Practica 5.5 y 5.6 Sustrato e Inhibidores 1

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias de Biolgicas

Laboratorio de Bioqumica y Biloga Molecular
Profesora: Gabriela Edith Olgun Ruiz
3IM1 Seccin III
Crdova Flix Juan Manuel, Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Prez Sndoval
Prctica 5.5 y 5.6: Efecto de la
Concentracin del Sustrato sobre la
Velocidad de Reaccin e Inhibicin
Enzimtica.
Introduccin:
El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la
velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y los
efectos que pueden tener factores como los inhibidores.
En las reacciones no catalizadas por enzimas la formacin de
producto depende linealmente de la concentracin de sustrato
aadido. A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la
velocidad de la reaccin aumenta en forma proporcional a la
concentracin de sustrato, obtenindose una relacin de tipo
lineal. Sin embargo, a concentraciones ms altas de sustrato,
la relacin proporcional no se cumple ya que al aumentar la
concentracin de sustrato, la velocidad no aumenta
considerablemente.
Una de las formas de regulacin de la actividad de una
enzima es a travs de molculas que disminuyen su velocidad
de reaccin, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden
encontrarse de manera natural en las clulas para controlar la
velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser
compuestos sintticos que se utilizan como herramientas
experimentales para el estudio de las reacciones enzimticas.
1.- Efecto de Concentracin del Sustrato:

Lecturas de Absorbancia obtenidas en el espectrofotmetro a
540 nm con diferentes concentraciones de sacarosa 0.2 M en
presencia de enzima: Invertasa 10 ug/mL.
Con las lecturas de absorbancia obtenidas en efecto de [sustrato]
interpolando y usando la ecuacin de la recta:
Abs = 0.0645 [Az. Red.] + 0.0031, estos valores en la curva tipo
de azucares reductores para tener la [Azcares Reductores] en
cada tubo.
Curva Tipo Azucares Reductores

0.8
0.6
Objetivos:
Observar el efecto de la concentracin del sustrato sobre
la velocidad de la reaccin enzimtica y determinar la
constante de Michaelis-Menten por los mtodos
conocidos, as como su aplicacin.
Absorbancia
0.4
0.2
0
0
Determinar el tipo de inhibicin producido por la anilina

sobre la actividad de la invertasa.
10
12
[Azucar Reductor] (moles)/2.0 mL
Resultados:
Tubo No.
Reaccin del 3,5 Dinitrosaliclico (DNS) con

Azcares Reductores
f(x) = 0.06x + 0
R = 0.99
Sacarosa
0.2 M (ml)
Absorbancia
Azcar
Reductor
(moles)/2.
0 mL
Velocidad
(unidades
de
invertasa)
Concentraci
n de
Sustrato
Bl
an
co
T
0.5
Problemas
1
0.1
2
0.2
3
0.3
4
0.5
5
0.8
6
1.0
0.323
0.585
0.637
0.655
0.680
0.707
4.959
6
9.021
7
9.827
9
10.10
69
10.49
45
10.913
1
0.495
9
0.902
1
0.982
7
1.010
7
1.049
4
1.0913
0.01
0.02
0.03
0.05
0.08
0.1

3IM1 Seccin III
(moles/L) =
M)
Grfica de Dobles Reciprocos

4
De esta forma la ecuacin de Michaelis- Menten:
V0
Vmax [ S]
[ S ] + Km
f(x) = 0.03x + 0.8

R = 1
3
, tomando los recprocos de ambos miembros1 2
/
se transforma a la ecuacin de Lineweaver-Burk, la cual es V 1
Km
1
1
Vmax
1
=
+
V0
S
Vmax
f(x) = 0.01x + 0.36

R = 0.91
0
0
20
40
60
80
100
120
1/[S]
Que es la ecuacin que representa la tendencia lineal de la
Grfica de Dobles Recprocos, que al ser de la forma:
y= mx + b nos permite calcular el valor de la Km (Constante
de Michaelis) y la Vmax.
Siendo:
De esta forma pudimos calcular la Vmax:

1/Vmax= 0.3604,
Entonces Vmax= 1/0.3604= Vmax= 2.7746 U.I
y = 1/Vo, m = Km/Vmax, x=1/ [S] y b= 1/Vmax
Con este valor de Vmax calculamos la Km:

Km/Vmax =0.0059
Grfica V vs [S]
3
Entonces sustituyendo: Km= 0.0059* 2.7746
Km= 0.0163
V 1
Gg2.- Inhibicin Enzimtica: Resultados con Inhibidor
0
0
0.02
0.04
0.06
[S]
0.08
0.1
0.12
Tubo No.
Sacarosa
0.2 M (ml)
Absorbancia
Azcar
Reductor
(moles)/2.
0 mL
Velocidad
(unidades
de
invertasa)
Concentraci
n de
Sustrato
(moles/L) =
M)
Blan
co
T
0.5
Problemas
1
0.1
2
0.2
3
0.3
4
0.5
5
0.8
6
1.0
0.192
0.321
0.401
0.435
0.552
0.211
2.928
6
4.928
6
6.168
9
6.696
1
8.510
3.22
32
0.292
8
0.492
8
0.616
9
0.669
6
0.851
0
0.32
23
0.01
0.02
0.03
0.05
0.08
0.1
As mediante la obtencin de las dos ecuaciones de tendencia

lineal de la forma:

3IM1 Seccin III
Km
1
1
Vmax
1
=
+
V0
S
Vmax
y= mx + b
Calculamos la ordenada al origen y, y la abscisa al origen x
Por otro lado al elaborar la grfica de Doble

Recprocos o Lineweaver-Burk logramos obtener la
constante de Michaelis-Menten Km con un valor
de 0.0163 la cual relaciona la [sustrato] con la
velocidad de reaccin y la velocidad mxima que se
alcanza, del mismo modo con la ecuacin de
Lineweaver-Burk obtuvimos la Vmax=2.7746 U.I
Respecto a la prctica de Inhibidores en esta

prctica utilizamos como Inhibidor a la Anilina
realizando el mismo proceso de hidrlisis de la
XCI= -0.8017/0.0258 =-31.0736
Sacarosa con la enzima Invertasa obteniendo
Glucosa y Fructosa,
que al dar color
XSI=-0.3604/0.0059 = -61.0847
reaccionando con el 3,5 DNS deteniendo la Act.
Enzimtica por el medio Bsico. Logramos
YSI= 0.3604, YCI= 0.8017
observar como es que los Inhibidores disminuyen
De esta forma al observar que las rectas no son paralelasla Actividad Enzimtica al unirse ya sea a la
(Inhibidor Acompetitivo), y que tampoco se cortan entre s en el eje enzima en su sitio activo, al complejo ES, o a la
de las ordenadas 1/V (Inhibidor Competitiva), entoncesenzima pero en un lugar que no es su sitio activo,
observamos que las rectas si se cortan entre s pero en un punto teniendo como funcin retrasar la velocidad de
en el segundo cuadrante pero que no es sobre ninguno de los ejes
reaccin enzimtica, al graficar los dobles
por lo que la Anilina es un Inhibidor No Competitivo.
recprocos con y sin inhibidor llegamos a la
conclusin de que la Anilina es un Inhibidor No
Discusin:
Competitivo por el comportamiento observado al
Como en la prctica de Inhibidores el ultimo valor de absorbanciagraficar.
Para as conocer el tipo de Inhibidor que era la ANILINA con la
actividad de la INVERTASA.
obtenida fue menor que el anterior a este, los valores calculados a

partir de este fueron mucho menores debido a esto concluimos que
la enzima se saturo en este caso de glucosa al tener demasiada
cantidad de este azcar reductor por lo cual en ese momento ya no
dejo que la Invertasa trabajara. Por lo que decidimos descartar el
ltimo valor, en la Grfica de Dobles Recprocos.
Conclusin:
A partir de estas dos prcticas logramos observar cual
es el efecto que tiene la concentracin del sustrato y
la accin de los inhibidores en la Velocidad de
Reaccin a la que llamamos Actividad Enzimtica
De los cuales observamos que al cambiar la
concentracin del sustrato la enzima (Invertasa) acta
cada vez ms rpido mientras ms sustrato tenga para
trabajar en este caso Sacarosa y que si graficamos
Velocidad de la enzima en U.I contra [sustrato] se
observa un comportamiento lineal solo al inicio de la
grfica por lo cual se podra a decir que este
comportamiento solo se da en un inicio a bajas
concentraciones de sustrato ya que conforme aumenta
la [sustrato] la grafica de velocidad adquiere el
comportamiento de una parbola rectangular es decir
cada vez la velocidad se incrementa menos, llegando
incluso a ser independiente en cierto punto al aumento
de [sustrato], debido a que la enzima tiene mucho
sustrato (sacarosa) con el cual trabajar teniendo
alrededor de 5 millones ms de molculas de sacarosa
que de Invertasa por lo cual incluso puede llegar a
saturarse la enzima de la glucosa obtenida por la
ruptura de sacarosa y bloquear su sitio activo y hacer
que la grfica se caiga como sucedi en nuestro caso.
Comprobamos que al aumentar la

concentracin del sustrato la velocidad
aumenta hasta llegar a un valor mximo
Calculamos la Vmax y encontramos su valor
que es de 2.7 U.I.
Encontramos el valor de la Km (constante de
michaelis) el cual es de 0.0163 en este caso
Comprobamos que los inhibidores reducen
la actividad enzimtica al comparar las
graficas de velocidad vs concentracin.
Identificamos que el inhibidor que usamos
(anilina) es un inhibidor no competitivo debido
a la grafica realizada.
Bibliografa
Nelson D.L y Cox M.M, Lehninger: Principios de
Bioqumica, 4ta Edicin, Ed.: Omega, 2006, pgs.: 202211

3IM1 Seccin III
http://bioquimexperimental.files.wordpr
ess.com/2009/08/seccic3b3n3-sustratoe-inhibidor-final.pdf

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1.- Efecto de Concentracin del Sustrato:

Curva Tipo Azucares Reductores

Determinar el tipo de inhibicin producido por la anilina

[Azucar Reductor] (moles)/2.0 mL

Reaccin del 3,5 Dinitrosaliclico (DNS) con

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Grfica de Dobles Reciprocos

De esta forma la ecuacin de Michaelis- Menten:

f(x) = 0.03x + 0.8

f(x) = 0.01x + 0.36

De esta forma pudimos calcular la Vmax:

y = 1/Vo, m = Km/Vmax, x=1/ [S] y b= 1/Vmax

Con este valor de Vmax calculamos la Km:

Entonces sustituyendo: Km= 0.0059* 2.7746

Gg2.- Inhibicin Enzimtica: Resultados con Inhibidor

As mediante la obtencin de las dos ecuaciones de tendencia

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Calculamos la ordenada al origen y, y la abscisa al origen x

Por otro lado al elaborar la grfica de Doble

Respecto a la prctica de Inhibidores en esta

obtenida fue menor que el anterior a este, los valores calculados a

Comprobamos que al aumentar la

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