Práctica 7

CENTRO DE CIENCIAS BSICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICA

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA
INGENIERA BIOQUMICA
LABORATIRIO DE BIOTECNOLOGA
PRCTICA No. 7
Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slido
Profesor:
Alumnos:
Dr. Juan Antonio Lozano lvarez

Alcaraz Nava Ulises Antonio.
Garca Mariscal Jos Luis.
Snchez Tagle Daniel Martn.
Silva Muoz Vctor Manuel.
Lpez Senz Vicente de Jess.
Borjas Esqueda Aldo Daniel
Aguascalientes, Ags. 19 de mayo de 2015
Prctica #7
Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slido
Objetivo:
Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de realizar la recuperacin y
evaluacin del producto en un proceso de obtencin de enzimas haciendo uso
de la fermentacin en sustrato slido
Introduccin:
El proceso de fermentacin se conoce desde hace mucho tiempo; sin embargo,
cada da se estudian nuevas tcnicas para mejorarlo, ya sea mediante el
mejoramiento del microorganismo o la seleccin de los medios ptimos, as
como el control de los diversos parmetros que determinan el crecimiento y
produccin del microorganismo.
Se conocen varios tipos de fermentacin, como son:
1. La fermentacin sumergida tanto en suspensin como en clulas
inmovilizadas que involucra aquellos procesos que se realizan con los
agentes biolgicos inmersos en la fase acuosa. Y la fermentacin
sumergida con clulas inmovilizadas que es semejante a la anterior,
excepto que los agentes biolgicos estn unidos a soportes insolubles en
agua.
2. La fermentacin en sustrato slido que se efecta con la utilizacin de
materiales insolubles en agua y con muy poca agua en el sistema.
(Garca, Quintero, & Lpez-Munga, 1993)
En la biotecnologa, las tcnicas de cultivo en sustratos slidos constituyen una
alternativa importante para producir alimentos, productos de alto valor
agregado y otros. La transformacin de residuos slidos por fermentacin
slida es un potencial importante, no slo para producir desechos enriquecidos
en protena y usarlos como alimento animal, sino tambin para obtener otros
aditivos de alto valor agregado, como son los probiticos o los extractos crudos
de enzimas ricos en celulasas, proteasas, pectinasas y lipasas.
La fermentacin en estado slido consiste en el desarrollo de microorganismos
sobre o dentro de sustratos slidos hmedos e insolubles, en los que el
contenido de humedad est al nivel correspondiente de la actividad de agua y
sin exceder el mximo nivel de retencin de lquido en el slido.(Dustet, Pea,
& Prez, 2002)
El diseo de biorreactores est vinculado a estas tcnicas de cultivo, aunque
an se encuentra en vas de desarrollo. Entre las tendencias mundiales en el
diseo de biorreactores para estado slido, se seala principalmente el uso de
equipos compactos, con una altura mnima de slido de 40 cm.
La mayor dificultad para aplicar la fermentacin en estado slido a gran escala
est en los gradientes importantes delas variables, debido a las caractersticas
intrnsecas del sistema heterogneo slido-lquido-gas. Otro aspecto de inters
es mantener, durante perodos prolongados de fermentacin (ms de 24h) las

condiciones adecuadas de temperatura y humedad del cultivo. En sistemas
estticos, esto slo puede lograrse con una buena distribucin del aire a travs
del medio de cultivo.(Dustet, Pea, & Prez, 2002)
Procedimiento:
MATERIALES
A.
Espectofotometro y celdillas
de 1 cm
2 gradillas
Micropipetas de 1000 y 200 l
Agitador Orbital
Parafilm, papel secante
Puntas
para
micropipetas
(1000 y 200 l)
Tubos eppendorf de 2 ml
esteriles
1 hoja de bistur con mango
1 frasco gerber con agua
esteril
1 blender con recipiente de
acero inoxidable
1 mechero Fischer
2 agitadores o microesptulas
estriles
REACTIVOS
Cepa de T. versicolor en PDA

250 ml de buffer acetatos
100 mM pH=5
500 ml de buffer fosfatos 60
mM pH=6
2,6 dimetoxifenol 2 mM
1 matraz erlenmeyer de 250
ml con 50 ml de medio liquido
GMY esteril
2 matraces erlenmeyer de
250 ml con 50 g de avena y
30 ml de buffer fosfatos 60
mM pH=6 estril cada uno
Cinta testigo, masking tape,
algodn,
gasa,
rollo
de
aluminio,
vitafilm,
papel,
tijeras, marcador, etc
CRECIMIENTO E INDUCCIN DE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS POR EL

MICROORGANISMO
a) Inocular en una caja Petri con PDA la cepa del hongo T. versicolor,
colocando un pequeo trozo de agar con micelio en el centro de la
caja con medio.
b) Incubar a 28C por un periodo de 7-10 das para dar oportunidad
que el hongo crezca.
c) Cortar un trozo de micelio crecido en PDA con el bistur
previamente esterilizado y enfriado en agua y aadirlo al
recipiente metlico que contiene medio GMY estril, homogenice
usando el blender.
d) Retorne este homogenizado l matraz Erlenmeyer de donde
originalmente se tomo el medio GMY y selle la boca del matraz
con tapon de algodn estril y fjelo al matraz con vitafilm.
e) Colocar los matraces en un agitador orbital e incubar a 28-30C
durante 4 a 7 das, para promover la formacin de los pellets del
hongo.
f) Aada aproximadamente de 30-50 ml de los pellets crecidos en

medio GYM al recipiente de acero inoxidable y homogenicelos. De
ah coloque este homogenizado en la avena humedecida con
buffer fosfatos, mezcle con una esptula o agitador estriles para
que el hongo quede esparcido en toda la avena. Selle la boca del
matraz con tapn de algodn estril y fjelo al matraz con vitafilm.
g) Coloca la avena humedecida con buffer fosfatos inoculada con el
hongo en la oscuridad a 28 C durante 20-30 das. Al sptimo da
se observar que el micelio de color blanco invadi
completamente al grano. Realice la extraccin de la enzima del
da 20 al 30 para obtener una mxima expresin de la enzima.
B. EXTRACCIN DE LA LACASA
a) Aada 100 ml de buffer acetatos pH=5 al cultivo de T. versicolor
crecido en la avena humedecida con buffer fosfatos y mezcle con
una esptula o varilla de vidrio y filtre en una gasa. Centrifugue el
sobrenadante a 15000 rpm por 5 min. Y utilice el sobrenadante
para realizar el ensayo enzimtico de la lacasa.
C. ENSAYO ENZIMTICO
a) Dispense las cantidades indicadas de cada reactivo para
completar un volumen total de 2000 l de acuerdo a la siguiente
tabla:
Buffer acetatos
1800
1700
1600
1400
900
2,6-dimetoxifenol 100
100
100
100
100
Extracto
100
200
300
500
1000
enzimtico
b) Cada columna indica un ensayo, inicie del que tenga la mayor
cantidad de extracto enzimtico y micelios con los respectivos
volmenes de 2,6-DMF y buffer. Considere que el blanco es el
extracto mas el buffer.
c) Mida el incremento de la Absorbancia a 477 nm y determine la
actividad especfica en UI/ml a los diferentes tiempos tomando en
cuenta que el coeficiente de absortividad molar del 2,6-DMF a 477
nm es de:
= 0.0148 M -1cm-1
Resultados:
D. Desarrollo de T. versicolor
E.
G.
F.
H. Ilustracin 1-2. Desarrollo de pelets de T. versicolor, para su
homogenizado e inoculacion. Pellets en forma esferica de color
crema, pastosos.
I.
K.
J.
L. Ilustracin 3. Avena estril
con buffer (medio solido).
M. Ilustracin 4. Desarrollo de
micelio de T. versicolor, sobre
avena estril durante 20 das.
Micelio blanco algodonoso.
N.
O. Actividad enzimtica de lacasa extrada de T. versicolor, sobre 2,6dimetoxifenol:
P.
1. 600376
UI
ml
Q. Actividad enzimtica de lacasa extrada de Pleurotus ostreatus, sobre

2,6-dimetoxifenol:
R.
0 . 9014
UI
ml
S. Discusin:
A. Se ha reportado que la lacasa con un peso molecular de 61.5 kDa y pI de
3.7, capaz de oxidar a un pH de 3.5 ABTS y 2,6-dimetoxifenol a
temperaturas de 60C
(Matnez, 2010). Se seleccion a
Trametesversicolorpor su capacidad para degradar distintos compuestos
fenlicos (fenol, cido glico, 2,6-dimetoxifenol y guayacol) como lo
comenta el autor y por su habilidad para utilizar el fenol como nica
fuente de carbono. Esto se representa en la ilustracin 5, que tiene un
color marrn oscuro (oxidacin) donde se mostr muy brusco el vire,
teniendo al principio una solucin incolora; al agregar la enzima lacasa
junto con el 2,6-dimetoxifenol tenemos una reaccin de oxidacin
rpida, cambiando en cuestin de segundos.Bioqumicamente, la lacasa
es una enzima que oxida una variedad de compuestos aromticos;
cataliza la remocin de un electrn y un protn de hidroxilos fenlicos o
de grupos amino-aromticos, para formar radicales libres fenoxilo y
radicales amino, respectivamente. De esta manera fue como se logr
oxidar al 2,6-dimetoxifenol,aunque los productos iniciales de la oxidacin
con lacasa pueden llegar a ser bastante inestables, por lo que pueden
sufrir reacciones espontneas de hidratacin o desprotonacin, y de esta
manera dan lugar a compuestos insolubles de tipo melanina, o bien
produciendo radicales que pueden reaccionar entre ellos mismos
formando dmeros, oligmeros o polmeros covalentemente unidos. Cabe
mencionar adems que la lacasa oxida directamente al oxgeno
molecular a agua a travs de un mecanismo de transferencia de cuatro
electrones, de una manera general se puede ver que la actividad
cataltica de las lacasas es de tipo ping-pong bisustrato en dos sitios
(Petersen y Degn 1978), ya que los productos son liberados antes de que
tenga lugar la unin de nuevos sustratos, esto hace a la enzima buena
en produccin y de buen rendimiento.
B. Estudios especializados con la estructura de la lacasa de T. versicolor,
cristalizada con un sustrato aromtico, sugieren que la transferencia de
electrones desde el sustrato a la protena tendra lugar a travs de una
de las histidinas que ligan el tomo de cobre (Bertrand et al., 2002). Por
este detalle en su estructura, el nmero de sustratos que es susceptible
a la oxidacin es muy grande, aunque muy pocos han sido tomados
como modelo, y entre ellos se encuentra el reactivo utilizado (2,6dimetoxifenol), el cual tambin pudo ser comparado en su actividad con
otras peroxidasas. Si bien la actividad enzimtica obtenida fue
detectable en la medicin espectrofotomtrica debido al mtodo de

diluciones que se utiliz donde la cantidad de enzima fue la ms alta en
la muestra, puede ser un tanto baja, y esto fue posiblemente ocasionado
por la inhibicin en el crecimiento del hongo.
C. Se puede observar cmo es el desarrollo del T. versicolor en las
ilustraciones 1 a 4, que como medio de cultivo se utiliz medio GMY,
este medio es muy semejante al utilizado originalmente por el Institute
of Hygiene and EpidemiologyMycology de Blgica cambiando algunas
cantidades de los reactivos (CIT, 1994). Posteriormente, al hacer el
licuado de hongo, tuvimos buena respuesta por parte del hongo con la
avena como sustrato, como se puede observar en la ilustracin 4,
teniendo un desarrollo de micelio blanco algodonoso, muy caracterstico
de T. versicolor. Sin embargo, el crecimiento no fue el deseado, ya que al
momento de hacer la preparacin en medio slido, la cantidad de medio
lquido que qued fue muy alta, de esta manera, el crecimiento se vio
inhibido por el alto porcentaje de humedad en el medio.
D. Conclusin:
E. El sustrato slido es ideal para el crecimiento de hongos ya que estos no
requieren grandes cantidades de humedad en el medio, sin embargo
presenta dificultades para el control de pH, humedad y aireacin.
F. Se observ que el sustrato induce la produccin de enzimas especficas
por parte del hongo inoculado.
G. El extracto crudo de enzima presenta actividad y degrada el sustrato.
H. Cuestionario:
I.
1: Aplicaciones de la fermentacin en sustrato solido
J. Se emplea este proceso de fermentacin desde muy antiguo en

el Lejano Oriente, como por ejemplo en la preparacin del kji en China y
en Japn (arroz cocido y fermentado) es la base de la elaboracin
del sak, del teiupeh habitual en la actualidad en Indonesia, el shoyu,
el miso y el ontjom. Es frecuente el uso en la elaboracin de aromas
artificiales de alimentos
K. Bibliografa:
L. Garca, M., Quintero, R., & Lpez-Munga, A. (1993). Biotecnologa

Alimentaria. Mxico: Limusa.
M. Dustet, J. C., Pea, J. J., & Prez, W. (2002). Evaluacin de un nuevo
prototipo de biorreactor para fermentaciones en estado slido de
residuos fibrosos. Revista Cubana de Ciencia Agrcola , 36(4), 373-386.
N. Matnez D. et al, (2010), Hacia un Desarrollo Sostenible del sistema de
produccin-consumo de los Hongos Comestibles y Medicinales en
Latinoamrica: Avances y Perspectivas en el Siglo XXI, Red
Latinoamericana de Hongos Comestibles y Mediciales-COLPOS-UNSCONACYT-AMC-UAEM-UPAEP-IMINAP, Puebla, pg. 193-196.
O. Petersen, L. C. y Degn, H. (1978). Steady-statekinetics of
laccasefromRhusvernicifera. Biochim. Biophys. Acta, 526:85-92.
P. CIT, (1994), Informacin Tecnolgica, Vol. 5, N 6, Casilla de Correos 593,
La Serena, Chile, pg. 66.
Q. Bertrand, T., et al. (2002). Crystalstructure of a fourcopperlaccasecomplexedwithanarylamine:
insightsintosubstraterecognition and correlationwithkinetics.
Biochemistry, 41:7325-7333.
R.

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es mantener, durante perodos prolongados de fermentacin (ms de 24h) las

Cepa de T. versicolor en PDA

CRECIMIENTO E INDUCCIN DE LA PRODUCCIN DE ENZIMAS POR EL

f) Aada aproximadamente de 30-50 ml de los pellets crecidos en

Q. Actividad enzimtica de lacasa extrada de Pleurotus ostreatus, sobre

detectable en la medicin espectrofotomtrica debido al mtodo de

1: Aplicaciones de la fermentacin en sustrato solido

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L. Garca, M., Quintero, R., & Lpez-Munga, A. (1993). Biotecnologa

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