Hidrolisis de Las Grasas Por Acción de La Lipasa Pancreática

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN
Universidad del Per,
MARCOS
DECANA DE MERICA
FACULTAD DE
QUMICA,
INGENIERA
QUMICA E
INGENIERA
AGROINDUST
RIAL
E.A.P DE
QUMICA
MANUAL UNIVERSITARIO
PRCTICAS DE BIOQUMICA
Dra.
PERIODO
ELECTIVO
ADICIONAL
2015-O
MARIA
ROSARIO
CALIXTO COSTOS
LIMA PER
2015
Elaborado por
Rosario Calixto
Cotos
Practica 02
Procedimiento
Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla
Tubos
mL de casena 5%
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
1
8
1
9
1
mL
de
agua
destilada
mL
de
cido
actico 1.0 N
8.4
7.8
8.8
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
1
.
6
mL
de
cido
actico 0.1 N
mL
de
cido
actico 0.01 N
pH terico
pH experimental
Observa
la
precipitacin de la
casena a los 15
minutos (X)
Reactivos
Tubo de Ensayo 1
0
.
2
0
.
6
1
.
2
0
.
5
1
.
0
2
.
0
4
.
0
8
.
0
Tubo de Ensayo 2
Tubo de Ensayo 3
Tubo de Ensayo 4
Tubo de Ensayo 5
Tubo de Ensayo 6
Tubo de Ensayo 7
Tubo de Ensayo 8
Tubo de Ensayo 9
Se
agito
suavemente los tubos con la precaucin de no formar espuma, luego se procedi a tapar los tubos.
Se prosigui a determinar los pH tericos de cada uno de los tubos con los datos dados.
Luego se determin el pH experimental usando un pH metro.
Los tubos se dejaron en reposo durante 15 minutos y observar el grado de turbidez o precipitacin.
Determinamos el punto isoelctrico de la casena.
PRACTICA 09
HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIN DE LA LIPASA PANCRETICA
I.
OBJETIVO
Determinar la actividad de la lipasa pancretica mediante la formacin de cidos
grasos libres por titulacin.
II.
INTRODUCCIN
En el organismo de los animales casi todos los lpidos se encuentran en
complejo con las protenas, los carbohidratos y otras sustancias, en realidad los
lpidos rara vez se encuentran en estado libre. Los mamferos los acumulan en forma
de grasa, los peces en forma de ceras y en las plantas se almacenan en forma de
aceites que adicionalmente tienen funciones de proteccin y proveen aromas y
sabores caractersticos.
Los acilgliceroles (constituido por una molcula de glicerol y cidos grasos)
pueden existir como monoacilglicridos, diacilglicroles y triacilglicridos (TAG) En
los alimentos los ms comunes son los TAG, los otros son usados como aditivo por
sus propiedades emulgentes.
La presencia de cidos grasos en la estructura de los lpidos determina sus
propiedades. Aunque se considera que no todos los lpidos tienen cidos grasos, s
tienen por lo menos alguno de sus derivados.
Los trminos grasas y lpidos no pueden ser usados indistintamente, ya que
al hablar de grasas se refieren a un tipo especial de lpidos: Los triacilgliceroles,
que generalmente son slidos a temperatura ambiente y constituyen la principal
reserva energtica en algunos organismos.
Los cidos grasos naturales poseen un nmero par de tomos de carbono,
producto del mecanismo de biosntesis, iniciada a partir AcetilCoA. Su nmero de
tomos de C varia de 4 (cido butrico de lpido de la leche) a 38 (ceras)
Los acilgliceroles se hidrolizan para formar glicerol libre y los cidos
grasos que los constituyen; en las clulas, las enzimas llamadas Lipasas
realizan la hidrlisis; sta hidrlisis catalizada por lipasas se caracteriza por
cierto grado de especificidad, de modo que las distintas lipasas actan de modo
preferencial sobre diferentes enlaces ster.
La enzima principal de la hidrlisis de los TAG es la lipasa pancretica, que

prefiere cidos grasos de cadena larga de ms de 10 tomos de carbono; hidroliza a
los TAG en diacilgliceroles, liberando el cido graso de la posicin 1
3 del
glicerol. Los diacilgliceroles son hidrolizados rpidamente hasta glicerol y cidos
grasos
libres.
Los
productos
son
cidos
grasos
libres
(AGL)
o
2-monoacilglicero (2-MAG). Este ltimo puede ser hidrolizado por medio de la
transferencia del grupo acilo en posicin 2 hacia la posicin 1 o 3 por medio de las
ismeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL
La lipasa pancretica es un polipptido de 449 aminocidos y PM de 50,000

daltons que hidroliza los enlaces ster en posicin 1 y 3 de los triacilglicridos.
La accin conjunta de las enzimas pancreticas y de las sales biliares lleva a
la formacin de micelas, que progresivamente se enriquecen en productos
hidrolticos ms polares que sus precursores. La velocidad de absorcin de los
cidos grasos depende de la longitud de su cadena (nmero de tomos de carbono)
y de su grado de saturacin. As, los insaturados de cadena larga son absorbidos
ms eficazmente que los saturados.
Fundamento
La actividad de la enzima se evala midiendo los cidos grasos libres que se
liberaron en el curso de la hidrlisis de la grasa por accin de la lipasa pancretica.
La concentracin de los cidos grasos libres se determina mediante la titulacin con
NaOH 0,05N.
La accin de lipasa se ve potenciada por las sales biliares que al emulsificar las
grasa las transforma en pequeas micelas
III. MATERIALES
REACTIVOS
Aceite, buffer fosfato 0.1 M pH 8, sales biliares, lecitina y glicerol, pancreatina 1%

Bureta, probeta, tubos de ensayo, gradilla, vasos de 50 mL, pipetas, bombillas,
papel parafina, Balanza analtica, bao mara.
IV. PROCEDIMIENTO
HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCION DE LA LIPASA
Tubos
1 Sales
2 blanco
3 Sin sales
4 blanco
Aceite ml
Buffer fosfato 0.1

M pH 8, ml
Sales biliares en
buffer, ml
Lecitina/ aceite ml
Agua destilada, ml
El color rosa del aceite no debe desaparecer en caso contrario, agregar NaOH
0,05N hasta que aparezca el color (Slo a los tubos 1, 2 y 3).
Agregar 5 ml de pancreatina 1% a cada tubo (los 5). La Pancreatina es un extracto
de enzimas que contiene a la Lipasa pancretica. Incubar por 45 minutos a 370C.
Agitar por 15 ser cada 10 minutos.
Titular cada tubo con NaOH 0,05N hasta coloracin ligeramente rosa, anotar el gasto
en ml, agitar constantemente durante la titulacin.
Reactivos
5 mL de Buffer fosfato 0,1Sales

M PH biliares
8
5 mL de Aceite
en BufferLecitina / Aceite
Tubo de ensayo 1 Sales
Sales biliares en buffer

Aceite
Agua destilada
Reactivos
5 mL de Buffer fosfato 0,1Sales

M PH biliares
8
5 mL de Aceite
en BufferLecitina / Aceite
Tubo de ensayo 2 Blanco
5 buffer
mL
de Aceite
+ Sales
biliares en buffer + Agua destilada
3 mLbiliares
de Aceite
+ Sales
biliares
en buffer
1 mL Aceite
Sales
en
Agua destilada
2 mL de Sales biliares
5 mL de
enSales
buffer
biliares en buffer + agua destilada
Tubo de ensayo 3 Sin sales

Aceite
Buffer fosfato 0,1M PH 8
Agua destilada
1 mL Aceite
3 mL de Aceite
5 mL
+ Buffer
de Aceite
fosfato
+ Buffer
0,1M PH
fosfato
8
0,1M
PH 8 + Agua destilada
Tubo de ensayo 4 Blanco

Buffer fosfato 0,1M PH 8
Agua destilada
5 mL de
Buffer
fosfato 0,1M PH 8 + agua destilada
2 mL de Buffer fosfato
0,1M
PH 8
Adherencia de Pancreatina al 1%
Pancreatina al 1% (Lipasa Pancretica)
Incubacin y Agitamiento
4 Tubos de ensayo con 5 mL de mezclas
4 Tubos de ensayo con 10 mL de mezclas + 5 mL de Pa
Agitar por 15 seg cada 10 minutos
El color rosado del aceite no debe desaparecer en caso contrario, agregar NaOH 0,05 N hasta que aparezca el color
NaOH 0.05 N
Titulacin de los 5 tubos
NaOH 0,05 N
Tubos 1, 2 y 3
NaOH 0,05 N
10 mL de las mezclas Coloracin Transparent

Mezcla titulada Coloracin Rosada
V. RESULTADOS
Clculos: Los gastos en ml de NaOH 0.05 N
Gasto
Gasto
Con sales
Sin sales
biliares
Ml
ml
Tubo 1
8,3
Tubo 3
9,6
Tubo 2
6,0
Tubo 4
9,4
2,3
0,2
gasto
gasto
Determinar la concentracin de los AGL en funcin de la acidez:
1.1
Gasto
ml
Tubo 5
Tubo 4
gasto
1.
Miliequivalentes de Acidez con sales biliares = gasto x 0.05 N
A: Miliequivalentes de acidez con sales biliares = 2.3*0.05 = 0.115*10-3 #eq-gsto

1.2
Miliequivales Acidez sin sales biliares = gasto x 0.05 N
B: Miliequivalentes de acidez sin sales biliares = 0.2*0.05 = 0.01 *10-3 #eq-gsto

1. Cul de los tubos presento mayor actividad enzimtica?
En la actividad enzimtica de cualquier enzima, el sustrato hace contacto con el
centro o sitio activo de la enzima .Se forma un complejo intermedio llamado enzimasustrato.
La molcula de sustrato se transforma por reorganizacin de los tomos, por rotura, o
por combinacin de varias molculas de sustrato. El sustrato transformado, los
productos de reaccin, se liberan de la molcula de enzima .La enzima, ahora libre
puede reaccionar con otras molculas de sustrato.
Entonces como se tuvo a los tubos de ensayo por 45 minutos en incubacin con la
mano a 37C, lo que se puede ver en este caso son los posibles factores que afecten
la actividad enzimtica: temperatura, pH, concentracin e inhibidores.
Temperatura: la actividad enzimtica se incrementa al aumentar la temperatura,
hasta que la enzima se desnaturaliza.
PH: en este caso la enzima es ms activa alrededor de pH= 6.
Concentracin de sustrato: al aumentar la concentracin de sustrato, la velocidad
de reaccin se incrementa, hasta que se ocupan todos los centros activos.
El tubo que presento mayor actividad enzimtica es el tubo nmero 3, donde el gasto
de volumen de NaOH fue 9.6 ml tornando a una coloracin rosada; mientras mayor
sea el gasto de NaOH a 0.05 N mayor ser la actividad enzimtica.
2. Mencione cinco propiedades de la lipasa pancretica

La lipasa pancretica es una enzima del tipo ster hidrolasas carboxlicas que se
encarga de hidrolizar enlaces esteres propios de las lpidos mediante la adicin de
una molcula de agua dando lugar a cidos grasos libres y glicerol.
Es una enzima que cataliza reacciones con una elevada especificidad de sustrato
as como de forma regio o enantioespecfica.
Se secreta en forma activa (y no como proenzima) y funciona a un pH ptimo de 6
7 en presencia de colipasa.
Acta rpidamente en interface hidrofbica/hidroflica de la emulsin de la grasa.
Se estabiliza en la interface agua aceite por accin de la colipasa y cidos grasos
libres.
3. Que funcin cumplieron las sales biliares
La funcin que cumplen las sales biliares en la hidrolisis de las grasas (aceite) es la
de emulsificar y solubilizar las grasas, transformndolas en pequeas micelas con lo
cual disminuye la tensin superficial producindose la ruptura de los enlaces esteres.
4. Por qu se neutralizo el aceite utilizado en la prctica?
Como la hidrolisis del aceite por medio de la lipasa pancretica va liberando cidos
grasos en la solucin y al emplear hidrxido de sodio en la valoracin
cido
base para la determinacin indirecta de la cantidad de cidos libres liberado, lo que
provoca una reaccin acido base debido a la mezcla entre un lcali y los cidos
grasos libres dando la formacin de jabones.
Adems, tambin sirve para neutralizar la acidez del aceite residual debido a los
cidos grasos libres
5. Cul fue la utilidad de la fenolftalena?

La fenolftalena es un indicador cido base que indic el cambio de pH dada por la
neutralizacin del aceite residual obtenida por los cidos grasos libres.
V.
CUESTIONARIO
1. Esquematice la estructura de un triestearina y tripalmitina.

Triestearina o tambin llamada Estearina o Glicerol triestearato de manera trivial. Su
nombre IUPAC es 1,3-Di(octadecanoiloxi)propan-2-iloctadecanoato es un gliceril ster
de cido esterico, derivado de la grasa animal creada como producto derivado del
procesamiento de la carnes y es utilizado como sebo en la manufactura de velas y
jabn. Su frmula molecular es C57H110O6
Tripalmitina es un glicrido de cido palmtico, o es Tripalmitato de glicerol. Es un

aceite que se encuentra en el aceite de palma y otros aceites o grasas. A diferencia
con la Triestearina es en vez de cido palmtico (C16:0) posee, cido esterico
(C18:0)). Su frmula molecular es C51H98O6
2. Cules son los productos liberados por accin de la lipasa pancretica?

Sntesis: Pncreas exocrino
Sustrato: Triacilgliceridos con cidos grasos de cadena larga.
Accin enzimtica: Hidrolisis cidos grados C1 y C3
Productos: 2-moniacilgliceridos y dos cidos grasos libres.
Requiere: Colipasa, fosfolpidos, fosfolipasa A2, Sales biliares y los cidos grasos
libres provenientes de la de las lipasas: Lingual y gstrica.
La lipasa pancretica , la enzima principal de la hidrlisis de los TAG es la lipasa

pancretica , que prefiere cidos grasos de cadena larga de ms de 10 tomos de
carbono; hidroliza a los TAG en diacilgliceroles, liberando el cido graso de la posicin
1 o 3 del glicerol. Los diacilgliceroles son hidrolizados rpidamente hasta glicerol y
cidos grasos libres. Los productos son cidos grasos libres (AGL) o
2monoacilglicero (2- MAG). Este ltimo puede ser hidrolizado por medio de la
transferencia del grupo acilo en posicin 2 hacia la posicin 1 o 3 por medio de las
ismeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL.
3. Cules son los cidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados

presentes en los alimentos.
cidos grasos saturados
No poseen dobles enlaces en su cadena.
Son generalmente slidos a temperatura ambiente.
Se encuentran en alimentos de origen animal, y las excepciones son el aceite de coco
y de palma.
La grasa saturada aumenta el colesterol ms que cualquier otro tipo de grasa.
El exceso de grasas saturadas puede aumentar la biosntesis de colesterol y tiene
efecto trombognico.
cidos grasos monoinsaturados
Generalmente son lquidos a temperatura ambiente.
Presentan un doble enlace en su estructura.
Su principal representante es el cido oleico (C-18), presente en el aceite de oliva.

Pueden disminuir el colesterol total y LDL, cuando reemplazan parcialmente a
los cidos grasos saturados.
cidos grasos poliinsaturados

Enzima
Pepsina
Fuente
Jugo gstrico
Jugo
Amilasas pancretico
Jugo
Proteasas pancretico
Jugo
Lipasa
pancretico
Jugo
Peptidasa
entrico
Jugo
Maltasa
entrico
Jugo
Sacarasa
entrico
Jugo
Lactasa
entrico
Sales
Biliares
Bilis
Poseen uno o dos enlaces en
Glndula
Pared
estomacal
Pncreas
Pncreas
Pncreas
Pared
duodeno
Pared
duodeno
Pared
duodeno
Pared
duodeno
Hgado
su estructura.
Sustrato
Productos
Pptidos y
Aminocidos
Protenas
Almidn
Protenas y
pptidos
Triglicridos
Maltosa
Pptidos y
Aminocidos
cidos grasos y
glicerina
Pptidos
Aminocidos
Maltosa
Glucosa
Sacarosa
Glucosa y Fructuosa
Lactosa
Glucosa y Galactosa
Grasa
Emulsin
Se encuentran principalmente en alimentos de origen vegetal, a excepcin de los

pescados y mariscos.
Son componentes imprescindibles de las membranas celulares y precursores de las
prostaglandinas (molculas mediadoras en la inflamacin).
Son esenciales porque no se sintetizan en el organismo, as que debemos aportarlos
a travs de la alimentacin.
Los cidos grasos poliinsaturados se dividen en dos grupos:
Omega-6
(n-6):
representado
por
el
cido
linoleico
Presente fundamentalmente en aceites de semillas y cereales.
araquidnico.
Omega-3 (n-3): representado por el cido linolnico proveniente de semillas y

cereales; y por el cido eicosapentaenoico y docosahexaenoico presentes en las
grasas de pescados y mariscos.
4. Cules son las enzimas que digieren las grasas en el sistema digestivo de un
mamfero? Indique la funcin de cada una.
La grasa del alimento es hidrolizada en el intestino delgado a cidos grasos y
glicerina por la accin conjunta de las sales biliares (son derivados del cido clico
que emulsionan y saponifican las grasas) y de la lipasa pancretica. En la pared del
duodeno y en las clulas adiposas se produce una neoformacin de triglicridos a
partir de la glicerina, de los cidos grasos y de los monoglicridos absorbidos.
La grasa no absorbida en el intestino delgado es excretada en las heces, produciendo

heces grasientas que dificultan la limpieza de las instalaciones.
5. Cite cuatro sales biliares y como intervienen en la emulsificacin de las grasas
El cido tauroclico procede del cido clico (uno de los cidos biliares) conjugado
con el aminocido taurina en el carbono 17. Su nombre IUPAC es
2-{[(3alpha,
5beta,
7alpha,
12alpha)-3,
7,12-trihydroxy-24-oxocholan-24-yl]
amino}
ethanesulfonicacid.
El cido glicoclico procede del cido clico (uno de los cidos biliares) conjugado con
el aminocido glicina en el carbono 17.Este cido con sodio y potasio da lugar a una
de las sales biliares.
Las sales biliares que se segregan en la bilis al intestino para contribuir a la digestin
de los lpidos se sintetizan en el hgado a partir de colesterol en una ruta en la que
interviene el citocromo P450, que origina el cido clico, con la posterior
incorporacin de los aminocidos glicina o taurina.
Las principales sales biliares son glicocolato y taurocolato, que son las sales de sodio
y potasio de los cidos tauroclico y glicoclico, respectivamente, los cuales son
conjugados de los aminocidos glicina y taurina con cido clico. Otros cidos biliares
son productos intermediarios de su sntesis y tambin pueden estar en el producto
final, en menor cantidad.
Funcin de las sales biliares
Los cidos biliares glicoclico y tauroclico interaccionan con iones de sodio o de

potasio para dar los resultados finales: glicocolato y taurocolato, que se excretan por
va biliar al intestino. Estas sales tienen carcter heteropolar (o anfipolar), debido a
sus cargas (+) y (-) y a su gran ncleo hidrofbico de anillos de carbono, en el otro
extremo de la molcula. Por ello son solubles en agua y tambin pueden
interaccionar con las grasas. As actan como detergentes, o solubilizadores,
provocando y estabilizando la emulsin de las grasas para que puedan ser digeridas
por las enzimas digestivas en el medio acuoso del intestino (quimo). Tambin all
producen la emulsin de otros compuestos liposolubles como las vitaminas A, D, E y
K, y tambin contribuyen a la absorcin de colesterol.
Esquema simplificado de las rutas de sntesis de los cidos biliares sales biliares
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Zamora Espitia. Mtodos selectos de bioqumica experimental. Univ. nacional de
Colombia. 1 edicin. 2012
2. Campbell Bioqumica 6ta edicin, Editorial Cengare Learning, 2009, Mxico.
3. Feduchi, Blasco, Romero, Yaez. Bioqumica Conceptos esenciales. Editorial
Moderno. 1 edicin. 2011.

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Universidad del Per,

HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIN DE LA LIPASA PANCRETICA

La enzima principal de la hidrlisis de los TAG es la lipasa pancretica, que

La lipasa pancretica es un polipptido de 449 aminocidos y PM de 50,000

Aceite, buffer fosfato 0.1 M pH 8, sales biliares, lecitina y glicerol, pancreatina 1%

Buffer fosfato 0.1

5 mL de Buffer fosfato 0,1Sales

Tubo de ensayo 1 Sales

Sales biliares en buffer

5 mL de Buffer fosfato 0,1Sales

Tubo de ensayo 3 Sin sales

Buffer fosfato 0,1M PH 8

Tubo de ensayo 4 Blanco

Pancreatina al 1% (Lipasa Pancretica)

4 Tubos de ensayo con 5 mL de mezclas

4 Tubos de ensayo con 10 mL de mezclas + 5 mL de Pa

Agitar por 15 seg cada 10 minutos

Titulacin de los 5 tubos

10 mL de las mezclas Coloracin Transparent

Miliequivalentes de Acidez con sales biliares = gasto x 0.05 N

A: Miliequivalentes de acidez con sales biliares = 2.3*0.05 = 0.115*10-3 #eq-gsto

Miliequivales Acidez sin sales biliares = gasto x 0.05 N

B: Miliequivalentes de acidez sin sales biliares = 0.2*0.05 = 0.01 *10-3 #eq-gsto

2. Mencione cinco propiedades de la lipasa pancretica

5. Cul fue la utilidad de la fenolftalena?

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Tripalmitina es un glicrido de cido palmtico, o es Tripalmitato de glicerol. Es un

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La lipasa pancretica , la enzima principal de la hidrlisis de los TAG es la lipasa

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