%, de 90% y de 100%)una hora en cada una.
7. Preparar una mezcla con tres partes de acetonay una de la solucin de Vestopal-W. Mezclar bien y dejar
evaporar la acetona hasta el dia siguiente.
8. Cambiar el material a frascos limpios y secos, aadiendo a cada uno 10 gotas de la solucin de Vestopal
puro.
9. Incluir en cpsulas. Colocar 3 gotas de la solucin de Vestopal-W. Transferir la muestra a la cpsula y
llenar esta con Vestopal-W.
10. Dejar reposar de 1 a 2 horas a temperatura ambiente.
11. Meter las cpsulas en estufa a 620C durante 48 horas para su polimerizacin. Una vez finalizado este
pasoestn listas para los cortes en ultramicrotomo.
IJI*ramicrotomia:

12. Antes de realizar las seccionesen el ultramicrotomo, se tallan los bloques en pirmide para descubrir la
muestra y delimitar la forma y dimensin de la seccin que se desea obtener, controlndola
postenorunente al microscopio ptico.
13. En el ultramicrotonio LKB se realizancortes de 1 micra a 300 angstrm.
14. Tincin con Giemsa de los cortes de controlpasndolos porxiloL
15. Cortes semifinos (color amarillo dorado) que se toman en una rejillay dejarsecar.

27

Material y Mtodos
Contraste:

16. Tincin con acetato de urmnilo: depositar en los los discos Pefr, con ayuda de una pipeta Pasteur,
tantas gotas de la solucin de acetato de uranio como rejillas deseen conirastarse.
17. Situar una rejilla sobrecada gota.
18. Cubrir el disco Petri y esperar 20 minutos.
19. Transcurrido este tiempo tomar las rejillas. Lavar 3 veces en agua destilada y secar en secar en papelde
filtro.
20. Tincin con citrato de plomo: depositar sobre el disco de Petri tantas gotas de la solucin de citrato de
plomo como rejillas deseen contrastarse. (Es conveniente que el disco de Petri que se use contenga en su
interior algunas lentejas de NaOH y haya estado cerrado desde algunos minutos antes, para reducir el
nivel de CO2, que puede interferir en el proceso de tincin formando precipitados de carbonato de
plomo).
21. Colocar las rejillas por el lado que contienen las secciones sobre la gota del reactivo.
22. Lavarlas tres veces con agua destilada. Secar en papel de filtro (en el interior de la placa de Petri).
23. Observacin en M. Electrnico de transmisin Hitachi HU-12A.
24. Se fotografian las zonas demostrativas.
Se han estudiado 15 casos de CBCC, 2 de CB y 12 de LMF.
D.- INMUNOHISTOQIJMICA
El estudio inmunobistoquimico Le realizado en todos los casos en tejido incluido en paraflna utilizando
los mtodos de Avidina-Biotina (ABC) y Estreptavidina-Biotina (STABC) segn la metdica explicada a
continuacin. Los anticuerpos utilizados, comerciales o experimentales, secitan en la Tabla V.

D. 1.- PROCEDIMIENTO IHQ MANUAL:

1.- Secciones deparafina y preparado de los cortes
a.
b.

Cortar secciones de 4-6 micras de grosor y extenderlas en portaobjetos tratados con poli-L-lisina
0C durante una noche.
(SIGMA, Cod. P-1274). Mantener en estufa a 60
Desparafinar e hidratar.

c.

Incubar 5 miii. en agua oxigenada al 3%.

d.
e.

Lavar en agua.
Se realiza Tratamiento con calor como mtodo recuperador antignico segn el AcMo. pnmario donde
sea necesano.

2.-Tratamiento por calor

Utilizacin de calor como recuperador antigemco en:

a. Casos de material antiguo o con parafinas no adecuadas

28

Material y Mtodos
b. Conlos anticuerpos dbiles para incrementar su positividad: MIB1,p53,...[Cattoretfl G
a

al, 1992;Norton AJet al, 1994; Butier De:al, 1997]?

flpos:
* Olla a presin.
*

Microondas.

Buifer empleado (en ambos):

* Buifer citrato sdico pH 6 (citrato de t-sodio diliidrato C
6H5Na3O7.2H20; Merk Cod.A763243).

Olla a presin
Colocar los cortes en costillas metlicas dejando dos espacios entre ellas para dejarfluir cmodamente el
buifer citrato entre ellas; se dejan en H20 destilada hasta que la olla a presin est preparada.
La olla (capacidad: unos 2 litros) secoloca en un hornillo elctrico sin cenar hasta que entra en ebullicin,
entonces se introducen las costillas en el interior totalmente sumergidas en el buifer y se cierra la olla.
La olla dispone de un sistema de control manual para sealar la correcta presin con la subida de una
vlvula. Una vez alcanzada dicha presin se cronometran 2 minutos (tiempo aproximado en alcanzar la
segunda vlvula de presin). Transcurrido el tiempo se debe pasar la olla al agua fria para bajar su
temperatura y presin y posterior apertura (no antes).
Una vez abierta la olla se pasan las cestillas al agua destilada lo ms rpido posible impidiendo que se
sequen las preparaciones; stas se pasan a buifer TRIS (T.B.S. Tris Saline Buifer Wash Concentrate;
Lipsliaw/immunan. Cod. 484850; 30 ml/botella a diluir en 1 litro de >120 destilada; pFh7.2-7.8) y ya estn
listas para la tcnica de inmunohistoqurnuca.
Los anticuerpos que requieren la olla a presin como mtodo recuperador antignico de los aqu utilizados
son el MIEL, CD3, CD79a, 5100 (aunque tambin responde sin tratamiento) y J Chain. La mayoria se
utilizaban antes con microondas, pero se obtiene mejor patrn de tincin sometindolos al calor por presin
de la olla.
Microondas

En este caso, las cestillas (de cristal o plstico) donde secolocan las preparaciones alternas, tienen que ir en
un contenedor de plstico rellenado con buifer Citrato Sdico pH 6 (el mismo buifer que para la olla a
presin) que debe cubrir en exceso las mismas. El contenedor debe ir tapado para evitar en lo posible la salida
del buifer, aunque no hennticamente para que pueda salir el vapor.
Se utiliza un microondas de uso domstico con la mxima potencia, y el nmero de pulsos depender del
AcMo utilizado.
Para los AcKAPPA y LAMBDA setrata de tres pulsos de 10, 10 y 5 minutos respectivamente. Se controla
entre cada paso para evitar la evaporacin del buifer con el consiguiente secado de las preparaciones.
3.-Incubacin con el anticuerpo primario

a. Anticuerpo monoclonal: incubar directamente el anticuerpo primario, a la dilucin ptima del mismo
29

Material y Mtodos
en T.B.S., durante 40-60 ma dependiendo del AcMo que se trate.
b. Ac poiclonal: si el anticuerpo primario es policlonal, incubar en Normal Swine Serian (NSS) 1:10
(DAKO, X901) durante 10 minutos, para evitar inespecificaciones y fondo. Decantarlo sin lavar en
T.B.S. e incubar el anticuerpo a su dilucin especifica durante 40-60 mm.

4.- Incubacin con el anticuerpo secundario

Tipo de anticuerposecundario:
a. Si el Ac primario es monoclonal:
Biotinylated affinity isolated rabbit imnumoglobulins TO MOUSE IMMUNOGLOBULINS. 1 ML. Cod.
E354. Do. Solucin de trabajo: 1:250.
b. Si el Acprimario es policlonal:
Biotinylated alflnity isolated swine ininitmog]obulins TO RA?BBIT IMMUNOGLOBULINS. 1 ML. Cod.
E353. Dako. Solucin de trabajo: 1:250.
Duracin: se incubanlas preparaciones de 40-60 minutos con posterior lavado en TES.
5.-incubacin con el anticuerpo terciao:
Reactivos:

a. Tcnica de Avidina-Biotina (ABC); ABComplex/HRP (Dako. Code No. K355) que contiene:
l.Reactivo a: Avidin lml. en 0,01 M Phosphate buifer, 0,15 M NaC, 15 mM NaN3, pH 7.2.
2.Reactivob: Biotinylatedhorseradishperoxidase imlen 0,01 M Phosphatebuffer, 0,15 MNaCIpH 7,2,
15 mM NaN3.
3. Una botella para realizar la mezcla (1 xnixing / storage bottle).
Solucin de trabajo: una gota de a + otra de b + SmI buifer TES.

b. Tcnica de Streptavidina-Biotina (STABC StreptABComplex/HRP (Do. Code No. K377) que

contiene:
iReactivo a: Streptavidun lml. en 0,01 M Phosphatcbuffer, 0,15 MNaCl, 15 niMNaN3, pH 7.2.
2.Rcactivob. Biotinylatedhorseradishperoxidase Imlen 0,01 M Phosphatebuffer, 0,15 MNaClpH 7,2,
15 mMNaN3.
3. Una botella para realizarla mezcla (1 mixing storage bottle).
Solucin de trabajo: una gota des + otra de b + 5 ml buifer T.B.S.

Tcnica:

Los pasos previos son iguales en ambas tcnicas; enteeflos se deben hacer intensos lavados en buifer T.B.S.
de al menos 5 miii. de duracion.
Se incuban las preparaciones con el anticuerpo terciario de 40-60 minutos y posteriormente se lavan en
lBS.

30

Material y Mtodos
6-Revelado con Diamino-Bendina (hABcontrastefinal
Cromgeno:

D.A.B. (3,3a-Diamino-benzidin-tetrahydroclorid) (25 gr). Cod. 32750. Fluka.

Solucin de trabajo:
Buifer TRIS para D.A.B. pH 7.6:
TRIS 0,2 molar

12 cc

Acido clorhdrico 0,1 N

19 cc

Aguadestilada

l9cc

Solucin de D.A.B.:
a. D.A.B. 5 mgr +10 cc buifer D.A.B.
b. Agua destilada 2,9 ce + 0,1

>1202.

Mezclar y filtrar.
DAB comercial DAS TABLETS. (SIGMA FAST,D-4293):
1 tableta de DAS +
1 tableta de UREA H202 +
5 ml H20 destilada

Tcnica:
Las preparaciones se incuban en DAB durante 2 a 10 mm. (control con microscopio) y posteriormente se
lavanen TBS y se pasan al agua corriente para ser contrastadas con Hematoxilina de Carazzi. Se deshidratan
y montan en medio no acuoso (Eukitt).
Hematoxilina de Carazz:

Hematoxilina

2 gr

Yodato potsico

0,4 gr

Alumbre potsico

100 gr

Glicerina

400 gr

Agua destilada

1.600 cc

D. 2.- PROCEDIMIENTOAUTOMTICO.
4 500/1000.
INMUNOTEIDOR: DAKO TECH.Mate~
Reactivos: DAKO Cbem-Mate~ Detection Kit. Code No. K 5001.
El funcionamiento del inmunoteifidor est basado en reacciones de capilaridad que hace ascender el
reactivo dispuesto en bandejas especiales en cada paso del proceso, automatizado por un programa
informtico, por preparaciones enfrentadas verticalmente creando una cmara virtual entre ellas. Asi se
homogeneizan las condiciones de manejo durante todo el procesado, y por consiguiente se igualan los
resultados.
31

Material y Mtodos
El TECHMATE consta de 89 pasos automticos. El <it Dako Chem-Mate est basado en el mtodo
complejo Streptavidina-Biotina (STAiBComplex) como conjunto de anticuerpos secundarios utilizados para
amplificar reacciones primadas de Ag-Ac en tejidos, creandouna estructura terciaria de red en los lugares
dcmde el Ac primario se ha unido al epitope especfico del Ag detectado. Las enzimas Peroxidasa del complejo
STABC catalizan la reaccin substrato-cromgeno para formar un producto de reaccin coloreada.
La automatizacin y estandarizacin del proceso intenta obtener una mejor calidad y reproductibilidad
de la tincin. El TECH-MATE est diseado para proporcionar volmenes adecuados de reactivo en tiempo
y formaprecisos. La secuencia de lavado automtica disminuye el potencial de reactividad no especfica. Se
disminuye el coste ya que los reactivos se dispensan mediante un sistema de capilaridad. Los protocolos del
ordenador proporcionan una adecuada guia al usuario y para control de calidad. Las titulaciones de los
reactivos han sido seleccionadas para un ptimo resultado.
Principios del procedimiento

El Kit CHEM-MATE utiliza una tcnica inmunohistoquimica conocida como tcnica sandwich, en la
que el tejido reacciona primerocon una protena bloqueante que disminuye la unin inespecfica a otros Ag,
seguida por la incubacin con el Acprimario, que se une a los Ag especficos que haya presentes. El Ac
secundario biotinilado reacciona con el primado,y se sigue con la incubacin con la solucin estreptavidina
biotina enzima, para unir la enzima a cualquier lugar que haya reaccionadopreviamente con el Acprimario
-

y secundario. Se aade el cromgenoDAS (3, 3 Diamino Benzidina) que reacciona con la peroxidasa unida
al complejo Ac Enzima STABC. La actividad de la peroxidasa sobre el cromgeno produce un depsito de
-

precipitados marrones-negros en los lugares antignicos que contienen los eptopos especficos reconocidos
por el Ac primario [AbbottCD, 1997].
D. 3.- CONSIDERA (IONES TCNICAS PARA LA REALIZACIN Y VALORACIN DE

LA IHQ.
El empleo de anticuerpos monoclonales permite la identificacin de tipos celulares basados en el
reconocimiento de antgenos (eptopos) de superficie, intracitoplasmticosy nucleares, que caracterizanno
slo una determinada estirpe, sino distintos estados funcionales dentro de un mismo tipo celular.
Para poder comprender el porqu de las diferentes variantes de las tcnicas de inmunohistoquimica(IHQ)
y su metodologia, se debe tener presente los conceptos bsicos de inmunidad adquirida y la respuesta
antgeno-anticuerpo.
Se han utilizado las tcnicas de avidina-biotina y estreptavidina-biotina por tratarse de mtodos con mayor
sensibilidad. Los resultados en paralina permitido realizar un estudio retrospectivo y prospectivo [Knapp 0
eta!, 1989; Hedley DWet al, 1983]. Para obtener resultados ptimos, las tcnicas IHQ tienen una serie de

32

Material y Mtodos
requerimientos durante toda la metdica que son mdispensables para una posterior valoracin:
La fijacin del material deber ser correcta y rpida, as sepreservar la integridad de los antgenos
(Ag), la morfologa celular y tisular, se impide la difusin de Ag de un compartimentocelular a extracelular
lo que puede interknir en la reaccin Ag-Ac. Un fijador de eleccin fue el formol preferentementetamponado
en buifer a Ph 7,2. El proceso de fijacin sepuede alterar por distintos factores; pH del fijador, temperatura,
concentracin y tiempo de fijacin.
*

Deben ser considerados los Tratamientos previos a las tcnicas de IHQ: como desparaflnaciny

rehidratacin del tejido. En ocasiones, si el fijadorutilizado es del tipo aldehdo, se pueden formar enlaces con
el Ag que se quiere detectar; por este motivo es preciso efectuar una digestin proteoltica (tripsina) en
aquellos antgenos que lo requieran Otroproceso a efectuar es el bloqueo de enzimas endgenos (peroxidasa
endgena o fosfatasa), debindose enmascarar/eliminar o inhibir la actividad enzimtica endgena que
presenta el tejido normal (sto se realiza con H202).
Control de la propia tcnica de IHQ; tiempos de incubacin, lavados, revelado, evitando que en
ningn momento del proceso la preparacin se quede seca, incubando siempre en cmara hmeda a
*

temperatura ambiente.

De los anticuerpos monoclonales utilizados se considerarn: caractersticas, calidad, requerimientos,

especificidad, concentracin y, dilucin ptima. Se deben tener en cuenta dos hechos: la tincin especfica y
el fondono-especfico que se debe evitar.

Los reveladores o cronigenos como el DAS (2, 2 diaminobenzidmatetrahidroclorada) que produce

un precipitado de color marrn, ha sido utilizado como sustrato de las tcnicas de avidina-biotina y
estreptavidina-biotina.
Los controles, tanto positivos como negativos ensayados en paralelo con las muestras son exigidos con
el ini de comprobar posibles reacciones inespecificas.
Lo ms complejo de las tcnicas de ll-IQ es la valoracin final (tincin especfica, inespecfica, intensidad
de tincin, artefactos

...),

aunque las premisas tcnicas y la experiencia suministra una informacin

indispensable para interpretar los hallazgos en los LNH.

D. 4.- ANTICUERPOS UTILIZADOS EN INMUNOHISTO QUMICA

El listado completo de todos los Acutilizados en esta tesis sedetallan en la tabla V.

33

Material y Mtodos

PROLIFERA ClON: Descripcin detallada en seccinpro4/&racin.

MARCADORES LINFOIHSTIOCITARJOS:
1.- CD3, Pan T (Dako Rabbit Anti-Human T Cdl, Code No.A 452). Policlonal. Dilucin 1/50.
ESPECIFICiDAD: Reaccionacon la porcin intracitoplasmtica del antgeno CD3 expresado en las clulas
T. La protena consiste en una cadena de cinco polipptidos designados como gamma, delta, epsilon, zeta y
etadc 16 a 2810. E antgeno CD3 se detecta en principio en los tiniocites tempranos, lo que representa una
de las primeras seales de la estirpe linfoide. En timocitos corticales el antgeno est presente sobre todo como
componente intracitoplsmico. Aparece en la superficie celular en el estadio de timocito medular. Las clulas
de Purkinge del cerebelo parecen expresar tambin el antgeno CD3. Es el marcador ms especfico para
clulas T en material fijado y parafinado.
REACl!VIDAD: Clulas T timicas y de tejidos linfoides perifricos. Reacciona con la mayora de los linfomas

T, a excepcinde parte de los anaplsicos de alto grado.

2.- CD79a (DAKO clon HM57; CodeNo.M 7051). Monoclonal. Dilucin 1/50
CARACTERISTICAS: Es un heterodimero fonnado por los polipptidos mbl y B29, asociadode anua no

covalente con el receptor de membrana de las Ig de las clulas E; es por tanto un complejo antignico de
menbrana de las clidas B. Cuando el antgeno se une a este complejo se produce una transduccin
inlracitoplsmica acompaadade una fosforilizacinde distintos componentes. As pues el dmero mb- 11B29
es a leaclula B lo que el CD3 es a la clula T.
ESPECIFICIDAD: Es un antgeno temprano de la estirpe E y que persiste desde el estadio pre-B al de clula

plasmtica en el que aparece a nivel citoplasmatico. Apareceen humanos y en distintas especies de mamiferos.
Marca leucemias E de clulas precursoras, linfomas B y algunos niielomas. Este anticuerpo es vlido en cortes
de parafma y extensiones citolgicas, pero no para cultivo de tejidos [MilnerRl et al, 1996].
3.- S-100 (DAKO Code No. Z 311). Policlonal. Dilucin 1/400.
CARACTERISTICAS: Sl0osehaaisladodel cerebro de iaca (segn el mtodo de BW Moare) con distintos

buffers que contienen 2.5 mM de EDTA y 0.1 mM de 2-Mercaptohetanol. Se realiza posterior purificacin
porcroniatografla de afinidad, utilizando anticuerpos para contaminar las protenascerebrales. El antisuero
seha purificado por absorcin con fase slida con plasma humano y suerobovino.
ESPECIFICIDAD: El antisuero reacciona con la Sl 00 A y B bovina, y tiene una fuerte reaccin cmzada con
la SiQO Ay E humana. Tambin seha demostrado estareaccin cruzada con la ratay el canguro. El antisuero
seha testado en varios tejidos incluidos en parafina y mostraron ser especficos de forma estricta a la 5100;
tambin son positivas las clulas de Schwann del sistema nervioso perifrico, en piel los melanocitos,
tumores melanocticos y las clulas de Langerhans. En ganglio linftico, las clulas reticulares interdigitantes
son positivas a este Ac [FondevilaD et al, 1989].

34

Material y Mtodos

4.- MAC 387 bstiocitario (DAKO. Code No. M 747). Monoclonal. Dilucin 1/100.
ESPECIFICIDAD: Dako MAC 387 reacciona con el antgeno leucocitario L expresado en neutrfilos,
monocitos, algunos niacrthgos reactivos, epitelio escamoso en mucosa y epidermis reactiva. El antgeno Li
est formado por tres cadenaspoipeptdicas unidas por enlaces no covalentes, con un pesomolecular total
de 365 lcD.
REACTIVIDAD: Se encuentra en citoplasma de muchas clulas mielomonocticas. El Ac reacciona con el
sustrato predominante de maerfagos reactivos y tambin se observa en histiocitosis (maligna o sndrome
hemofagocitico).
5.- Kappa Light Chains (DAKO. Code No. A 191). Policlonal. Dilucin 1/400.
PRESENTA ClON: Fraccin de inmunoglobulinas purificadas del suero de conejo ant- cadenas ligeras
KAPPA humanas.
INMUNOGENO: Cadenas ligeras KAPPA humanas aisladas de orina de pacientes con proteinuria Bence

Jones (mieloma Bence iones)

ESPECIFICIDAD: El Ac reacciona con la cadena Kappa libre, as como las unidas a molculas de

inmunoglobulinas. Tie preferentementela Ig intracitoplasmtica.

APLICACIONES: Tipificacin de cadenas KAPPA libres o unidas a Igs.

6.- Lambda Light Cbains (DAKO. Code No. A 193). Policlonal. Dilucin 1/400.
PRESENTA ClON: Fraccin de inmunoglobulinas purificadas del suero de conejo anti- cadenas ligeras

Lambda humanas.
JNMLWOGENO: Cadenas ligeras LAMBDA humanas aisladasde orina de pacientes con proteinuna Bence

iones (mieloma Bence Jones)

ESPECIFICIDAD: El Ac reacciona con la cadena LAMBDA libre, as como las unidas a molculas de
inmunoglobulinas. Tie preferentemente la lg intracitoplasmtica.
APLICACIONES: Tipificacin de cadenas LAMBDA libres o unidas a lgs.

7.- J-Chain policlonal prediluida. Biomeda.

La cadena J esun componente unido a las inmunoglobulinas poliniricas. Tiene un peso molecular de 15000
y una estructura diferente a los dems polipptidos de las Ig. Es rica en residuos de cisteina y est unida por
puentes disulfliro a las subunidades IgA e IgM en relacin de una cadena J por polmero, independientemente
del tamao de ste.
E.- ACTiVIDAD PROLIFERATIVA NUCLEAR
Reactivos:

1. Anticuerpos monoclonales:
PC-lO 6 PCNA. 2 ML. Cod. M879. Dako.

35

Material y Mtodos
MiIB1. 1 ML. Cod. 0505. lmmunotech.
2. Analizador de Imagen CAS-2 en el PROGRAMA DEPROLIFERACION NUCLEAR
Ptocedimiento:

Se detennina la actividad proliferativa del tejido con IHQ utilizando los AcMo. PC-lo y MB1 [Gerdes.1,
Dallenbach F a al, 1984; Gerdes .1, Lemke Retal, 1984; Hall PA et aL 1990; JVasee,n NR et al, 1990;
Gerdes Jetal, 1991; Marcos RetaL 1993; Sabatfln E u al, 1993; Mazerolles C a aL 1994; Li T-Jet al,
1995; Ross Viet al, 1995]. Antes de proceder a la cuantificacincon el analizador de imagen CAS-200 se
han de seguir una serie de condiciones:
1. Comprobar la calidad de la IHQ.
2. Evitar mediciones en reas perifricas, zonas desvitalizadas, con componentes mflamatorios,
calcificaciones, necrosis artefactos.
3. Seleccionar reas con ms cantidad de ncleos por campo y mayor actividad proliferativa.

E.1.- ANTICUERPOS MONOCLONALES DE PROLFERA CRiN CARACTERSTiCAS.

~ PCNA PC-lO (Dako Code No.M 879)
.

CARACTERISTICAS: El antgeno de proliferacinnuclear (PCNA o ciclina) se define como un polipptido

nuclear, cuya sntesis alcanza su mximo durante la fase 5 del ciclo celular. Se ha identificado recientemente
como una protena accesoria de la polimerasa Delta. El PCNA es esencial para la sntesis de ADN celular y
es requerida para la replicacin y reparacin del ADN. El gen humano PCNA ya ha sido aislado y
secuenciado (Travalli). PC-JO reacciona con PCNA de todas las especies de vertebrados, insectos y levaduras
(Schizosaccaromyces pombe).
CLON: PC. 10 (inmungeno: PCNA de rata hecho en protena A expresado en el vector pRlT2T).
SUBCL4SE:Ig 02a, Kappa.
CONCENTRAClON DE Ig DE RATON: 480 mgug/l
CONCENTRACIONDEPROTEINA: 15,1 g/l
REACTIVIDAD: El PC-lO reacciona con clulas proliferantes en todos los tejidos. En los linfomas no-

Hodgkin, se ha comprobado que existeuna relacin lineal entre el MIB 1 y el PCNA. Pueden existir ciertas
alteraciones en la regulacin de la expresin del gen del PCNA debido al incrementode la vida media del
RNAni, de forma que puede aumentar tambin el nivel de PCNA en algunas clulas neoplsicas [Garca RL
etal, 1989; Hall PA etal, 1990; Kamel OWet al, 1991;Mc CormckDetal, 1992].

Mlii (ICI-67 en parafina) lmmunotech. Code No. 0505

.

ESPECIFICIDAD: El anticuerpo monoclonal Mml reacciona con el antgeno nuclear Ki-67 asociadoa la

proliferacin nuclear y al desarrollo del ciclo celular (fases ~1, ~ Q y M) y ausente en la fase de reposo
nuclear
Este anticuerpo reconoce la forma nativa del antgeno 1<1-67 y los ftagmentos recombinantes
~

36

Material y Mtodos
de la molcula del Ki-67.
CLON: Mieloma 3<63 Ag 8,653 x BalbIc de clulas de bazo.
SUBCLASE: lgG 1 de ratn.
REACTIVIDAD: Reacciona con clulas proliferantes de todos los tejidos. En el timo, la mayora de los
timocitos corticales lo expresan, mientras que los de la mdula slo ocasionalmente. En el tejido linfoide: los
cenfros germinales lo expresan en gran cantidad de sus clulas, siendo inferiorel nmero en otras reas. En
el tracto gaslrointestinalreacciona con las clulas epiteliales mucosas en el cuello y la regin basal (las clulas
ms superficiales son negativas). En el epitelio escamoso se unen preferentemente a las clulas basales
[Gerdesi, Dallenbach FetaL 1984; Gerdesi, lemkeHetaL 1984; GerdesietaL 1991; Gerdes Jet al,
1992; Cattoretti G et aL 1992; Fournel-Fleury C et aL 1997].

2. - ANALIZADOR DE IMAGEN.

Un Analizador de Imagenes la unin del microscopio ptico y del ordenador al mundo de la Patologa
diagnstica, con el fm de facilitar la medida, cuantificacin y anlisis de las clulas por medio de la
densitometra y el anlisis estadistico [Bacus.1VIel al, 1987].
El Analizador de Imagen cuenta con:
a. Microscopio pUco convencional modificado al incorporar dos cmaras de televisin que
producen seales en funcin de la longitud de onda que transmite el microscopio al observar las
muestras. Convierte la seal en distintas longitudes de onda, las digitaliza y las dista en imgenes.
b. Un ordenador con al menos 30 Mbytes en disco duro.
c. Dos monitores en color para el sistema de controly seleccin de los mens y otro para recuperar
las imgenes, tanto digitalizadas como normales, del procesador de imagen. Ambos monitores cuentan
con una resolucin de 256x256 pixeles o nmero de puntos.
El sistema dc imagen consta por lo tanto de:
1. Sistema de captacinde imagen (microscopio ptico).
2. Procesador digital que transforma las imgenes para el manejo porel sistema informtico.
3. Dispositivo de presentacin de la imagen (monitor).
4. Sistema de almacenamiento y/o de transmisin de imgenes.
5. Ordenador que ejecuta los programas de anlisis y manipula las imgenes hasta obtener los
resultados deseados.
El Analizador de Imagen contiene varios programas de software, de los cuales han sido utilizados para
esta tesis: programade proliferacin nuclear o indice proliferativo &roliferation ndex programme -Pl-) y el
programa de anlisis del ADN (Quantitative DNA Analysis). Se efectu una cuantificacin de la actividad
37

Material y Mtodos
pwliferativaen cadamio de los subtipos histolgicos con el programa Indice proliferativo (Pl) para valorar
los anticuerpos monoclonales: MIEl y PC-lo.
Programa de Proliferacin nuclear (PI).

Nos va a permitir cuantificar el rea de proliferacin nuclear expresado en tanto por ciento. En este
programa se puede elegir la opcin de cuantificacin sobre improntas, extensiones o cortes histolgicos.
El programanuestra una regleta con distintas opciones; antes de realizar la cuantificacin, es necesario
calibrar las cmaras y el analizador (&t Light), ajustando los sensores de las dos cmaras de TV incorporadas
al microscopio. Este paso se lleva a cabo con el portaobjetos en la platina donde se enfoca un rea libre de
t~ido. A continuacin, se procede a incluir los datos de identificacin (LobeO. El siguiente paso, es ajustar
el permetro nuclear (Nuclear Threshold) delimitando los ncleos del citoplasma o estroma celular,
remarcando en color verde. Dentro de esta opcin se encuentran varias posibilidades:
a) TOGGLE, ensea de forma intennitente la muestra, conforme ajustamos el permetro nuclear.
b) INCREASE, aumenta el contraste del permetro nuclear.
c) DECREASE, disminuye el contraste del permetro nuclear.
d) SET STEP SIZE. tamao estandarizado de contraste. Viene prefijada pordefecto en 0,01
e) HEL?, opcin de ayuda.
O

EXIT, salida al men inicial.

A continuacin, se procede a fijar los umbrales de positividad (Annbody Threshold) en los que se
diferencianlos ncleos marcados positivamente con el AcMo de los negativos. Los ncleos quedan en color
marrn sobre el verde anterior. Finalizados estos ajustes, se procede a cuantificar la actividad proliferativa
(Anlisis) de fomm semiautomtica en la opcinMEASURE o conformidad para la medida, dentro de la cual
se oftece ayuda con:

IMAGE SEGMENTATION permite eliminar zonas con necrosis o artefacto, evitando falsas

positividades.
2.- AVERAQE NUCLEAR AREA Y AVERAGE A}JTIBODY AREA tamao medio dc 54 y 27H2
prefijado, que se corresponden con el tamao medio del linfocito.
3.- TOGOLE MASK UNDO CIRCLED ARRAS y CLEAR AVERAGE ARRAS permite borrar panes
del campo.

La opcin posterior MERGE acumula los resultados de cada uno de los campos medidos. En cada uno de
los casos, se medieron 10 campos de 1000 p2 cada uno, para conseguir uniformidad de medida.
Expresin de los resultados.
El analizador de imagen valora la actividad proliferativa el programa Indice de proliferacin
(Proliferation index) cuantificando o valorando el rea nuclear positiva en relacin al rea nuclear total
38

Material y Mtodos
expresado en tanto por ciento (% ANP).
Los resultados aparecen expresados con dos regletas; la primera, refleja los resultados de todos los
campos y la inferior, los datos del ltimo campo medido.
a) Total de campos contados,
b) Suma de la proliferacin nuclear expresada en

%,

es decir, ncleos positivos contabilizados en

funcin del rea total,

ncleos positivos

x loo
rea total
c) Total de ncleos contabilizados,

d) Area de proliferacinnuclear, es decir, ncleos marcados positivamente entre ncleos totales y partido
del rea total, expresado en
ncleos positivos 1 ncleos totales
X 100

rea total
e) Area nuclear total expresada en micras (112).
E-

ESTUDIO

CITOMTRICO.

Material requerido

Para el estudio en ambos mtodos citomtricos se utiliz tejido incluido en parafina, para lo cual se procedi
a una desparafinacin, hidrataciny disgregacin basta obtener clulas aisladas en suspensin celular tanto
para estudios de citometria de flujo (CMF) como esttica (CME).
El tejido incluido en parafma produce histogramas de peor calidad [Esteban .JM et aL 1991], pero se
pretendia obtener resultados mas homogneos teniendo solo en cuenta material en parafina [FriersonHE
1988;Kallionemi 01, 1988; Alanen KA et aL 1989; Laskey RA, 1989; Esteban .JMet aL 1991; Garca R
et aL 1994;]. Se emple el mtodo de Hedley y cols. [HedeyeraL 1984; Hedley eta), 1985] para procesar

el material, aunque la digestin con pepsina puede alterar la valoracin del AUN, disminuyendo la
sensibilidad del ncleo al fluorocromo, dando falsas diploidias en verdaderas aneuploidas [AlanenKA et aL
1989; Garca R et aL 1994].

39

Material y Mtodos
Tratamiento del material incluido enparafina para obtener a suspensin celular segn el mtodo de
Hedleyy cok (1985).

1.

Realizarvarios cortes a 25 mieras.

2. Desparafinar en xilol durante 24 a 48 h. dependiendo de la antiguedad del material e hidratar

sucesivamente en alcoholes 100%, 70%, 50% y 30% durante 30 min cada uno.
3. Dos cambios en T.BS. oP.B.S.
4. Disgregar el material mecnicamente en 2 ml. de pepsina 0,5% a pH 1,5 e incubar a 370C durante 30
mm. en un bao de agua que previamente tiene esta temperatura.
5. Aumentar el volumen a 20 ml. con medio RPMI-1640 (en fro). Parar la reaccin con unas gotas de
TRIS pH 11.
6. Esta suspensin celular esla base para ambos mtodos citomtricos, y se separa en dos partes porque
a partir de ella seprocesan por separado.
PEPSINA
*

Pesar 250 mg. de pepsina (SIGMA).

Disolver en 50 ml. de CINa 0,9%

*Aji~ta~apffr~5(conCUi UN)
*

Incubar a

Guardar en alicuotas de 2 ml. a -2WC

370

durante 30 miii. (agitando de vez en cuando)

TRISpH=1 1
* Pesar 12,11 gr. de Tris(hydroxymcthyl)-aniinomethan. (Merck)
*

Disolver en 100 ml. de agua destilada.

Ajustar a pH=l 1.

F.1.- CITOMETRA EST TICA (CME).

Esta tcnica permite marcar y reconocer el ADN, mostrando las distintas fases del ciclo celular. Est
basada en la tcnica de Feulgen, reaccin especfica y cuantitativa de tincin de AUN donde el cido
clorhdrico (SN) hidroliza las bandas ribosa-puruna dando residuos azcar-aldehdos y el reactivo de Schiff
(colorante azul) reacciona con el aldehdo-azcar dando un precipitado de color azul (Azure A), reconocida
porel analizador de imagen CAS-200. Es importante el anlisis dcl contenido del AUN, en relacin con la
proliferacinde las clulas neoplsicas, habindose comprobado una cierta tendencia a un contenido anonnal
en numerosos tipos de tumores: mama, pulmn, tracto gastrointestinal, linfomas,.. etc [MontironiR et aL
992;

GraceJet al, 1993; Lee SetaL 1994; BockingAetaL 995].

40

Material y Mtodos
Ftocedimiento: Tomando como base la suspensin celular ya citada:
Filtrar el material por una malla de 0,2 it
Lavar por centriftgacin suave durante 6 mm
Decantar el sobrenadante.
Lavar en PBSo CINa 0,9%
Citocentrifugar durante 5 miii.
Decantar el sobrenadante.
Secar las preparaciones de 10 mm. a 2 h.
Fijar en formol neutro al 10% durante 30 mm.
Lavar en agua destilada y secar las preparaciones al ambiente.
Posteriormente las preparaciones se tien con una variante de la tcnica de Feulgen, que lleva Azure A
como colorante para el contenido en ADN,ya que produce la longitud de onda que reconoce el Analizador
de Imagen CAS 200, con con el programa de ploida QDA (Quantitative DNA Analsis Anlisis
-

cuantitativo del ADN).

TCMCA DE FEhLGEN <variante de a tcnica cUsita):

Material

Extensiones celulares, sUde de calibracin con hepatocitos de rata, agitador magntico, papel de filtro,
erlenmeyer, pinzas...
Reactivos:

1. Solucin de coloracin
Azure A (Cod. A6270 Sigma)

2,28 gr.

Bisulfito Sdico Na2S2O5 (Cod. 9000 Sigma).... Sgr

Acido Clorhdrico 12N

5 ml.

Agua destilada

595 ml.

2. &ilucin de lavado
Bisulfito Sdico Na2S2O5 (COd. 9000 Sigma)..
cido Clorhdrico 12N

7,68 gr.

Agua destilada

1792,5 ml.

3. Alcohol cido
cido Clorhdrico 12N

6 ml.

Etanol al 70%

600 ml.

7,5 ml.

4. cido clorhdrico SN

cido Clorhdrico 12N

300w].

Agua destilada

720 ml.
41

Material v~i4t~
La solucin de coloracin debe estar protegida de la luz, agitndose durante 2 h. como mnimo, filtrara
con cuidado porque se evaporael SO2 La solucin de coloracin y la de lavado son estables durante 4-6 h.
a l ambiente.
Es una tcnica donde el nucleolo y el citoplasma no se tien; el contenido normal de ADN es 1; en las
clulas malignas el contenido de AUN puede incrementarse o incluso disminuir.
Procedimiento (variacin de la lsncin de Feulgen clsica):

Sumergir en HCI 5N durante 65 miii. agitando.

Pasar a la solucin de coloracin durante 60 mi agitando.
Hacer tres lavados en la solucin de lavado durante 30 sg, 5 muy 10 miii, sucesivamente.
Hacer tres cambios de 5 miii. en agua destilada.
Alcohol cidodurante 5 miii.
Alcohol de 100 durante 10 mm.
Xilol durante 10 mm.
Montar en medio sinttico (EukitO.

Programa deploidia.

Este programa requiere calibrar las cmaras como en el programa PI ya comentado.

Se calibra el indice de AUN con un control de hepatocitos de rata ya que tienen una cantidad de AUN
semejante al humano (el programa enta diseado en funcin de la cantidad de AUN humano), y con una
extensin control de ganglio canino para ajustar los lmites normales de diploida en perro. Es necesario hacer
un recuento nuclear en contctas condiciones de conservacin, es decir, con ncleos enteros y uniformes, para
valorar los casos. El coeficiente de variacin de los hepatocitos no debe sersuperior al 3%.
Las opciones que presenta este programa para la valoracin del AUN son:
-

LABEL: Fichar los datos

SET-LIGHT: Calibrar las cmaras

- MEASURE:

valor O - acepta todos los ncleos automticamente

valor 1 a 8 - acepta los ncleos clasificndolos pordistintos tamaos de forma totalmente subjetiva (los
fija el observador)
valor 9 anula ese ncleo para que no sea contabilizado
-

ANALYZE: procede a la medicin dc las muestras donde nos encontramos con las siguientes opciones:
CHECK-LIGHT: comprobar la iluminacin de los casos
BOUNDARY: ajustael perimetro nuclear para ser identificados.
CLASSIFY: clasifica los ncleos en seis categorias distintas, numeradas de 1 a 6.
Dentro de esta opcin, se permite cortary aislar ncleos que se encuentrenmuy prximos evitando
42

Material y Mtodos
dobletesy tripetes as como el recuento de ncleos rotos o solapados.
SELECT-2ND: posibilita

identificar un segundo pico de AUN.

SCALE: escala

los histogramas.
AREA ABCD: marca las distintas rea de contenido de AUN en G0G1, S, G2+M.
ESTADSTICA
CLEAR: borrado de los datos.
Los resultados se expresan por medio de distintos parmetros:
a.- en forma del histograma
b.- cantidad de ADN en cada una de las reas
c.- coeficiente de variacin del rea A
d.- presencia de ms de un pico de ADN dentro del hstograma.
E 2.- CITOMETRIA DE FLUJO (CM!).
La Citometria de Flujo se realiz sobre la suspensin celular obtenida del material parafmado,
sometiendo el tejido a un proceso de desparafinizacin e hidratacin ya detallado para citometria esttica. Las
muestras fueron teidas medidas en un citmetro de flujo EPICS-C (Coulter) con el programa PARA- 1, que
calcula el porcentaje de clulas en cada una de las fases del ciclo celular G~, G1, 5 y G2M ~HedleyWet al,
1983, 1984y 1985; Fflerson 11F 1988; Rutternan GR et aL 1988; GarlandP et aL 1989; .Ioensuu H et al,
1990;MinlceJMI-Metat 1990; FrersonllF 1991; Scanzzan EetaL 1991;MacartneyiC, 1993; Teske
E et aL 1993; Garca R et aL 1994; Garca R et aL 1997].

Tincin de las muestras.

Suspender las clulas aisladas del tejido en P.B.S. Se tratan con Ribonucleasa A antes de la tincin con
loduro de Propidio utilizando 1 ml. de muestraen aproximadamente un milln de clulas al que se le aade
0C en agitacin.
10 ji. de RNasa, dejando actuar el enzima durante 30 miii. a 37
Lavarlas clulas tres veces en P.B.S.
Teir las clulas con 500 ~d.de loduro de Propidio (mantener la muestra a 4 0C).
Leer en el Citmetrode Flujo entre 30 miii. y 24 h. despusde la Uncin.

Se utilizaron como controles de ploida, suspensiones de ganglio linftico canino tratadas de la misma
forma que las muestras. La Uncin del AUN con loduro de Propidio se utiliza para calcular el ciclo celular,
determinando el porcent~e de clulas que seencuentran en fase GO, G, 5 G
2+M. Los resultados aparecen
en forma de hstogramas.

43

Material y Mtodos
El

anlisis del ciclo celular ha sido estudiado mediante el programaPARA- 1, con el que se calculel

pcrcataje de clulas que estaban en cada fase del ciclo celular. El anlisis del contenido en AUN -ndice de
AUN- se realiza segnuna frmula establecida:
Canal de la muestraproblema
ndice de ADN =

_______________

Canal de la muestra control

Segn esta frmula, se calculan los rangos para la diploida y aneuploida.

F.3.- VALORACIN DEL CICLO CELUL4R EN CITOMETRIA:

El criterio considerado en ambos mtodos citomtricos se ha basado en un estudio cualitativo conjunto
del hstograma y el ndice numrico (Tabla VI). La mayor informacin sobre el ciclo est en la forma,
contenido y simetra de la grfica, dato que preponden en si mismo (ya que a veces una diploida puede estar
definida poruna grfica simtricao una aneuploidia por una grfica asimtrica aunque los ndices numricos
se escapen de los lmites establecidos para diploida y aneuploidia).
El ndice de una poblacin diploide normal es 1, y toda variacin mayor o menor constituye una
aneuploidia. Sin embargo, los controles normales producen rangos variables cuando se trata con tumores
slidos que requieren un tratamiento enzimtico en su procesamiento. Una muestrase considera aneuploide
cuando el ndice de ADN -DNA ndex: DI es mayor de 1,2 (HIPERDIPLOIDE), o cuando el ndice DI es
-

menor de 0,8 (HIPODIPLOIIDE), o bien cuando el pico G0+01 sea asimtrico aunque su DI se encuentre
dentro del rango de diploida para el material en parafma [GarcaRetal, 1994; Obeso O et al, 1994; Garca
Retal, 1997].
Se define otro grupo conocido como DIPLODE CON FASE 5 ALTA, en caso de diploidas con un alto
valor en la fase 5 (mayor del 15%), corno si mostraran el solapamiento con otra poblacin con mayor Usa
proliferativa que pudiera enmascarar una aneuploidia [Garca R et al, 1997; Garca R el al, 1994; Lask.ey
RA et a 1989; Obeso G et aL 1994]. Se considera una fase 5 baja la media del valor de la fase 5 en los
ganglios reactivos control (5-6%), intennedia (6-15%) y alta mayor del 15%.
Los Coeficientes de Variacin (CV) se desestiman en el caso de la Citometria Esttica por tratarse de

graficas continuas de menor resolucin, donde no es posible la divisin real en fases del ciclo celular, excepto
en controles diploides tratados con las condiciones ptimas de manejo. Adems, el material en parafina da
peores hstogramas con mayores CV [ClaudRDel al, 1989]. En Citometria de Flujo, el criterio normal de
los CV semantiene(10-12%paramaterialenparaflna)[GarciaR eta), 1994; Obeso Get al, 1994; Bcking
A el aL 1995; Marcos Bel al, 1998].

44

Material y Mtodos

(L- ANLISIS ESTADSTICO

Todos los datos han sido analizados con el programa de estadstica SPSS para variables biolgicas.
Adems de la estadstica bsica, con correlacin estadstica por los mtodos Pearson, Kendall y Spearman,
realiza las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, para las cuales considera un nuevo grupo formado por
todosaquellosanimaiesquebayansuperadoendasdevidaeldal,esdecir,desechatodoslosanimalesque
han sido sacrificados el mismo da del diagnstico. Se considera da 1 la entrada o admisin en el centro
veterinario, descartando la visin subjetiva del dueo sobre la fecha de comienzo de la sintomatologa propia
del linfoma, para intentar homogeneizar todos los resultados. El otro problema aadido es que todos los
animales han sido sacrificados, por lo que la supervivencia se transforma en un dato relativo. Las distintas
variables recogidas como edad, sexo, raza, estadio, tratamiento (si/no),... se analizan con respecto a la posible
supervivencia observada. Los casos felinos no han sido considerados en el estudio estadstico por ser slo
ocho en nmero.
Los resultados obtenidos en proliferacin, CMF y CME se han analizado estadsticamente mediante dos
pruebas no paramtricas: la prueba de Wilcoxon para variables dependientes y la prueba de Mann-Whitney
y de Kruskal-Wallis para comparar la homogeneidad de dos medias en el caso de muestras diferentes o
independientes.
Estas pruebas no presuponen ningn tipo de distribucin de probabilidades para los datos, de ah que
reciban el calificativo de no paramtricas y son aplicables a muestras de pequeo tamao. Para este anlisis
se ha utilizado el programa R-SIGMA.
La prueba de Wilcoxon no slo considera el signo de las diferencias sino tambin, en cierta medida, su
magnitud. Se utiliza en caso de muestras intentacionadas; los individuos de las dos muestras son los mismos,
ante dos situaciones diferentes.
La prueba de Mann-Whitney permite determinar si existen diferencias, en cuanto a las medidas de
centralizacin entre dos muestras independientes.
En cada parmetro se ha tomado como nivel valorable de significacin: pcO,OS o p.c0,01 que son los
valores habituales estadsticos en un trabajo con datos tan dispares en cantidad y heterogeneidad
fKaplan EL et aL 1985; Carrasco Ji, 1989j

45

IV.- RESULTADOS

Resultados
A. HALLAZGOS CLINICOS (edad, sexo,raza, laboratorio, estadio dnico, tratamiento):
EDAD: Las edades de este grupo de animales oscilanentre 2 y 12 aos,con un valor medio de 8.5y una

mediana de 9. En cuanto a las frecuencias de aparicin segn las dcadas, un 22.2%tiene 12 aos (6/27),
un 7.4% 11 aos(2/27), un 14.8% (4/27)10 aos, 11.1% (3/27) 9 aos, 11.1%(3/27)8 aos, 7.4% (2/27)
7 aos, 3.7% (1/27)6 aos, 14.8% (4/27)5 aos 3.7% (1/27)3 aos y 3.7% (1/27)2 aos.
SEXO: la proporcin de presentacin del linfoma en este grupo es de 20 machos por 10 hembras (2:1); es

decir, un 66.6% en machos frente a un 33.3% en hembras.

*)>A

Z4 las fitcuencias de aparicin de las distintas razas es de 8/30 (26.6%) para el Pastor Alemn; 3/30

(10%) para Cocker, Boxer y cruces diversos; 2/30 (6.6%) en el Labrador, y 1/30 (3.3%) para las razas
Spaniel Breton, Pequins, West Highland, Chow-Chow, Pastor Belga, Airdale Terrier, Caniche, Ciriffon,
Pastor Alsaciano, Podenco y Bulldog.
*

ANALTICA SANGUINEA: La anemia se observ en 9 casos de los 21 anlisis estudiados (42.8%),

aunque slo en 6 de esos 9 casos habauna clara afectacin tumoral medular. En 7/21 ocasiones, se recogi
un leucograma de stress con neutrofilia y linfopenia, pero slo 4 casos mostraban afectacin medular
neoplsica. Los glbulos blancos elevados se presentaron en 10/21 casos, con correspondencia medular en
8 (origen diverso: casos severosdedisnea y tos, infecciones ...). Los 6 casos de linfocitosis (de un total de 17
anlisis conposibihdad de valorar os linfocitos en sangre; 35.2%) coincidieron con 6 afectaciones medulares,
y en 4 de ellos se present un cuadro leucmico con blastos linfoides en sangre. Neutrofihia se produjo en
14/17 casos (82.3%) y de ellos slo 8 presentaban la mdula infiltrada.
ESTADIO CLINICO: La valoracin del estadiajeclnico & este grupo de linfomas se expresa bajo e! perfil
veterinario y mdico, ya que el estadio IV en veterinaria incluye bazo y/o hgado dentro de un mismo bloque
por considerar ambos rganos paralelos en la evolucin del tumor, y en medicina humana se gradan por
separado por dar ms importancia al hgado como rgano hematgeno (111 bazo y ganglios; LV hgado y otros
rganos). El estudio estadstico demostr que la supervivencia global de los animales he significativamente
superior en el caso de no estar el hgado afecto, factor que no se refleja en el estadaje en veterinaria, ya que
seconsideraran en estadio IV. De los 26 casos en os cuales el estadio clnico pudo ser evaluado, un 76.9%
(20/26) presentaban un estadio V (IV en medicina humana), un 19.2% (5/26) estadio IV (III en patologa
humana)y un 3.8% (1/26) fue estadio 1V (tambin IV en humana).
*

TRA TAMIENTO: Slo nueve de los 30 animales recibieron polquimioterapia por combinacin de

vuncristina, ciclofosfamida y prednisona (COP), con metotrexate o adriamicina intercalado en ocasiones. Las

supervivencias globales de tratados y no tratados, oscilaron en un rango de O das (sacrificio en el mismo da

del diagnstico) hasta un total de 203 das. Los tratados tuvieron un rango de duracinde 12 a 203 das, con
46

Resultados
un valor medio de 92.4 das. El tipo de respuesta en la induccin fue completa (RC) en 5/9, parcial en l/9y
no hubo respuesta en 3/9.
*

FORMAS CINICAS ENCONTRADAS:

A) perro: 20 multicntricos (66.6%), 4 multicntricos con expresin principalmente leucmica (13.3%),

4 timicos (13.3%), un cutneo (3.3%) y un intestinal (3.3%).

B) casosfelinos contwl: De los 8 casos recogidos como control, 2/8 (25%) fueron linfomas primarios

renales de naturaleza B, 3/8 (37.5%) primarios tncos de naturaleza 1, 1/8 (12.5%) del SNC B y los dos
ltimos multicntricos B (25%).
B. AFECTACIN NECRPSICA TUMORAL:
Macroscopia de los distintos rganos con infiltracin por linfama
1. (24NGLIO: 30/30 (100%) de los casos en perro estn infiltrados. Se observa un marcado incremento de
tamao, de 3 a 10 veces el original. El ganglio con linfoma es fcilmente palpable, firme, bien definido,
indoloro, fijo (P corporal) y generalmente mvil por no estar adherido a piel o a planos profundos. La cpsula
est tensa y lisa, y al corte protuye el interior, que se caracteriza por tener un patrn de crecimiento slido
difuso con coloracin blanquecino-roscea; es un tejido carnoso mable, menos estructurado y firme que el
ganglio normal, que desprende gran cantidad de material lechoso denso. Si el tamao es muy grande, suele
haber necrosis central con muchamenor consistencia, incluso semisida. En mediastino y mesenterio, cuando
varios ganglios vecinos estn infiltrados, pueden unificarse a una sola masa grande (bulky mass). El tipo de
infiltracin tumoral es difuso con permanencia mayor o menor de la estructura normal del ganglio
dependiendo del grado, estadio y tipo histolgico.
De los 8 gatos controles, en 6 casos se ha podido valorar el ganglio, donde el crecimiento era difuso, y en
un caso con naturaleza T todava estaban los folculos conservados (Figura it).
2. BAZO: Todos los casos donde el bazo ha sido valorable (26/26) ha estado implicado por el linfoma. Se

caracteriza por un aumento de tamao en mayor o menor grado esplenomegalia que en ocasiones puede
-

hasta hacerse palpable, pennanecindo indoloro. La cpsula se presenta tensa, con superficie rugosa
(grumosa) que deja ver pequeos ndulos mltiples. Al corte protuye al exterior; el tejido es fiable, sin
estructura, blando y carnoso, que desprende abundante material barros?. Muestra un claro incremento de
la pulpa blanca formando ndulos mltiples de 5-10-20 mm, con incremento tambin de la pulpa roja, que
toma un aspecto carnoso hmedo con coloracin roscea (6/2 6); en corte histolgico seobserva un infiltrado
homogneoblstico difuso (14/26)0 tambin en pulpa blanca que se extiende a senos de la pulpa roja (6/26);
cuando sta ltima no est comprometida presentahemorragia, congestin, edema y fibrosis muy avanzada
(5/26). Puede haber infiltracin difusa con un aumento homogneo del parnquima sin diferenciar pulpa
47

Resultados
blanca y roja (15/26). Raramente hacendulos macroscpicos (2/26), aunque pueden identficarse en cabeza
y cola, con coloracin blanquecina y tamaos de incluso 5 6 centmetros. En ocasiones se produce ima
Sofia total de la pulpa blanca con infiltracin parcial de la roja (1/26) (Figuras Id y le). El bazo en el gato
control se ha comportado de forma similar, con crecimiento difuso nodular (dos ocasiones), atrofia total
esplnica (1 caso) o parcial de la pulpa blanca (1 caso) o de la pulpa roja (dos casos) con hemorragia y edema,
paralelo a un incrementode la blanca.
3. HIGADO: Aumento de tamao Hepatomegalia general y uniforme, incluso puede hacersepalpable por
-

debajo del arco costal. La infiltracin masiva dibuja el patrn lobulillar, portal y periacinar del parnquima
hepticohasta hacerse claramente visible (16/26). Aunque es muy rara, se ha visto una infiltracin difusa
parenquimatosa con la fonnacin de ndulos macroscpicos subcapsulares. En los casos de no haber
infiltracin neoplsica, s suele darse una marcada degeneracin grasa con tipico aspecto amarillento ifiable
(10/26). En el gato se han dado dos casos de inmtracin periportal, con adems infiltracin difusa
parenquimatosa, con ndulo macroscpico, en 3 ocasiones (Figura ib).
4. AMGDAL.4S: En todos los casos estudiados (16/16

100%) al igual que en el ganglio, tambin se

produce un aumento de tamao generalizado, con crecimiento difuso slido que protuye hasta hacer
desaparecer las criptas, desplazando completamente la glndula salivar accesoria. La superficie est tensa,
y al corte sc observa una coloracin blanquecina. En corte histolgico seobserva un infiltrado difuso, donde
en ocasiones permanecen folculos, mantos o trabculas (2/16) (Figura 2a).
5. MDUL4 sEA: Toma el aspecto homogneo de mdula empaquetada: macroscpicamente

corresponde a una mdula rica, carnosa, blanday ms plida de lo habitual. Histolgicamente es un infiltrado
difuso intraparenquimatoso (11/18), que en ocasiones conserva cierta proporcin de tejido hematopoytico
normal todava funcionante y tejido graso habitual (5/ls). Puede no estar infiltrada (2/18). En el gato slo
dos presentan incremento de tamao con crecimiento difbso, y en un caso los foliculos estan conservados. Las
cincomdulas recogidas de gato presentan infiltracin por el linfoma en mayor o menor grado.
6 INTESTINO: No ha presentado afectacin en 14/21 de los casos. La macroscopa del intestino afectado
en la forma primaria de linfoma intestinal (1/30) muestra ndulos blanquecinos aislados de 5-10 cm, o
incluso segmentos/tramos enteros de 20-30 cm, donde todo el grosor de la pared est comprometido, desde
mucosa a serosa, protuyendo en la forma severa a ambos lados, con ulceracin de la mucosa (con diarrea
hemorrgica en la mayora de los casos) y rigidez caracterstica. Dependiendo del grado de compromiso de
la pared produce o no obstruccinintestinal. Las placas de Peyer del tejido intestinal adyacente suelen estar
claramente visibles por afectacin tumoral. Cuando no es la forma intestinal del linfoma, puede haber un
infiltrado tumoral con una marcada dferenciacin plasmactica-plasmablstica sobre la lmina basal, o
incluso rompindola, que se extiende en mayor o menor medida a la submucosa del epitelio, o a muscular y
serosa (6/21 en perro - 1/8 en gato control). El pncreas vecino suele estar tambin comprometidocuando hay
48

Rtsultados
infiltracin en digestivo (4/5 pncreas recogidos en perro). En gato slo un timico T presentaba infiltracin
del pncreas, que no

coincida con infiltracin intestinal (Figuras lb,2c,2d y 2e).

7. RIN: El rin con laformaprimaria de linfoma renal (0/30; 2/8 en los controles felinos) aparece con
ciato aumento de tamao, dependiendo del grado de infiltracin. La frecuencia en perro es muy inferior a la
presentada en el gato. Muestra ndulos plidos en corteza, elevados con respecto a la superficie renal normal.
Al cortemuestra reas/segmentos blanquecinos, generalmente corticales, que se dilbnden al interior medular.
El rin tambin puede aumentar de forma global por infiltracin difusa, dando un aspectoplido. La cpsula
queda adherida y se desprende con dificultad. En linfomas generalizados encontramos infiltrados
perivasculares o intraparenquimatosos, tanto en mdula como en cpsula (10/21). No ha habido afectacin
alguna en 11/21 de los casos caninos.
& FORMA TIMICA (MEDL4STZNO); (4/30 penos). La forma timica T se caracteriza por ser una masa
firme, blanquecina-plida que ocupa la regin torcica craneo-ventral. En gatos puede ser tan grande que
desplace dorsalmente la trquea y esfago, y caudalmente corazny pulmn. En estos casospuede presentar
implantes blanquecinos mltiples en pleura parietal y visceral, peri y miocardio, diafragma. con incluso
metstasis nodulares en pulmn y atelectasias. En los linfomas felinos de estirpe T se ha infiltrado cl pulmn
adyacente. En en perro el desplazamiento no es tan llamativo. El mediastino tambin puede estar
comprometido en linfomas generalizados de naturaleza B por la cadena ganglionar y presentar tambin
extensin a estructuras vecinas.
9.

FORMA EPIDURAL: el espacio epidural aparece puntualmente relleno de un material blanquecino

setnislido con compresin medular (presenta el cuadro clnico correspondiente), LCR algo aumentado por
deformacin del espaciovirtual normal. No se suele encontrar la masa primaria que origina la metstasis, as
que se considera primario. La forma primaria de linfoma epidural slo se ha presentado en un caso de gato
control.
O. PIEL:El linfonia primario cutneo (1/30 en perro) presenta desde un engrosamiento de la piel en placas
con eritema-mcula-ppula, hasta la formacin de ndulos tumorales verdaderos con ulceracin y posibles
piodennas secundarias. La forma muiticntrica presentacon frecuencia un edema subcutneo marcado con
aspecto gelatinoso porcompromiso del sistema linftico. Ningn gato control ha presentado ni forma primaria
ni extensin a piel de otra forma de linfonia.
11. GENITALES/PRSTATA: Dos perros presentan adems tumores de Leidig testiculares, y de las 6
prstatas recogidas, 3 mostraban infiltracin por el linfoma, adems de una hiperpasia marcada. No ha
habido infiltracin por linfoma en ningn caso de linfoma felino.

49

Resultados
12. OTROS RGANOS: El pncreas suele estar comprometido de forma paralela al duodeno, ya sea con
afectacin primaria o gweralinda, en un caso presenta un quiste asintonitico en cabeza, pero no corresponde
con infiltracin clara duodenal. La glndula adrenal ha estado infiltrada en el caso de infiltracin masiva
renal, no en un rin con infiltracin inicial. La vejiga present mbolos tumorales en un caso de los cinco
estudiados; en dos casos hubo una marcada displasia epitelial con cistitis aguda abscesiflcada. La mama
estuvo infiltrada de forma difusa en un caso de linfoma multicntrico generalizado. Un hallazgo de necropsia
tite la calcificacin distrfica de la epiglotis en en caso con marcado compromiso respiratorio.
*

TUMORES SECUNDAMOS: En varias ocasiones el linfoma se ve acompaado por la presencia de otros

tumores: un caso con un hepatocarcinoma; otro con un tumor mamario previamente extirpado; en dos
ocasiones el perro presenta una patologa politumoral con adenocarcinoma bronquiolo-alveolar y tumor de
clulas de Leidig testicular; u otro caso con 2 mastocitomas, tumor de clulas de Leidig testicular y
adenocarcinoma de glndulas perianales.
C. MORFOLOGIA PTICO - ELECTRNICA
Todos los casos estudiados han sido de alto grado, donde se diferencian citologas de los distintos
subtipos: 13/30 (43.3%) linfoblsticosLB de los cuales 5 son B (Figuras 3 a 6) y 7 son T (Figuras 7 a
-

9), 10/30(33.3%) inmunoblsticos IB (Figuras lOa 12), 5/30(16.66%) centroblsticos CB (Figuras 13

a 15), y 2/30 (6.6%) extranodales, uno cutneo T (Figuras 16 a 18) y otro un MALT intestinal
plasmablstico B de alto grado (Figuras 19 y 20). Por tratarse de neoplasias de alto grado, el patrn de cielo
estrellado se encuentra de forma constante sin relacin alguna con los distintos subtipos histolgicos
(Figura 21).
El linfoblasto LB es un blasto linfoide mediano (10 micras) con ncleo redondo u oval en la estirpe B
y convoluto o cerebriforme en la estirpe T. Los E muestran nucleolos mltiples e hiperplsicos y cromatina
dispersa , en parte marginada. Los T exhiben cromatina en acmulos densos irregulares siendo los nucleolos
pequeos y mltiples, lo que les confiere un aspectode ncleo denso, hipercromtico e hiperlobulado con
MO. El citoplasma es mediano y basfilo porla cuanta polirribosmica, as mismo con escasas organelas,
aunque destacan las mitocondrias despolarizadas, algunos acmulos lipoides, centriolos y excepcionales
lisosomas. Puede observarse cierta diferenciacin a plasmtica en la estirpe E. Suele ir acompaado con un
patrn de cielo estrellado por lisis celular debido a la dinmica tumoral con mitosis abundantes y a la
fagocitosis de restos nucleares por histiocitos. Se diferencian dos grupos principales: el tipo Burkitt B
(Figuras 3, 4, 5 y 6) y el tipo convoluto T (Figuras 7, 8 y 9).
El inmunoblasto IB tiene un tamao grande (aprox. 12 micras), con ncleo de 8 a 10 micras, cromatina
de predominio dispersa, escasa marginada a membrana nuclear y nucleolo hiperplsico en nmero variable
(1-3) ms ftecuente en el centro del nucleolema; el citoplasma es amplio y basfilo con poca densidad de
50

Resultados
crganelas, abnndantcsribcsomas~ escasas mitocondriasyen la estirpeB, frecuente diferenciacin plasmacitica
con gran desarrollo del RER., paralelo ala membrana celular, con dilatacin de las cisternas rellenas de
material proteico, formando estructuras de aspecto enstaloide, visibles al M.O. como acmulos gutulares
(Figura 20). En algunos casos (Figuras 11 y 12), cl crecimiento tumoral se acompaa de un notorio
desarrollo de clulas plasmticas con distinto grado de diferenciacin (plasmablastos). En la estirpe T el
citoplasma exhibe una claridad caracterstica por imbibicin de solutos (Ib de clulas claras).
El centroblasto CB es similar al fisiolgico del centro germinal pero ms anaplsico; tambin es una
clula de tamao grande (10-12micras) con ncleo similar al IB, ms claro por la cromatina an ms dispersa
y los nucleolos suelen estar en la periferia; excepcionalmente el contorno nuclear puede estar hendido. El
citoplasma es escaso, tambin basfilo por la cuanta de polirribosomas, con muy escasas organelas entrelas
que son constantes las mitocondrias despolarizadas, siendo mnimo el RER (Figuras 14 y 15). El linfoma
centroblsco recibe la denominacinmonomorfo opolimorfo (Figura 13) si dicha lnea celular se encuentra
mezclada con inmunoblastos o cenrocitos en mayor o menor cuanta. En esta serie corresponden a linfomas
centroblsticos polimorfos, siempre acompaados no slo por inm~moblsticos sino tambin por clulas
plasmticas.
No se han observado signos caracteristicos ultraestructurales nucleares en relacin con los cambios
neoplsicos. No obstante existen cambios nucleolares compatibles con nuclear bodies o segregacin:
separacin de los componentes proteico y fibrilar. En cuanto a las imgenes de muerte celular programada
o apoptosis no se han visto aumentadas y exhiben disminucin del tamao, desnaturalizacinde las organelas
y picnosis nuclear, sin signos inflamatorios vecinos (Figura 22).
En todos los casosla arquitectura ganglionar est borrada, mostrando el linfoma un patrn difuso, a veces
pseudonodular porinfiltracin medular y sinusal que slamente respetaparcialmente las trabculas (Figura
23 c); la arquitectura general no se conserva y presentacierto aumento de la trama reticulnica, y suele haber
infiltracin de la cpsula en los estadios ms avanzados.

D. PATRONES DE TINCIN EN INMUNOHISTOQIJMICA

Un 80% de los linfomas de esta serie ha sido B y un 20% T.
1.- CD79a (don HMSY): Reacciona con el antgeno (dmeromb-l/B29) de membrana temprano de la estirpe
B y que persiste desde el estadio pre-B al de clula plasmtica en el que aparece a nivel citoplasmtico.
Aparece en humanos y en distintas especies de mamferos. En patologa humana marca leucemias B de clulas
precursoras, linfomas B y algunos mielomas. En ganglio reactivo animal marca las clulas B del folculo,
senos medulares y manguitos perivasculares. Dentro del folculo, las clulas del manto lo expresan con una

51

Resultados
clara positividad en citoplasma, en forma de anillos perinucleares y/o acmulos en RLER y Golgi; el centro
germinal marca los blastos B preferentemente en forma de anillo pednuclear, y el citoplasma de las clulas
plasmticas fuertemente teflido. En linfomas animales (peno y gato) marca del 60 al 70% de las clulas
tumorales B, con una intensidad de tincin variable (dbil-moderada-intensa), que depende de la fijacin y
condiciones del material. La positividad a este marcador coincide con la positividad a la cadena Lambda de
las Ig aunque el CD79aen perro es mucho ms especfico. En gato presentatambin, en muchos casos, una
reaccin cruzada con protenas nucleares, no slo del tejido linfoide, lo que dificultasu lectura (Figura 23).
De los 24 linfomas B en peno, el Ac HMS7 (CD79a) ha sido positivo en 22, de los cuales 10 casos han
presentado positividad muy fuerte, y 12 de ligera a moderada.
2.-KAPPA UGITT CHJ4INS/L4MBDA LIGHT CIL4INS: cadenas ligeras KAPPA /LAMBDA humanas.
Se utilizan para hacer diagnstico diferencial entre infiltrados homogneos de naturaleza B: tumoral
monoclonal que slo exprese una cadena (Kappa o Lambda), o reactivo policlonal que exprese ambas. En
hombre la mayor pwporcin de tumores de estirpe B es Kappa+/Lambda-, a excepcin de los linfomas MALT
digestivos que son Lambda+/Kappa-. Nuestra experiencia en animales es la contraria: todos los linfomas B
son Lambda+/Kappa-, y el nico caso de linfoma intestinal es Kappa+/Lambda-. El Ac reaccionacon las
cadenasKappa/Lambda libres, as como las unidas a molculasde inmunoglobulinas. Tie preferentemente
la lg intracitoplasmtica. Se aplica para tipificar las cadenas KAPPA/LAMBDA libres o unidas a Igs
presentes, por separado, en las clulas linfoides B en distinto grado de maduracin. En nuestros tejidos
animales marca con gran intensidad en las plasmticas sinusales, foliculares y en el manto; con menor
intensidady en acmulos intracitopasmticos y/o anillo perinuclear sedispone el Ac en los blastos linfoides
del folculo y manto. En los blastos tumorales dibuja un halo alrededor del ncleo, y en ocasiones forma de
acmulos de diferente tamao en la zona del aparato de Golgi y del retculo rugoso (Figuras 24,25 y 26).
Delos 24 casos de linfomas B en peno, 23/24 han mostrado positividad para la cadena Lambda, de los cuales
6 muestran positividad excesiva no valorada, y slo 1/24 muestra una clara positividad a la cadena Kappa.
3.- J CHlfVpotidonalpredilzdda: La cadena J esun componente unido a las mmunoglobulinas polimricas
y est unida por puentes disulfuro a las subunidades IgA e IgM en relacin de una cadena 1 por polimero,
independientemente del tamao de ste. Las clulas positivas a este anticuerpo en ganglio reactivo son
preferentemente plasmticas sinusales, foliculares y del manto; en gato ha marcado ocasionales plasmticas
sinusales. En linfomas las plasmticas positivas se disponen pobremente en el tejido conjuntivo y restos
sinusales que quedan entre los ndulos tumorales linfoides (Figura 27), Slo 5 casos han mostrado
positividad parcial a este Ac.
*

Un ensayo con IgM e lgD especficas de perro marc en ganglio reactivo las clulas plasmticas

excepcionalmente. El resultado esperado en clulas B inmaduras fue escaso y defectuoso, inferior incluso a
las cadenas K y L, y con el inconveniente de encontrar un gran fondo base.

52

Resul~dos
4.- CD3, PAN T: Reacciona con el receptor de membrana de clulas T timicas y de tejidos linfoides
perifricos. En patologa humana reacciona con la mayaria de los linfomas T, a excepcin de partede los
anaplsicos de alto grado. En ganglio reactivo de perro marca la zona T interfolicular; en ocasiones dicho
infiltrado T coloniza el manto adyacente y dispone de forma dispersa (15%) dentro del centrogerminal del
folculo B. En ganglio reactivo de gato el infiltrado T sobre las zonas B (folculo y senos medulares) es ms
numeroso (25%) donde los folculos se disponen de forma ms desordenada en la arquitectura del ganglio,
no solo en la corteza. Tanto en perro como en gato, ha teflido casi el 100%de las clulas de los linfomas T;
en los linfomas B las clulas T se han dispuesto salpicadas, dispersas de forma intermitente dentro del
infiltrado homogneo B (Figuras28 y 29). Los 6 casos de linfoma T en peno y 3 en gato presentan 100%
de positividad para el Ac CD3.
5.-. S-100: El anticuerpo reacciona con la 5-100A y B bovina, humana, de ratay canguro. El Ac se ha testado
en varios tejidos incluidos en parafina y mostraron ser especficos de forma estricta a la 5100; tambin son
positivas las clulas de Schwann del sistema nervioso perifrico, en piel los melanocitos, tumores
melanocticos y las clulas de Langerhans. En ganglio linftico, las clulas reticulares interdigitantes son
positivas a este Ac. En ganglio reactivo animal marca las dendrticas foliculares y del manto con sus
prolongaciones citoplasmticas, y en menor medida las dendrticas medulares. En linfomas caninos marca
clulas de estirpe monohistiocitaria redondas y estrelladas de forma variable: monocitos sinusales, dendrticas
interfoliculares y sinusales. No sigue un patrn constante; depende de la agresividad, grado de fibrosis, cielo
estrellado, etc... (Figura 30). Slo ha sido negativo en 2 de los 30 linfomas, y el resto presentaba distintos
grados de positividad de leve-moderado-alto en funcin del patrn que presentara en cada caso.
6- MAC3S7RISTIOCITARJO: El Ac MAC 387 reacciona con el antgeno leucocitario Li expresado en
neutrfilos, monocitos, algunos macrfagosreactivos, epitelio escamoso en mucosa y epidennis reactiva. Se
encuentra en citoplasma de muchas clulas niielomonocticas. En tejidos humanos el Ac reacciona con el
sustrato predominante dc macrfagos reactivos y tambin se observa en histiocitosis (maligna o sindrome
bemofagocitico). En ganglio reactivo de perro y gato marca histiocitos sinusales con fuerte positividad
(clulas monocitarias redondas). En el linfoma canino y felino parece estar relegado a monocitos-histiocitos
sinusales con menor positividad que el anterior (Figura 31). Ha marcado en 25 de los 30 linfomas de peno.
7.- MIR) (Ki-7enparafina): Reaccionacon clulas proliferantes (fases 01, 5,

02

y M) de todos los tejidos.

En el timo, la mayora de los timocitos corticales lo expresan, mientras que los de la mdula slo
ocasionalmente. En el tracto gastrointestinal reacciona con las clulas epiteliales mucosas en el cuello y la
regin basal (las clulas ms superficiales son negativas). En el epitelio escamoso se unen preferentemente
a las clulas basales. En el tejido linfoide: los centros germinales lo expresan en gran cantidad de sus clulas,
siendo inferior el nmero en otras reas. En ganglio reactivo animal, dentro del rea B, el centro germinal
parece mostrar una positividad del 60% (notablemente inferior a la descrita en humana, que es casi de un
1000/o), el manto deS a 10%, y los senos medulares un 20% en perro y un 30% en gato. El rea T expresa el
53

Resultados
Acaiun 10%de las clulas. En linfomas se detectan valores falsamente inferiores aIAcPClO por el patrn
de tincin heterogneo, en nuclealo y cromatina marginada, que es captado con mayor dificultad por el
analizador de imagen CAS 200 (Figura 32).Ha tefiido todas las muestras, aunque en una ocasin no ha sido
valorable por estar retrado el tejido.
&-

PCNA/PC-1O: El Ac PC-lo reacciona con clulas proliferantes en todos los tejidos (el Ac PC-lo

reacciona con el Ag de la ciclina PCNA de todas las especies de vertebrados, insectos y levaduras). En la
prctica, aunque la ciclina PCNA alcanza su sntesis mxima en la fase 5 del ciclo celular, los niveles
detectados entejidos normalesytumorales igualan o incluso exceden a los detectados con el Ac MIB, el que
marca todas las fases del ciclo celular con excepcin de la G0. De todas formas, ambos marcadores tienen una
relacin lineal de los valores del Ac. El patrn de tincin es homogneo, nuclear-nucleolar, y no permite
visualizar las estructuras nucleares (Figura 33). Hapresentado positividad en todos los cortes, aunque en tres
casos no ha alcanzado la intensidad necesaria para el sensor del CAS 200.
E) CINTICA TUMORAL: IROLIFERACIN Y CITOMETRA
Todos los resultados obtenidos en proliferacin y ambas citometrias de los 30 casos se detallan en la
tabla VII.
El patrn de tincin con ambos marcadores proliferativos (PC 10 y MIB 1) es nuclear y nucleolar,
homogneo en el caso del PC 10 y marginado-irregular en el caso del MIB 1, con positividad variable
dependiendo del caso a considerar.
El estudio proliferativo con estos marcadores se ha realizado en un analizador de imagen CA.S-200. Los
resultados fmales se han agrupado segn varios criterios como:
*

Histologa: Primera divisin en los distintos grupos histolgicos descritos en la clasificacin de Kiel

(Lennert, 1990) para corroborar la similar cintica:

Los linfomas linfoblsticos (13/30) tienen un rango de 25 a 42%, con un valor medio de 33.75% y una
-

mediana de 34% con el marcador PClO. Con el marcador MIB tienen un rango de 25 a 47%, una media
de 36.75% y una mediana de 38.5%.

Los linfomas centroblsticos (5/30) tienen con el marcador PClO un rango de 21 a 43%, una media de

32% y una mediana de 32%. Con MIB tienen un rango de 25 a 39%, un valor medio de 33.6%y una
mediana de 35%.
Los linfomas inmunoblsticos (10/30) muestran un rango de 19 a 42%, una media de 34.375% y una
mediana de 35.5% con el Ac PCl0; con el AcMIB tienen una media de 38.1%, una mediana dc 40%
-

y un rango de 26 a 46%.
54

Resultados
-

Los lmfomas exlranodales (2/30) tienen un valor medio (y mediana) dc 38%y un rango de 26850%

conelAcPCIO.ConelAcMlBltiencnunamcdia(ymediana)de3O.5%yunrangodcl7a44<>4
*

Estirpe tumoral: B 1 T:
-

Los lnfomas B (24/30) tienen un rango de 19 a 50%,una media de 34.72%y una mediana de 35% con

el PClO, yun rango de 25 a 46%,media de 35.75 ymediana de 41 con el MIB.

-LoslinfoniasT(6/30)tienenunrangodevaloresde2s a42>4unamediade30.4%,yunamedianade
26% con el PClO; con el MBl los linfomas 1 tienen un rango de 17 a 47%, una media de 29.8%y una
mediana de 27%.
Si consideramos los 30 casos en conjunto, con el Ac PClO tiene un valor medio de 33.92%y con el MIB
tiene un valor medio de 36.24%.
La proliferacin en el grupo de 15 casosconstituido por material antiguo (Tabla VIII) tiene un intervalo
devaloresde20 a 73%, media de 29.7%y mediana de 27% con el PCIO; con el MIBI tiene unrango de 26
a 72%, media de 36.46%y mediana de 33%.
En el estudio citomtrico, con CME (programa quantitative DNA analysis del analizador de imagen CAS
200), de los 30 casos de linfoma estudiados, 40% eran diploides (12/30) y 53.3% aneuploides (16/30), con
2/30 no valorables (Figura 34). Con CNff (programa PARA- 1 del citmetro de flujo EPICS-C) la diploida
se ha encontrado en 46.6% (14/30) dc los casos y aneuploidia en 43.3% (13/30) de los casos, con 3/30 no
valorables (por necrosis, manejo inadequado del material o excesiva fijacin en formol) (Figura 35).
Los ocho casos felinos control han presentado un comportamiento mucho ms agresivo e inestable: la
aneuploidia con CMF ha estado presente en 6/7 (uncaso no ha podido valorarse por lisis de la muestra) y con
CME en 6/8.

La proliferacin con PCIO tiene un rango de 53 a 26%, con una media de 38.8 y una mediana
de 37%. Con el marcador MIB tiene un rango de 54 a 37%, con media de 45.4 y mediana de 47%.

F. ESTUDIO ESTADSTICO:
Todos los datos han sido analizados con el programa de estadstica SPSS para variables biolgicas.
Adems de la estadstica bsica, realiza las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, para las cuales
considera un nuevo grupo formado por todos aquellos animales que hayan superado en das de vida el da 1,
esdecir, desecha todos los animales que han sido sacrificados el mismo da del diagnstico (Figura 36). Se
considera da 1 la entrada o admisin en el centro veterinario, descartando la visin subjetiva del dueo sobre
la fechade comienzo de la sintomatologa propia del linfoma, para intentar homogeneizar todos los resultados.
El otro problema aadido es que todos los animales han sido sacrificados, por lo que la supervivencia se
transforma en un dato relativo. Las distintas variables recogidas como edad, sexo, raza, estadio, tratamiento
55

Resultados
(si/no),... se analizan con respecto a la posible supervivencia observada. Los casos felinos no han sido
considerados en el estudio estadstico por ser slo ocho en nmero.
La ditbrenciaentre la supervivencia de los animales tratados frente a la de los no tratados s fue claramente

significativa (p=t.0002), porlo que obviamente la variable tratamiento s tiene valorpronstico. La variable
tratamiento con el protocolo COP no se analiza desde un punto de vista cualitativo, es decir, no se busca
conocer ni el tipo de respuesta que pueda producir ni la fiabilidad del mismo, slo si ha variado la
supervivencia total en alguna medida con respecto al grupo de animales no tratados (Figura 37).
Al

dividir el gmpo total en funcin de valores medios de la edad como media y mediana (8, 9)y en funcin

de cada tipo de edad, no sehan encontrado diferencias significativas entre las curvas de supervivencia de los
intervalos resultantes, por lo que no sepuede decir que la edad de presentacin tenga valor pronstico en este
grupo de estudio (Figura 38).
*

Con respecto a la variable sexo,las curvas de supervivencia tienen un comportamiento similar en ambos,

por lo que no se ha encontrado su valor pronstico. La proporcin de presentacin segn el sexo es de 2:1
de machos frente a hembras, pero no tiene significacinestadstica como dato aislado (Figura 39).
*

Aunque el Pastor Alemn tiene una frecuencia muy superior al resto de razas, su curva de supervivencia es

similar con respecto a la de los dems, considerados en conjunto portener todos frecuencias muy bajas. Por
no encontrar diferencias significativas, no se puede decir que la raza tenga valor pronstico en este grupo de
estudio.
*

No seencontr valor pronstico en la variable inmunofenotipo ya que las curvas de supervivencia de los

casos B y T fueron similares; en parte pudo ser debido al escaso nmero de casos T (6) frente a los B (24)
(Figura 40).
*

La afectacin hephtica si tiene valor pronstico en este grupo de animales, ya que la supervivencia global

de los casos en los que el hgado no estaba implicado es significativamente mayor (p=0.0009) que la de los
casos en los que el hgado si estaba afecto, Por lo tanto, no se debe considerar al bazo y al hgado en el mismo
estadio clnico, no slo porla diferencia en su supervivencia, sino porla mayor importancia del hgado como
rgano hematgeno (Figura 41).
*

El valorde la proliferacin con el marcador PC1O result tenervalor pronstico frente a la supervivencia

global; La proliferacincon el marcador PC 10 dividida en dos intervalos segn la mediana (> 34; c = 34),
mostr supervivencias significativamente diferentes (p=O.0 17) (Figura 42). Incluso en el grupo de animales
tratados con quimioterapia, la supervivencia fue significativamente superior para el intervalo PC 10: < 34
(p=O.0 16) (Figura 43). No fue as con el marcador MIBX, donde la divisin por intervalo de valores segn
56

Resultados
la mediana (> 38; c = 38) no dio supervivencias significativamente distintas (Figura 44).
No hay di~mcias significativas entelos valores de la proliferacincon ambos marcadores en las distintas

divisiones aaj establecidas (globalmente, por grupo histolgico, inmunofenotipo, tiempo de fijacin...). La
correlacin por los mtodos Pearson, Kendall y Spearman del programa SPSS es de 0.61, 0.429 y 0.61
respectivamente, con nivel de sinificancia de 0.01 (Figura 45). Aunque los indices con el PC10 parecen ms
altos considerando cada caso por separado, ambas medias permanecenhomlogas. Aunque a simple vista
tiene valores absolutos inferiores, el marcador MB1 muestra un mejorpatrn de tincin inmunohistoquimico,
con independencia al tiempo de fijacin en formol y mejor respuesta a la olla a presin como mtodo
recuperador antignico.
*

Existe correlacin estadsticaentre el indice de proliferacin con PC 10 y el indice numrico de contenido

de ADN por citometra de flujo, con valores de 0.54, 0.323 y 0.426 por Pearson, Kendall y Spearman
respectivamente, con nivel de significancia de 0.01 y 0.05 (Figura 46).
*

Si consideramos la ploida como una variable cualitativa, existe una correlacin precisa entre ambas tcnicas

citorniricas en 25/27 -92.6%- (ya que tres casos de los 30 no fueron valorables). La correlacin es de 0.862
por Pearson, Kendall y Spearman, con nivel de significancia de 0.01 (Figura 47). No hubo correlacin entre
los valores con ambas tcnicas en 2/27 -7.4%-. Los dos casos de discordancia entre ambas tcnicas eran de
estirpe 7, aunque no se puede establecer ninguna relacin por el escaso nmero de casos (Tabla IX).
*

No existe correlacin alguna entrela fase 5 y la proliferacin, grado histolgico e inmunofenotipo, por lo

que seconsidera una variable independiente. S se relaciona la fase 5 con la valoracin global cualitativa de
la ploida con ambos mtodos citomtricos (conelacin estadstica de 0.6, 0.5 y 0.6 con nivel de significancia
de 0.01) (Figura 48). En este estudio los altos valores de fase 5 se han relacionado con la aneuploidia (Fase
5

>

15%), aunque no todas las aneuploidias tienen fase 5 alta. Los altos valores de fase 5 no se han

relacionados con los valores ms altos de proliferacion.

*

No hay correlacin estadstica significativa entre la ploidia y la proliferacin, ni tampoco con el grupo

histolgico. La proliferacinmantuvo un rango medio independientemente de la ploida que presentaba cada

caso; no hubo diferencias signflcativas entre los valores medios de proliferacin de los casos diploides y
aneuploides tomados por separado. La posible asociacin entre diploidia con bajo indice proliferativo o
aneuploidiacon alto ndice proliferativo no ha podido demostrarse, ya que el nmero total de casos estudiados
esmuy pequeo, y adems la mediana se aproxima mucho al valor medio, lo que significa que la mayora de
los valores se sitan alrededor de la media (son similares).

57

y.- ICONOGRAFA

Iconografla

TABLA 1
cLASIFICAcINDE MIELREVISADA Clan:. 1913)
LINFOMAS NO-HODOJUNDE BAJO GRADO E

LINIQEAS No HODGRIN DEBAJO GRADO T

- t~hn ~

Lnh ~
Lawende lnatia atcic
Las jxolistc#im
IM,foens de clula pequsfiawebeifcnne
Micaela furunide. sndrome de Szaxy
Linfas,. I,faepitelioid. (hobus doLennert)
Listen.An~ioinnn.a,oblsco
Linfas de 1. zote t

Lenoess LinSdm ctnice (LLC)

lsn~
olntc~te
l.acede de clulasPeludas
LinEen. Linfoplwnsdlioo (innnsncciflm>
Planoconss
- Linfas,. CesifrocIlico (CC) - Linfrma Cntoblstico.Cetocltico (OB-CC>
Nodul.rol)ifoao
LINFOMAS NO-HODOION DE ALTO GRADO E

LINFOMAS NO HODGICIN DE ALTO GRADO T

Li-Jan Cnfrobls*ico
LffomnInhlmoblstico
Linfas,. Axaplsico de Clulas Grandes (Ki.lfl
- Lisian,. Linfoblaslico
LizdoetiadeBuxkitt

dinfomapleonort de odiulamcdiai~aygrende (HflV-l +-)

Linfom. lmnunoblsco (HTLV.l 4-.j
Linfas. An~,Iaioo de clula pande (Ki.l+)
Linfas. Linfohl.tico

Cotesdesdo hoy semejan, al Lmfos,s da Clulas del Manto (Weuasenbwr DD eta], 1981)

TABLA II
CLASIFICACIN DE LA WORICINGFORMULATION
LII4FOMAS DR BAJO ORADO:
1. L4adttca de eflua pequsIla

.ConLLC
Plasn,ocitoide
2. Folicular, vox, predominio de clulas pequefla. hendidas
Aras. difinas

Escl&csla
3. Fallador de clula pequefiahedida y clulagrande
.nadifl,as

Esclerosis
LINFOMAS DE GRADO U4TERMEDIO
Folicular canpendoxoinio de clulas pandes

asclerosis
2.DJlao con clula pequefes hendida

Esclerosis
3. D

4frsa. mato con clula pequefias y pandes

Esclerosis
Clulas eptelioldea
4 Dtfzcsa de clulas g,andn

Clulas hendidas
Clula no hendidas

LINFOMAS DE ALTO GRADO

1 lmnunoblatico de clula pande
Plasinocitoido
De clulas claras
Polimorfo
Can clulas epiteltoidas)

2. Linfoblstico
Convolssto
No convolulo)
3. Dc clula pequeS.no hendid.

Tipo Buitt
Conrea. folculerea)
MISCELNEOS

Micaela F,m~ida
Plsnocitomn. Ex,ramnedular
lnclaificables
Oteas

58

Icopprafia

TABLA III
CLASIFICACINDE LNH (REAL 1994 -OMS.
L LlmIcassa E

II. laf.mas T

1 Les,caniaiLinfcnsaLinfoblstico E pennor

Linfas,.! leoocenis Linfolstios de clula T preosna

2. Ttnsnea de clulas T peuifnices y clulas WC

2. Tumores de clsulas E purifrias:

Laiscensia Liufocliios adeticaE /Linfoenade linfocilos peqtseftcs E
-

Laicemis Proliotcla

LiofocsaLinfoplasnsocitoide
Lffs,enadelMsstofoliculr
LinEena Centro Folicul.
Linfoma Bde la mn.inai: Eriras,odai (MALT de bajo grado B>
1 Nodsl Esplnios
Leucemia de ClsslasPeludas
Linfoena E da Clula .ndu
Lisifamna E pnsnado de mediastino

1997)

2a. Formas pndcmst.sa,stsmanss !euc,scosdnemssadas:

Leucemia prolinfocltica T (clula peqs.efiao coefriftmnne>

Leucemia linteina panular
Leucemia sgrca~a NK
Sindroenedesmy
LinfomMeucensss de clulas Tdel adulto (FILVI4>
Linfo.s.a T bepatocaplnica gmsussaldelta

Zb. Formar predoestnosremenee gaaglsanans

BSrhO

Linfo,na E da alto grado, BuslIr-lre

Linfosna de clulas grandes as,aplsico, Te Nulos.

Linfoena T angsonnsunoblstico
Lnfasna de clula. T perifricas no especifico
<Linfoepitelioidede zona T/pleanorfo/Ina,sa,obllstico)
Linfo.s,a anaphsico de clula grande (LACOXT y null)

3 Enfens,edaden tinunosecretosus(varsasitas olimos. o nsorfolgsca)

2c. Formar predc~si.santements s4ranadtzlus
.Mielan.
flasmociton.

Qannapatia mossoclonai
Mscroglobulissemia de Waldasatron, (bnwsocitosna)
Enfennedad de la. cadenaspesadas

Enfennedad de depsito de Ip

Liafonsa nasal y ciponasal da clulas 14K

Micosis firgoide(Retsculosa pag.roide/rnucmcais folicular
e.ocisda/enf cutnea lasta grmmlomatoaa)
Enf Linfoprolifexatna cutneas pnsnariss CD304 (Papvlcuis
lmfomnaloide A y BiLACO cutneo prisnso/lesionea border.
linct
tspoparaiculltico
Linfosna
subcutneo
Listan,. Tintestinal
de clula. T (+1- enteropasia)

59

Iconografla

TABLA IV
N0 BIOPSIA FJD
1, 87A55
2. 87A61
3. 95A48
4. 95A49

MATERIAL UTILIZADO
NECROPSIA UCM PAT. MDICA
CF.
CF.
CF.
CF.
N253/95
3923/94
CF.
CF.

5. 95A70
6. 95A86

N325/95
N344/95

CF.
1613/94

7. 95.4197
8. 95A238
9. 95.4248
10. 95.4264
11. 95.4266
12. 96A6
13. 96.47
14. 96.423
15. 96A28
16. 96.430
17. 96.432
18. 96.450
19. 96A51
20. 96.452
21. 96A53
22. 96.4105
23. 96.4108
24. 96A109
25. 97.46
26. 97.411
27. 97.412
28. 97.413
29. 97.445
30. 96A48

N473/95
CF.
BIOPSiA
N107/96
N126/96
N249/96
N253/96
N262/96
BIOPSIA
N326/96
N339/96
N455/96
N457/96
N469/96
N445/96
N576/96
N614/96
N650/96
N54/97
N138/97
N154/97
N1SO/97
N268/97
BIOPSIA

5950/95
C.P.
BIOPSIA
5806/95
6689/95
943/94
7556/96
7552/96
BIOPSIA
7917/96
7 175/95
8604/96
8090/96
8032/96
2524/96
7883/96
9592/96
9746/96
10150/97
10673/97
10755/97
10745/97
10444/97
BIOPSIA

M. ELECTRNICA
87E113
87E106
95E12
95E13
95E20

95E40
95E48
95E66
95E74
95E79
96E4
96E6
96E8

96E49
96E54
96E
96E66
97E12
97E31
97E34

N0 Biopsia F.J.D.: Nmero de protocolo dado en el Dpto. de Anatoma Patolgica de la Fundacin Jimenez
Daz. Necropsia UCM: Nmero de necropsia asignado en el Dpto de Anatoma Patolgica de Patologa
Animal IIde la Facultad de Veterinaria de la UCM. Pat. Mdica: Nmero de protocolo asignado en el Dpto.
de Patologa Mdica de Patologa Animal II de la Facultad de Veterinaria de la UCM. M. Electrnica:
Nmero de protocolo de Microscopia Electrnica dado en el Dpto. de Anatoma Patolgica de la Fundacin
Jimenez Daz. CP: Procedencia dc Centro Privado, directamente a la Fundacin Jimenez Diaz. Biopsia: Caso
sin necropsia seriada. ( ) carece de estudio de M.Electrnica.

60

Iconoarafla

TABLA V
ANTICUERPOS UTilIZADOS EN EL ESTUDIO DE LINFOMAS ANIMALES
Ac

Tipo

CD

Dilucin

Fuente

Especificidad

PanT

1/50

DAXO

Linfocitos T

HM57

1/50

DAKO*

Linfocitos B

5-100

Po

1/100

DAKO

Histiocitos

MAC387

Mo

1/100

DAKO

Histiocitos

KAPPA

Po

1/400

DAKQ

clulas B

LAMBDA

Po

1/400

DAKO

clulas B

J-Chain

Po

Prediut

BIOMEDA

clulas B

MW 1

Mo

1/50

DAKO

ncleos en

PC1O

Mo

1/50

DAKO

ncleos en

Cortesa del Dr. David Mason.

TABLA VI
VALORACIN DEL CICLO CELULAR
ANEU?PLOIDE
DIPLOIDE
DIPLOIDE-FASE 5 ALTA

ANEU?PLOIDE

GRFICA SIMETRICA

CICLO DIPLOIDE

GRFICA ASIMETRICA

Y/

0.8<DNA.> 1.2

FASE SALTA
(5> 15%)

DNA <0.8: HpD

DNA> 1.2:HrD

(HpD:Hipodiploide; HrD:Hiperdiploide)

61

Iconocatla

TABLA Vil
PLOmIA Y PROLIFERACIN
CMF
NDEAP
1.87.455
2.87.461
3.95.448
4.95A49
5.95.470
6.95.486
7.95.4197
8.95.4238
9.95A248
10.95.4264
11.95.4266
1296.46
13.96A7
14.96.423
15.96.428
16.96A30
17.96A32
18.96A50
19.96.451
20.96.452
21.96.453
22.96A105
23.96A108
24.96.4109
25.97.46
26.97.411
27.97.412
28.97.413
29.97.445
30.96.448

LADN
0.69
N.y
1.55
1.11
0.95
0.95
0.98
0.97
0.71
12
1.3
1.19
1.28
1.29
1.03
0.99
N.y.
0.96
1.01
1.05
1.02
1.2
1.87
1.13
1.09
0.97
0.94
0.96
0.97

=2L

CME

IROLIFERACIN

FASE 5

PLOIDIA

LADN

PLOIDIA

Poe

MiEl

28.2
NV
111
11.9
158
13.6
8
123
173
104
163
201
188
107
75
204
N.y.
7.2
2.4
6.9
13
33.9
0
13.2
11
7.3
10.8
6
16.6
N.y.

A
N.y.
.4
D
0
D
0
0
A
A
A
A
A
A
D
A
N.y.
0
0
0
0
A
A
D
D
D
D
0
0*

0.99
0.5
0.51
1
0.8
0.91
090
109
1 02
121
096
103
1.35
138
094
088
N.y.
085
092
0.84
0.81
0.53
1.21
2.29
0.85
0 98
1.09
1.04
1.09
N.y.

.4
N.y.
.4
D
0
D
0
0
A
A
.4
.4
A
A
0
A
N.y.
0
0
0
0
A
A
A
A
D
0
0
D*

43
N.y
42
36
26
31
29
35
21
34
32
35
42
38
40
25
25
26
16
19
39
34
50
42
33
39
33
35
32
N.y.

39
44
44
39
27
43
26
38
25
25
29
46
37
32
41
32
16
17
27
34
45
46
44
47
31
35
41
39
37
41

.flY~

fly~.

CMF: Citometria de Flujo. CME: Citometria Esttica. Proliferacin: Indice Proliferativo en el

Analizador de Imagen CAS-200 con los marcadores MIB 1 y PC 10. Ploida: Valoracin cualitativa de los
ndices de ADN en ambos mtodos citomtricos.

62

Iconografia

TABLA VIII

PROLIFERACIN EN MATERIAL RETROSPECTIVO

N BIOPSIA

MIBX

PC1O

1.- 94.4197

31

21

2.- 94.4199

43

32

3.- 94.4200

26

21

4.- 94.4204

26

20

5.- 94.4209

40

48

6.- 94A224

36

25

7.- 94.4226

31

20

8.- 94.4231

38

28

9.- 94.4232

33

27

10.- 94.4234

30

30

11.- 94.4239

72

73

12.- 94.4240

42

22

13.- 94.4244

31

24

14.- 94.4260

29

28

15.- 94.4261

39

27

63

Iconograifa

TABLA IX
LA CITOMETRIA ESTTICA FRENTE A LA CITOMETRIA DE FLUJO
VENTAJAS
*

Mtodo muy simple.

Se requiere muy poca cantidad de material.

Posibilidad de utilizarmaterial parafmado.

INCONVENIENTES
*

la parafina no interfiere con el manejo del

equipo.
*

Elige las celulas que van a ser analizadas

directamente.
Puede clasificar las clulas en funcin de su
forma, tamao,.. .etc.

Capacidad para eliminar directamente nucicos

rotos, debris, dobletes, elementos
mflamatonos,... etc.
*

Posibilidad de identificar poblaciones

pequeas aneuploides enmascaradas por una
diploide mayoritaria,

64

Problemas en manejo los cambios en la

intensidad de tincion puede dar falsos
resultados
La objetividad puede disminuir al elegir
las clulas; es preciso medirlos
suficientes campos para evitar el sesgo.
Al seruna curva continua de menor
resolucin, es dificil identificar las
distintas fases del ciclo celular<~~,Q1, S y
G2+M.
Los coeficientes de variacin son
mayores con material parafinado, por lo
que se desestiman en el caso de la
citometriaesttica.
El nmero total de clulas necesarias para
el anlisis del ADN es mucho menor, lo
que supone un ahorro de tiempo y de
material, aunque podra disminuir su
eficacia (CME:300 clulas
aproximadamente; CMF:50000).

eon9grafla

Distribution ot DNA Mass

Gel Ciasses
Dis~vcd 12345
rkst Peal<
Man: 4.3 pg.
DNA ndex: 0.84
Asca 30.2 u2
Cok 44
Second Peak
N4ass: 0.Oog
DNA Mex 0.00
Aiea: 0.0 u2
Ccls: O

ue

8
OUA Mas: Picogams

12

rEid Coajnt 13
Total Col Ocun: 165
16 tekDiso~Jed165
Oeb 01< Scake: O

Distribution al DNA Mass

20

64

Ccli Clanes
D~pIaycd: ~2 45

40

-H
Hs Peak

48

3.5 pg
DNA Mex: 0.77
Asca: 3~.3 u2
CelIs: 55
Sccond Pnk
Man: 0.0 Ps.
DNA ndex: 0.00
Aiea: 0.0 LI2
Cois: O
Mass:

(A

32

i
u
16

I I

II II~Is..IIs.

12

DNA Man Pcogiams

16

Ficid Ceun: 10
Total Ceil Count: 309
Oebflispltcd3OS
Celis DII Scalc: 0

Distribulion of DNA Mass

20
t --A

32

40

Gel Classes
Displ~ed: 12145
Fist Pcak
Man 4.8 pg.
DNA Mex: 0.88
Aiea: 44.8 u2
Cek 32
Sccond Peak
Mass: 0.0 pg.
DNA ndex: 000
Aiea: 0.0 112
Cok: O

24
J

uo 16
u

Ii ., .111

11111.1.1. 5

8
DNA Man Picogams

12

ricd Count: 19
Total Ccli Oount: 311
16 O.k Dispi~.d311
OeilsOttScaIe:0

Figura 34: Estudio de la ploida de las clulas tumorales con citometra esttica. Grficas de distribucin
de la cantidad de ADN en histogramas proporcionadas por el programa de ploida dcl CAS 200. A)
Poblacin diploide. B) Poblacin diploide con fase 5 alta. C) Poblacin aneuploide.

98

Iconografi a

fbt%12.1J0 113 1

5000

~.L

u.

2400.

0. SOS

2000

~3
18OO~

4)

WC,

,<01

.81.1

3.Z

seas 01It.I

taco..

000

CiI*Z
Sara

OJO

3.7

MC

2.2

.4 3

6.8

atC

1.849

400

84

II

t0a

120

DNA

240

858

380

304

.40

att

Conteat

.tjo tu vaa

4)

~1*
14... 01In.,

ose

tse.

MCI

.72.2

120.

Iba C..S
WC 5 2.7

00

JL
84

120

103

DNA

880

330

MC

448

Oontent

811

~t

54. 1.1

puwls cICJ
II... Cts 52.2
a 0.1
.05.8
lI.aa 02sl3.2
WC
5
8.1
MC
.3

>4 7 a

14
43
250

10~

tflI

O/Ca
xl

Sao

-4
4)

7.8

5C.b. 5.2
384

350

3.4

=45

W4*C .1 lIs NA 41fl

E a

400

.0

1..

u.

e.

cM Sta

a,

200
14
4)
.0

.49..

0.2

a 7~7.7

AS.WL. CICLE
II... Ola 57.2
0.501 allZ
> Ci. a

200
150

>h.n 0. 7~7.3
0.> 0 a 12.2
MC a

100
so
o
u

a 17.3
0/01
S.l.

aZ.575
5

.712

Sn. 4.. 5.2

84

120

ia

Oslo

320

304 440

DNA Content

M 5.. a
OS St..

.1
1.4

Figura 35: Estudio de la ploidia de las clulas tumorales con citometria de flujo. Grficas continuas

obtenidas con el programa PARA- 1 del citmetro de flujo EPICS-C. A) Poblacin diploide. B) Poblacin
diploide con fase S alta. C) Poblacin diploide con un pico aneuploide hipodiploide de menor altura.

99

Iconografia

Fase S va Valoraclon de CME

40

35

30-

e
e

25
Ci,

u.
u-

20-

e
e

o
15

10

u
u

e
0

Aneuploide

Diplolde

CME ( Valoraclon)
Fase 8 va Valoraclon de CMF
40

35

CMFvSCMFS

30

25

uE.

u.

20

u-

15

lo
5

e
Meuplolde

Dploido

CiAP (valoraclon>

Figura 48: Correlacin estadstica de la fase S con ambos mtodos citomtricos con los mtodos de
Pearson, Kendall y Spearman. Se aprecia que en ambas citometrias, los valores bajos de fase 5 se agrupan

en la columna diploide, y los valores altos en los aneuploides.

106

VI.- DISCUSIN

Discusin

A.- CONSIDERACIONES GENERALES

Apesardelabajafl-ccueneiadeloslinfomasenelpeno(meuiosdeunl%un 11-24%porcada 100.000
animales) Maulton JE el a!, 1990; Val! VEO eta!, 1993] esta patologa esde gran inters por su aumento
creciente en los ltimos aos, tanto a nivel animal como humano. En el peno la etiologa no es totalmente
conocida; enel hombre serelaciona con los estados secundariosde inmunodeficiencia (SIDA y transplantes
[Rivas C era!, 1989; Alba/ate Ma al, 1998]), hecho tambin aceptado en la especie felina por distintas

virosis [Hardyir WD eta! 1989;Moulron .JE el aL 1990].

El presente trabajo representaba un reto dentro del estudio de la patologa veterinaria ya que, por las
caractersticas del

tejido linfoide tanto en reacciones como en tumores, necesitaba un enfoque

multidisciplinario. Este comprende, no slo una correcta consideracin morfolgica macro y microscpica,
sino inmunohistoquimicay dinmica global (proliferacin y citometra) para relacionar de forma correcta los
datos obtenidos con la clnica y evolucin [Linden MD el al, 1992].
Para realizar las nuevas metdicas (IHO, ME y CITOMETRIA) ha sido imprescindible un control
minucioso de los tejidos afectos en todo su manejo, prefiriendo material reciente (no ms de 4 horas postmortem) y fijaciones inferiores a 48 horas en formol tamponado [FriersonHE 1988; Kallionemi Ot 1988;
Esteban Al et aL 1991; Frierson HE 1991]. Como el tejido linfoide es muy lbil, presenta varios

inconvenientes en estudios retrospectivos a la hora de trabajar con material postmortem, dado que a la posible
autolisis puede aadirse una sobrefijacin formlica con retraccin tisular y celular, que dificulta una correcta
tipificacin histolgica [EstebanJMet al. 1991; Alanen KA eta!, 1993]. Cuidando ademstodos los pasos
del proceso de inclusin en parafma, y controlando sobre todo la temperatura, se puede a priori asegurar
un buen resultado en las tcnicas especiales posteriores.
El material retrospectivo por tanto, no ha cumplido las exigencias requeridas y no ha respondido
adecuadamente ante estas nuevas tcnicas, siendo en ocasiones imposible tanto su tratamiento como la
interpretacin de los resultados. As pues, las conclusiones se han basado sobre todo en el grupo obtenido de
forma ms correctay homognea -30 linfomas en perro y Sen gato- recogidos en el periodo 1995-1997. Los
15 linfomas retrospectivos caninos del periodo 1987-1994 slo han servido para verificar diagnstico de
neoplasias linfoides malignas difusas y para el estudio proliferativo.
Uno de los objetivos de este trabajo ha sido reconsiderar y aceptar una clasificacin dc los linfomas
caninos desde un punto de vista morfolgico e imnunofenotpico, relacionandolos datos con la agresividad,
valorada con marcadores proliferativos. En patologa humana, la controversia existente por la diferente
semntica utilizada en los distintos subtipos, ha ocasionado durante muchas dcadas un retraso en el
entendimiento de estos tumores. La agrupacin dc subtipos diferentes como enfermedades idnticas por
rasgos morfolgicos celulares ms o menos parecidos ha complicado la concepcin patognica,dado que las
107

Discusin
evoluciones ylas terapias no eran acordes. Las distintas clasificaciones (Rappaport, Lukes-Collins, Kiel,
Woiidng Formulation, REAL u OMS /Rappaport II, 1966;Lenner K el aL 1975; Lukes U 1975; RoSmith ARTn al, 1981; LennertKet al, 990; HarrisNetat 1993; Chan JKetaL 1994; WHO 997])
demuestran una multitud de opiniones, pero para los estudiosos en linfomas son bastante unitarias y, gracias
a las nuevas metodologas, se puede establecer la estirpe y la agresividad con mayor seguridad.
Dadoque el alto y bajo grado morfolgico de los linfomas B en la clasificacin de Le se conelacion
con baja y alta agresividad clnica, nos ha parecido que este camino, la demostracin de los distintos grados
de agresividad, era quizs el ms adecuado para la consideracin del presentetrabajo. As pues este grupo
ha quedado reducido a linfomas de alto grado, de celularidad blstica variable, nodales y extranodales
[Lenner K el al 1990].
Es importante incluir en las clasificaciones las entidades extranodales que se empiezan a presentar en
animales domsticos y, que en un principio no estaban contempladaspor su poca frecuencia o rareza; algunas
son de naturaleza B [IsaacsonPG eta), 1983; Spencer Jet al, 1986] pero hoy se conocen otras, por ejemplo

las 1 de naturaleza CDS+, hoy incluidos como variantes 1 citotxicas [HHO,1997], algunas de clulas
granulares [Eran/cv
Tel aL 1986; Welltnan Miel

aL 1989; MoareFetaL 1994; French RA el aL 1996].

Con respecto a las clasificaciones histolgicas de patologa humana que se han asumido como correctas
porla OMS [WHO1997/, y a su vez han sido adaptadas a patologa veterinaria [ParodiAL, 1988; Carter
RE el al, 1986; Greeniee PC el al, 1990; Teske E, 1993; Fournel-Fleury C el al, 1997,/), ~
nuntualizar ~n~:
*

La mayora de los blastos linfoides en perro son ms peque5os que en el hombre, especialmente los

inmunoblastos y los centroblastos tanto reactivos como tumorales [Carterel aL 1986; Teske E, 1993].
*

La

clara diferenciacin entre IB y CB es dudosa en algunos casos, dato as mismo comentado en

humanos y que ha llevado a considerar los linfomas de ambas clulas como B de clulas grandes
[Lenner 1<, 1978; Nahona! Cancer Inshlute, 1982; RK4L: Harris NL el aL 1993; Chan JK el aL
994].

En cualquier forma histolgica, el sustrato acompaante es mucho ms rico en plasmticas que su

homnimoenpatologia humana, hecho an ms llamativo en gatos [FederBMet al, 990; Hulson CA

etaL 1991; Parodi AL eta!, 1994; PollA el al, 1994; CallananJi el aL 1996].

Estos hechos hacen dificil presuponer a priori una total correlacin entre los subtipos caninos y humanos

aunque seha tratado de hacer una aproximacinlo ms acertada posible.

los

Discusin
La morfologa ptica dc rutina pamite un diagnstico conecto del patrn nodular o difusa, la existencia
o no de cielo estrellado, la blastosis celular y las mitosis. En muestras bien fijadas con buena citologa
ahadida, proporciona un diagnstico preciso.
La ME, abandonada pormuchos patlogos en la actualidad, ha aportado grandes ventajas en el estudio
morfo-citolgico, sobre todo en ejemplos incorrectamente fijados, con lisis celular o artefacto de retraccin
(casos tratados con quimioterapia). Teniendo en cuenta la semejanza ptica y el alto grado de malignidad de
toda la serie, la ultraestructura ha tenido un papel muy importante como complemento, detallando las
caractersticas ncleo-citoplasmticas de las clulas neoplsicas y ofreciendo as matices de diferenciacin
celular que penniten diferenciar IB de CB y LB. Se confinna pues, como ocurri antes de la era
inmunohistoquimica, que los hallazgos de ME aportandatos fidedignos, y que por ello ayudan en casos en
los que laIHQ no ha podido realizarse o sus resultados no han sido completos [HenryK, 1975; Kaiserling
E, 1977; Rivas C et aL 1980; Rozrnan Cel aL 1993J.

Hay que resaltar la importancia del inmunofenotipo, hecho ampliamente demostrado en patologa

veterinaria y humana. De un lado permite la exacta caracterizacinde la estirpe y con ello del pronstico, y
de otro la agresividad. Aunque se ha definido un peor pronstico en los Iinfomas de naturaleza T (de forma
global) y biologa cambiante en los extranodales [Castrillo JAl el aL 1992; TesAr E, 1993; Teske E el aL
1994], en este estudio, estos hallazgos no han podido verificarse, quizs por elmenor nmero de linfomas

T en nuestra geografia y en la serie (20%), en contra de las referencias de distintos artculos de patologa
veterinaria, donde los linfomas T son mucho ms frecuentes Teste E el al, 1993]. Por ello, la correlacin
estadstica no ha podido resultar significativa, otro hecho objetivo que denota la dificultad de comparacin
de forma absoluta de los linfomas de perro y hombre Montalbn C el a), 1993; Teske E, 7993-1994 dos
artculos].

Siguiendo con la IHQ, el inmunofenotipo tampoco es comparable al de los linfomas humanos ya que el
nmero total efectivo de Ac Mo y Po parafinadosha sido mucho menor. Por ello distintos subtipos 1 oB han
exhibido caracteres citolgicos compartidos, lo que ha llevado al solaparniento de algunos casos, con
dificultad de interpretacin por la IHQ aislada (CB-IB-LB).

La inmunohistoquimica facilita la agrupacin de subtipos por estirpe y agresividad [Linden MD el al,

1992], siendo fcil entender que los linfomas son nodales o extranodales, B, 1 o milos, de alto, intermedio

o bajo grado segn los valores de los marcadores proliferativos. No seha consideradola nf Q en congelacin,
comenzada en patologa humana en 1981 (entonces las bateras de AcMo eran ms especficas y numerosas,
pero la visualizacin e interpretacin de los resultados era dificil y con posibilidad de errores en muchos
casos), aunque haya evolucionado mucho en la actualidad y existan mayor nmero de Ac anti Ag animales
[Sein H, Mason DT 1985; Teste E, 1993 y 1994; Fisher Di el aL 1995; Rabanal?Af el aL 1995].

109

Discusin
Este trabajo se ha realizado slo con material parafinado para unificar los hallazgos. Con los AeMo de
parafina, cada vez ms abundantes y especficos, los resultados han sido fiables y fcilmente vulorables. Se
han utilizado .AcMo y Po humanos que producen reaccin cruzada con antgenos animales y an as ofertan
buenas haigenes. El marcador T-CD3 se ha utilizado policlonal por su buena positividad en los linfocitos T
animales. La estirpe B no cuenta con buenos marcadores monoclonales, pero el CD79a (clon HMS7) y las
cadenas ligeras policlonales Kappa y Lambda han sido satisfactorios (a pesar de lo publicado en patologa
veterinaria sobretodoconlas cadenas ligeraspoliclanales [BreuerWetaL 993; TesKeE, 993; FisherDJ
et al, 1995; Caniath Al et al, 1996]. El AcPo 1-chain, no ha proporcionado positividad ms que en
plasmticas, al contrario que en tejido humano, donde es capaz de teflir clulas B productoras de Ac, sobre
todo las IB. De los AcMo histiocitarios, se ha desechado el CD6S, de macrfagos, por la negatividad
constante a pesar de los mtodos recuperadores antignicos por calor utilizados /Norlon AJ el a!, 1994;
BuderD eta!, 997]. El MAC 387 y la protena 5-100 han detectado clulas de la estirpe HM en distintos
momentos funcionales. Para resumir: el conocimiento del inmunofenotipo con CD79ay CD3 como batera
rpida, es suficiente y fiable, algo ya plasmado en estudios anteriores [AfllnerRiel al, 1996].
Otro de los objetivos ha sido probar y cuantificar la accin de los marcadores proliferativos sobre
linfonias caninos. Este estudio biodinmica no ha presentado excesivos problemas, ya que dichos marcadores

MIB1 y PC 10, se han conservado intactos en la mayora de los casos, incluso en los expuestos a una
sobrefijacin, sobre todo el MIB 1. Por la cintica y clnica, todos los casos han sido dc alto grado.
Parececonveniente recordar aqu que tanto en perro como en gato hay ocasiones en las que un linfoma,
por su alta actividadproliferativa se presenta de inicio can extensin perifrica. Este hecho seftalado tambin
a nivel humano /Suchi Teto!, 1979] sirve parahacer nfasis en la dificultad de distinguir entre leucemia con
afectacin ganglionar mltiple o linfoma con extensin a MO y sangre; son los casos denominados leucemialinfoma, ya que no es posible la distincin entre una y otro, y que entraan un pronstico desfavorable [Suc/ii
Ter al, 979; RosernbergMiP gr al, 1991; Dobson iMer al, 993; Morris JS eral 1993,].

Otro hecho para comentar es la idea de estudiar como controles un grupo de linfomas de gato, de
etiologa conocida y aceptada, comparados a su vez con ganglios felinos reactivos inespecficos o en animales
portadores del FeLV. No nos parece pasible hacer comparacin entre ambas especies. De un lado los ganglios

reactivos inespecficos pueden ser semejantes, pero los portadores de FeLV muestran mayor plasmocitosis
ylinfocitosisintrasinusaldificil de valorar [FederBMer al, 1990; Hurson CA eral, 1991; Parodi AL eta!,
7994; oh A el a), 1994; Callanan Ji eta), 1996]. Los linfomas felinos difieren en subtipo histolgico,
inmunofenotipo, ME, proliferacin y ciclo celular. La morfologa recuerda a los LNH en inmunosuprimidos
Rivas C, 1989; Alba!aee Meta 1998] y los ganglios pueden afectarse de forma total o parcial, planteando

en el segundo caso problemas de diagnstico diferencial con reacciones benignas.

110

Discusin
B.- CONSIDERACIONES DEL GRUPO DE ESTUDIO
La edad de pitsentacinno ha resultado tenervalor pronstico, siendo las que ms se repiten doce y diez
dos, aunque el rango general se mueve ente los dos y los doce dos.
El sexo del animal ha seguido la proporcin 2:1 de machos frente a hembras, aunque las curvas de

supervivencia de los dos grupos no mostraron diferencias significativas, por lo que la variable sexo no es
factor pronstico en esta serie, dato que ya sehabia comentado con anterioridaden la bibliografla /jTeske E,
eraL 1994].
La raza tampoco ha mostrado diferencias significativas ni en cuanto a la presentacin ni a la
supervivencia ha habido marcadas diferencias en las frecuencias, quizs ms atribuible a modas sociales que

a factores genticos en s f1eske E el al, 1993-1994].

Los valores de laanaltica sangunea y bioqumica no han sido de utilidad para el diagnstico [Dobson

iMetaL 1993]
El estadio clnico ha sido expresado bajo el perfil mdico y veterinario, ya que segn los resultados
evolutivos en medicina humana ante la afectacin del bazo y el hgado, el pronstico es diferente [Carbone

PP. 1971]. En esta serie, con slo bazo afecto e hgado libre de enfennedad, la evolucin ha sido ms
favorable, por lo que deberan definirse por separado los casos con y sin afectacin heptica (diferencias
estadisticamente significativas con p=O.0002). Cabe destacar la alta frecuencia de estadio V (IV en medicina
humana) nl diagnstico, datos semejantes a los publicados [DobsonJA4 el al, 1993; Teske E el aL 1994].

Seria por tanto, necesario el desanollo de distintos mtodos de diagnstico precoz como citologa y aspiracin
/liawlns EC eta?, 1993] como medida inicial, dado que por larpida progresin del linfoma y estadios tan
avanzados el tratamiento paliativo con quimioterapia tiene poca utilidad.

El estudio necrpsico corrobora la extensin generalizada; segn el baremo veterinario, veinte casos
mostsamn E-y, cuatro E-TV y ningn caso E-mo inferiores (cl 80% eron linfomas multicntricos, de los
cuales el 13.3% tuvo afectacin leucmica como forma clnica principal; 13.3% present linfomas con la

forma mediastinica de naturaleza T, y slo el 6.6% fueron linfomas extranodales). Slo en cuatro casos han
existido tumores de otra estirpe, por lo que se considera independiente a la presentacin del linfoma. Segn
el estadiaje de medicina humana, que separa la afectacin esplnica y heptica, se encontraron cinco casos

con afectacin ganglionar y esplnica (E-II!), y el resto tuvo, adems, afectacin hepticao de otros rganos
(E-IV). En esta serie de tumores el estadio clnico al diagnstico tiene valor pronstico (con significacin
estadstica; r 0.0009), por la superior supervivencia del estadio III frente al IV, lo que ha coincidido con una
diseminacin generalizada con peor evolucin.

111

Discusin
El tipo de respuesta aJ fratandeuto COP no ha sido un dato valorado en si, sino como una variable para

poder clasificarlos linfomas en Ihncin de su comportamiento clnico con respecto a un protocolo comn. La
respuesta ha sido uniforme: en la mayora de los casos se produce una remisin total en el periodo de
induccin para luego recaer en el mantenimiento, comportamiento habitual en los liafomas agresivos Vicente
J, 1980; Teslce E el al, 1993; Arrnage Jo, 1993; Teske E el aL 1994]. An as la diferencia entre la
supervivencia dc los animales tratados frente a los no tratados fue claramente significativa (r0.0009), por
lo que parece conveniente considerarla variable tratamiento como factor pronstico, pese a sus limitados
resultados. En la prctica de esta serie, el tratamiento no ha variado la supervivencia global en ms de 203
das; esto contrasta con los datos publicados en veterinaria sobre supervivencias medias de un linfoma tratado
con quimioterapia, de 8 meses aproximadamente fTeske E el aL 990; Teske E el aL 1993; Rosenhal RC
el al, 1995; Hardy WD el aL 1989]. Esto podra deberse al estadio tan avanzado de la enfermedad al

diagnstico, o tambin a la falta en su composicin de la adriamicina como principal droga frente a los
procesos linfoproliferativos, descrito en medicina humana [Diaz Rubio E el aL 1991; Gonzlez Barn M,
1992; EspaRa , 1993; Wllson WH el al, 1998]. Como conclusin, en esta serie no se puede saber si la
respuesta al tratamiento es ono dependiente del grado histolgico de malignidad fleske E el aL 1994]. Dada
la ausencia de subtipos de bajo grado que ofrecieran otro patrn de respuesta y en nmero suficiente, no se
pueden comparar resultados.
Desdeun punto dc vista morfolgico, todos los casos estudiados han sido linfomas no Hodgkin de alto
grado -LNH- /MaedaHna 1993], con una proporcin alta de inmunoblsticos LB (33.3%) y linfoblsticos

LB (43.3%), mostrando los centroblsticos menor porcentaje (16.6%); slo ha habido dos casos de linfomas
extranodales (6.6%). Estos resultados en morfologa no concuerdan con la mayora de los datos publicados
anterionnente en patologa veterinaria canina, donde se describen todos los subtipos histolgicos de la
clasificacin de Le (alto, intermedio y bajo grado), aunque predomina el alto grado [Parodiel al, 1988;
Monton iE el aL 1990; Teske E, 1993; Teske E el aL 1993; ValIz VEO el aL 1993], aunque s coincide con

otros [Dobson.JMe aL 1993]. El subtipo histolgico no ha sido un factor pronstico en s, sino el grado de
malignidad segn la clasificacin de Le, dato que coincide con lo anteriormente publicado al ser todos
linfomas de alto grado 7eske E, 1993]. La morfologa de los casos felinos control no ha coincidido con la
presentada en el peno, ya que elgato FeLV+ parece compartir una morfologa compatible con centroblstico

polimorfo en la mayora de casos, ya definida por otros autores [1eskeE eta!, 1993; Fournel-Plury C e
al, 1997].

En nuestra serie los casos con positividad al virus de la leucemia felina FeLV+ han presentado una

morfologa de predominio inmuno-plasmablstico, que recuerda a las neoplasias B humanas en estados de

inmunodeficiencia adquirida SIDA y trasplantes [Rivas C, 1989; Spodnick Ci el aL 1992; Cu LX el aL
1995;AlbalateMel al, 1998].

112

Discusin
Con respectoa la estirpetuinorai, el 80% de los linfomas caninos ha sido de naturaleza B, y cl 20% de
naturaleza T, frecuencias diferentes a las citadas en bibliografla (res/ce E e aL 1993]. En los gatos control
3/8 fueron B (37.5%) y 5/8 T (62.5%). No se ha podido encontrar valor pronstico de la variable
inmunofenotipo en esta serie por el escaso nmero de casos T para confrontar resultados.
El patrn de crecimientoha sido difuso en todos los casos, a excepcinde uno con patrn parcialmente
nodular (posible CB post CB-CC). El patrn de cielo estrellado (respuesta fagocitaria de los histiocitos a una
tasa elevada de muerte celular o apoptosis) se ha encontrado en todos los subtipos celulares, aunque ms
frecuente en el subtipo linfoblstico, como se describe en patologa humana /li,ennerl K, 1978; Rivas C el aL
1980]. El cielo estrellado no guarda relacin directa ni con la histologa ni con el nmero de mitosis por
campo, dato anteriormente publicado (res/ce E et aL 1993].

La ME se correlacion con la ptica, mostrando en general rasgos comunes con cambios celulares
polimorfos con inmunoblastos y plasmticas, o caracter blstico mediano poco diferenciado. Como hallazgos
especiales nucleares y celulares los signos de apoptosis, la segregacin nucleolary los cuerpos nucleares

no son especficos; podran indicar activacin nuccolar mxima, signos txicos y morfologa de muerte
programada, que en estos tumores no ha sido exagerada.
C.- CONSIDERACIONES

BIODINMICAS

Existe una correlacin precisa entre la ptica de alto grado encontrada y la proliferacin [FaurnelFleury C e al, 997]. Ambas ciclinas muestran una clara positividad, que ha sido evaluada cualitativa y
cuantitativamente. El Ac MIB 1 combinado con recuperacin antignica por calor [NorlonA.! Jordan AS el

aL 1994; Buller D el al, 1997] mejora notablemente la positividad, de forma independiente al tiempo de
fijacin, as que debe anteponerse al PC 10. La distribucin del marcaje es ms fiable en el MIB ya que
perfila la disposicin cromatnica y nucleolar del ncleo, mientras que el patrn de tincin con PC 10 ha sido
ms homogneo e indefinido.

Los valores proliferativos lmite para los rangos de agresividad han seguido el patrn aplicado en
patologa humana [Rivas C el aL 1992]: menos de 15%, entre 15 y 25 y ms de 25% para grados bajo,
intermedio y alto respectivamente; aunque tambin se ha tenido en cuenta lo anteriormente publicado en
patologia vetennaria [Fournel-FleuryC el aL 1997] en la que se utiliza como valor limite entre bajo y alto
grado un 21%. Segn esto todos los linfomas de esta serie corresponden al alto grado de malignidad.
Los valores proliferativos obtenidos con ambos marcadores han sido cualitativamente iguales, aunque
los valores cuantitativos absolutos cambien y fueron similares a nuestra experiencia previa en linfomas
humanos /Marcos el aL 1993]. Se puede establecer una relacin entre valores obtenidos con un mismo
marcador, pero no con los valores obtenidos a partir del otro. De la misma forma, los valores PC 10 y ME 1
113

Discusin
fueron similares para cada caso de linfonia canino, felino y ganglio reactivo
El valor proliferativo global en infamas caninos y grupos control ha sido mfenor al encontrado en los
mismos subtipos en patologa humana [irisel al, 1988;Marcos el al, 1993; Obeso eta!, 1994]. Hay que
afladir adems que la prolii~racin global de los subtipos linfoblsticos no fue superior a los del grupo CB-IB
(en patologa humana la pwliI~racin en el linfoblstico tipo Burkitt est prxima a

90O/o~ 100%;

[iris eta),

1988]). Estas variaciones pueden deberse a la mayor especificidad para Ag humanos, o bien a problemas
tcnicos relacionados con la sobrefijacin del material con tinciones dbiles o muy fuertes, cuya valoracin
con el analizador de imagen se ha limitado por las caractersticas que para la misma exige el aparato, y que
posteriormente se comentan [CrockerJ, 1993].
Existe una buena correlacin entre ambos marcadorcs proliferativos PC 10 Y ME 1 [SabatfinE el aL
1993], aunque nos parece, como ya se ha comentado parcialmente, que es preferible el ME 1 por su mejor

respuesta IHQ: mejor patrn de tincin, independencia al tiempo de fijacin en formol y se comporta mejor
con la olla a presin como mtodo recuperador antignico [SabaninE el aL 1993; Mazerolles C el aL 1994;
Ostrowski M el aL 1995]. No existieron diferencias significativas de forma global entre los valores
proliferativos con ambos marcadores, segn los distintos baremos considerados (subtipo histolgico,

inmunofenotipo, tiempo de fijacin, etc...), pero el marcador ms estable a cualquier cambio en el manejo
ordinario de lametdica ha sido elMIBI, por lo que opinamos debe ser elmarcador proliferativo dc eleccin
[Gerdesi, Dallenbach Fetal, 1984; Gerdesi, LemkeHet al, 1984; Gerdes Jet al, 1991; Gerdesietal
1993; Ross Viet aL 1995].

Sin embargo un dato importante encontrado ha sido poder relacionar el valor proliferativo con el
marcador PC10 como factor pronstico desde un punto de vista estadistico frentea la supervivencia global.
Se define asi con el valor del PC 10 superior o igual a 34%, un grupo de alto riesgo dentro de la poblacin
total. Creemos que este hallazgo podra constituir el punto base para la aplicacin de protocolos de
quimioterapia ms agresivos, como viene hacindose en medicina humana.

Para un completo entendimiento del mtodo de valoracin cuantitativa parece necesario comentar el tipo
de funcionamiento que tiene el programa proliferation index del analizador de imagen CAS-200. Est
preparado para captar el contraste entre dos colores con longitudes de onda opuestas, como son elmarrn y
el verde. El marrn indica la positividad a Ac por revelado con diamino-benzidina; el verde debe ser el color

de eleccin de contraste en el campo de la preparacin de IHQ. El problema puede surgir al utilizar la

hematoxilina como mtodo de contraste rutinario, ya que la tcnica de tincin verde de metilo suele ser larga
y pesada; esta hematoxilina debe ser muy dbil para evitar la formacin de falsos positivos, ya que un azul
muy intenso podria confundir al sensor, y alestar el azul ms prximo en la escala de colores, podra captarse
como un positivo final.

114

Discusin
En esta smie sehan realizadocontrastes dbiles a mano (el inmunoteflidor suele contrastar intensamente
por gusto del patlogo) para evitar estos problemas de manejo e igualar los resultados al vade de metilo
requerido, ajustando adecuadamente los umbrales nucleares negativos y positivos. Las mediciones deben
realizarse siempre por la misma persona para evitar cambios subjetivos en dichos umbrales que modifiquen
considerablemente los resultados finales de la serie. Tambin el tipo de funcionamiento de este programa
puede explicar la variacin de valores entreambos marcadores proliferativos, constatada ya en la bibliografla
[VtiedGLetaL 989; HalPel al, 1990; ViaseemNilel al, 1990].
El tipo de tincin del PClO es continuo y homogneo, por lo que es captado por el sensor del analizador
como un rea completa circular [Sebo Ti et al, 993]. El Mifil marca el ncleo de forma discontinua,
dibujando la cromatina marginada a la membrana nuclear, por lo que el sensor no capta un crculo positivo

sino, en ocasiones, una circunferencia. Esto hace que el rea total positiva del Mffl 1 sea menor en valor
absoluto que ladel PC10, y tambin explique la diferenciadel valor captado a simple vista por el ojo humano,

a la expresada porel ordenador.

La parafma y los tejidos postmortem no han supuesto ningn problema para los resultados de ambas

tcnicas citomtricas [Frierson HE 1988; Kallionern OF, 988; Frierson HP 1991]. Requiere prestar
especial atencin altiempo de fijado en formol [Esteban4 el al, 1991], revisar las piezas con microscopia
ptica para elegir un bloque adecuado, tiempo de recogida de muestras inferior a 5 horas despus de la muerte
del animal [Atanen 4 el al, 993] y un desparafinado intensivo.

La frecuencia de aparicin de aneuploida fue de un 44% con CMF y de un 56% con CME, un tanto

superiores a lo estudios previos en linfomas caninos y humanos (res/ceE el al, 993] pero podra deberse
a la constitucin del grupo por linfomas de alto grado en su totalidad.

La aneuploidia no se ha relacionado con los altos valores proliferativos t ladiploida con los bajos como

ya lo han expuesto otros autores (JBauer TW et aL 1990; Minke .JMHM el aL 1990; Tes/ce E et al, 993;
Garca R el al, 1994]). Tampoco guarda relacin con el alto grado citolgico presente en esta serie, dato
estudiado con anterioridad [Rutteman GR el al. 1988; Bauer TWet al, 1990; A-fin/ce JMHMeI aL 990;
Ruiteman GR el al, 1991; Teske E el aL 1993; Garca R el aL 1994]. Si existe correlacin estadstica entre
el ndice de proliferacin del marcador PC lOy el ndice numrico del contenido de AUN por citometria de
flujo.

La fraccin en fase S presente en CMF no se relaciona con ningn otro parmetro como cabria esperar
(proliferacin [WoodsAL et al, 1991; TesIce Letal, 1993; JfojdkElvfe aL 1993; Ostrows/a Mel al, 1995],
ploida [FriersonHE 1991; Scanziani LetaL 1991; OstrowskiMe al, 1995]); no guarda relacin ni con

laproliferacinconMlB yPClO,ni con la ploidia con ambos mtodos citomtricos fTeskeEe al, 1993].
De los 8 valores de faseS alta, 7 fueron aneuploides y 1 diploide con fase 5 alta, pero no se puede establecer
115

Discusin
una correlacin estadstica portratarse de un nmero pequefio de casos. Sin embargo la aneuploida parece
sc un marcadorbastante fiable de alteraciones citogenticas [SeckingerDel al, 1989; MinAre JMHMeI aL
1990; Gardo R el aL 1994; Obeso G el aL 994/.
La tasa proliferativa parece aproximarse ms a la agresividad tumoral que la fase 5, ya que si parece
presentar un valor intermedio-alto que guarda relacin con el alto grado citolgico presente en esta serie
[WoodsAL el al, 1993]. Slo parte de estos casos presentan un alto valor de fase 5 [GarcaR el al, 1994;
Obeso G el al, 1994]. Un dato indiscutible es que los marcadores MB 1 y PC 10 marcan ms clulas en el

tejido que el % expresadopor la fase 5 de FCM [Garca R el al, 1994; Obeso G el aL 1994].
Existe muy buena correlacin entre ambos mtodos citomtricos [BowmanR el aL 1993; ClaudRD el
al, 1993; Marcos B el al, 9980; Wojcik EM el aL 1993] por lo que pueden considerarse homlogos

(coincidencia de valores en 22/25 casos).

La citometria esttica CMB es un mtodo eficaz para el estudio del ADN [BoudryC et aL 1989; Wojcik
EMe aL 1993]. Comparada con la citometra de flujo, como se detalla en la tabla IX [CaudRD el aL 1989;
Marcos Bel aL 1997], es un mtodo muy sencillo de manejar que requiere muy poco material (500 clulas

frente las 10000 necesarias en CMF con el consiguiente ahorro del mismo. El uso de material parafinado no
interfiere en los resultados de ambas tcnicas, aunque hay que considerarque los coeficientes de variacin
establecidos para CMF en fresco aumentan, y en CMB son dificilmente valorables por tratarse de grficas

continuas de menor resolucin (en las que no son claramente diferenciables los ditintos periodos del ciclo
celular) aunque los resultados finales sean ugualmente fiables a los de CMF. Antes de medir las clulas, como
la imagen captada del microscopio queda digitalizada, permite elegir las celulas conservadas, clasificarlas
en funcin de su forma o tamailo, eliminar nucleos rotos, debris, dobletes, tripletes, clulas inflamatorias,
etc..., algo no posible con CMF, porque toda la solucin se analiza al mismo tiempo. Es importante sobre todo
en tumores heterogneos, con apoptosis o necrosis en los que es necesario escoger las clulas a analizar
[Doudry C et al, 1997]. Se pueden identificar poblaciones aneuploides pequeas inmersas en una gran

poblacion diploide, que pueden pasar desapercibidas en FCM [ClaudRD el aL 1989],

En la serie considerada, y tal vez por el nmero de los casos, no se ha podido establecer diferencias
estadisticamente significativas entre las distintas morfologas celulares con el resto de los parmetros

considerados, sobre todos los dinmicos. Al tratarse de linfomas de alto grado en su totalidad, han presentado
valores medios similares en proliferacin, ploida, estadio clnico, comportamiento (con o sin tratamiento)
y supervivencia, considerados individualmente, por subtipos o en total.

En cuanto a que todos los casos sean de alto grado, y a pesar que algunas publicaciones tambin apuntan
a la mayora de linfomas agresivos animales, no se puede infravalorar el hecho de que probablemente en series
mayores tal vez se podra haber encontrado algn caso de linfoma de bajo grado [Carter RE el aL 1986;
116

Discusin
Pamdi Al, 1988; GreenleePG el al, 1990; TesAre E, 1993; Fisher Diel aL 995; Fourne-fleu,y C el al,
1997]. Por otra partey conociendo que cualquier linfoma poco agresivo dejado a su evolucin natural puede
cambiar aun alto grado, [LennertK el al, 1978], tal vez la sintomatologa que lleva a consulta a los perros
portadores de linfomas ocurre en estados muy avanzados, cuando ya han pasado a ser agresivos, quizs por
ima mayor tolerancia del animal a neoplasias de bajo grado o intermedio.
La necesidad de un diagnstico precozCarterREel al, 1986; Carter REel al, 1988; Jacobs RAj 1988;
Hawkins EG el al, 1993; Fisher fiel aL 1995; Canatn.U, el aL 1996] con promocin de los mtodos

citolgicos y bipsicos se perfila como imprescindible en esta patologa porque con estadios tan avanzados
el tratamiento paliativo con quimioterapia tiene poca utilidad. Por otra parte habra que concienciar al dueo
de la realidad de un animal geritrico, donde la aparicin de cualquier masa ganglionar debe ser consultada.

117

VII.- CONCLUSIONES

Conclusiones
1. Todos los linfomas caninos estudiados son LHN de alto grado.
2. El estadio tumoral necrpsico corrobora la extensin avanzada por la afectacin de: 20 casos en estadio
y, 6 en estadioNy ningn caso en estadio DI (26casos necropsiados: 23 muiticntricos, 5 timicos, 1 cutneo
y intestinal). Con el estadiaje humano, 21 presentaron un estadio Ny 5 un Di.
3. La macroscopia de los rganos hematopoyticos (ganglio, bazo, mdula e hgado) demuestra
organomegalia difusa, sin tumor ni nico ni mltiple. La presentacin extranoda] cutnea e intestinal exhibi
tumores nodulares macroscpicos.
4. La citologano es totalmente superponible a los subtipos humanos, por lo que las clasificaciones aplicables
a los animales deberan ser simplificadas.
5. Desde el pinito de vista citolgico se han encontrado subtipos linfoblsticos (43.33%), inmunoblsticos
(33,33%) y menor cuanta de cenfroblsticos (16.66%) y extranodales (6.66%). Para la subtipificacin ha sido
imprescindible la ME, aunque aisladaniente no existen caracteres ultraestructurales especficos de malignidad
linfoide.

4. Los hnfomas caninos son en su mayor parte de naturaleza E (80%) existiendo slo un 20% de neoplasias
T. Veintiocho casos fueron nodales (93.33%) y 2 extranodales (6.6%). El panel de anticuerpos humanos
utilizados, de fcil adquisicin y apto para material parafinado, ha mostrado resultados satisfactorios.
7. En relacin con la agresividad neoplsica comprobada por la morfologa y el estudio con marcadores
proliferativos, con el marcador MIEL slo el linfoma cutneo fue de grado intermedio y cl 96.66% restante
de alto grado. Con el PC 10 un caso de linfoma IB tuvo agresividad intermedia y el resto de linfomas fije de
alto grado. Este hecho difiere de otros estudios previos, que consideran subtipos de alto, bajo y grado
intermedio.

8. El estudio del ciclo celular con citometra demostr aneuploidia en 53.3% de los casos con CMB y en
43.3% con CMF. La ploida no se correlaciona con los subtipos histolgicos, es comn y uniforme en todos
los casos y seconfinna como un factor de agresividad. Ambas tcnicas citomtricas son homlogas, con una
correlacin de 0.8 y un nivel de significancia de 0.01. La fase 5 no guarda relacin con ninguno de los
parametros estudiados, por lo que seconsidera una variable independiente. Slo se relaciona con la definicin
de ancuploidia.

9. En estadios IV la afectacin heptica demostr ser estadsticamente significativa como signo de mal
pronstico (p=O.OOO9). Por ello, se debera pensar considerar bazo e hgado por separado en el estadiaje.

118

Conclusiones
10. El thctor tratamiento con quimioterapia mejor estadsticamente la supervivencia global de los animales
(p=0.0002).
11. Los altos valores delaprolifuacin con el marcador PC1O resultaron ser un signo denia] pronstico con
significacin estadstica (p0.017), incluso dentro del grupo de animales tratados con quimioterapia
(px=O.OlG). El valor proliferativo del marcador MIBI no es pronstico desde el punto de vista estadstica.

12. Existe correlacin estadstica entre los valores de proliferacin obtenidos con ambos marcadores
(correlacin de 0.6, nivel de signiticancia 0.01). El MIEl muestra mejor patrn de tincin IHQ, mayor
independencia a la fijacin y mejor respuesta al tratamiento por calor como recuperador antignica. No hay
correlacin estadstica entre la proliferacin y el grupo histolgico. El indice proliferativo con PCIO tiene
correlacin estadstica con el indice numrico de ADN (CMF) (pO.$4; nivel de significancia 0.01).
13.

No se encontr valor pronstico a las variables edad, raza, sexo o inmunofenotipo, seguramente debido

al pequeo tamao de esta serie.

14. Los controles felinos no deben utilizarse como comparativos ya que difieren en subtipo histolgico,
inmunofenotipo, ME y ciclo celular. La morfologa recuerda a los LNH secundarios a inmunodeficiencia.
15. El mal pronstico de la enfermedad en pequeos animales, con o sin terapia, en los casos tan avanzados
sirve para enfatizar la necesidad de un diagnstico precoz.

119

VIII.- BIBLIOGRAFA

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