Tecnicas Array

Tcnica de CGH-array
Mara Rodrguez-Rivera
Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia.

Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona
ndice
Introduccin a los microarrays
Arrays genmicos
Condiciones del ADN

Tcnica de CGH-array
Aplicaciones
Introduccin
Qu es un microarray?
Tipos de microarrays
Introduccin
Qu es un microarray?
Introduccin: Qu es un microarray?
Mikro (del griego,pequeo) y array (del ingls,distribucin
ordenada)
Coleccin de biomolculas ordenadas en filas y columnas
sobre un soporte slido miniaturizado.
Introduccin
Que es un microarray?
Introduccin: Tipos de microarrays
Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin
Introduccin: Tipos de microarrays
Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin
Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte
slido que permiten detectar alteraciones en el genoma
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Microarrays genmicos: Arrays de CGH

Array de BACs:
- BAC: Bacterial Artificial Chromosome

- Puede ser casero
- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM
Array de oligos comerciales:

- Oligonucletido: secuencias pequeas de ADN 50pb
- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM

- Diferentes formatos
- Microarrays prefabricados o custom
Microarrays genmicos: Arrays de CGH
Estudio de hibridacin comparativa (ADN tumoral vs ADN

control) que permite detectar ganancias y/o prdidas de
material gentico
Microarrays de CGH
slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Contiene adems sondas de oligonucletidos
correspondientes a variantes allicas de SNPs seleccionados
(oligoarray).
SNP ( Single nucleotide polymorphism ):
- Variacin de la secuencia de ADN que afecta a una
sola base
- 1 SNP cada 1000 bases

Permite obtener el nmero de copias de ADN y el
genotipo (seal de fluorescencia para cada alelo)
Hibridacin no competitiva:
- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan
en arrays independientes
- Posterior comparacin de resultados
Microarrays de SNP

Prdida de heterocigosidad sin cambio en el nmero de copias
(CNN-LOH)
Importancia en genes supresores de tumores:

mutacin heterocigota mutacin homocigota
Genes supresores de tumores: p53
Mutacin p53
Proliferacin
clulas
anormales
CGH vs SNP
CGH
SNP
Hibridacin competitiva
Hibridacin no competitiva
Muestra y control en
un mismo array
Muestra y control se hibridan

por separado
Ganancias y prdidas
Ganancias y prdidas
LOH
CGH y SNP:Limitaciones
No detecta alteraciones equilibradas
No detecta diferentes clones
>30% clulas tumorales
Protocolo tcnico
arrays CGH
Microarrays genmicos: ADN
ADN:
Sangre perifrica o mdula sea
Separacin de poblaciones celulares (microbeads)
Tejido en fresco
Tejido congelado (OCT)
Micro-Macrodiseccin del tumor
Parafina
Micro-Macrodiseccin del tumor
ADN: Tipos de extraccin
Extraccin automatizada
Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual
ADN: Tipos de extraccin
Extraccin automatizada
Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
ADN: Criterios de calidad

Cantidad ADN:
500ng
Calidad ADN:
Espectofotmetro

Espectofotmetro: NanoDrop 1000
Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80
Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80
Concentracin

Integridad ADN
ADN no degradado
ADN degradado (smear)
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Marcaje del ADN

ADN tumoral
ADN control
Desnaturalizacin
Marcaje
Cy5 -dUTP
Cy3 -dUTP
Marcaje del ADN

Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN

Marcaje del ADN

Marcaje del ADN

Hibridacin
Preparacin del array e hibridacin (muestra y control)
Muestra (Cy5)
Hibridacin
Control (Cy3)
Hibridacin: Preparacin del array

Unimos el mixer con el array
Hibridacin
Pipeteamos la muestra dentro del mixer
Hibridacin
Horneado
48-72h
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Lavados y secado
Lavados de astringencia
Secado
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Escaneado del array

Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Visualizacin de datos
Se obtiene una imagen con la lectura de los dos
fluorocromos (Cy3 y Cy5)
Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder
analizar en forma de datos
Anlisis
ADN tumoral > ADN control
Ganancia
ADN tumoral < ADN control

Prdida
ADN tumoral = ADN control
Normal
Anlisis de datos
Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
Anlisis de datos: Principios
Sonda
Cromosoma
Ideograma
Cariotipo
molecular
Anlisis visual: Ejemplos
DEVA
Nexus
Ganancia
Prdida
Nexus
Anlisis de datos
Anlisis datos: Ejemplos
N sondas: > 5
Log2 Ratio: < - 0.2 (Prdidas)
> 0.2 (Ganancias)
Aplicaciones
arrays genmicos
Aplicaciones arrays genmicos
Oncohematologa
Diagnstico
Pronstico
Investigacin
Post-natal y Pre-natal
Sndromes asociados a ganancias/prdidas de material gentico:
Deleciones: ej sndrome de Cri-du-chat (5p-)
Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y
(Sd.Turner, )
Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo
Nuevos sndromes
Aplicaciones arrays genmicos: Ejemplos

Estudio de carcinomas de clulas renales (CCR) mediante
arrays de CGH y cariotipo
N=24
16 CCR de clulas claras

5 CCR papilares
2 CCR cromfobos
1 Oncocitoma
Tejido fresco:
Estudio citogentico
Extraccin ADN
Poster SEAP- 081. M.Salido
CCR-CC: Citogentica
45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14
CCR-CC: CGH-arrays
CCR-CC: CG vs CGH-arrays
Resumen
Buena herramienta complementaria

Diferentes formatos
Limitaciones
Coste cada vez menor
Agradecimientos:
Dra.Blanca Espinet
Dra.Marta Salido
Dra.Anna Puiggros
Carme Melero
Dra.Silvia de Muga
Dra.Nuria Juanpere
Dr.Josep Lloreta
Dr.Josep M Corominas
Prof.Sergi Serrano
Agradecimientos:
Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de

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Condiciones del ADN

Introduccin: Tipos de microarrays

Introduccin: Tipos de microarrays

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genmicos: Arrays de CGH

- BAC: Bacterial Artificial Chromosome

Array de oligos comerciales:

- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM

Microarrays genmicos: Arrays de CGH

Estudio de hibridacin comparativa (ADN tumoral vs ADN

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Importancia en genes supresores de tumores:

Genes supresores de tumores: p53

Muestra y control se hibridan

No detecta alteraciones equilibradas

No detecta diferentes clones

>30% clulas tumorales

Microarrays genmicos: ADN

ADN: Tipos de extraccin

ADN: Tipos de extraccin

ADN: Criterios de calidad

ADN: Criterios de calidad

ADN: Criterios de calidad

ADN degradado (smear)

Marcaje del ADN

Marcaje del ADN

Marcaje del ADN

Marcaje del ADN

Marcaje del ADN

Hibridacin: Preparacin del array

Escaneado del array

ADN tumoral < ADN control

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis de datos: Principios

Anlisis visual: Ejemplos

Anlisis visual: Ejemplos

Anlisis visual: Ejemplos

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis datos: Ejemplos

Aplicaciones arrays genmicos

Aplicaciones arrays genmicos: Ejemplos

16 CCR de clulas claras

Poster SEAP- 081. M.Salido

Buena herramienta complementaria

Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de

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