Orquideas PDF

UNIVERSIDAD DE CUENCA
FCULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INGENIERIA AGRONMICA
RESUMEN:
TTULO: EVALUACION DE DIFERENTES DOSIS DE
AUXINAS (ANA - IBA) Y CITOQUININA (BA) PARA EL
DESARROLLO DE MERISTEMOS EN Maxillaria grandis
Rchb.f. .
Por la gran importancia econmica, medicinal, y de
endemismos de las orqudeas ecuatorianas nos vemos en la
obligacin de realizar estudios referentes a salvaguardar
especies en va de exrincion como Maxillaria grandis, ademas
evitar la trasmisin de patgenos como los virus que eliminan
por completo al cultivo y por ende la produccin de la flor
cortada. La
presente investigacin sse realiz en el
Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad de Cuenca. Y tuvo como
finalidad desarrollar meristemos a nivel in vitro, con diferentes
dosis de Auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA) en la especie
de Maxillaria grandis, as como determinar el comportamiento y
variaciones que estos pudieron tener. Para obtener los
resultados planteados se procedi a la recopilacin y
clasificacin de informacin y determinar las caractersticas de
la especie en estudio. Para determinar los resultados de las
dosis de AUXINAS (IBA y ANA) y CITOQUININA (BA) se utiliz
un diseo de arreglo factorial de 4x4 con 6 repeticiones del
cual se obtuvo el 100% de sobrevivencia de meristemos para
el tratamiento 9 (ANA0 IBA0; BA 0.50) en un medio de
cultivo de Phytamax al 33.3 % siendo este el recomendable
para el desarrollo de los meristemos. Los meristemos tuvieron
un comportamiento heterogneo en las primeras etapas, sin
embargo al termino de su evaluacin a los 90 das se
AUTORA: PAOLA CRUZ JARAMILLO
2011
determino claramente el desarrollo, que se verifico de acuerdo

a una escala de colores impuesto.
Palabras claves: Meristemos, Cultivo in vitro, Dosificacin de
Auxinas y Citoquininas. Cultivo de tejidos. Maxillaria grandis.
NDICE
I. Introduccin
II. Objetivos e Hiptesis
13
2.1. Objetivo general.
13
2.2. Objetivos especficos.
13
2.3. Hiptesis.
13
III. Revisin de literatura.
15
3.1. Perspectiva histrica de las orqudeas.
15
3.2. Importancia econmica
18
3.3. Distribucin y diversidad
19
3.3.1. Ecologa y hbitat
21
3.3.2. Patrones generales de endemismo de las orqudeas

ecuatorianas.
24
3.4. Estructura botnica del gnero maxillaria.
27
3.4.1. Clasificacin botnica.
27
3.5. Tipos de crecimientos de las orqudeas.
30
2011
3.5.1. Crecimiento simpodial
30
3.5.2. Crecimiento monopodial.
30
3.6. Morfologa de Maxillaria sanderiana o Maxillaria

grandis
31
3.6.1. Raz.
31
3.6.2. Los rizomas y pseudobulbos.
31
3.6.3. Hojas.
32
3.6.4. Flor.
33
3.6.5. Frutos
42
3.6.6. Semillas.
48
3.7. Conservacin de orqudeas
53
3.7.1. In situ
53
3.7.2. Ex situ
54
3.8. Resea histrica del cultivo de tejidos
55
3.8.1. Infraestructura adecuada para la micropropagacin
59
3.9. Cultivo de tejidos in vitro
67
3.9.1. Importancia del cultivo de tejidos in vitro
69
3.9.2. Tipos de cultivos in vitro
70
3.9.3. Cultivo de meristemos
73
a. El meristemo.
73
b. Divisin dentro de los meristemos
74
2011
c. Zonas de segmentacin del meristemo
75
3.10. Sanidad
76
3.10.1. Los Virus
77
3.10.2. La termoterapia o tratamiento trmico
78
3.10.3. La quimioterapia
79
3.11. Tcnicas del cultivo in vitro
80
3.11.1. Determinaciones
80
3.12. Vitrificacin o Hiperhidricidad
86
3.12.1. Consistencia del medio productora de vitrificacin
88
3.12.2. Sistema de doble fase
89
3.12.3. Concentracin
crecimiento
tipos
de
reguladores
de
89
3.12.4. Humedad
90
3.12.5. Recipientes
91
3.13. Asepsia y esterilizacin del material vegetal
92
3.14. Medio de cultivo.
94
3.14.1. Tipos de medio de cultivos
96
a)
Medio slido
96
b)
Semi-lquido
96
c)
Lquido
96
3.14.2. Medios definidos

97
2011
3.14.3. Medios indefinidos.
99
3.14.4. Componentes del medio de cultivo.
100
a)
Macro-elementos
101
b)
Micro-elementos
104
c)
Compuestos orgnicos
107
d)
Reguladores de Crecimiento
109
3.14.5. Proceso para la realizacin del medio de cultivo.
114
3.14.6. Tcnica para la preparacin del medio de cultivo.
114
3.14.7. Condiciones fsicas del medio de cultivo.
115
a) El pH
115
b) Conductividad elctrica
116
3.14.8. Esterilizacin del Medio.
117
IV. Materiales y mtodos.
118
4.1. Ubicacin del lugar de la investigacin.
118
4.2. Caractersticas de los laboratorios.
118
4.2.1. Primer laboratorio.
119
4.2.2. Segundo laboratorio.
121
4.2.3. Tercer laboratorio.
121
4.3. Materiales y equipos del

realizacin de la investigacin.
4.3.1. Materiales biolgicos.
laboratorio
para
la
122
122
2011
4.3.2. Materiales qumicos.
122
4.3.3. Materiales fsicos.
123
4.3.4. Herramientas.
124
4.3.5. Materiales.
124
4.4. Mtodos.
125
4.4.1. Material experimental.
125
4.5. Factores en estudio.
127
4.5.1. Tratamientos estudiados.
127
4.5.2. Diseo experimental.
131
4.5.3. Caractersticas de la unidad experimental.
132
4.5.4. Esquema del anlisis Estadstico.
132
4.5.5. Prueba de Significacin.
133
4.5.6. Manejo de la investigacin
133
4.5.7. Tcnicas del manejo del ensayo.
134
a) Primera fase preparacin de reactivos para el medio de

cultivo.
135
b) Segunda fase.
139
c) Tercera fase. Esterilizado de materiales y del medio de

cultivo.
143
d) Cuarta fase: Seleccin de explantes.
145
e) Quinta fase: Preparacin del material vegetal para la

2011
siembra.
145
f) Sexta fase: Siembra de Meristemos
152
g) Sptima Fase: Toma de datos.
153
V.
Resultados y discusin
155
V.
Conclusiones.
207
VI. Recomendaciones.
209
VII. Resumen
211
VIII. Summary
218
IX. Bibliografa citada
223
2011
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INGENIERIA AGRONOMICA.
EVALUACION DE DIFERENTES DOSIS DE AUXINAS (ANA IBA)

Y CITOQUININA (BA) PARA EL DESARROLLO DE
MERISTEMOS EN Maxillaria grandis Rchb.f. .
Tesis de grado, previa a la

Obtencin del titulo de
Ingeniera
Agrnoma
Director:
Ing. Agr. Francisco Merchn B.
Coordinacin:
Instituto de investigacin Cientfica de la

FF.CC.AA. de la Universidad de Cuenca
Autora:
Paola Dennise Cruz Jaramillo.
Cuenca - Ecuador
2010-2011
2011
I.
Introduccin
La familia Orchidaceae, es una de las ms grandes y diversas

del planeta, ya que por su forma, tamao, y sus colores
especialmente de sus flores, es uno de los atrayentes, no solo
en la parte ornamental, sino tambin por cosmetlogos, sus
aromas son utilizados para la fabricacin de perfumes, de la
gastronoma y en el campo medicinal en el cual se utiliza las
orqudeas (ABC, sf.).
En la economa, es importante, en pases donde se encuentra

la mayor diversidad de especmenes, como es Sudamrica, su
mega diversidad por las condiciones edafo-climticas que
brindan estos pases (ABC, sf.).
Ecuador, es uno de los pases que tiene la biodiversidad

adecuada para este tipo de plantas, encontramos una gran
gama de especies que llama la atencin no solo por sus
atractivos sino tambin para la investigacin cientfica.
Encontramos
4.163
especies
de
orqudeas
1.710
endmicas, que son materia de trabajo cientfico; de estas,

muchas de ellas son vulnerables, estn amenazadas o en
peligro crtico, como es el caso de Brachionidium lehmannii,
2011
Cyclopogon
leurorum,
Dichaea
chiquidensis,
Dichaea
longissima, Encyclia angustiloba, Epidendrum falcisepalum,

Maxillaria stricta, Maxillaria vulcanic.(Jijn, et al., sf.).
Causas principales para que se encuentren en lista roja en el
Ecuador,
se
debe:
la
deforestacin,
al
saqueo
indiscriminado de individuos silvestres; y a un desconocimiento

cientfico para su cultivo. Al determinar cada una de las plagas,
enfermedades
virus
que
las
atacan
destruyen
completamente, podramos salva individuos importantes en

estas listas.
Una de los patologas que arrasa con las orqudeas, son los
virus; cada uno de estos patgenos traen efectos negativos,
ya que el solo roce entre planta y planta, o el mal manejo
mecnico, produce
una trasferencia del 100% de la
inoculacin del virus, la que se transmite a toda la planta por

medio de la savia, dependiendo cada especie, pero en su
mayora se transmiten principalmente los patgenos ms
comunes, particular que se presenta no solo en nuestro pas,
si no en el mundo entero, entre las que tenemos: Cymbidium
mosaic potexvirus (CyMV) quetiene como sntomas manchas
necrticas y clorticas (Ringo, 2004)
2011
10
El virus de la mancha anillada del Odontoglosum (ORSV o

TMV-O) se caracteriza porque su ataque se concentra en las
flores de las orqudeas, para controlar estos sntomas tenemos
un manejo fitosanitario, estrategias preventivas, pero que no
cura a la planta, por cuanto puede producirse una nueva reinfeccin, ya con el mismo patgeno o con otra especie de
virus(Banks, 2006)
Las orqudeas, son productoras de semillas, al no contar con
un porcentaje adecuado de desarrollo in vitro y ex situ, las
plantas de orqudeas necesitan de agentes externos como son
los hongos, especialmente de la especie (Rhizoctonia sp.) para
obtener un porcentaje alto de germinacin, por cuanto el
endospermo que rodea el embrin es muy reducido, y se ha
determinado una relacin semilla hongo, dependencia que
lleva el nombre de simbiosis, por lo cual debemos conservar
adecuadamente
estos
hongos
para
su
estudio
reproduccin de esta orqudea que se encuentra en la lista roja

de especies endmicas del pas (Jijn, sf.).
Salvar a una especie de los patgenos para evitar su
decadencia por estas causas, es el objetivo del presente
trabajo, para lo cual utilizaremos tcnicas alternativas, por
medio del tejido vegetal que permite la reproduccin de
2011
11
orqudeas
en
condiciones
aspticas,
para
obtener
masivamente plantas para adaptacin, en poco tiempo y

asegurando la calidad y sanidad de cada una de ellas (Jijn,
sf.).
Consideramos que estas tcnicas puede ser la respuesta,
encaminada para evitar la extincin de estas especies
endmicas.
Por la importancia de estas especies justificamos el presente
trabajo cuya finalidad es obtener plantas libres de virus.
2011
12
II.
Objetivos e Hiptesis
2.1. Objetivo general.
- Desarrollar meristemos de Maxillaria grandis a nivel in

vitro
2.2. Objetivos especficos.
- Evaluar el porcentaje de meristemos vivos despus de la

siembra.
- Evaluar los comportamientos y
variaciones de los
meristemos in vitro
2.3. Hiptesis.
- Las diferentes dosis de AUXINAS (IBA y ANA) y

CITOQUININA (BA) actan de manera diferente para el
desarrollo de meristemos in vitrio en la especie Maxillaria
grandis?
CITOQUININA
(BA)
no
2011
tienen
efecto
en
el
13
comportamiento para el desarrollo de meristemos in vitrio

en la especie Maxillaria grandis?.
2011
14
III.
3.1.
Revisin de literatura.
Perspectiva histrica de las orqudeas.
Su origen se relata desde la prehistoria, donde se han

encontrado fsiles del perodo jursico, de la era mesozoica
que nace en 195 136 millones de aos y tambin de la era
cenozoica que hace referencia a unos 64 millones de aos. Se
considera que su origen proviene del Mediterrneo, ya que
algunos especmenes crecen espontneamente como son las
Orchis y Ophys (Kijima, 1994).
En los registros de los chinos, se hace referencia que ya
cultivaban las especies ms fragantes como Cymbidium en los
aos 500 a.C (Banks, 2006). Especialmente de su flor se
encuentran referencias en el libro Historia de las plantas de
Teofrasto, un discpulo de Aristteles en los aos 300 a.C. En
el siglo I d.C. se realiza la primera identificacin por un
herborista griego llamado
Dioscrides el cual las recolect
para formar un herbario de plantas medicinales, que fue

utilizado como punto de referencia hasta la edad media en
Asia (Kijima, 1994).
En la antigua Grecia, se conoce a las orqudeas, como un
smbolo de virilidad. La palabra orqudea proviene (del latn
2011
15
orchis, que a su vez deriva del griego), que significa testculo

(que hace referencia al par de rizomas subterrneos de
algunas especies); apareci por primera vez mencionada en
un manuscrito de un filsofo griego, aproximadamente entre
los aos 371 a.C. 285 a.C (ABC, sf.).
En Europa, el cultivo de las orqudeas, comenz por aficin
probablemente con las expediciones Britnicas del siglo XVIII,
y recin a inicios del siglo XIX, el cultivo de orqudeas se
convirti en una actividad popular. En esta poca, las
expediciones de los colonizadores europeos, iban y venan
desde el Nuevo continente, con cargamentos de orqudeas
tropicales, financiadas por aristcratas aficionados a
estas
especies endmicas, por la exoticidad de las mismas, que eran

sembradas en grandes viveros construidos nicamente para
este fin.
La aristocracia se caracteriz por la intensa competencia, por
obtener las mejores y ms raras orqudeas, la cual daba al que
la posea un estatus social diferente. Los viveros ms grandes
se encontraban en manos de familias poderosas entre las que
se destacan: Loddiges, Williams, Bull, Veitch y Sander, creador
de una de las colecciones ms importantes que se destaca
hasta la actualidad, y entre las que se encuentran las
orqudeas tropicales. Sander inmortalizo el nombre de su
2011
16
familia ya que describi
algunas de las
orqudeas
introducidas en Europa, como por ejemplo: Paphiopedium

sanderianum; Dendrobium sanderae; Vanda sanderiana la cual
tambin tiene el nombre de Euanthe sanderian, cabe indicar
que dentro de esta lista se encuentra la especie en estudio que
es la Maxillaria sanderiana o actualmente conocida como
Maxillaria grandis.
La historia, acusa a todos estos recolectores de ser los
causantes y devastadores de la parte ambiental y humana que
acab con una gran cantidad de trabajadores relacionados con
esta actividad; pas al que llegaban para recolectar especies,
lo
contaminaban
con
enfermedades
contagiosas
que
trasmitan a la poblacin. Adems que extinguan a las

especies endmicas de cada pas (Banks, 2006).
Las orqudeas han fascinado a la humanidad durante su
existencia; consideradas flores msticas en algunos pases; en
Grecia y Asia los rizomas chancados como pasta se utiliza
para tratar algunas dolencias y se coloca en las bebidas como
afrodisiaco, en los pueblos primitivos como en la Sierra del
Ecuador en la poblacin de Loja - Saraguro se la utiliza con
fines medicinales, especialmente la hoja de Odontoglossum
longipes Rchb (Ros, et al., 2007).
2011
17
3.2.
Importancia econmica
Por su aroma y su belleza, las orqudeas actualmente tienen

un elevado costo en el mercado mundial, mientras ms rara es
la especie, ms alto es su valor comercial, por lo cual los
productores, ya sean empresarios particulares e industriales la
comercializan como flor cortada y como planta ornamental. El
cultivo de orqudeas es posible en todas partes del mundo, y
est especialmente desarrollado desde la mitad del siglo
pasado por muchos hbridos inte-respecfico e inter-genricos,
quienes crearon estas especies para comercializarlo con xito
econmico increble.
La explotacin comercial para flor cortada y el cultivo en

maceta agrupa a unos cincuenta gneros cuyo cultivo se
practica en muchos pases. Los principales productores de
orqudeas son: Ecuador, Per, Colombia Brasil, China, Costa
Rica, Estados Unidos, Filipinas, Indonesia, Pases Bajos y
Tailandia. El aumento de la demanda en los pases
industrializados ofrece una oportunidad para el desarrollo de
mercados de exportacin en otros pases en desarrollo tanto
en Asia Sudoriental como en Sudamrica. Algunos gneros de
la familia de las orqudeas son objeto de cultivos importantes
para exportacin como en el caso del Ecuador que tiene como
2011
18
representante a empresas reconocidas, las cuales en sus

listas tienen gran cantidad de ejemplares entre las que
mencionaremos
casapensis,
algunas:
Acianthera
Acacallis
cyanea,
Acianthera
wageneriana,Barbosella
cucullata,
Barbosella cucullata, Barbosella fuscata, Cattleya gigas,

Cattleya gigas, Cattleya gigas, Dendrobium aggregatum,
Dendrobium anosmun, Dendrobium antennatum, Dracula
andreettae, Dracula benedictii, Dracula carlueri, Encyclia
seidellii, Encyclia thienii, Encyclia unaensis, Epidendrum
agoyanense,
Epidendrum
angaritae,
Epidendrum
arachnoglossum, Gongora catilligera, Gongora colombiana,

Gongora
flaveola,
Masdevallia
paivaena,
Masdevallia
panguiensis, Masdevallia pastinata, Maxillaria sanderiana,

Maxillaria saragurensis, Maxillaria schunkeana, Pleurothallis
aspasicensis, Pleurothallis barbulata, Pleurothallis bivalvis,
Pleurothallisbrenneri,
Pleurothallis
brevipes,
Pleurothallis
breviscapa,Pleurothallis brighamella, especies
en las que
trabajan mediante cultivos muy especializados. (ABC, sf y

Ecuagenera,2011).
3.3.
Distribucin y diversidad
2011
19
Las orqudeas se encuentran casi en todo el planeta a

excepcin de los polos, ni en las zonas desrticas, tampoco
crecen en montes donde existe nieve perpetua. Son plantas
monocotiledneas, pertenecientes a la familia Orchidaceae, la
ms vasta del reino vegetal. (Mjia, et al., 2000).
Freuler,
(2008)
Indica
que
se
han
descubierto
aproximadamente 28.000 especies repartidas en 700 gneros,

pero todava hay regiones sin revelar fitogeogrficamente,
varias de ellas en el continente americano.
Si a esto le aadimos la enorme cantidad de hbridos entre
especies e incluso entre gneros distintos, nos encontramos
en un campo de enormes posibilidades. (Mjia, et al., 2000).
Las orqudeas se encuentran distribuidas desde el Norte a 72
y al sur a 54. La mayor parte en la zona tropical y subtropical
del Ecuador, que registra entre un 80 al 90% de su produccin.
El mayor porcentaje se encuentra en Asia, Indonesia y
Australia, en segundo lugar
frica y Madagascar y luego
desde Mxico hasta Brasil. (Jijn, et al., sf.).

El gnero Maxillaria se encuentra dispersa a lo largo de
Amrica Tropical, desde Florida y Mxico hasta Argentina, en
altitudes van desde el nivel del mar hasta los 3 500 msnm. Las
plantas pueden ser epifitas, litfitas, y muchas crecen de forma
2011
20
terrestre en los taludes y bordes de carreteras. Abundan en

zonas muy hmedas, si bien algunas pueden crecer en zonas
un ms secas. Hasta la fecha se han reportado unas 650
especies para el gnero, de las cuales 200 estn en Ecuador
(Jijn, et al., sf.).
3.3.1. Ecologa y hbitat
La recoleccin de orqudeas endmicas en nuestro pas se

realiza en la red vial, esto es muy comn en nuestra zona.
Cabe destacar y como lo indica el mapa de la distribucin
endmica de las orqudeas del Ecuador (Fig. 1), todas las
especies se encuentran en zonas protegidas por la SNAP
(Sistema Nacional de reas Protegidas). Es un reto estudiar
los endemismos de las orqudeas en un pas mega diverso
como es el nuestro, por esta razn se debe contar con varias
estrategias. El Ecuador las tiene, para conocer la situacin en
las que se encuentran las especies, por lo cual contamos con
una lista de especies amenazadas en el Libro Rojo de
especies Endmicas del Ecuador, en la que se destaca el
estado en que se encuentran las especies: peligro crtico, en
peligro, o amenazadas; esto es de gran ayuda cientfica; al
igual que los herbarios activos y bien mantenidos, ya sean
2011
21
pblicos y privados, que nos proporcionan informacin sobre

la ecologa, hbitat, taxonoma de la planta, estructura
botnica, y conocer su origen y situacin en la se encuentra
dentro de la lista roja elaborada a nivel mundial o para el
Ecuador.
Nuestro pas ha sido botnicamente explorado, con todas
estas estrategias ya obtenidas lo cual nos permite establecer
tcticas para proteger producir y exportar cientficamente esta
nueva fuente de ingresos econmicos. (Endara, 2009).
Figura 1.- Distribucin de las especies endmicas del

Ecuador.
2011
22
Fuente: Sistema Nacional de reas Protegidas (SNAP, sf.)
Dentro de la base de datos de los trpicos tenemos las

recolecciones que se han realizado a nivel internacional como
es el caso de Per y local como es el Azuay, Caar, Napo,
2011
23
Tungurahua. En esta distribucin se encuentra la zona exacta

de recolectas y el ao que se han obtenido, los cdigos que
tiene nuestra planta en estudio.
Cuadro 1. Localizacin por provincias en Ecuador de
Maxillaria grandis.
Fuente:(Base de los Trpicos. 2011).
3.3.2. Patrones
generales
de
endemismo
de
las
orqudeas ecuatorianas.
El Ecuador es considerado como uno de los 17 pases con
mayor diversidad de plantas en el mundo, y dentro de esta
diversidad encontramos la familia Orchidaceae, la cual aporta
2011
24
con un tercio del total de especies al fito-endemismo del

Ecuador, 4.163 spp. De lo cual tenemos
que el 40% son
orqudeas endmicas, que solo crecen en el pas, un tercio de

las plantas endmicas son orqudeas, catalogadas en
228
gneros y 4 023 especies. Existen en todos los pisos

altitudinales comprendidos entre 0 4500m.s.n.m., como
varios estudios indica que la mayor cantidad de orqudeas
endmicas se encuentran en los micro-hbitats. Toda la
riqueza del Ecuador se debe a la posicin estratgica en que
nos encontramos, lo cual permite una convergencia importante
con flora de otros pases. As tenemos que la influencia de las
especies provenientes de la cuenca del Amazonas al oriente;
al oeste la influencia de las especies de Centro Amrica y del
Choc-colombiano; y hacia el sur de nuestro pas la influencia
de Sudamrica. Otra de las razones por la cual nuestro pas es
mega-diverso, se debe a la cordillera de los Andes, que se
eleva desde los 500 a los 6 000 metros sobre el nivel del mar,
aspecto que marca de manera significativa la distribucin de
las orqudeas en nuestro pas. La mayor parte de orqudeas
se encuentran en rangos de altitud entre los 1000 y 3000
m, bajo este rango la diversidad est en un 22% del total de
las especies, y sobre el 18%.La cordillera de los Andes con
sus dos ramales que atraviesa al Ecuador de Norte a Sur,
2011
25
unidas por ramales transversales que dan origen a las hoyas,

por lo cual su orogrfica es irregular e indefinida de microclimas, micro-hbitat, y consta de varios tipos de vegetacin, y
por estos accidentes naturales producidos, las irregularidades
edficas
favorece
una
completa,
abundante,
heterogeneidad de cada una de las especies que se

encuentran a cada lado de la cordillera, y en los valles que se
forma. Para entender mejor citamos un ejemplo, en el rango
comprendido entre los 0-1000 metros sobre el nivel del mar
crecen alrededor de 969 especies, el 89% de especies
comparten similitudes con el otro lado de la cordillera, esto
representa el 9%, mientras que el 91% restantes no se
encuentran del otro lado de la cordillera con este ejemplo
podemos constatar la heterogeneidad de las especies en
nuestro pas (Jijn, et al., sf.).
Pero no solo se encuentra la cadena montaosa en la parte
central (Sierra) si no que en la parte costera el Ecuador se
ubican dos corrientes marianas las cuales modifican el clima
de esta parte del pas, estas corriente son: la clida del Nio,
en el norte que genera un clima hmedo tropical y da origen a
bosques del mismo nombre (hmedo tropical), y la fra de
Humboldt que genera un clima ms seco hacia el sur del pas
y origina un bosque seco tropical muy rico en especies
2011
26
endmica. En conclusin podemos decir que las plantas en

especial las orqudeas evolucionaron y se adaptaron de
acuerdo a las condiciones climticas que brinda el Ecuador.
Gracias a este clima podemos encontrar orqudeas en todas
las cuatro regiones del Ecuador como es la Costa en los
manglares, Sierra en los pramos, Oriente y Galpagos, en
esta ltima encontramos 15 especies de orqudeas las cuales
dos son exclusivas del lugar (Jijn, et al. sf.).
La combinacin de perfiles de distribucin, como los
observados en las orqudeas, y la rpida conversin de
bosques son un reto para los esfuerzos de conservacin,
especialmente porque una pequea fraccin de las especies
se
encuentra
dentro
del
Sistema
Nacional
de
reas
Protegidas. Se estima que el 85% del total de especies

endmicas presentan algn tipo de amenaza: 2% En peligro
crtico, 11% En peligro y 87% Vulnerable. A nivel subtribu la
flora de Orchidaceae endmica est compuesta por un 65% de
especies de la subtribu Pleurothallidinae, seguida lejanamente
por Laeliinae (12%) y Oncidiinae (9%) (Endara, 2009).
3.4.
Estructura botnica del gnero maxillaria.
3.4.1. Clasificacin botnica.

2011
27
Los cientficos dedicados a la Taxonoma, en su afn de

comprender su naturaleza, han buscado clasificar y ordenar
los diferentes elementos que la constituye. Desde las pocas
primitivas se ha determinado clasificaciones bsicas las cuales
eran
tiles,
en la actualidad se utiliza el ADN para poder
identificar la afinidad de las especies para su agrupacin en las

diferentes escalas que corresponde
en relacin con las
existentes a nivel internacional. Al reino vegetal se lo ha

dividido en subgrupos por la gran cantidad y diversidad de
plantas que se encuentran distribuidas en la tierra. Cada grupo
tiene una divisin, pero estas divisiones tambin tiene
terminacin las cuales nos pueden ayudar para identificar o
nominar
correctamente
una
especie;
utilizaremos
la
clasificacin de Cronquist quien es uno de los ms nobles

botnicos y cuyo sistema se utiliza hasta la actualidad (Jijn, et
al., sf.).
Cuadro 2. Clasificacin de las orqudeas segn Cronquist.
Reino
Vegetal
Divisin
Magnoliophyta
Clase
Liliopsida
Orden
Orchidales
Familia
Orquidaceae
2011
28
Fuente: Jijn, C.sf.Ecuador pas de orqudeas.
Como existe una clasificacin general desde REINO hasta la

FAMILIA, hay una clasificacin para la SUBFAMILIA (Jijn, et
al., sf.).
Cuadro 3. Subdivisin de la familia Orchidaceae

Subfamilia
Vandoideae
Fuente: Jijn, sf. Ecuador pas de orqudeas.
Cuadro 4. Subdivisin de Tribus y Sub-tribus dentro de la

Subfamilia Vandoideae.
Tribu
Maxillarieae
Subtribu
Zygopetalinae
Fuente: Jijn,sf. Ecuador pas de orqudeas.

Los botnicos espaoles Ruiz y Pavn
establecieron
el
gnero Maxillaria en 1794, con ms de 600 especies hasta

ahora. Este gran gnero debera estar claramente definido, lo
cual no ha sido clasificado hasta la fecha. Hay taxonomistas
que trabajan para clasificar los grupos y algunos de ellos estn
ms o menos claramente definidos. Varios grupos han sido
segregados, como es el caso de
2011
Maxillaria; a veces se
29
reconoce el estatus de gnero para Camaridium, Ornithidium, y

Pseudo maxillaria.
Hay un vasto grupo de especies que no ha sido descrito aun.
Algunas maxillaria son especies de tierras bajas, otras son de
cotas altas y algunas se encuentran entre estos extremos. Su
rango va desde el nivel del mar y los 3 500 m de altura,
creciendo como epifitas, litofitas, y terrestres (Zelenko, et al.,
2009).
3.5.
Tipos de crecimientos de las orqudeas.
3.5.1. Crecimiento simpodial
Es aquel que se presenta en las orqudeas que tienen bulbos y

pseudobulbos, es de crecimiento definido, esto se basa en que
luego de florecer la orqudea no sigue creciendo. Los tallos
darn nuevos brotes a partir de una yema especfica que se
encuentra en la base del tallo y sin esta yema la orqudea no
volver a florecer (Jijn, et al., sf.).
3.5.2. Crecimiento monopodial.
Es aquel que se da en forma longitudinal e indefinida, lo cual

se debe a que hay un punto de crecimiento apical el cual da
2011
30
origen a hojas y posteriormente a los tallos, y est provisto de

races en toda su longitud: las inflorescencias nace de las
axilas de las hojas (Jijn, et al., sf.).
3.6.
Morfologa de Maxillaria sanderiana o Maxillaria
grandis
3.6.1. Raz.
La investigadora Freuler, (2008) seala que las races se ven
gruesas apenas emergen del rizoma.- pseudobulbo o tallo- y a
veces se ramifican cuando son muy largas. Estn cubiertas por
un tejido que acta como una esponja, llamado velamen.
3.6.2. Los rizomas y pseudobulbos.
La referida tratadista Freuler, (2008) nos ensea que Las
plantas simpodiales tienes un rizoma (tallo subterrneo o
areo) al partir del cual se originan pseudobulbos (rganos de
reserva de alimento y agua.). Los ms jvenes llevan las
hojas, son portadoras de yemas auxiliares, dan origen a races
y, en muchos casos, a flores. Pueden ser cilndricos,
fusiformes, elpticos, ovales, etc. En el caso de Maxillaria
grandis tenemos que el tipo de pseudobulbo es el ovoide.
2011
31
Grfico1: Clasificacin de rizomas y pseudobulbos en

orqudeas
Fuente: Mara Freuler (2008).
3.6.3. Hojas.
Sobre el tipo de hojas, dice la tratadista Freuler, (2008) en las

plantas monocotiledneas, sus hojas se presentan nervaduras
(llevan agua y transportan los productos de la fotosntesis) que
corren paralelas entre si y al eje longitudinal. Por las
observaciones que se han hecho el tipo de hoja de la
Maxillaria es la lineal.
2011
32
Grfico2: Clasificacin de hojas en las orqudeas

Fuente: Mara Freuler (2008).
3.6.4. Flor.
Cuando nos referimos a
flores de orqudeas, no las
imaginamos grandes, coloridas, con labelos grandes; o, si no

grandes racimos de colores vivos, aunque debemos destacar
que las orqudeas son pequeas, de formas simtricas en sus
flores. Podemos sostener que todas las orqudeas tienen una
simetra bilateral;
si cortamos la flor de la orqudea en dos
estas son exactamente iguales, una es la copia de la otra. Las

flores de ciertas orqudeas pueden ser solo masculinas o
femeninas; por ejemplo: es el caso de las especies de
Catacetum,
dependiendo
estas pueden ser masculinas o femeninas y

del gnero de la flor, tendremos diferente
estructura en sus rganos reproductores (Jijn, et al., sf.).

En el caso de la Maxillaria, es solitaria, y su caracterstica
principal es que sus flores crecen desde la base de los
pseudobulbos. Para evitar problemas con las flores, estas
deben ser sembradas en macetas de alambre y colgadas para
asemejar a su hbitat (Banks, 2006).
2011
33
Fotografa 1: Flor de Maxillaria grandis

Fuente: Ing. Francisco Merchn B. (2010)
a) Estructura de la flor de orqudea de Maxillaria grandis.
Tiene 3 spalos; estos son ms grandes que los ptalos de
color blanco con manchas rojizas; sus ptalos son 2, son de la
misma coloracin que los spalos, pero su borde es algo
irregular. El labelo es de color amarillo, esta se encuentra
opuesta a los ptalos, y
su caracterstica
es de forma
irregular, como una mandbula, de donde proviene su nombre.

El labelo es la estructura ms importante, por ser la parte
reproductiva de la flor de Maxillaria grandis, esta estructura
est conformada por rganos femenino y masculino (Seaton,
et al., 2009).
2011
34
Fotografa 2: Estructura floral de Maxillaria grandis

b) Tipos de polinizacin y polinizadores.
Existen dos tipos de polinizacin natural y artificial.
- Proceso de polinizacin natural.
Dentro de la polinizacin natural, con la ayuda de la flor de
orqudea, que por su forma, olor, estructura, textura, fragancia,
sirve como atrayente para la gran cantidad de insectos que
participan en la polinizacin. Gracias a la estructura de las
orqudeas se puede dar la polinizacin, ya que todas poseen
un labelo modificado, como es el caso de Ophys scolopax,
cuya estructura se asemeja a una abeja, por su forma, color
y olor de abeja hembra, que le permite atraer a las abejas
machos para el proceso de polinizacin, que se conoce
tambin como pseudo-copulacin.
2011
35
Debemos recalcar que las orqudeas no solo tienen agradable

fragancia que emanan feromonas; sino existen otras que
producen
olores
desagradables,
como
el
caso
de
la
Bulbophyllum, que se da en Nueva Guinea, y tiene un olor a

carne en estado de putrefaccin; lo cual no implica que atraiga
polinizadores, si la tiene, que en este caso son moscas o
insectos carroeros.
Fotografa 3 y 4: Polinizacin natural y Polinizacin artificial

respectivamente.
Fuente: Alex Hirtzi. (2010)
El proceso de polinizacin natural es muy rpido, despus que

el insecto es atrapado por la planta, ste se posa sobre la flor
para intentar volar, que lo consigue luego de varios intentos.
Como resultado tenemos que el insecto lleva consigo una
gran cantidad de polen en su cuerpo y al posarse en otra flor,
2011
36
con la
misma estructura,
dejara el polen inoculado, en la
parte estigmtica y de esa forma tendremos la polinizacin

natural (Banks, 2006).
Este proceso se efecta tambin en la especie de Maxillaria

grandis, la cual atrae a colibrs y avispas para su polinizacin
(Dodson, 2002).
Fotografa 5: Polinizador de Maxillaria grandis

Fuente: Alex Hirtzi. (2010)
- Proceso de polinizacin artificial.

Antes del proceso de polinizacin, se recomienda identificar
correctamente la estructura de la flor, para poder polinizar y
evitar la transferencia de virus a la planta. Tener a mano los
instrumentos necesarios para el trabajo como es: pinzas de
2011
37
punta fina, un palillo, una hoja de papel, es fundamental para

garantizar este proceso (Seaton, et al., 2009).
Fotografa 6. Identificacin de las estructuras floral

Fuente: Ing. Francisco Merchn. (2009)
Las flores a polinizar deben estar frescas y con toda su
estructura. Debemos identificar la planta madre (en la cual se
va a polinizar) y la planta padre (de quien se va a obtener el
polineo)
para
lo
cual
debemos
seguir
el
siguiente
procedimiento:
1.- Debemos identificar en
la flor como es la columna, la
antera, el rstelo, y el estigma.
2011
38
Fotografa 7. Estructuras de la orqudea y eliminacin del

labelo para la polinizacin artificial.
2.- Colocar la hoja de papel para recoger si se cae el polen y
los polinios que se necesitan.
3.- Separar de la flor el capuchn que se encuentra cubriendo
al polineo, y es de fcil identificacin.
Fotografa 8.Eliminacin del capuchn para la polinizacin

artificial.
2011
39
4.- Al separar el capuchn, nos encontramos con el polinio

que es de color amarillo, el mismo que prevalece en la mayora
de orqudeas;
en algunas plantas, como es el caso de
Sophronitis cernua,es de color gris azulado, en el cual se

encuentran las anteras, que tienen en su interior el polen.
Fotografa 9 y 10. Observacin de los polinios y Extraccin de

los polinios.
5.- Al ser identificado el polinio, se recoge el polen y se lleva
hasta a la flor madre, donde ser colocado en el estigma para
su posterior fertilizacin.
2011
40
Fotografa 11. Polinizacin en la planta madre.

6.- Etiquetar y registrar correctamente la orqudea polinizada,
con el nombre de las plantas madre y padre, y fecha de
polinizacin; y en el registro que se lleva, adicionalmente,
anotaremos
la fecha de recoleccin, numero de flores
polinizadas; polinizaciones efectivas; fecha de corte, etc

(Merchn, 2010).
Cabe indicar que entre ms generoso sea la cantidad de

polinio que se coloca, ms abundante ser la cantidad de
semillas que se obtendrn al momento que se recoja la
cosecha de la cpsula.
2011
41
3.6.5. Frutos
Los frutos de las orqudeas son cpsulas dehiscentes, que se
abren cuando llegan a la madurez fisiolgica. Estas se pueden
recolectar antes de esta etapa, para su posterior siembra.
Fotografa 12. Frutos de orqudeas (capsulas dehiscentes).

En el cuadro5.- sealamos ejemplos de das en los que la

capsula posiblemente se puede abrir, por que posiblemente?,
ya que esto depende del cuidado que el investigador de al
cultivo de orqudea, como es la cantidad de suministros de
agua, luz, temperatura, las condiciones de sanidad, plagas
enfermedades, la calidad de sustrato (Merchn, 2010).
Cuadro 5. Ejemplo de das a la cosecha de capsulas verdes.
Gnero especie
2011
Das cpsula
42
verde
240
Anguloa uniflora
Bollea ecuadorensis 210

Brassia arcuifera
180
Cattleya maxima
220
Comparettia
200
speciosa
Cytochillum
220
macranthum
Epidendrum
120
secundum
Gongora
quinquenervis
120
Masdevallia rosea
120
Maxillaria rufescens
140
Fuente:
Dr.
Eduardo Snchez. (2010)
2011
43
Fotografa 13. Invernadero de donde se obtienen las capsulas

para la siembra.
Luego de la recoleccin y guardada la semilla o cpsula que
se abri, debemos proceder a la siembra, aplicando diferentes
tcnicas como la de Philip Seaton, (las cuales se la realiza
con un sobre de papel en el cual se encuentran la semilla, este
sobre ser sellado con grapas, desinfectado y sembrado)
(Snchez, 2010).
2011
44
Fotografa 14 y 15. Tcnica del sobre para la siembra de

semillas de orqudeas.
Fuente: III Curso Internacional de Cultivos In vitro y
Germoplasma de Orqudeas. (2011)
Otro mtodo es la siembra de:

- Semillas de cpsula cerrada, se realiza de la siguiente
forma:
1
2
Prender la cmara de flujo laminar.

Limpiar y atomizar con alcohol etlico comercial de 30
minutos a una hora de anticipacin a cualquier trabajo.

3
Colocar
en alcohol etlico, pinzas, bisturs, pipeta
Pasteur, invirtiendo el orden una vez, por lo menos.

Para el ambiente debemos seguir el siguiente procedimiento:
1
Limpiar las reas necrosadas.
Dejar en agua circulante por 4 a 6 horas la cpsula.
2011
45
Con un cepillo de dientes suave limpiar la cpsula
Colocar en un litro de agua, 1 gramo de detergente y de 1
a 2 gotas de tween 20 y sumergir la cpsula por 10 minutos.

5
Eliminar el detergente con 2 lavadas utilizando agua
normal.
6
Preparar alcohol etlico al 70% y colocarlo en un vaso de
precipitacin.
7
Preparar hipoclorito de sodio entre el 1 y 1.5% (Ajax cloro
de 20 a 25 cc y aforar a 100 cc con agua).

8
Colocar sobre una tapa de caja petra unas gotas de
alcohol, las pinzas, bisturs y flamear.

9
Poner en alcohol al 70% por tres minutos.
10
Con una pinza pasar a un recipiente con agua estril para
elimine el alcohol.
11
En un vaso o jeringuilla, colocar la cpsula en hipoclorito
de sodio por 10 minutos realizando de 2 a 3 succiones.

12
Eliminar el cloro en un vaso.
13
Sobre un papel estril abrir la cpsula con una pinza y
bistur.
14
Con el bistur pasar semilla a una caja petri con 1 o 2 cc
de agua.
15
Poner una a dos gotas de semillas en el medio de cultivo
usando una pipeta pasteur.

2011
46
16
En un frasco pequeo poner 1 gota de agua oxigenada y
en grandes 2 gotas.
17
Flamear el frasco y tapar.
18
Etiquetar el material con marcador resistente al alcohol o
lpiz, y no con bolgrafo: genero, especie, variedad, fecha de

siembra ao mes da, quien siembra en cdigos.
19
Colocar los frascos en el cuarto de cultivo a baja
intensidad luminosa hasta la germinacin.

20
Anotar en el registro de laboratorio: Cdigo, descripcin,
fecha de siembra, tipo de medio, nmero de siembras,

cambios de medio, contaminaciones, responsable y otros. En
el cuarto de cultivo, revisar peridicamente y anotar resultados
(Merchn, 2010).
- Siembra de cpsula abierta o semilla seca se realiza

de la siguiente manera:
Preparar
hipoclorito de sodio de 1 a 1.5 % de
concentracin.
2
Colocarlo dentro de la cmara de flujo laminar.
Poner la semilla dentro de una jeringuilla hipodrmica y
adicionar el hipoclorito de sodio, realizar la succin 3 veces, a

los 2 minutos pasar al filtro estril
2011
47
Eliminar el cloro con un chorro de agua estril.
Poner el filtro dentro de un vaso y adicionar agua, realizar
3 cambios de agua cada 3 minutos.

6
Pasar la semilla a una caja petri, adicionar agua para
poder distribuir uniformemente la semilla.

7
Seguir luego los pasos descritos en los numerales 17 a
20 referentes a preparacin del ambiente (Merchn, 2010).
3.6.6. Semillas.
Una vez efectuada la cosecha, debemos proceder a la

evaluacin de la calidad de la semilla. Este proceso se realiza
con la ayuda de un microscopio para observar las diferentes
estructuras de las semillas de las orqudeas que se han
recolectado. Se identifica la calidad, esto es por medio de la
cantidad
de
semillas
con
embriones,
los
que
deben
encontrarse completos. Es importante conocer que dentro de

la capsula se tiene porcentajes de semillas con embriones
viables, poco desarrollados o poco viables; y, por supuesto,
semillas sin embriones. Se puede proceder a realizar la prueba
de tetrazolium para verificar la viabilidad de las semillas, previo
a proceder a la siembra o al almacenamiento. (Seaton, et al.,
2009).
2011
48
Fotografa 16 y 17: Observacin de semillas a travs del

microscopio y semillas con embriones viables.
Fuente: Paola Cruz Jaramillo. (2011)
a. Cosecha y almacenamiento de la semilla.

Para proceder a la cosecha debemos tener en cuenta los das
que han transcurrido desde la siembra y por medio de
bibliografa conocer los das de
maduracin del fruto por
especies, para detectar correctamente poca de cosecha del

fruto y no perder la semilla. Para mantener la viabilidad, se
guarda deshidratada la semilla evitando que tome humedad a
-20 C de temperatura. (Seaton, et al., 2009).
2011
49
Fotografa 18: Cosecha y etiquetado de las capsulas para su

almacenamiento.
El secado de las semillas se pueden realizar de distintas
maneras: si no se tiene los diferentes productos qumicos que
se aplican dentro de grandes laboratorios, como es el cloruro
de calcio o cloruro de litio que sirven para el secado de las
semilla, se puede sustituir estos reactivos por granos de arroz
secados al horno a una temperatura de 105C; la semilla del
arroz se deben colocar en un frasco sellado por 4 a 6 das.
Proceso que se debe realizar con la semilla y el arroz, cada
vez que se quiera secar un nuevo grupo de semillas.
2011
50
Fotografa 19. Secado de semillas con granos de arroz.

En los grandes laboratorios se puede tener las siguientes
opciones para el secado de las semillas: las semillas debemos
introducirlas por 3 o 4 das en cloruro de calcio o cloruro de
litio saturado. Para reducir la humedad de las semillas de 5 a 6
% se puede utilizar cloruro de calcio a una temperatura de
20C, aunque podemos utilizar cloruro de litio que produce
mejor resultado.
Se puede utilizar diferentes tipos de gel para el secado,
recalcando que estos pueden ser perjudiciales para la salud
de quien o quienes intervienen en estos procesos; no se
recomienda utilizar slica gel azul/rosa, que actualmente ha
sido remplazado por la slica anaranjada, cuya caracterstica
2011
51
es cambiar de color a translucido, al absorber humedad.

(Seaton, et al., 2009).
Luego de haber secado las semillas se proceder al

almacenamiento,
una congelacin
a -20 C (Merchn,
2009).
Fotografa 20. Almacenamiento de las semillas de orqudeas.

b. Fuentes de semillas.
Las semillas se puede encontrar en banco germoplsmico el
cual permite obtener
semillas de muy buena calidad. Se
pueden intercambiar semillas con instituciones dedicadas al

cultivo de orqudeas como: Universidades, Jardines Botnicos,
Empresas, que cumplen con los requisitos y estndares de
calidad, como tambin mediante intercambio o compras
2011
52
podemos evitar que daen aun ms la naturaleza y el hbitat

de las orqudeas (Seaton, 2011).
Fotografa 21. Banco Germoplsmico de Inglaterra.

Fuente: Phil Seaton (2011)
3.7.
Conservacin de orqudeas
Tenemos dos tipos de conservacin: la in situ y la ex situ, que

igualmente
aplicamos a las de orqudeas (Castillo, et al.
1991).
3.7.1. In situ
Esta conservacin se basa en que las especies de orqudeas
se conserven en cada hbitat, la misma que se produce sin
perturbar su dinmica. Para este tipo de conservacin se
puede determinar varias estrategias como son: Preservar las
orqudeas de una manera integral, no alterando su hbitat,
clima y en general el medio ecolgico en el cual se desarrollan.
2011
53
Y preservando las especies silvestres en comunidades

naturales (Castillo, et al. 1991).
Fotografa 22. Bosque nativo conservacin in situ

Fuente: Phil Seaton. (2011)
3.7.2. Ex situ
Est conservacin se realiza fuera de su hbitat y altera la

dinmica de las especies,
adems de existir varias
estrategias, podemos conservar y salvar especies que estn

en peligro,
humedad
preservndolas en invernaderos, controlando

y
temperatura;
utilizando
tcnicas
como
la
conservacin de germoplasmas, que almacenan partes de las

plantas, para su estudio como son bancos de polen, bancos de
clones, banco de semillas, bancos de propagacin y
conservacin in vitro. (Castillo, et al. 1991).
En cualquiera de las dos formas descritas, podemos tener
beneficios y aportar de manera eficiente a las necesidades de
2011
54
la naturaleza, que actualmente es una necesidad para poder

sobrevivir en armona con ella.
Fotografa 23. Invernadero. Facultad de Ciencias

Agropecuarias conservacin ex situ.
3.8.
Resea histrica del cultivo de tejidos
Esta tcnica comienza con las prcticas que se producen por

heridas que se encontraron en rboles descortezados, en los
cuales se aplicaban la tcnica de injertos; al producirse una
herida en los rboles ste produca una serie de clulas no
identificadas, que actualmente conocemos como callos, y a
partir de ste experimento, se lo aplic en otras plantas. La
falta de una base cientfica para determinar el desarrollo que
2011
55
hoy se conoce como la teora celular, impide su aplicacin de

una forma adecuada (Prez, 2006).
Los primeros experimentos realizados refieren a Duhamel du

Monceauen el ao de 1756, quien aplic la teora de los
rboles descortezados, en rboles de olmo,
observando el
desarrollo de callos y yemas. Investigacin que

seguidos
fueron
y que le permiti determinar la existencia de
abultamientos denominados callos; basado en la circulacin

de la savia, procedi a efectuar injertos y sellados de las
heridas. Hoy sabemos que la formacin de callos es la
respuesta de varias plantas a las heridas (Prez, 2006).
En la poca de Trcul en el ao de 1853, realiz experimentos
basados
en los anteriores, observando por medio del
microscopio que los callos podan obtenerse a partir de

diferentes tejidos como es el cambium, floema y otros. En el
ao de 1893 Rechinger experimento con races, tallos, y
yemas que fueron colocadas en arena hmeda, para
determinar el crecimiento de cada uno de los materiales
(Prez, 2006).
Los primeros resultados obtenidos fueron conocidos como

callos, que llegaban a un lmite de 1.5 mm y no crecan mas;
2011
56
los otros materiales vegetales llegaron a un grosor de 20 mm y

comenzaron a producir ocasionalmente yemas (Prez, 2006).
Todos estos resultados, al no tener una base terica cientfica,

no sirvieron
para formular hiptesis que permitan
posibilidad de poder
la
cultivar aisladamente material vegetal.
Con el descubrimiento de la toti potencia se genera nuevas

visiones; la misma que es entendida como la capacidad que
tiene una clula para regenerarse a partir de ella. Todos los
diferentes tipos de clulas que componen un organismo
multicelular tienen esta caracterstica (Prez, 2006).
Esta teora fue dirigida por dos cientficos alemanes, el

botnico Matthias Jacob Schleiden en el ao de 1838 y el
zologo Theodor Schwann en el ao de 1985, quienes
formularon la teora por la cual dicen que las clulas son la
base de la estructura de los animales y plantas (Prez, 2006).
Para comprenderla base de la toti potencia citamos
un
ejemplo: la forma de divisin que tiene el zigoto, que este

contiene todo la informacin gentica para formar un nuevo
organismo (Prez, 2006).
2011
57
En
el
siglo
XIX
se
dio
uno
de
los
ms
grandes
descubrimientos, que cambio la visin de la mayora de los

cientficos, al descubrir que las plantas no necesariamente
pueden depender de un suelo para poder vivir; sino que lo
poda hacer fuera de l, dndose a conocer el primer cultivo
hidropnico, consistente en cultivar plantas sin suelo, a base
de
sales
minerales
que
proporcionaban
los
nutrientes
necesarios para su desarrollo (Prez, 2006).

Con esto se dieron los primeros pasos para realizar el cultivo in
vitro. En los aos posteriores se cultivaron embriones
zigticos. En 1958, Thilo Irmisch realiz un intento para
determinar
el
cultivo
aislado,
propuso
analizar
su
comportamiento frente a diferentes condiciones. Julios Sachs,

en 1859 se realiz el primer cultivo de embriones aislados de
judas en un medio artificial (Prez, 2006).
Cabe destacar que al no tener las condiciones aspticas estos

cultivos no se mantenan. Con el pasar de los tiempos se fue
perfeccionando los elementos que conforma el cultivo in vitro,
como es el medio de cultivo con todos sus componentes
minerales para que cada unos de los tipos de cultivos tengan
las condiciones adecuadas para multiplicarse adecuadamente;
2011
58
se perfeccionaron las tcnicas, condiciones adecuadas para

aislar la contaminacin del medio, etc. (Prez, 2006).
En
estos
momentos
existe
tecnologa
muy
avanzada,
conocimientos cientficos que nos permite adaptar cada unos

de los tipos de cultivos a condiciones favorables y mantener
estas plantas a salvo (Prez, 2006).
3.8.1. Infraestructura
adecuada
para
la
micropropagacin
El tratadista Roca, et al. (1991) su en obra Cultivo de Tejidos
en la Agricultura se refiere a los siguientes procesos
relacionados con las condiciones de infraestructura, tcnicas y
mtodo asptico de Micro propagacin. Nos ensea que sta
rea puede estar constituida por dos reas conectadas entres
si, o por un solo ambiente, y puede estar localizada dentro del
rea general de preparacin. El rea de esterilizado debe tener
espacio para el autoclave vertical u horizontal, el cual puede
ser pequeo (olla de presin) o grande (de carga frontal o
vertical y de enfriamiento lento o rpido),
segn sea el
volumen del material que se procese. El rea tambin puede

incluir espacio para estufa, secador destilador de vidrio,
2011
59
gradillas para secado bandejas de aluminio y de plstico de

varios tamaos y un lavador con agua caliente y fra.
a) Esterilizacin
Igualmente el tratadista, refiere que la esterilizacin es el

proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie,
este libera completamente de cualquier microorganismo vivo o
espora. Se dice que tales materiales o sitios son estriles o se
han esterilizado.
b) La desinfeccin
Roca,
et
al.
generalmente
(1991)
al
no
ensea,
proceso
de
que
sta
destruccin
se
de
limita
los
microorganismos mediante mtodos qumicos; la esterilizacin

se refiere a menudo al mtodo fsico para la destruccin de los
microorganismos. Se utiliza la palabra asptico como sinnimo
de estril.
c) Proceso de esterilizacin
Roca, et al. (1991)nos dice que es bien conocido, el xito en el
logro de esterilidad en cualquier preparacin depende de
2011
60
muchos factores, como es la naturaleza de la sustancias que

se esterilizan, el volumen contenido en cada unidad, el tamao
del recipiente y el nmero de unidades que se puede manejar
es una sola operacin. Por consiguiente, no se pueden dar
instrucciones especficas relacionadas con el mtodo de
esterilizacin que se utiliza para una preparacin individual; en
contraposicin,
se
presentan
sugerencias
generales
relacionadas con los procedimientos de esterilizacin.
d) Calor seco (estufa)
Roca, et al. (1991)nos relata que los recipientes de vidrio

secos que se utilizan para operaciones estriles se pueden
esterilizar por medio de aire caliente; para el efecto se colocan
en una estufa de aire caliente a una temperatura mnima de
170 C, preferiblemente durante dos horas, pero nunca menos
de una hora. El algodn (debidamente envasado) a menudo se
esteriliza por intervalos ms largos, ya que tiene a contener
esporas altamente resistentes; pues que tanto el algodn
como el papel toman un color marn a temperaturas de 190 C
o superiores, para este material se debe usar una temperatura
menor de
170 C, mantenindolos bajo ella por lo menos
durante un ahora. Es obvio que los materiales esterilizados

2011
61
mediante calor seco debern estar limpios, e incluso libres de

trazas de material orgnico.
e) Vapor de agua a presin (autoclave)
Roca, et al. (1991) describe que el vapor bajo presin es muy

eficiente para destruir todas las formas de bacterias y hongos y
sus esporas, y es el mtodo ms utilizado para esterilizar
diferentes materiales
(siempre
cuando
incluyendo los medios de cultivo

no
contengan
componentes
termolbiles).La autoclave ms utilizada actualmente en el

laboratorio es la contraparte de mayor tamao de la olla de
presin comn. Al utilizarlo, es necesario extraer todo el aire
antes de empezar el proceso de esterilizacin ya que, a
presiones iguales, la temperatura de una mezcla de aire y
vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extraccin de
aire se logra automticamente al permitir que el vapor expulse
el aire del aparato, antes de cerrar la vlvula correspondiente.
La temperatura dentro dela autoclave se regula mediante la
presin y es directamente proporcional a sta; la presin se
lee en un manmetro
que forma parte de autoclave. Para
esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos

se acostumbra usar una presin de 15 lb durante 20 minutos; a
2011
62
esta presin la temperatura del vapor es aproximado 121 C,

suficiente para matar virtualmente todas las formas de vida en
cinco minutos. Sin embargo se debe recalcar que el tiempo de
exposicin requerido depender tanto del tipo del material que
se va a esterilizar como de la cantidad. Si se desea que la
esterilizacin sea completa, el calor debe penetrar en cada
porcin del material; ninguna sustancia es estril si queda en
ella un organismo viable o esporas. La siguiente es una gua
para presiones variables.
10 lb de presin (115.5 C) durante 30 minutos

Para las operaciones mayores se recomienda colocar

detectores de esterilizacin en diferentes puntos dentro de la
autoclave o dentro de la masa de material que se trata, para
asegurar de que todas las partes han alcanzado la
temperatura deseada.
f) Calor hmedo a 100 C.
2011
63
Roca, et al. (1991)nos ensea que con este mtodo

probablemente sea suficiente una sola exposicin de 15
minutos al calor vivo (100 C) para matar todas las formas
vegetativas microbianas. Sin embargo, as no se mata
necesariamente todas las formas de esporas y pueden ser
prctico,
por
consiguiente,
efectuar
la
esterilizacin
intermitente, siempre y cuando se disponga de cierto equipo.

En este caso, la exposicin puede ser de 30 a 60 minutos y se
repite
diariamente
durante
tres
das
consecutivos,
conservando el material a la temperatura del cuarto o en una

incubadora entre una exposicin y otra. Tericamente la
primera exposicin destruye todas las formas microbianas;
durante las prximas 24 horas, generalmente germinan las
esporas convirtindose en formas vegetativas que mueren en
la segunda exposicin; la tercera exposicin es simplemente
un medio de prevencin para destruir las esporas vivas que
hayan podido tener una germinacin lenta. A veces el
procedimiento se modifica utilizando temperatura inferiores a la
del agua hirviendo y aumentando el nmero de las
exposiciones hasta cuando haya una seguridad razonable de
esterilidad. Se utilizan temperaturas de 60 a 80 C y se repiten
sucesivamente las exposiciones durante
4 a 7 das. Este
mtodo de calor hmedo a 100 C, conocido como mtodo de

2011
64
Koch se utiliza en la esterilizacin de medios que contienen

componentes
capaces
de
soportar
la
exposicin
temperaturas de vapor vivo, pero no a las temperaturas

mayores que tienen el vapor bajo presin. No obstante, este
mtodo no est exento de problemas; las esporas pueden no
desarrollarse en las soluciones no nutritivas como el agua
corriente, por lo cual se recomienda reemplazarlo, cuando sea
posible, por el mtodo de filtracin; sin embargo se menciona,
incluso en este caso, como una alternativa cuando no se
dispone de las instalaciones o medios para esterilizar por
filtracin. En trminos generales, los medios para el cultivo de
tejidos de plantas son bastante ricos en componentes que
pueden servir de sustento a los microorganismos y existen la
posibilidad de que los contaminantes aparezcan durante los
intervalos sucesivos.
g) Filtracin
Indica que la esterilizacin de lquidos va acompaada

rutinariamente de la filtracin a travs de filtros especiales a
prueba de hongos y bacterias. Es claro que los filtros y otros
aparatos se deben esterilizar antes de tratar de utilizarlos para
remover los contaminantes de un lquido. Obviamente el
tamao de poros es el principal factor en la capacidad de
2011
65
retencin de bacterias de estos filtros; otros factores que

afectan la penetrabilidad del filtro por los microorganismos son
el pH, la carga elctrica del material filtrado, la temperatura, la
presin y la duracin del procedimiento de filtracin como el
efecto de la absorcin de protenas y otras sustancias en el
filtro; tambin puede haber contaminacin en el filtro a causa
de una presin excesiva en el filtro o de fugas de las lneas al
vaci cuando se utiliza presin negativa. En el mercado se
encuentra una amplia gama de aparatos de filtracin entre los
cuales est el Millipore. Se encuentra disponibilidad adems
los filtros desechables que, aunque costosos, pueden ahorrar
tiempo y son pre-esterilizados.
h) Limpieza de los recipientes de vidrio
Roca, et al. (1991) explica que la limpieza de los recipientes de

vidrios y otros utensilios es de importancia vital en el trabajo de
cultivos de tejidos vegetales. Nunca se debe utilizar jabn
debido a que este deja residuos grasos y puede ser uno de los
contaminantes; cuando sea posible, se deben adoptar
detergentes que se laven y enjuaguen fcilmente. Se debe
utilizar agua caliente con el detergente, enjaguar con agua
caliente sola, hacerlos despus con agua desionizada y
2011
66
finalmente con agua destilada. Bajo circunstancias especiales

pueden ser necesarios exponer los recipientes de vidrio a
soluciones limpiadoras de cido crmico, durante varias horas.
Pero es necesario reconocer que sera imposible remover los
iones de cromato residuales y que estos a su vez seran
dainos o txicos para las clulas y tejidos de las plntulas.
Adicionalmente, las soluciones limpiadoras son peligrosas y se
deben utilizar con cautela para evitar quemaduras y problemas
de contaminacin ambiental. Los residuos de iones de cromo
se podra remover lavando con detergente, pero el proceso de
limpieza se volvera a ms intensivo en el uso de recursos
humanos. Tambin existen soluciones inorgnicas para el
lavado, las cuales son tan efectivas como las soluciones de
cido crmico y, a diferencia de ellas, se dice que son inocuas
para el medio ambiental.
3.9.
Cultivo de tejidos in vitro
El cultivo in vitro, es un proceso complicado que requiere

condiciones para su cultivo; manifestando que el termino in
vitro proviene de los primeros experimentos que se realizaron
en vidrio, ya que en esa poca se sembraba el material vegetal
en matraces, tubos de ensayos, y erlenmeyers. El cultivo de
2011
67
tejidos in vitro se basa en el cultivar, rganos, tejidos, clulas,

embriones, y requiere de dos condiciones: la primera, controlar
el ambiente
en condiciones aspticas (eliminacin de
microorganismo del lugar que se va a trabajar) para evitar

problemas posteriores como la contaminacin de hongos,
virus; la segunda, es determinar un medio nutritivo con las
diferentes dosis de macro y micro elementos adecuados para
sustituir los minerales que requiere la planta y que absorba
del suelo (Prez, 2006).
Fotografa 24. Instrumentos que se necesitan en el laboratorio

de cultivo de tejidos.
Fuente. Paola Cruz. (2011)
2011
68
3.9.1. Importancia del cultivo de tejidos in vitro
Las tcnicas que se utilizan dentro del el cultivo in vitro son

muy importantes; y actuando en interrelacin
con otras
ciencias como la ingeniera gentica, ingeniera molecular, etc,

podemos multiplicar gran cantidad de plntulas que en la
naturaleza es muy difcil propagar e identificar; por esa razn
requerimos de ellas y la tecnologa adecuada para realizar el
trabajo que nos propone estas tcnicas, como es identificar por
medio de ADN o propagar especies que estn en peligro de
extincin en el laboratorio; igualmente podemos producir
sustancias de inters farmacolgico
o alimentario, para
proveer a una sociedad de consumo que requiere de los

mismos para subsistir.
Por todas estas consideraciones, es importante contar con

instalaciones adecuadas y laboratorios en los cuales se debe
estar equipados con la ms alta tecnologa; y aplicando todos
los conocimientos cientficos que los diferentes tratadistas nos
han legado,
poner en prctica la mircopropagacin de
orqudeas, especialmente para salvar la biodiversidad en

nuestro pas, ya que es muy extensa (Prez, 2006).
2011
69
3.9.2. Tipos de cultivos in vitro

El tratadista Prez, (2006) en su obra Cultivos de tejidos in
vitro nos ensea que los diferentes tipos de cultivos que se
dan in vitro son:
Cultivo de callos.
Cultivo de clulas en suspensin.
Cultivo de protoplastos.
Cultivo fotoautotrpicos
Cultivo de rganos
Dentro del cultivo de rganos se presenta la siguiente

clasificacin:
- Cultivo de meristemos
- Cultivos de yemas, segmentos nodales
- Cultivo de anteras y polen aislados
- Cultivo de flores, ovarios y vulos
- Cultivos de embriones zigticos
- Cultivos de embriones somticos
De esta clasificacin centraremos nuestro estudio en el cultivo
de meristemos.
2011
70
3.9.3. Cultivo de meristemos
Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de

meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y
1957, a partir de cultivos de papa y Dalia, segn refiere el
tratadista (Rivero, 2007.)
El tratadista Roca, en su obra antes referida, manifiesta que

en el ao 1960, se desarroll los procedimientos para
multiplicar y mantener plantas en cultivos aspticos, perodo
de tiempo en el cual recibi este procedimiento, un impulso
dramtico; ello se debi al descubrimiento de la capacidad que
tiene las puntas de los brotes y los meristemos de las
orqudeas
Cymbydium
sp.
cortados
apropiadamente
sembrados en cultivos aspticos, para producir protuberancias

que semejan protocormos normales capaces de crecer y
desarrollarse en plntulas.
Desde entonces se han usado los cultivos de puntas de brotes

y de meristemos de muchas otras plantas para obtener,
mantener y multiplicar los materiales genticos; de una punta
de brote
cultivado o de
explante, en algunos casos, se

2011
71
regenera una planta y en otros casos se puede estimular la

formacin de brotes mltiples (Prez, 2006).
Se han realizado cultivos de meristemos, como es en el caso

de banano, y como primer paso debemos realizar una buena
extraccin y en forma inmediata proceder a
identificar
correctamente el pseudotronco de la planta de banano; como

segundo paso, se procede a separar el cormo de la planta, y
se comenzar a realizar los cortes hasta identificar la parte
apical en donde se encuentra el meristemo, luego se corta el
meristemo y se siembra. Este meristemo es de 5 mm, aunque
contiene primordios foliares, con estas dimensiones, si
queremos tener plantas sin virus se tendr que extraer
correctamente el meristemo (Prez, 2006).
En el caso de las orqudeas, es ms complejo la extraccin del

meristemo, ya que se comienza a partir de la germinacin de la
semilla y brotes en desarrollo, posteriormente se identifica y se
procede a la eliminacin de hojas para encontrar la parte
apical y reconocer al meristemo; al extraer el meristemo se
siembra y hay que esperar que el medio sea el adecuado para
obtener resultado positivo.
2011
72
Para que esta tcnica tenga mayor resultado, debemos

considerar otros aspectos para conseguir los objetivos
planteados en este campo, como es la aplicacin de la
termoterapia o la quimioterapia o en combinacin termoterapia
y cultivo de meristemos.
Fotografa 25. El meristemo

Fuente: Paola Cruz (2011)
a. El meristemo.
Son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la

capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una
planta. Los meristemos determinan el crecimiento de la planta
y dan origen a sus diferentes rganos. El cultivo de
2011
73
meristemos facilita la eliminacin de patgenos. El domo

meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se
traslocan por los tejidos de conduccin) por lo cual se utiliza
para obtener plantas libres de virus. La velocidad de divisin
celular a nivel del meristemo es mayor que la velocidad de
replicacin de un virus por esta razn podemos obtener
plantas sin virus (Prez, 2006).
El tratadista Rivero, nos ensea quela estructuracin de los

meristemos est conformada de la siguiente manera: al
momento de su extraccin debemos localizar la pared
primaria,
que
isodiamtrica
generalmente
y
con
gran
se
presenta
actividad
de
forma
mittica;
luego
determinamos la presencia del ncleo, que se localiza en la

parte central, en donde encontramos vacuolas y citoplasma.
Los meristemos siempre estn en constante divisin por esta
razn tenemos gran cantidad de meristemos que se pueden
ver durante la citocinesis (Prez, 2006).
b. Divisin dentro de los meristemos
Existen tres divisiones dentro de los meristemos: una divisin

anticlinal (es la divisin transversal); divisin periclinal (es la
2011
74
divisin longitudinal); y la divisin oblicua (como su palabra lo

dice oblicua o diagonal); esta divisin nos permite conocer que
estructuras van a originar posteriormente; las mismas que
pueden ser primordio o tallos. El meristemo apical es ms
complejo, el cual consta de una tnica, en las angiospermas, la
tnica del meristemo est conformado por dos capas celulares;
y,
a su vez, la suma de varias capas de clulas se las
denomina capas L1 (capa externa), L2 (capa interna), L3 (esta

capa se denomina corpus, en esta capa hay varias divisiones
especficamente las tres anteriores descritas), Luego podemos
observar los primordios que son estructuras que cubren al
meristemo apical, cuyo dimetro es de 0.1 a 0.2 mm y un
altura de 0.1 a 0.5 mm. (Prez, 2006).
c. Zonas de segmentacin del meristemo
As, como se encuentran divisiones en los meristemos,

tambin tenemos zonas en las cuales se desarrollan
segmentaciones importantes que son:
La zona ZC., que se distingue por tener clulas de mayor

tamao que el resto de las clulas del meristemo y se dividen
con menos frecuencia que las otras clulas. Estas clulas se
2011
75
denominan inciales y producen las clulas que formarn las

otras zonas denominadas derivadas de las inciales.
La zona ZP., dispone de alrededor de ZC y est formada por
cellas en rpido divisin, que formarn los primordios foliares y
otros
rganos
laterales
que
puedan
generarse
en
el
meristemo.
La zona ZM., Situada por debajo de las otras zonas, esta
tambin constituida, al igual que la ZP, por clulas con alta
actividad mittica. Las funciones principales de esta zona son,
formar los tejidos de la zona central del tallo y los tejidos
vasculares. Por debajo de la zona meristemtica, se encuentra
una zona de maduracin.
A medida de que nos alejamos del meristemo, podemos

observar que las clulas dejan de dividirse y comienzan a
diferenciarse. Eso trae consigo la formacin de la pared
secundaria, la elongacin celular, la aparicin de una gran
vacuola que relega el ncleo a la periferia. (Prez, 2006).
3.10.
Sanidad
La mayor amenaza para las orqudeas son los virus, que

afectan a los gneros ms populares. Debilitan a las plantas y
suelen producir hojas con malformaciones, en ocasiones con
2011
76
fallos en los colores. Las hojas muestran un moteado por

ambos lados, o bien se distinguen un claro motivo con forma
de diamante. Por desgracia, no existen remedios para las
plantas infectadas, que deben eliminarse. Existen numerosas
cepas que son propagadas por caros, cochinilla, fidos y
otros insectos chupadores y masticadores. (Banks, 2006).
Fotografa 26. Problemas virales en las plantas de orqudeas.

Fuente: Paola Cruz. (2010)
3.10.1. Los Virus
La infeccin vrica puede matar a una clula; los virus son,

como mnimo, una carga para su husped. Todos los
organismos son susceptibles a la infeccin vrica, y segn una
estimacin conservativa, existe 10clases de virus diferentes.
La ubicuidad, la variedad y la destructibilidad de los virus han
2011
77
motivado el estudio de su reproduccin (Ringo, 2004). Uno de

los virus ms conocidos y ms dainos es el virus del mosaico
de Cymbidium y el punto de anillo de Odontoglosum (Banks,
2006).
3.10.2. La termoterapia o tratamiento trmico
Consiste en elevar o bajar la temperatura para inactivar los

virus de plantas enteras, rganos, tejidos, o meritemos.
Cuando los virus son excesivamente dainos, es preferible
utilizar temperaturas altas, pero no solo se le utiliza para
eliminacin de virus, sino tambin para eliminar bacterias y
micoplasmas. (Prez, 2006). En el Cuadro 6 podemos
observar unos ejemplos de la inactivacin viral, el tiempo
requerido y a que temperatura fue expuesto.
Cuadro 6. Tipos de virus y sus das de irradiacin.

40 C, 7 das
irradicacin
de
Aimv
40 C, 9 das
irradicacin de Cmv
32 C, 16 a 168 das Virus detectados

32 C, 46 a 48 das
Erradicacin
2011
de
78
virus
Fuente: Walkey, 1976.
3.10.3. La quimioterapia
Es la aplicacin de productos qumicos al medio de cultivo, lo

que ocasiona una mayor probabilidad de obtener plantas libres
de patgenos, por cuando se aplican diferentes productos
quimioteraputicos de manera exgena al medio de cultivo,
estamos asegurando la obtencin de material sano(Rivero,
2007).
Despus de investigaciones realizadas se detectaron pocos

antivirales, pero su precio es elevado, y adicionalmente se
debemos detectar el virus para aislarlo y aplicar la dosis
exacta. Los compuestos ms usados son el Virazole (tambin
denominado ribavirina) y Vidarabina; para utilizar estos
qumicos se debe identificar si la planta o el material vegetal
est contaminado con virus, y al tener los resultado se procede
a colocar por ejemplo el Virazole a una concentracin de 35
mg/l; esta dosis es como ejemplo (Prez, 2006).
2011
79
Se deben realizar ensayos con diferentes dosis y con un

parmetro de virus en una determinada planta. Al hacer el
experimento se debe realizar prueba para detectar virus, ya
para subir la dosis o eliminar las plantas por toxicidad (Prez,
2006).
3.11.
Tcnicas del cultivo in vitro
3.11.1. Determinaciones
Dentro de la cmara de crecimiento nos encontramos con una

gama de efectos fsicos que necesitan los ex plantes para
sobrevivir, y ayudan a mantener las condiciones adecuadas
para tener xito en el presente trabajo. Estos factores son
determinantes, ya que al no tener controlados, podemos
perder aos de investigacin.
Los factores fsicos que se necesita son:
a) Temperatura:
Para determinar correctamente debemos tener en cuenta la

procedencia de cada uno de los ex plantes y plantas que se
producen in vitro y provienen de los trpicos; quienes
necesitan una mayor cantidad de temperatura para su
2011
80
desarrollo y crecimiento el rango se encuentra entre los 28 y

29 C;
para material vegetal proveniente de temperaturas
bajas o que contengan bulbos es necesario tener una

temperatura de 18 C, pero en la mayora de laboratorios se
tiene una temperatura promedio de 24-25 C. (Prez, 2006).
Fotografa 27. Instrumentos de control, de temperaturas en el

laboratorio de tejidos.
b) Intensidad de luz.
La luz es uno de los factores ms importantes, ya que de ste

depende el desarrollo y el crecimiento de cada uno de los
explantes la luz afecta de 3 maneras diferentes dentro del
experimento.
2011
81
Como fuente de energa para la fotosntesis.
Como fuente de calor.
Como fuente para el desarrollo de plantas y esto nos
conduce a los procesos de foto morfognesis.
Para mantener cada una de estas condiciones, lo ms

recomendable es tener energa artificial por medio de lmparas
fluorescentes de color blanca; estas pueden colocarse de
manera lateral o en la parte superior de donde se encuentran
los frascos o tubos de ensayo. La localizacin de las lmparas
fluorescentes
depende
del
criterio
que
tenga
cada
investigador. Debemos manifestar que no solo depende de la

luz el crecimiento de los ex plantes; debemos tener en cuenta
el tipo de tapa y el recipiente a utilizar, como pueden ser de
vidrio o plstico, ya que esto ayudara a definir correctamente la
intensidad de luz necesaria e incluso la posicin de los tubos
fluorescentes (Prez, 2006).
2011
82
Fotografa 28. Intensidad lumnica.

Dentro de la luz tenemos tres aspectos que son:
El fotoperiodo
La Irradiacin
Composicin espectral
Estos tres aspectos nos ayudaran a determinar mejor las

condiciones que se necesitan para tener un excelente cuarto
de crecimiento (Prez, 2006).
- El fotoperiodo
Es bsicamente la cantidad de horas luz y oscuridad que

recibe el explante por ejemplo tenemos que para cultivos in
2011
83
vitro se utiliza, 12 horas de luz / 12 horas de oscuridad o 16

horas de luz / 8 horas de oscuridad. Para tener mejores
referencias de qu cantidad de luz y oscuridad necesita cada
unos de los experimentos es necesario realizar prcticas con
estos
parmetros
as
determinar
correctamente
las
necesidades para cada uno de los experimentos ya que no

todos son iguales por ejemplo en explantes de melocotn se
trabajan con 4 horas de luz 2 horas de oscuridad con este
fotoperiodo de luz determinaron crecimientos de tallos
significativamente. En el caso de las orqudeas se necesita
determinar correctamente el fotoperiodo, ya que estas pueden
ser extremadamente sensibles a la longitud luz, estos casos se
encuentran en semillas dentro de la cmara de crecimiento.
Para una mayor agilidad de trabajo se puede determinar un
rango
estndar
que
sirva
para todo los
trabajos
de
investigacin que se encuentren en la cmara, lo cual nos

ayudar a ahorrar una mayor cantidad de energa y podremos
dar adecuadamente la luz necesaria que necesita un
investigador (Prez, 2006).
- La irradiacin
2011
84
Es simplemente la cantidad de luz que fluye a travs
de
fotones que inciden sobre una superficie a un determinado

tiempo (Prez, 2006).
- La composicin espectral
Es la coloracin de cada una de las lmparas que irradian la

luz para toda la cmara de cultivo. Normalmente se utilizan
lmparas de luz roja-anaranjada pero los mejores resultados
se han observado al ocupar lmparas de sodio, hay tambin
lmpara que irradian luz (LED) la cual se trata de tipos de luz
de color azul, roja o roja lejana estas lmparas puede ahorrar
energa. (Prez, 2006)
Estos diodos son de costo bajo, ocupan un volumen pequeo,

tienen larga vida y podran ser una alternativa prctica a los
sistemas convencionales. Las investigaciones con cultivos
sometidos a luz de diferentes longitudes de onda ponen de
manifiesto los resultados sobre la Fisiologa de las plantas que
han notorio que la luz no solo es solo fundamental para la
realizacin de la fotosntesis o como fuente de calor sino que
adems,
juega
un
papel
importante
como
Factor
de
reguladores de crecimiento y desarrollo vegetal. (Prez, 2006).

2011
85
En diversas especies la luz roja (600 nanometros) promueve

la formacin de yemas adventicias y en ciertos casos, tambin
races adventicias. Estos efectos son producidos por el
Fitocromo. En el caso de la luz azul la mejor para estimular el
crecimiento en algunos sistemas. Los foto receptores de luz
azul, se denomina
criptocromos, conocindose hasta el
presente, dos molculas de este tipo en las plantas. La luz

blanca (poli cromtica) generalmente es mejor para la
formacin
de
tallos
adventicios
pero
puede
inhibir
el
crecimiento de races adventicias. (Prez, 2006).
3.12.
Vitrificacin o Hiperhidricidad
El trmino vitrificacin, hasta hace algn tiempo atrs, se

refera a una enfermedad bioqumica que actualmente
conocemos como hiperhidricidad; y se le conoce como
vitrificacin al proceso que involucra la transformacin de la
fase liquida de las clulas y tejidos vivos en una fase vtrea o
amorfa, como consecuencia de la sustitucin del agua de
dichos tejidos, por ciertas sustancias crioprotectoras. Esto
impide la formacin de grandes cristales de hielo evitando as,
el dao por congelacin.
2011
86
La hiperhidricidad
que se define, como un conjunto de
sntomas fisiolgicos, morfolgicos, anatmicos y ambientales,

que pueden aparecer en cultivos in vitro o en
plantas
procedentes de cultivos in vitro, como consecuencias de

ciertas condiciones del cultivo. Esta enfermedad, es un
problema grave dentro de la Micropropagacin,
ya que se
pierde el 60% de las vitro-plantas producidas dentro del

laboratorio; y por cuanto estos datos son elevados, deberemos
tomar muy en cuenta esta enfermedad al momento de realizar
un protocolo de trabajo dentro del laboratorio.
Los primeros sntomas que presentan en las plantas son: hojas

y tallos con aspectos translcidos, plantas ms gruesas en
sus tallos (se debe a problemas en la mdula y clulas
corticales); se encuentra una elongacin, y se rompen con
facilidad en referencia a las plantas normales. Al avanzar esta
enfermedad podemos constatar las malformaciones e incluso
deficiencias de clorofila, esto se produce por problemas en las
granas y estomas (estos pueden estar tapados por depsitos
de calosa), y esto se verifica en los tejidos.
Causa probable para la presencia de esta enfermedad, es los

altos niveles de etileno, causado por el estrs que tienen los
2011
87
explantes al momento de ser sembrados en in vitro, o

encontrarse en un medio liquido, tener condensaciones dentro
del recipiente, y en especial la alta humedad relativa. La
presencia de hipolignificacin, es el resultado de los bajos
niveles de compuestos fenlicos, alteracin en la activad
enzimtica y desordenes metablicos (esto se da por estrs
oxidativo, anoxia, deficiencia en ciertos elementos minerales,
alteraciones en la peroxidasas, y cambio en la poliaminas)
(Prez, 2006).
Estos sntomas se resumen en cuatro aspectos principales:
Elevada transpiracin.
Escaso crecimiento.
Baja tasa de multiplicacin enraizamiento y aclimatacin.
Facilidad para adquirir enfermedades.
Otra causa de este problema, es el medio de cultivo, cuando

tiene ciertas caractersticas:
3.12.1. Consistencia
del
medio
productora
de
vitrificacin
2011
88
Que depende de la concentracin y tipo de agar que se utilice,

cuando ms baja es la concentracin de agar, ms
posibilidades de tener plantas con hiperhidricidad, en la
propagacin de explantes.
3.12.2. Sistema de doble fase
Que consiste en colocar sobre el medio de cultivo solido un

medio de cultivo lquido, el cual acelera la enfermedad.
3.12.3. Concentracin
tipos
de
reguladores
de
crecimiento
Cuya importancia radica en su utilidad dentro del laboratorio,

donde se trabaja con diferentes dosis de citoquininas y
auxinas/citoquininas; y al tener altas concentraciones y utilizar
Phitagle, puede activar la enfermedad, por lo cual se deben ser
dosificadas con cuidado para cada micropopagacin que se
vaya a realizar. Esta enfermedad podemos evitar si tomamos
en cuenta las recomendaciones efectuadas, especialmente si
se complementan con la utilizacin de recipientes dentro del
laboratorio, ya que si estos no permiten el intercambio de
gases se producir un aumento en el contenido de agua,
2011
89
etileno y dixido de carbono en el interior del recipiente

favoreciendo la precipitacin de la enfermedad. (Prez, 2006).
3.12.4. Humedad
Dentro de la cmara necesitamos una humedad entre 50 60
%, por su importancia debido a que el momento que suben los
niveles de ste podemos tener problemas crticos que se
producen
normalmente
en
el
laboratorio
como
es
la
contaminacin de bacterias, hongos etc. La humedad es alta

en el interior de cada uno de los frascos, lo que puede producir
deformaciones en el material como es el dao de hojas; se
puede
producir
deshidratacin
por
la
supresin
de
transpiracin que se encuentran en los frascos; al presentarse

estos problemas podemos tener deficiencia en Ca, por lo cual
se debe tener tapas adecuadas para intercambiar los gases
que se encuentran en el interior con el exterior (Prez, 2006).
2011
90
Fotografa 29: Efectos de la humedad sobre los explantes de

orqudeas
Fuete: Paola Cruz. (2010)
3.12.5. Recipientes
Los recipientes que se utilizan dentro del laboratorio son de

acuerdo a las necesidades del experimento que se van a
realizar, por ejemplo, los tubos de ensayos los podemos
utilizar no solo con medio slido, sino tambin con medio
lquido para siembra de meristemos; igual podemos utilizar
cajas petri para siembras de semillas de orqudeas con el
mtodo del sobre de Phil Seaton, elermeyer; con medio lquido
para siembra de meristemos, yemas, brotes, se recurre a los
frasco para siembra de semillas de orqudeas, cuando se
quiere producir una gran cantidad de explantes, ya que en los
frascos se tiene la capacidad requerida. Los recipientes deben
ser adecuados para autoclavado (Prez, 2006).
2011
91
Fotografa 30 y 31. Recipientes utilizados para el laboratorio.

Fuente: Ing. Francisco Merchn B.(2009)
3.13.
Asepsia y esterilizacin del material vegetal
Para obtener un buen cultivo in vitro, se requiere de

condiciones aspticas necesarias, no solo es en la limpieza del
rea del laboratorio, sino tambin en la desinfeccin de los
explantes.
Debemos desinfectar el material vegetal con el que se va a

realizar
el
experimento,
ya
que
en
el
campo
existe
contaminacin superficial, por el medio en que se desarrolla y

por las condiciones en las que se encuentran. Para la
desinfeccin de los explantes, se puede utilizar detergente
(limpieza de zonas grasosas), cloro (desinfeccin completa de
hongos). (Prez, 2006).
2011
92
Fotografa 32. Eliminacin de residuos del material vegetal.

El aire, uno de los factores que debemos cuidar para evitar la
contaminacin; en el ambiente encontramos microorganismos
para desinfectarlo; debiendo tener en cuenta las lmparas de
luz ultravioleta, para esterilizar el ambiente del cuarto; y para la
manipulacin del material se necesita una cmara de flujo
lamina; se recomienda verificar constantemente los filtros que
mantienen el aire limpio, de esa manera contrarrestamos los
efectos de la contaminacin. (Guachizaca, 2011).
Debemos tener presente las siguientes recomendaciones para

la esterilizacin:
2011
93
Para la esterilizacin del medio de cultivo, tener en cuenta los

componentes del mismo, ya que pueden ser termolbiles, y la
mayora de medios se esterilizan en autoclave.
Los instrumentos como por ejemplo, pinzas largas, pinzas
cortas de diferentes puntas, mangos de bisturs, cajas petri,
papel,
frascos,
para
cada
experimento
deben
ser
esterilizados, ya sea en seco a 180 C, por dos horas, o en

hmedo a 121 C por 20 minutos. (Guachizaca, 2011).
Fotografa 33 y 34. Eliminacin de patgenos por medio de

luz ultravioleta y Tipo de Autoclave
Fuente: Ing. Francisco Merchn Ing. Ivn Guachizaca. (2011)
3.14.
Medio de cultivo.
Es la combinacin slida o liquida de nutrientes y agua, que

usualmente incluye sales inorgnicas, carbohidratos, vitaminas
y aminocidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede
ser suplemento con algn regulador de crecimiento y
2011
94
ocasionalmente con otras
sustancias. Los nutrientes son
esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta, sin

agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir.
Tambin se aaden azucares al medio de cultivo, ya que las
plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotrficas,
cuando
se
desarrollan
en
condiciones
in
vitro.
Los
requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro ptimo

varan con la especie, e incluso son especficos de acuerdo a
la parte de la planta que se est cultivando y a la respuesta
que se desea obtener. Debido a estas condiciones especficas
se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de
cultivos. (Penacho, et al. sf).
El tratadista Hartmann, T. et al,. (1968) nos dice: que adems
que los nutrientes requeridos en el medio de cultivo varan con
la clase de plantas y con el propsito del cultivo. Las
sustancias necesarias pueden agruparse de modo conveniente
en varias categoras.
Fotografa 35. Medio de cultivo para cultivar en in vitro

2011
95

3.14.1. Tipos de medio de cultivos
a) Medio slido: Este medio se lo puede utilizar para la

siembra de, semillas de orqudeas, trasplantes, repiques,
cultivo de callos, regeneracin de plantas, cultivo de
meristemos, etc.
b) Semi-lquido. -Este medio se utiliza para el cultivo de
antera de arroz, crecimientos de callos de Stylosanthes
guianensis, etc. (Prez, 2006).
Fotografa 36. Medios de Cultivo slidos

c) Lquido: Este medio se usa usualmente cuando se
necesita tener en agitacin constante para tener un mayor
rendimiento en crecimiento y desarrollo, como por
ejemplo, en cultivo de protoplastos, cultivo de meristemos
2011
96
si no se va a cambiar constantemente al material vegetal

(Prez, 2006).
Fotografa 37: Medio lquido.

3.14.2. Medios definidos
Como su palabra lo dice ya estn determinados con sus

exactas dosis de
macro y micro, elementos para cada
requerimiento de los experimentos; dentro de estos medios

tenemos los siguientes:
- Murashige y Skoog,
- Phytamax,
- Schenk y Hildebrandt,
2011
97
- Loyd y Mc Cown,
Woody Plant Medium, este medio es utilizado para
plantas leosas.
Cada uno de estos medios se encuentra con facilidad en el

mercado. (Prez, 2006).
Cuadro 7. Formulacin de medios de cultivos definidos.
Concentraciones en mg/l
SALES
P 6793
100%
INORGANICAS
Clorhidrato
Nitrato de
825.0
de
aluminio
Sulfato de
amonio
Acido brico 3.1
amonio
Clorhidrato
166.0
Nitrato de
de
calcio
Clorhidrato
0.0125
calcio
4H2O
Sulfato
0.0125
de
cobalto
Aci de Na,
37.24
cprico
5H2O
Citrato
frrico
6H2O
2H2O
Sulfato
27.85
Magnesium
90.35
(EDTA)
ferrosos
Sulfato de
8.45
sulfate
Trixido
de
7H2O
magnesio
Molybdicacid
0.125
Anhytrate
molibdeno
H2O
Clorhidrato
(sodium salt
Clorhidrato
de
nquel
2H2O)
Potassium
0.415
de
potasio
Nitrato
de
950.0
6H2O
Iodide
Fosfato de
85.0
potasio
Nitrato de
potasio
Sulfato de
5.3
sodio
monobsico
zinc 7H2O
35%
K 4003
100%
35%
M 8280
100% 35%
L 0270
100%
35%
0.05611 0.0196385
288.75
1.085
58.1
500.0
0.056
175.0
0.0196
694.4
243.04
6.2
2.17
332.2 116.27
1000.0
1.014
350.0
0.3549
347.2
121.52
0.004375
0.004375 0.0624
13.034
0.025 0.00875
0.02184 0.025 0.00875 0.019
0.00665
37.3 13.055
4.4
1.54
97.475 25.0
8.75
27.8 9.73
316.225 122.125 427.437 180.7 63.245 58.62
20.517
29.575 5.682
1.9889
16.9 5.915
0.0515 0.018025
0.016
0.0056
0.04375
0.25 0.0875
0.14525
332.5
29.75
250.0
87.5
1.855
0.1158
0.331
2011
0.83
1900
170
1751
8.6
0.2905
665
59.5
612.85
3.01
0.03116 0.010906
1050.0 367.5
0.099
0.03465
135.0
47.25
0.565
0.19775
98
ORGANICOS
Agar
6,5
Myo-inositol
100
Nicotinic acid
0,5
Peptone
2000.0 2000.0
(free
acid)
Pyridoxine
0,5
Sucrose
7000
HCl
Thiamine HCl
1
6,5
100
0,5
2000.0
0,5
7000.00
1
6,5
100
0,5
2000.0
0,5
7000.00
1
6,5
100
0,5
2000.0
0,5
7000.00
1
Fuente: Plant tissue culture. SIGMA p 74, 75
3.14.3. Medios indefinidos.
Dentro de esta clase tenemos el medio casero, el cual no est

determinado correctamente y se puede dar uso de las
dosificaciones de acuerdo a las necesidades del experimento
(Merchn, 2010).
a) Ingredientes para la realizacin del medio casero.
- Maicena 80 g
- Banano maduro 100 g
- Tomate cherry 5 o 100 g de tomates
- Agua de coco 50 cc
- Carbn activado 1 g o carbn vegetal molido
- Azcar 15 g
2011
99
- Fertilizantes 20 20 20 y 30 10 10 1 g de c/u. (Merchn,

2010).
b) Proceso de preparacin del medio casero:
- Cocine por 15 minutos en 400 cc de agua el tomate y

guineo.
- Licue y tamice la mezcla anterior.
- Cocine por 5 minutos la maicena.
- Ponga todos los ingredientes en un recipiente (Agua de
coco, carbn activado, azcar y el fertilizante con sus
respectivas dosis) y afore a 1 litro. Homogenice o licue.
- Ponga en los frascos de 30 a 40 cc de medio.
- Ajuste el pH con cinta para pH.
- Esterilizar en: Autoclave, Olla de presin a 15 libras por
presin al cuadrado lb/p2 por 15 minutos o en microondas
(Merchn, 2010).
3.14.4. Componentes del medio de cultivo.
Los componentes bsicos del medio se determinan de la

siguiente manera.
- Macro-elementos.
2011
100
- Micro-elementos.
- Sales minerales.
Otro de los elementos bsicos es el agua, este elemento no

se toma mucho en cuenta, pero es de gran importancia, ya que
este aporta los beneficios suficientes para elaborar el medio de
cultivo. Se recomienda utilizar agua destilada para la
realizacin y evitar problemas con el pH. (Prez, 2006).
a) Macro-elementos.
Son sustancias que las plantas necesitan en gran cantidad
para su desarrollo como por ejemplo:
Nitrgeno.
Influye directamente en el crecimiento de la planta, elemento

esencial para formacin de protenas, clorofila, amino cidos.
Fuente: nitrato de amonio (NH4NO3) sulfato de amonio
(NH4)2SO4
Deficiencia: hojas clorticas poco crecimiento
Exceso: crecimiento vigoroso de hojas color verde muy intenso
(Vaca, 2011).
2011
101
Fsforo.
Abundante en tejidos meristemticos. Constituyente de ADN y

ATP es esencial para la fotosntesis y tiene efecto en la
maduracin de las races.
Fuente: fosfato de potasio (KH2PO4)
fosfato de sodio
(NaH2PO4.H2O)
Deficiencia: enanismo y malformaciones en las hojas (Vaca,
2011).
Potasio.
Necesario para la divisin celular y promueve el crecimiento

meristemtico. Ayuda la sntesis de protenas, clorofila y
reduce nitratos.
Fuente: nitrato de potasio KNO3 fosfato de potasio KH2PO4
Deficiencia: plantas anormales con hojas con pecas enrolladas
o de filos muertos (Vaca, 2011.
Calcio.
Componente de la pared celular controla y facilita el
movimiento de carbohidratos y amino cidos por la planta y
2011
102
promueve el desarrollo de races. Ayuda en la asimilacin de

nitrgeno.
Fuente: nitrato de calcio Ca (NO3)2. H2O Cloruro de calcio
CaCl2.2H2O
Deficiencia: muerte de brotes o races. Brotes blanco (Vaca,
2011).
Hierro.
Sntesis de clorofila y en la respiracin
Fuente: Sulfato de hierro PeSO4.7H2O (mescla frecuentemente
con Na2EDTA)
Deficiencia: hojas jvenes clorticas
entre las venas poco
crecimiento
Exceso: crecimiento vigoroso de hojas color verde muy intenso
(Vaca, 2011).
Magnesio.
Elemento central de la
molcula de clorofila, importante
activador enzimtico
Fuente: Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O
Deficiencia: hojas maduras amarillentas rojizas (Vaca, 2011).
Azufre.
2011
103
Constituyente
de algunas protenas ayuda a la coloracin
verde de las hojas.

Fuente: complemento de otras sales sulfatos.
Deficiencia: Crecimiento muy lento, sobre todo de brotes.
(Vaca, 2011).
b) Micro-elementos.
Son sustancias que las plantas necesitan en mnimas

cantidades pero al sobrepasar la dosis podemos producir una
toxicidad para el material vegetal.
Estos elementos son:
Boro.
Elemento que facilita el movimiento de azucares agua y
hormonas, y esta involucrado en el metabolismo del nitrgeno
y divisin celular.
Fuente: Cloruro de Calcio.
Deficiencia: deterioro de tejidos internos, enrolamiento intenso
de hojas clorticas.
Exceso: daos severos a la planta y muerte (Vaca, 2011).
Cloro.
2011
104
Elemento que estimula la fotosntesis, adems muy necesario

para el crecimiento.
Fuente: Acido brico CaCl2.2H2O.
Deficiencia: hojas marchitas de color amarillo a bronce
posteriormente mueren.
Exceso: daos severos a la planta y muerte (Vaca, 2011).
Cobalto.
Elemento presente en el complejo B12,
esencial para la
fijacin de nitrgeno, (nitrgeno atmosfrico en nitratos).

Fuente: Cloruro de cobalto CoCl2.6H2O
No se ha demostrado que sea esencial (Vaca, 2011).
Cobre.
Elemento necesario en la conversin de energa, sntesis de
clorofila y se encuentra en varias enzimas.
Fuente: Sulfato de cobre CuSO4.5H2O
Deficiencia: crecimiento deficiente, malformaciones, hojas
decadas y manchadas.
Exceso: txico para la planta (Vaca, 2011).
Yodo.
Elemento que es componente del amino cido, no se lo
considera como elemento esencial
2011
105
Fuente: Yoduro de potasio KI

Exceso: toxico para la planta (Vaca, 2011).
Manganeso.
Elemento fundamental en la membrana de los cloroplastos
Fuente: Sulfato de manganeso MnSO4.H2O.
Exceso: Txico para la planta en medios con pH cido (Vaca,
2011).
Molibdeno.
Ayuda a convertir el nitrgeno en amonio ayuda a la fijacin de
nitrgeno, necesario para la sntesis de protenas.
Fuente: Molibdato de sodio Na2MoO4.2H2O.
Deficiencia: cuando se presentan venas de color amarillo
Exceso: cantidades superiores a 10 ppm son dainas para la
planta (Vaca, 2011).
Zinc.
Activador enzimtico involucrado en la formacin de la clorofila
as como en la produccin de AIA.
Fuente: Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O.
Deficiencia: Races anormales y hojas punteadas de color
amarillo o bronce.
2011
106
Exceso: txico para la planta. (Vaca, 2011).
c) Compuestos orgnicos:
Sucrosa.
Es un producto indirecto de la fotosntesis, las plantas in vitro
no son capaces de fabricar todo el azcar que necesitan por
ello generalmente se aade en grandes cantidades.
Fuente: Azcar de caa, remolacha. (Vaca, 2011).
D-Mannitol y D-Sorbitol.
Azcares, alcohol, usados como reguladores osmticos y
primeros carbohidratos traslocables en algunas plantas (Vaca,
2011).
Adenina vit B4.
Componente importante de los cidos nucledos tiene efecto
como una citokinina dbil.
Efecto: Vitamina til para promover la formacin de brotes.
Fuente: Sulfato de Adenina (Vaca, 2011).
Tiamina.
2011
107
Acta como coenzima para asistir a los cidos orgnicos en el

ciclo del cido ctrico (respiracin)
Fuente: Tiamina HCl (Vaca, 2011).
Inositol.
Azcar, alcohol del complejo B,es una forma de fosfato y es
parte de algunas membranas como en los cloroplastos.
Efecto: No es esencial pero es beneficioso al cultivo in vitro de
tejidos.
Fuente: myo-inositol (Vaca, 2011).
Acido Nicotnico.
Es un componente de las coenzimas que actan en la reaccin
de luz-energa (Vaca, 2011).
Piridoxina.
Tiene su funcin tambin como coenzima en varias reacciones
metablicas
Fuente: Piridoxina HCL (Vaca, 2011).
Acido Ascrbico.
Tiene cierta capacidad desinfectante y se lo usa como
antioxidante para prevenir la produccin de fenoles
2011
108
Restriccin: No se debe usar por largos periodos ya que se

convierte en un oxidante por si mismo (Vaca, 2011).
Pantotenato de Calcio.
Las plantas verdes se consideran normalmente auttrofas,
pero es necesario aadir al medio algunas vitaminas, hasta
cuando los cultivos crezcan o se hayan vuelto verdes. En la
mayora de los medios, la tiamina, la piridoxina, y el cido
nicotnico se consideran
benficos y se aaden de forma
rutinaria (Roca, et al. 1991).
d) Reguladores de Crecimientos:
Auxina.
Roca, et al., (1991), nos ensea que
las auxinas
comprenden una gran familia de sustancias que tienen en

comn la capacidad de producir un agrandamiento
alargamiento celular; sin embargo,
se ha encontrado al
mismo tiempo que promueven la divisin celular en el cultivo

de tejidos. Existen varias auxinas llamadas naturales que
incluyen AIA (cido 3-indolactico). Tambin se utiliza
ampliamente un buen nmero de sustancias que provocan
2011
109
un efecto fisiolgico similar y que se han producido

sintticamente; son las llamadas auxinas sintticas, como
el 2,4 D, el ANA (1 cido naftalen actico) y el IBA (3 cido
indol butrico) se encuentran ampliamente disponibles y se
utilizan comnmente. En la prctica, el uso de las auxinas
es un arte. No es posible establecer una concentracin
particular de la auxina, que se debe utilizar en un solo caso.
Sin
embargo,
comnmente
concentraciones
levemente
se
utiliza
mayores
el
ANA,
1mg/litro
en
como
mximo.
Acido Dicloro Fenoxi Acetico.
Auxina sinttica, usado ampliamente para la produccin
de callo (masa de clulas) (Vaca, 2011).
AIA (3 Acido Indol Acetico).

Hormona mejor conocida por los propagadores de
plantas, por ser buen promotor de races, frecuentemente
usado para este fin en el medio de cultivo. Restriccin:
Sensible a la luz (Vaca, 2011).
IBA (3 Acido Indol Butirico).
2011
110
Auxina natural, promotora de enraizamiento ms estable

que el AIA, es la ms usada. Restriccin: en altas dosis
se lo utiliza como herbicida (Vaca, 2011).
ANA (1 Acido Naftalen Acetico).
Hormona
inductora
de
enraizamiento,
usada
especialmente para promover el desarrollo de callo.

Restriccin: en altas dosis se lo utiliza como herbicida en
productos comerciales (Vaca, 2011).
Citoquininas
Las citoquininas o citocinas constituyen un grupo de

hormonas que promueven la divisin y la diferenciacin
celular. (Roca, W. et al. 1991).La primera citoquinina fue
descubierta en 1950, en la Universidad de Wisconsin, por un
grupo de profesores. Muchas citoquininas exgenas y todas
las endgenas derivan probablemente de la adenina, una
base nitrogenada de purina (Weaver,
1979 y Rodriguez,
2005).
BA. 6 BA 6 bencilladenina (6-BA, CAS 121-39-7).
2011
111
Es la primera citoquinina sinttica. Puede inhibir la

degradacin de la clorofila, acido nucleicos y protenas,
promover la entrega de los aminocidos, sales inorgnicas y
reguladores del crecimiento. Ayuda a mantener la planta
verde y retarda el envejecimiento. Puede ser utilizada en la
agricultura, en el campo de la horticultura, las plantas en las
diferentes etapas desde la germinacin hasta la cosecha
(Roca, et al. 1991).
BAP (6 Adenina O 6 Benzil Amino Purina).
Hormona sinttica, usada ampliamente para promover el
desarrollo de yemas axilares,
se presume que se
encuentra en la planta, pero difcilmente se la encuentra

(Vaca, 2011).
2ip (2 Isopentenil Adenina).
Hormona sinttica de amplio uso en los medios de cultivo, se
ha
encontrado
en
ciertas
bacterias
del
gnero
Corynebacterium, sta produce rpida divisin celular y posible

crecimiento irregular (Vaca, 2011)
Kinetina (6 Furfuril Amino Purina).
2011
112
Regulador de crecimiento aislado del ADN
se lo usa
frecuentemente para promover la divisin celular (Vaca, 2011).
Giberelinas.
Acido giberelico AG3.
Conjunto
de
sustancias
naturales
que
influyen
en
el
alargamiento celular y en la elongacin del tallo. Se han

identificado 3 o 4 giberelinas. Algunas, activas en la
germinacin de las semillas activadas por los embriones, que
actan sobre los almidones y su transformacin en azucares.
Utilizada ampliamente como complemento de las auxinas y
citokininas (Vaca, 2011).
Agentes gelificants.
Agar.
Polvo que al entrar en contacto con el agua se convierte en un

soporte suficientemente firme para sostener el explante. Y lo
suficientemente suave para permitir un contacto adecuado
entre el medio y ste. Medios con pocas sales u hormonas
tienden a ser ms duros y el movimiento de los nutrientes
suele ser ms lento.
2011
113
Agar muy suave, posible causa de vitrificacin o pH bajo 4.7

suelen ser suaves y agar con pH 5,8, suelen ser duros. Otros
compuestos gelificantes como gelrite o phytagel pueden
reemplazar al agar. Mezclas de estos AGARGEL,
agar y
phytagel, pueden dar el efecto deseado por el investigador.

Mezclas de gelrite con agar en proporcin 3:1 o 5:1 son
recomendadas (Vaca, 2011).
3.14.5. Proceso para la realizacin del medio de cultivo.
Para la realizacin del medio de cultivo se dispone de todos

los componentes del medio macro y micro elementos,
vitaminas, auxinas, citoquininas, azucares, agar, y debemos
elegir correctamente el medio de cultivo para las necesidades
que se requiere dentro del laboratorio, para lo cual debemos
contar con los equipos e instrumentos, cristalera adecuada, y
equipo de esterilizacin (Merchn, 2011).
3.14.6. Tcnica para la preparacin del medio de cultivo.
Para la preparacin de los medios se requiere un gran cuidado

ya que al alterar los porcentajes podramos daar los cultivos.
2011
114
Para ahorrar tiempo en la preparacin, se dosifica soluciones

madres de las cuales se pipetea volmenes, que permite
seguridad de la cantidad exacta de cada uno de los elementos,
adems de replicar en el tiempo con los mismos resultados. Se
procede al pesado de cada uno de las sales que son
compatibles, se diluyen en un vaso de precipitacin pequeo y
se afora a 100 cc, y se coloca en el recipiente, el cual va a
contener todos los componentes del grupo, y se refrigera.
Posteriormente se procede a pipetear las solucin madre,
cido giberelico (G3), Myo-inositol, auxinas, citoquininas,
vitaminas, y la sucrosa, se afora a un litro, se ajusta el pH, y la
conductividad elctrica, posteriormente se coloca el agar y se
procede a calentar hasta diluirlo, se hace el dispensador en
recipientes adecuados: frascos, tubos, elermeyer, y se
realizara la esterilizacin del medio de cultivo (15C por 15
minutos), se deja enfriar y llevar al cuarto de crecimiento para
su utilizacin (Merchn, 2011).
3.14.7. Condiciones fsicas del medio de cultivo.

a) El pH.
Es uno de los indicadores para verificar el equilibrio de los

macro y micro elementos del medio. Cuando el pH de
2011
115
encuentra por debajo de los 4 y por encima de 8 el medio no

solidifica. Al ser bajo algunos reguladores de crecimiento,
giberelinas y vitaminas, presentan menos estabilidad, y
algunas sales pueden precipitar.
El pH se debe ajustar,
para subir el pH se coloca Hidrxido de sodio OH Na y para

bajar se coloca Acido Clohdrico Cl H el pH debe quedar en
un rango de 5,8 y 6.0 antes de esterilizar (Prez, 2006).
b) Conductividad elctrica, se manifiesta a travs del

siguiente cuadro:
Cuadro 8. Ejemplo de conductividad elctrica para cada uno

de los medios de cultivos.
MS.
8280
100% M.S.
4.9
5524
100%
7.02
Murashige
5524
35% Phytamax
2.31
75%
3.44
Phytamax
35% Linderman
1.23 a 2
35%
1.84
Knudson
35% Casero
1.63
35%
0.43
Fuente: Ing. Francisco Merchn.
2011
116
3.14.8. Esterilizacin del Medio.

Despus haber obtenido los datos de pH, y conductividad
elctrica, se procede a la esterilizacin; para este proceso se
debe determinar las caractersticas del material a esterilizar, ya
que de esto depende el tiempo, y el grado de temperatura que
hay que mantener el material dentro de la autoclave.
La esterilizacin se realiza en autoclave, es un aparato similar
a una olla de presin en la cual de combina la temperatura y la
presin para eliminar cualquier microorganismo que se
encuentre dentro de los frascos o en el medio de cultivo. En la
autoclave se puede esterilizar cualquier material como por
ejemplo recipientes de vidrio, papel, agua, el cual se esteriliza
de 1 a 1.5 atmosferas de presin durante al menos 20 minutos,
materiales plsticos, prolipropileno, polimetilpenteno, tefln.
Para los medios de cultivos se proceder con una presin de
0.5 atmosferas durante 15 a 20 minutos (Prez, 2006).
2011
117
IV. Materiales y mtodos.

4.1. Ubicacin del lugar de la investigacin.
La presente investigacin se realiz en el Laboratorio de
Tejidos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad de Cuenca.
Cantn:
Cuenca.
Provincia:
Azuay
Parroquia:
Yanuncay.
Altitud: 2 584 m.s.n.m.

UTM: E 719768
N 9677340.
Temperatura Laboratorio (cmara del cultivo): 20 a 25 C

Precipitacin promedio: 847 mm/ao
4.2. Caractersticas de los laboratorios.
El laboratorio de tejidos de la Facultad de Ciencias

Agropecuarias tiene una infraestructura adecuada para la
realizacin del trabajo de investigacin, posee las siguientes
instalaciones:
2011
118
4.2.1.
Primer laboratorio.
Cuenta con los equipos necesarios para cada una de las

etapas de la investigacin. Para la realizacin de medios de
cultivos se dispone de
los siguientes equipos y los
componentes que se necesitan para su estructuracin: una

autoclave, necesaria para la esterilizacin de papel, agua,
cajas petri, medios de cultivos slidos y lquidos.
Para la preparacin de los medios de cultivo, se cuenta con un
sin nmero de reactivos: (sales minerales), como nitratos,
sulfatos, potasios, molibdatos, bromuros, componentes con
hierro, vitaminas, giberelinas cidos, y una balanza automtica
para
medidas de peso; equipos para medicin de pH y
conductividad elctrica.
2011
119
Fotografa 38 y 39: Equipos y sustancias qumicas con que

cuenta en el laboratorio de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias.
Fotografa 40. Balanza automtica del laboratorio.

El laboratorio dispone de una estufa, dos refrigeradoras, para
mantener todo tipo de soluciones que se han preparado, y
para almacenamiento de semillas.
Dentro de los instrumentos de vidriera, existen pipetas, cajas

petri, erlenmeyer, frascos, balones de aforo, vasos de
precipitacin de diferentes medidas.
2011
120
Cuenta con una bibliografa adecuada para la investigacin del

alumnado.
Fotografa 41: Estufa que se encuentra en el laboratorio.

4.2.2.
Segundo laboratorio.
Cuenta con microscopios, estreo microscopio, computadora,

se encuentra almacenados los frascos para su utilizacin.
4.2.3.
Tercer laboratorio.
Para el cultivos de tejidos, consta de dos zonas: en la primera

zona es la que se encuentra el
cuarto de crecimiento con
todos los implementos necesarios como son iluminacin,

2011
121
temperatura,
humedad,
etc.;
la
segunda
zona,
est
conformada por la cmara de flujo laminar, los instrumentos

necesarios para la manipulacin del material como son pinzas
de todo tipo, agujas de insulina, vidriera, cabe indicar que
todos estos equipos e instrumentos no salen de este
laboratorio para prevenir contaminacin, este laboratorio
consta con luz ultra violeta la cual es necesario para
desinfectarlo de microorganismos y mantener el rea estril.
4.3. Materiales
equipos
del
laboratorio
para
la
realizacin de la investigacin.
4.3.1.
Materiales biolgicos.
- Material vegetal de Maxillaria grandis para la extraccin

de los meristemos.
4.3.2.
Materiales qumicos.
- Sales para el medio de cultivo que se describen:

- ANA. Sigma (N 0640)
- IBA. Sigma (I 5386)
- G3.
Sigma (G 7645)
2011
122
- BA
Sigma (B 9395)
- Agua estril.
- Detergente.
- Hipoclorito de Sodio (Cloro).
- Alcohol etlico.
- Solucin para los medio de cultivo.
4.3.3.
Materiales fsicos.
Equipos:
- Cmara de flujo laminar.
- Autoclave.
- Balanza analtica.
- Estreo microscopio.
- Medidor de pH.
- Conductimetro.
- Roseador para el alcohol.
- Refrigerador.
- Cmara de crecimiento (20 a 25 C, 10 horas de luz, 14
horas de oscuridad, 400 pie/ candela
para la primera
etapa que comprende los 45 das y para la segunda etapa

que comprende entre los 60 das y 132 das 537
pie/candela) y repisas a 50 cm con 2 lmparas
2011
123
fluorescentes de 40 watts para la primera etapa y 4

lmparas para la segunda etapa.
4.3.4.
Herramientas.
- Pinzas
- Mango de bistur largo (hoja # 11)
4.3.5.
Materiales.
- Probeta 100 cc
- Tubos de ensayo de 150 mm de largo x 16 mm de
dimetro, tapas para tubos.
- Cajas petri
- Algodn.
- Vasos de precipitacin de 50, 100 y 250 ml.
- Jeringuilla hipodrmica de 50 ml
- Agujas de insulina.
- Lmpara para alcohol.
- Mandil de laboratorio.
- Mascarilla.
- Cubre pelo.
- Papel estril.
2011
124
- Pipeta digital de medicin en landas (ul)
4.4. Mtodos.
4.4.1.
Material experimental.
a. Taxonoma de la planta que se utilizar para la

investigacin.
La especie en estudio fue conocida
antiguamente
como
Maxillaria
sanderiana (Rchlo. F. ex. Sander).

(Dodson, 2002).Actualmente se ha
realizado una nueva clasificacin y se
la conoce
como Maxillaria gradis.
(Sanchez, 2010).
Reino
Divisin:
Magnoliophyta
Clase:
Liliopsida
Orden:
Orchidales
Familia:
Orquidaceae
Subfamilia:
Vandoideae
Tribu:
Maxillarieae
Subtribu:
Zygopetalinae
Gnero
Vegetal.
Maxillaria
2011
125
Grfico 3: Maxillaria grandis

Fuente: ngela Mirro.
La
semilla
fue
obtenida
Especie:
del
invernadero,
grandis
cosechada
deshidratada y congelada a -20 C de la que se sembr el

30/07/10 en medio de cultivo Phytamax al 75%. Este material
vegetal, se desarrollaba en el cuarto de tejidos de la Facultad
de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca.
(Merchn, 2009).
Para el proceso de investigacin los explantes in vitro fueron

obtenidos de una altura entre 5 a 7 centmetros de altura, con
una excelente fisiologa y morfologa, requerida al momento
de la extraccin de los meristemos.
Fotografa 42: Material vegetal para la investigacin

Fuente. Paola Cruz. (2011)
2011
126
4.5. Factores en estudio.
- Evaluacin del Medio de Cultivo.

- Evaluacin de diferentes dosificaciones de Auxinas (ANA,
IBA); Citoquininas (BA).
- Desarrollo de los meristemos.
- Sobrevivencia de los meristemos.
- Nmero de tubos contaminados.
4.5.1.
Tratamientos estudiados.
Se recurri a utilizar los siguientes tratamientos en el proceso

para el desarrollo de los meristemos.
- Phytamax 33.3 %+ G3 (Testigo).

- Phytamax 33.3% +G3+ BA con 4 dosis de Citoquininas 0,
0.25, 0.5 y 1 ppm.
- Phytamax 33.3% +G3+ ANA+ IBA con 3 Auxinas dosis
0.5, 1, 0.5, ppm.
- Phytamax 33.3% +G3+ ANA+ IBA+ BA Auxinas x
Citoquininas con 3 dosis 1, 2, 1 ppm
2011
127
Cuadro 9. Dosificaciones para los tratamientos de Auxinas

(ANA-IBA); Citoquininas (BA) en ppm.
Numero
de
ANA
IBA
BA
T1
T2
0,25
0,5
T3
0,5
T4
T5
0,25
T6
0,25
0,5
0,25
T7
0,5
0,25
T8
0,25
T9
0,5
T10
0,25
0,5
0,5
T11
0,5
0,5
T12
0,5
T13
T14
0,25
0,5
T15
0,5
T16
Tratamientos
Elaborado: Paola Cruz
2011
128
Cuadro 10. Randomizacin de los tratamientos.

Numero
de
ANA
IBA
BA
T13
T1
T5
0,25
T12
0,5
T2
0,25
0,5
T6
0,25
0,5
0,25
T3
0,5
T12
0,5
T1
T5
0,25
T4
T13
T2
0,25
0,5
T15
0,5
T8
0,25
T16
T9
0,5
T13
T11
0,5
0,5
Tratamientos
2011
129
T12
0,5
T2
0,25
0,5
T9
0,5
T3
0,5
15
0,5
T1
T5
0,25
T14
0,25
0,5
T5
0,25
T4
T12
0,5
T16
T7
0,5
0,25
T11
0,5
0,5
T14
0,25
0,5
T6
0,25
0,5
0,25
T9
0,5
T8
0,25
T6
0,25
0,5
0,25
T4
T11
0,5
0,5
T7
0,5
0,25
T15
0,5
2011
130
T10
0,25
0,5
0,5
T8
0,25
T14
0,25
0,5
T16
T11
0,5
0,5
T2
0,25
0,5
T13
T8
0,25
T10
0,25
0,5
0,5
T16
T4
T6
0,25
0,5
0,25
T1
T14
0,25
0,5
T10
0,25
0,5
0,5
T3
0,5
T9
0,5
T3
0,5
T10
0,25
0,5
0,5
T15
0,5

4.5.2.
Diseo experimental.
2011
131
El diseo experimental que se utiliz para esta investigacin

fue un arreglo factorial de 4 x 4 con 6 repeticiones.
4.5.3.
Caractersticas de la unidad experimental.
Cada unidad experimental fue conformada por un tubo de

ensayo con tapas de algodn y papel aluminio, con una
dimensin de 150 mm de largo por 16 mm de dimetro con
seis repeticiones por cada tratamiento, se ubicaron en el
cuarto
de
crecimiento
dentro
del
laboratorio,
con
las
condiciones adecuadas de horas luz 6-8 pm, temperatura

20C-25C, humedad 50% - 60%, para las primeras etapas
que fueron a los 9 das, 15 das, 30 das y 45 das despus de
la siembra se utiliz luz de 2 lmparas fluorescentes, para el
restos de etapas como fueron a los 60 das, 75 das, 90 das
se utilizo la luz de 4 lmparas fluorescentes a 50 cm de altura
para que l meristemos continuo con su desarrollo.
4.5.4.
Esquema del anlisis Estadstico.
2011
132
Se realiz los anlisis de Variancia (ADEVA) para tratamientos,

efectos o factores principales e interaccin entre los factores
determinados los cuales son:
Factor 1.- Auxinas
Factor 2.-Citoquininas
Factor 3.- Auxinas + Citoquinina
4.5.5.
Prueba de Significacin.
Se realiz la prueba de significacin de Tukey al 5% para las

variables
que
resultaron
significativas
significativas, para observar
altamente
si la muestra representa al
universo y con qu margen de error lo hace, para obtener una

probabilidad que lo encontrado en la muestra es real o al azar.
4.5.6.
Manejo de la investigacin, recurrimos a las
siguientes fases:
a. Primera fase.-Se prepar los reactivos y soluciones de

acuerdo a las dosis y concentraciones del medio de
cultivo para la investigacin.
b. Segunda fase.-Se prepar los medios de cultivo de
acuerdo a los tratamientos y nmero de repeticiones;
dispensados en tubos.
2011
133
c. Tercera fase.-Esterilizacin de materiales y medio de

cultivo (vidriera, papel, agua, medio de cultivo) en auto
clave.
d. Cuarto
fase.-Preparacin
del
material
vegetal,
laboratorio, estufa, cmara de flujo laminar, pinzas,

bisturs, papel, para los frascos, flameado, y destapado,
eliminacin de medios de cultivo no aptos para la
siembra.
e. Quinta fase.- Dentro del material vegetal se identific los
mejores explantes que se encontr en los frascos para la
extraccin de meristemos.
f. Sexta fase.- Extraccin y siembra de meristemos dentro
de la cmara de flujo laminar uso de papel estril, bisturs,
y jeringuillas hipodrmicas de insulina para el corte del
meristemo, flameados de tubos, corte del agar para dejar
el meristemo en el medio de cultivo, flameado del tubo,
tapado, trasporte a la cmara de crecimiento cada uno de
de los tubos, mover los meristemos cada da y cambiar a
nuevo medio.
g. Sptima fase.-Toma de datos.
4.5.7.
Tcnicas del manejo del ensayo.
2011
134
Las tcnicas que se realiz dentro de la investigacin fueron

proporcionadas por el Ing. Francisco Merchn B. impartidas
dentro de la ctedra de Biotecnologa y en prctica de
laboratorio. Utilizamos como referencias bibliografa que
contiene
experiencias de varios investigadores.
Todo este
proceso fue realizado en las siguientes fases:
a) Primera fase preparacin de reactivos para el medio

de cultivo.
Consisti en la preparacin del medio de cultivo; y para su
ejecucin
utilizamos
soluciones y
pesados al 33% de
concentracin. La investigacin se bas en la formulacin del

medio de cultivo Pytamax, con sus dosis exactas en
soluciones madres para 10 litros de medio de cultivo del que
se formula 10cc de cada grupo.
Cuadro 11.Reactivos qumicos grupo I que se utiliz para el

medio de cultivo. Nitratos.
NO3
Nitrato de Amonio
(NH4)
Nitrato de Potasio
NO3K
2011
135
Elaborado: Paola Cruz.
Cuadro 12. Reactivos qumicos grupo II que se utiliz para el

medio de cultico. Sulfatos.
Sulfato de Magnesio
SO4Mg
Sulfato de Manganeso
SO4Mn
Sulfato de Zinc
SO4Zn
Sufato Cuprico
SO4Cu
Cuadro 13. Reactivos qumicos grupo III que se utiliz para el

medio de cultico. Yoduros y clorhidratos.
Yoduro de Potasio
IK
Clohidrato de Cobalto
ClCo
Clohidrato de Calcio
Cl2Ca
Cuadro 14. Reactivos qumicos grupo IV que se utiliz para el

medio de cultico. Fosfatos y cidos.
Fosfato
de
Potasio
Monobasico
PO4H2K
Acido Borico
Bo4H3
2011
136
Molibdato de Sodio
MoO4Na
Cuadro 15. Reactivos qumicosgrupo Vque se utiliz para el

medio de cultico.
Sulfato ferroso
SO4Fe
EDTA
Cuadro 16. Reactivos qumicos grupo VI que se utilizo para el

medio de cultico. Vitaminas.
Tiamina
HCL
Priridoxina
HCL
Acido Nicotinico
C6H5NO2
Elaboracin: Paola Cruz
2011
137
Cuadro 17. Macro y micro-elementos al 33% de

concentracin para el medio de cultivo de la investigacin.
P 6793 #
SALES
mg / litro
INORGANICAS
100% 33,30%
Nitrato de Amonio
825
274,725
Nitrato de Potasio
950
316,35
90,35
30.08655
Manganeso
8,45
2.81385
Sulfato de Zinc
5,3
1.7649
Sufato Cuprico
0,0125 0.003996
Sulfato
de
Magnesio
Sulfato
de
Yoduro de Potasio 0,415

2011
0.138195
138
Clohidrato
de
Cobalto
Clohidrato
0,0125 0.0041625
de
Calcio
166
55.278
Monobasico
85
28.305
Acido Borico
3,1
1.0323
Fosfato de Potasio
Molibdato de Sodio 0,125
0.041625
Sulfato ferroso
27,85
9.27405
EDTA
37,24
12.40092
Tiamina
0.333
Priridoxina
0,5
0.1665
Acido Nicotinico
0,5
0.1665
ORGANICOS
Pantatenato
de
calcio
2 cc/l
Acido giberelico
0.25 cc/l
Myo-inositol
100 mg/l
Sucrosa
10 gr/l
Agar
6.5 gr/l
Fuente: (Sigma, 1930 y Arditii, 1992)
2011
139
b) Segunda fase.
Se agruparon los reactivos de acuerdo a su compatibilidad en
los 5 grupos de soluciones madres para 10 litros de medio de
cultivo: Nitratos, sulfatos,
otros y vitaminas; dentro del
laboratorio pueden ser conservados al ambiente, refrigeracin

y en congelacin, hasta 4 meses para su utilizacin sin que
se presenten cambios en las respuestas de las plantas o
especies que se cultiven sobre esos medios.
Para cantidades muy pequeas como de 0.041 de mg que se
requiere en sulfato de cobre y otros, se procedi a realizar
diluciones para obtener la cantidad exacta en el medio de
cultivo las mismas que se conservan de manera individual en
frascos obscuros y en refrigeracin hasta su utilizacin. La
dilucin se ajusta para utilizar un volumen fijo de 1, 5 o 10 ml
por litro de medio de cultivo.
Para obtener la quelatificacin de los micro-elementos
metlicos se inicia
con el sulfato de hierro y EDTA sus
cantidades respectivas son diluidas y calentadas por separado

y en frio mezcladas.
La auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA) se prepararon a 100
ppm 100 ml, utilizando como disolvente el OHNa 1 N y como
diluyente agua para aforar y son conservadas en refrigeracin
2011
140
hasta su uso, para obtener 0.25 ppm de ANA se tom 2.5 ml

para un litro de medio de cultivo.
Las cantidades que la balanza permiten pesar con exactitud
son disueltas en vaso de precipitacin y llevadas a un baln
volumtrico para su mezcla y aforo.
De cada solucin madre se tom un volumen de 10 ml para un
litro de medio de cultivo que se adiciona el Myo-inositol100
mg/l, pantotenato de calcio con una dosis de 2cc/ l, se disolvi
y se coloc el G3 en dosis de 0.25 cc/l, por ltimo se coloc la
sacarosa10gr/l, se procedi a medir el pH y la conductividad
elctrica. En la mayora de los casos se requiri ajustar el pH,
para subir con una solucin 1 normal de hidrxido de sodio
OHNa; y para bajar el pH con una solucin 1 normal de acido
clohidrico; normalmente, el ajuste del pH se hizo a 5.5 5.6,
para nuestra investigacin el pH se estabiliz en 5.53 y la
conductividad elctrica fue de 2.62 mstcm.
Como ltimo paso aadimos el agar, calentamos el medio de
cultivo hasta hervir
para diluir todo el agar, evitando no
quemar la solucin, y al terminar este proceso
colocar en
elermeyer etiquetados con cada uno de los tratamientos en el

cual se puso las dosis de auxinas y citoquinicas
con una
pipeta automtica en landas (ul), para cada unos de los

tratamientos.
2011
141
Fotografa 43 y 44. Equipo para el ajuste de pH y medicin de

la conductividad elctrica.
Fotografa 45: Dosificacin de dosis de Auxinas y

Citoquininas.
2011
142
- Etiquetado y colocacin de medio de cultivo en los

tubos de ensayos.
Dentro del etiquetado se procedi a identificar cada uno de las
distintas dosis en parte por milln (ppm) de ANA IBA y BA con
etiquetas de colores, con las dosis de auxinas, citoquininas, la
fecha de la realizacin y el cdigo de cada tratamiento.
Para el dispensado del medio de cultivo se tom en cuenta la
temperatura, esta debi mantenerse sobre los 45 C a fin de
evitar la gelificacin, se coloc en cada tubo la cantidad de 5
cm3 de medio de cultivo, terminado el envasado se procedi a
la rotulacin de cada uno delos tubos respectivas, con las
etiquetas de cada uno de los elermeyer, se coloc las tapas de
algodn y aluminio para posteriormente la esterilizacin.
Fotografa 46: Etiquetado y dispensado de tubos.

2011
143
c) Tercera fase. Esterilizado de materiales y del medio

de cultivo.
Para la esterilizacin del medio de cultivo se procedi a la

colocacin de los tubos en fundas de papel, las cuales
contenan los nmeros de tratamientos
para no tener
confusiones subsiguientes.
Fotografa 47 y 48: Preparado y colocacin de los tubos de

ensayos para la esterilizacin.
Los tubos se colocaron en las rejillas. La esterilizacin se

realiz por quince minutos a una temperatura de 20 C.
Adems se realiz la esterilizacin de la cristalera, agua,
papel para trabajar dentro del laboratorio. Pasado el tiempo de
esterilizacin se procedi a colocar los tubos en las
2011
144
respectivas gradillas, con una inclinacin para obtener que el

medio tenga la forma requerida (flauta) cuando se solidifique.
Fotografa 49 y 50. Esterilizacin de agua y papel e

inclinacin (flauta) del medio de cultivo respectivamente
- Preparacin de los equipos e instrumentos para la

investigacin.
Se utiliz radiacin ultravioleta para el ambiente, las lmparas

quedaron prendidas por 24 horas para desinfectar el rea de
trabajo y en la cmara de flujo laminar, posteriormente se
traslado los tubos con medio de cultivo, agua, papel, pinzas,
etc. para la siembra. Dentro de los elementos qumicos se
utiliz alcohol al 70% esto se utiliz para la cmara de flujo
2011
145
laminar y para las manos, y de 96 para cada una de las

lmparas de alcohol.
d) Cuarta fase: Seleccin de explantes.

Se tom los mejores frascos y se seleccion nicamente las
plantas vigorosas.
Fotografa 51: Seleccin de explantes para la extraccin.

e) Quinta fase: Preparacin del material vegetal para la

siembra.
Previo a la extraccin se debe tener el ambiente desinfectado,
mientras que el estreo microscopio, la cmara de flujo
laminar, los tubos de ensayo, y las pinzas flameadas, el papel
2011
146
estril, los frascos con el material vegetal, el agua de la

autoclave, debern ser desinfectados con alcohol al 70%.
Fotografa 52 y 53: Limpieza del estreo-microscopio y el rea

de trabajo
Con las referencias expuestas, se procedi a realizar el trabajo
prctico que consistente en:
1. Seleccin de explantes que se desarrollaron en el cuarto

de crecimiento.
2. Se procedi a colocar una lmina de papel estril en la

base del estreo-microscopio.
2011
147
3. Se roci y flame con alcohol el frasco del material

vegetal.
4. Abrimos cuidadosamente para evitar contaminaciones y

seleccionamos la planta sana,
evitando las que se
encuentran de color amarillento y colocamos en el papel

bajo el estreo- microscopio.
5. Observamos
y eliminamos cada una de las hojas
externas que se encuentra en el material.
6. El tiempo empleado para la eliminacin de hojas externas

y extraer el meristemo es de 4 minutos como mximo
para evitar la marchitez de las hojas de los explantes y
facilitar el corte del meristemo.
7. Al eliminar las hojas exteriores nos encontramos con
diferentes capas: la L1 externa la L2 interna y la L3 corpu;
al pasar por estas tres capas encontramos los primordios
foliares.
8. Luego procedemos a eliminar los primordios foliares, que
envuelven al meristemo.
2011
148
9. Al tener limpio el meristemo, se procede a cortar con el

bistur, observando nuevamente la punta del bistur, para
constatar que el meristemo se encuentre en la punta para
trasladarlo al tubo de ensayo.
Recomendaciones para la preparacin del material vegetal

antes de la siembra.
- Al utilizar las pinzas se debe tener una presin muy leve:

para evitar la destruccin del material vegetal.
- Debemos tener cuidado al utilizar el bistur, ya que es

muy fino y podemos cortar mucho material.
Recomendaciones para cortes del material vegetal antes de la

siembra.
Para controlar el pulso no olvidar asentar correctamente
los codos para contrarrestar las vibraciones de la cmara
de flujo laminar.
Flamear correctamente los frascos y tubos antes y
despus de destaparlos.
2011
149
En esta fase, trabajamos con agujas de insulina, aunque

tambin se puede trabajar con bistur, evitando cortar al
meristemo.
Si se trabaja con bistur tener en cuenta que si este se
oxida por las flameadas desechar rpidamente para evitar
contaminaciones.
Si al extraer los explantes de los frascos estos caen sobre
la cmara de flujo laminar eliminarlos para evitar
contaminacin de hongos o bacterias que se encuentren
en la cmara.
Al eliminar los primordios foliares obtendremos mejores
resultados en la eliminacin de virus.
Para el corte del meristemo se recomienda cortar de
abajo hacia arriba, para evitar que este cada sobre el
papel que se encuentra extendido sobre el estreomicroscopio.
2011
150
Despus de cada una de las extracciones de los

meristemos se recomienda eliminar la hoja de papel que
se encuentra sobre el estreo-microscopio, el bisturs, la
aguja de insulina para evitar la contaminacin cruzada.
Fotografa 54: Eliminacin de hojas externas.

2011
151
Fotografa 55y 56: Eliminacin de hojas externa y primordios

foliares.
Fotografa 57: Corte del meristemo para la siembra.

2011
152
f) Sexta fase: Siembra de Meristemos
Para la siembra se utiliz el bistur con la mano derecha en el

cual se encuentra inserto el meristemo; con la mano izquierda
se flamea el tubo, luego destapamos el tubo de ensayo con
mucho cuidado con la mano derecha sin soltar el bistur, luego,
con precaucin, realizamos un corte en el medio de cultivo en
el cual qued impregnado el meristemo, y lo tapamos,
colocndole en la gradilla de espuma flex para trasladarlo a la
cmara de crecimiento. Para facilitar un buen desarrollo de los
meristemos se procedi a mover cada tres das, luego cada
semana. Esto nos facilit que el meristemo absorba los
nutrientes de todo el medio de cultivo.
Recomendaciones para la siembra del meristemo.
- Es recomendable utilizar el dedo meique y anular,

haciendo presin sobre la palma de la mano para
destapar el tubo de ensayo para luego introducir el bistur
en el tubo y proceder a la siembra.
- No se debe realizar el corte muy profundo en el medio de

cultivo para evitar que el meristemo se ahogue.
2011
153
- Despus de la siembra se vuelve a flamear la boca del

tubo y la tapa para evitar contaminacin.
Fotografa 58 y 59: Destapado del tubo y siembra del

meristemo en el medio de cultivo.
g) Sptima Fase: Toma de datos.
Para una mayor facilidad de recopilacin de datos estos fueron
tomados cada 15 das hasta los 90 das.
- Evaluacin de Meristemos.
Para la evaluacin se observ a los meristemos y se determin
su desarrollo por medio de una escala de colores definida por
la autora.
Cuadro 18. Escala de colores y equivalencia para la

evaluacin del desarrollo.
2011
154
Cdigo
Codificacin
Escala
C/c/b
Cambi de color a blanco
C/c/m
Cambi de color a marrn
C/c/b/m
Cambio de color a blanco y 3

marrn
C/c/n
Cambio de color a negro
C/C/v
Cambio de color a verde
C/c/f/v
Cambio de color y forma
Muerto
Mantiene
2011
155
V.
Resultados y discusin
Para realizar las evaluaciones se recurri a la observacin bajo

el estreo microscopio debido a que a simple vista no se
puede detectar su tamao, ni las diferencias entre ellos. De la
siembra de meristemos de Maxillaria grandis se obtuvo los
siguientes resultados:
A los 9 das no se detect cambio alguno de los meristemos, al
realizar el ADEVA con valor 8, su color y forma se mantuvieron
(Datos que se encuentran en el anexo 1 basados en la tabla
1.). Los resultados obtenidos dieron valores ceros debido a
que no mostr cambios. El ADEVA y la prueba de Tukey al 5%
no detectaron diferencia alguna.
Grfico 4. Comportamiento de los meristemos a diferentes
dosis de Auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA) en Maxillaria
grandis de los tratamientos a los 9 das.
2011
156
Escala de colores
Tratamientos
Tabla 1. Escala de colores y tratamientos al que pertenecen

los tratamientos a los 9 das
Escala
Cdigos Codificacin
Cambi
C/c/b
C/c/m
de
color
de
color
blanco
Cambi
Tratamientos
marrn
2011
157
Cambio
de
color
C/c/b/m
blanco y marrn
C/c/n
C/C/v

C/c/f/v
Muerto
y forma
Se encuentran
8
Mantiene
todos.
Para realizar las evaluaciones de los meristemos se procedi a

disear una tabla que permita cuantificar los cambios
cualitativos que presenten los meristemos en su proceso de
adaptacin y comportamientos in vitro.
En el grfico 3 y en la tabla 1 a los 9 das los meristemos no
cambiaron de color ni de forma se mantuvieron del tamao
sembrado sin alteracin alguna.
Cuadro 19. Anlisis de Variancia de la codificacin para el
comportamiento de los meristemos a diferentes dosis de
Auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA) para Maxillaria grandis
a los 15 das desde la siembra.
2011
158
F
F.V.
Gl SC
CM
FC
Tab
0.5%
0.01%
9 1025.33
Total
5 3
Tratamiento 1
12.93
1.2
12.19
1.128
30.91
2.860
Auxinas
5 194
3 36.583
Citoquininas 3 92.75
NS 1.82
2.31
NS 2.74
4.085
4.085
2.74
0.664
Auxi Vs. Cito 9 64.667
7.185
NS 2.02
2.68
NS 2.74
3.298
0.385
Repeticiones 5 20.833
Error
4.167
10.80
5 810.5
C.V. = 75.86
Del ADEVA se encontr que el efecto de citoquininas es el
nico que dio diferencia significativa, y
los dems efectos
fueron estadsticamente iguales. El coeficiente de variacin del

75,86% corresponde a una heterogeneidad alta debido a que
cada tubo con su meristemo corresponde a una unidad
2011
159
experimental y la respuesta diferente que manifestaron los

meristemos en esta etapa. Los datos originales y los que
corresponden a valores codificados se encuentran en el
anexos 2.
Cuadro 20. Prueba de Tukey al 5% para el comportamiento
de los meristemos a diferentes dosis de Citoquininas (BA) en
Maxillaria grandis a los 15 das.
Dosis/Citoq BA
Promedios Rango
5.667
0.25
4.667
ab
0.5
4.042
ab
2.958
De la prueba de Tukey al 5%. se encontr en el primer puesto

el rango a en el cual se encuentra la dosis 4, est dosis son
las ms altas utilizadas ANA (1 ppm, IBA 2 ppm, BA 1ppm) con
un valor promedio de 5.667, seguido por el rango ab que
comparten la dosis 2 y 3, para la dosis 2 (ANA 0.25 - IBA 0.5
ppm, BA 0.25 ppm) con un valor promedio de 4.667,y la dosis
3(ANA 0.5 ppm, IBA 1 ppm, BA 0.5 ppm) con un valor
promedio de 4.042, y en ltimo puesto con el rango b la
dosis 1 (ANA 0 ppm, IBA 0 ppm, BA 0 ppm) que dio un
2011
160
promedio de 2.958. Con estos datos se determin que las

dosis que contenan auxinas y citoquininas en dosis altas,
presentaron valores promedios prximos a 6, son los que
interesan por la sobrevivencia de los meristemos, valores
promedios que se encuentran afectados por los de categora 7
que corresponden a una fenolizacin presentes en los
tratamientos 13 y 15.
Grfico 5. Codificacin del comportamientos de los

meristemos con diferentes dosis de Auxinas (ANA-IBA) y
Citoquininas (BA) en Maxillaria grandis para los tratamientos a
los 15 das desde la siembra.
2011
161
Escala de colores
Tratamientos
Los tratamientos 1,5,9 y 13 que contienen las dosis

progresivas de BA de menor a mayor cantidad que van de 0,
0.25, 0.5 a 1 ppm; al analizar las dosis de BA los mejor
resultados se obtuvieron con dosis bajas como es el caso del
tratamiento 1 y 5 que se observaron de color verde, al
aumentar la dosis como en el caso del tratamiento 9 el
meristemo cambi de color a negro esto nos di un indicio de
que las dosis altas de BA pudieron causar una fenolizacin
parcial o total del meristemo y en el caso del tratamiento 13 del
meristemo muere una parte del tejido. En los cuatro
tratamientos siguientes se observ que 2, 6, 10 y 14 con dosis
de ANA 0.25IBA 0.5 y las dosis de BA de 0, 0.25, 0.5 a 1
ppm nos dieron como resultado que la interaccin actu en
forma parcial entre auxinas y citoquininas de manera variables.
2011
162
Para el tratamiento 3 se determin que la dosis alta de IBA y

al no tener una dosificacin de BA el meristemo no cambia a
color verde, sino se mantiene de color blanco marrn como es
el caso del tratamiento 3; en los tratamientos 7 y 11, los
meristemos cambiaron de color a verde debido posiblemente a
la dosificacin de BA que fue de 0.25 a 0.5 ppm y el
tratamiento 15 al tener una alta dosificacin de BA de 1 ppm el
meristemo fenoliz como en el caso del tratamiento 13. En los
ltimos cuatro tratamientos 4, 8, 12 y 16
tuvimos que el
comportamiento fue similar a los otros tratamientos, las

dosificaciones
de
BA
determinaron
un
cambio
de
comportamiento de los meristemos, el tratamiento 4 cambi de

color a marrn al no tener dosificacin de BA, los tratamientos
8 y 12 cambian de color a verde en las dosificaciones de 0.25
y 0.5 de BA, y el tratamiento 16 cambi de color a negro
informacin que se estima en la Tabla 2.
Tabla 2. Escala de colores y tratamientos al que pertenecen a
los 15 das
Escal
a
Cdigos Codificacin
Tratamientos
Cambi de color a
1
C/c/b
blanco
2011
163
Cambi de color a
2
C/c/m
marrn
4_
Cambio de color a
3
C/c/b/m blanco y marrn
2_3_10
Cambio de color a
4
C/c/n
negro
9_16
Cambio de color a 1_5_6_7_8_11_12_1

5
C/C/v
verde
Cambio de color a
6
C/c/f/v
verde y forma
Muerto
13_15
Mantien
8
Cuadro 21. ADEVA para la codificacin del comportamiento de

los meristemos con diferentes dosis de Auxinas (ANA-IBA) y
Citoquininas (BA) para Maxillaria grandis a los 30 das desde
la siembra.
F Tab
F.V.
Gl
SC
CM
FC
0.5%
0.01%
Total
95
698.74
2011
164
Tratamientos 15
181.24
12.083 1.78
Auxinas
18.698
6.233
Citoquininas 3
83.948
27.983 4.1277 **
78.594
8.733
1.2881 NS 2.02
2.68
Repeticiones 5
9.052
1.81
0.2671 NS 2.74
3.298
Error
508.448 6.779
Auxi
NS 1.8175 2.31
0.9194 NS 2.74
2.74
4.085
4.085
Vs
Cito
75
C.V.= 76.91%
De los datos del ADEVA al comparar con el anlisis de los 15
das se encuentra un incremento en el efecto de Citoquininas
esto es de significativo a altamente significativo, el coeficiente
de variacin tiene un ligero incremento en una unidad 75.86 a
76.91 esto se da debido a que se encuentra todava una
heterogeneidad en cada uno de los tratamientos en estudio.
Cuadro 22. Prueba de Tukey al 5% para la codificacin en
valores promedios del comportamiento de los meristemos con
diferentes dosis a los 30 das de Citoquininas (BA) en
Maxillaria grandis.
Dosis/Citoq BA Promedios Rango
3
0.5
0.25 3.75
ab
ab
4.333
3.625
2011
165
1.833
La dosis 3 se mantiene en el valor de codificacin en la

caracterstica de color negro adems se encuentra en la
primera ubicacin, se asume que las dosis 2 y 4
al estar
prximo al valor codificado 4 mantienen caractersticas

similares, la dosis 1 que corresponde a un cambio hacia un
color blanco marrn a marrn.
Grfico N 6. Codificacin del comportamiento de los
meristemos con diferentes dosis de Auxinas (ANA - IBA) y
Escala de colores
los 30 das.
Tratamiento
2011
166
Los tratamientos 1, 5, 9 y 13 se comportaron de la siguiente

manera:
El tratamiento 1 cambi de color verde a marrn, este cambio
se dio posiblemente porque el tratamiento 1 no tiene
dosificaciones de auxinas y citoquinina, el tratamiento 5
cambi de color a verde y de forma y se mantiene de este
color, este cambio fue debido a que el meristemo entr en su
etapa de desarrollo, cabe indicar que el meristemo por su
tamao no se pudo medir, (el cambio tambin puede radicar
que estadsticamente las dosificaciones de citoquininas son
altamente significativo), para el tratamiento 9 una seccin del
meristemo tuvo un comportamiento inusual paso de color
negro a color verde, el cambio se manifest posiblemente por
los movimientos que se realizaron a un nuevo medio de cultivo
en el que se coloc y tuvo una mejor adaptacin y absorcin
de los componentes del medio de cultivo y en el caso del
tratamiento 13 tambin se obtuvo cambio de fenolizacin pas
a color negro el meristemo.
En el tratamientos 2 (ANA 0.25IBA 0.5 ppm, BA 0 ppm)
cambi de blanco a blanco marrn este cambio se produjo
posiblemente por no tener dosificacin de BA, el tratamiento 6
se mantuvo de color verde, el tratamiento 10se mantuvo de
color blanco marrn, para el tratamiento 14 pasa de color
2011
167
verde a color negro una de las causa puedo haber sido la alta
concentracin de BA.
Para los tratamientos subsiguientes (ANA 0.5-IBA1 ppm) como
es el caso del tratamiento 3 (BA 0 ppm)
pas de blanco
marrn a negro este tratamiento no tiene dosificaciones para

BA al comparar con la evaluacin a los 15 das los
tratamientos con stas dosificaciones no se obtuvieron
resultados satisfactorios. El tratamiento 7 de color verde
cambi a color negro esto es posiblemente por las altas
dosificaciones de BA, el tratamiento 11 se mantiene de color
verde, para el tratamiento 15 los meristemos muertos pasan a
color negro este tratamiento concuerda con las lecturas
tomadas del tratamiento 13.
Al analizar los ltimos cuatro tratamientos 4, 8, 12 y 16
tenemos que el comportamiento fue que las dosificaciones de
BA determinaron los cambios de comportamiento en los
meristemos, el tratamiento 4 se mantiene de color marrn, el
tratamiento 8 cambia de color verde a blanco marrn, el
tratamiento 12 se mantiene el color verde,
para el ltimo
tratamiento que es el 16 cambia de color negro a blanco

marrn, los comportamientos de los meristemos no fueron
iguales para cada una de las diferentes dosis del medio de
cultivo.
2011
168
Tabla 3 Escala de colores para los
tratamientos al que
pertenecen los 30 das

Escala Cdigo
Codificacin
Cambi
C/c/b
C/c/m
C/c/b/m
C/c/n
C/C/v
de
color
1_3_4_7
de
color
de
color
C/c/f/v
Muerto
Mantiene
a
8_10_16
a
13_14_15
de
color
verde
6_9_11_12
Cambio de color
6
negro
Cambio
2_
blanco y marrn
Cambio
marrn
Cambio
color
blanco
Cambi
de
Tratamientos
verde y forma
a
5_
Como se observ en el grfico 8 y la tabla 3cada uno de los

tratamientos se encontr agrupado por sus caractersticas
cualitativas, tenemos que los tratamientos se ubicaron en las
2011
169
escalas en grupos de 5 y 6 que corresponden a los

tratamientos 6, 9, 11, 12 y 5.
Cuadro 23. Anlisis de variancia de la codificacin del
comportamiento de los meristemos con diferentes dosis de
Auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA) para Maxillaria grandis
F
F.V.
Gl
SC
CM
FC
Tab
0.01
0.05% %
Total
95
702.24 -
Tratamiento
s
16.42
15
246.41 7
1.817
2.75
**
2.31
1.652
Auxinas
29.615 9.872 5
NS 2.74
4.085
**
4.085
138.36 46.12 7.720

Citoquininas 3
Auxi
Vs
Cito
1.458
9
78.427 8.714 7
Repeticione
s
2.74
NS 2.02
2.68
NS 2.74
3.298
0.261
5
7.802
1.56
448.03
Error
75
5.974
2011
170
C.V. = 56.81%
Realizado el anlisis de ADEVA para los 45 das se observ
que los tratamientos fueron altamente significativos y al
dividirse su efecto la citoquininas arroj un valor altamente
significativo, los valores restantes fueron estadsticamente
iguales; los valores originales para realizar el ADEVA se
encuentran en el anexo 4. El coeficiente de variacin que se
dio para esta etapa es de 56.81% sigue siendo alto debido a la
heterogeneidad de los tratamientos en el desarrollo de los
meristemos, pero al comparar entre los 30 das y 45 das se
redujo en un 20.1% debido posiblemente a que los
tratamientos se comportaron homogneamente y dentro de la
escala.
de los meristemos con diferentes dosis de Auxinas (ANA-IBA)
y Citoquininas (BA) en Maxillaria grandis para los tratamientos
a los 45 das.
Auxin
vs
Tratamiento Citoq
Rangos
7.167
13
6.167
ab
16
5.833
ab
2011
171
14
5.667
ab
5.5
ab
10
5.333
ab
4.5
ab
11
4.5
ab
15
4.5
ab
12
4.167
ab
3.333
ab
3.333
ab
3.167
ab
ab
1.5
1.167
De la prueba de Tukey al 5% para los tratamientos tuvimos

que el tratamiento 6 (ANA 0.25 ppm-IBA 0.5 ppm, BA 0.25
ppm) se encontr en la escala 7 esto indica que una parte de
su tejido fenoliz y por consiguiente ocupa el rango a, el
tratamiento 13 (ANA 0 ppm - IBA 0 ppm, BA 1 ppm) se
encontr en el rango ab se
observ en una de sus
repeticiones un cambio de color pero en su mayora hubo una

elevada fenolinazacin, para los siguientes tratamientos:
2011
172
16 (ANA 0 ppm-IBA 0 ppm, BA 1 ppm); 14 (ANA 0.25-IBA 0.5

ppm, BA 1 ppm);
9 (ANA 0 ppm-IBA 0 ppm, BA 0.5 ppm) se
encontraron dentro del rango 6 de la escala esto indic que los

meristemos se encontraron viables de color verde y cambiaron
de forma el tratamiento 10 (ANA 0.25 ppm-IBA 0.5 ppm, BA
0.5 ppm) ste cambi de color pero no de forma, por esta
razn se encontr en el valor 5.33 de la escala.
Para los tratamientos 5, 11 y 15 estadsticamente se
encontraba en 4.5 cabe indicar que dentro de este tratamiento
no cambi en su totalidad a 5 debido a que una de sus
repeticiones se encontr de color negro.
Como resultados parciales para los 45 das vimos que la
interaccin entre auxinas y citoquininas se encontraron en su
mayora entre los tratamientos 10, 11, 14, 15 y 16 como bien
lo vimos cada una de las dosis de stos tratamientos se
encontraron en relacin a las dosis de citoquininas debido a
que en los tratamientos 5, 9 y 13 no contienen dosis de
auxinas por lo tanto las dosis de citoquinas fueron las
responsables de la interaccin y el cambio de color y forma
que se manifest en los meristemos.
2011
173
Cuadro 25.Codificacin para el comportamiento de los

meristemos con diferentes dosis y Citoquininas (BA) en
Maxillaria grandis para los tratamientos a los 45 das.
Dosis/Citoq BA
Promedios Rango
5.542
0.5
4.875
0.25
4.458
2.333
Para el caso de las citoquininas a los 45 das las dosis que

mejor resultaron y compartieron el rango a fueron las dosis
4(ANA 1 ppm-IBA 2 ppm, BA 1ppm), 3 (ANA 0.5 ppm, IBA 1
ppm, BA 0.5 ppm), y 2 (ANA 0.25ppm-IBA 0.5 ppm, BA 0.25
ppm) esto nos indic que dentro de la escala de colores los
tratamientos en su mayora se encontraron cambiando de color
y de forma, al comparar los resultados para los 30 das y 45
das vemos que hubo un aumento de su promedio en ms de
una unidad de cada una de las dosis, tambin se encontr
una mayor homogeneidad de los tratamientos para ubicarse
dentro de la escala.
Grfico 7. Codificacin para el comportamiento de los
2011
174
Citoquininas (BA) en Maxillaria gradis para los tratamientos a
Escala de colores
los 45 das desde la siembra.
Tratamientos
Para el primer grupo de tratamientos 1, 5, 9 y 13 que se

analiz para los 45 das tenemos, el tratamiento 1 se encontr
en los valores escala 5 a los primeros 15 das a los 30 das se
encontr en el valor 2 y a los 45 das se encuentra en el valor
codificado 3 de la escala de colores, esto no cambiaron de
forma por la falta de auxinas y citoquininas que no le permiti
elongar sus clulas y desarrollarse, y al comparar con otros
tratamientos que ya han cambiado de forma y color, el
tratamiento 1 se mantuvo en un color blanco marrn. Para el
tratamientos 5 se mantuvo de color verde y sigui su
desarrollo, para el tratamiento 9 en esta etapa ya cambi su
forma y se mantuvo de color verde, el tratamiento 13 paso de
2011
175
color negro una seccin del meristemo cambi de forma y color

el inusual comportamientos de este tratamiento se da
probablemente a que el meristemo ya comenz a absorber
mejor los nutrientes del medio de cultivo, para esta epata se
procedi a cambiar a los meristemos a un nuevo medio de
cultivo con las mismas concentraciones de macro y micro
elementos con sus respectivas dosificaciones de auxinas y
citoquininas, el meristemo posiblemente en las otras etapas
anteriores se encontr recubierto del medio de cultivo anterior
o al agotar este medio pas de una coloracin blanca o por
efectos de exposicin al ambiente de la cmara de flujo
laminar o por efectos de movimientos dentro del tubo de
ensayo a una coloracin negra al cambiar de medio el
meristemo reacciono.
En el tratamiento 2 entre los 15 y 30 das de coloracin se
encontr dentro de la categora 1 que es la coloracin blanca
y 3 que es la coloracin blanca marrn
esto se produjo
posiblemente por no tener dosificaciones de BA; para el

tratamiento 6 pas de color verde a fenolizado, esto pudo
darse probablemente en el momento de mover o cambiar los
meristemos o por efecto del corte, el tratamiento 10 cambi
dentro de la escala de colores pas de color marrn a color
2011
176
verde debido posiblemente a las dosis de auxinas, el

tratamiento 14 pas de color negro a verde.
Para los tratamientos subsiguientes ANA-IBA el tratamiento 3

retorn de color negro a color blanco marrn, al no tener
dosificaciones de BA el meristemo no present desarrollo. El
tratamiento 7 pas de color negro a color blanco marrn, el
tratamiento 11 se mantuvo de color verde, el tratamiento 15
pas de color negro a color verde probablemente la interaccin
entre auxinas y citoquininas como las responsables.
En el ltimo grupo (ANA-IBA ppm) tenemos el tratamiento 4

que se mantiene de la misma coloracin est fue de color
negro, para el tratamiento 8 tambin se mantuvo en el color,
este fue el blanco marrn, el tratamiento 12 cambi de color
negro a color verde, y por ltimo el tratamientos 16 cambi de
color blanco marrn a verde; tratamientos que se ubicaron en
el grfico 9.
Al analizar en el grfico 9 los tratamientos 1, 5, 9 y 13 y los
tratamientos 4, 8, 12 y 16 observamos que a mayor
concentracin de BA mejor resultados obtuvimos para estos 45
das de evaluacin.
2011
177
Tabla 4. Escala de colores y tratamientos al que pertenecen a

los 45 das
Escal
a
Cdigo
Codificacin
Tratamientos
C/c/b
2_
C/c/m
4_
Cambio de color a blanco y

3
C/c/b/m
marrn
1_3_7_8
C/c/n
12_
5_10_11_15
C/C/v
Cambio de color a verde y 9_13_14_16

6
C/c/f/v
Muerto
Mantiene
forma
_
6_
Al observar la tabla4pudimos agrupar cada uno de los

tratamientos dependiendo del comportamiento que tuvieron a
los 45 das y observamos que los tratamientos ya se ubican
entre los rangos de la escala 5 y 6 en su mayora.
2011
178
Cuadro 26. ADEVA de la codificacin del comportamiento del

la siembra.
F
F.V.
Gl SC
CM
FC
Tab
0.05%
0.01%
592.90
Total
95 6
Tratamiento
s
12.60
15 189.07 5
2.48
**
1.8175 2.31
1.144
Auxinas
17.448 5.816 5
Citoquinina
s
NS 2.74
4.085
23.17
3
69.531 7
4.561 **
2.74
4.085
2.02
2.68
102.09 11.34 2.232

Auxi Vs Cito 9
Repeticione
s
0.894
5
22.719 4.544 2
NS 2.74
3.298
381.11
Error
75 5
5.082
C.V. % = 45.37 %
2011
179
De los datos originales del Anexo 5 se realiz el ADEVA, para

tratamientos,
citoquininas,
se
obtuvo
valores
altamente
significativos y para la interaccin Auxinas vs Citoquininas fue

significativo. El coeficiente de variacin disminuy en 11.44 %
con relacin a los 45 das de evaluacin, esto nos indic que la
investigacin se consolida secuencialmente, al homogenizarse
las
respuestas
entre
comportamientos
de
un
mismo
tratamiento.
de los meristemos con diferentes dosis de Auxinas (ANA, IBA)
y Citoquininas (BA) para los tratamientos a los 60 das en
Maxillaria grandis.
Tratamientos X
Rangos
13
6.833
14
6.5
11
6.167
5.833
15
5.833
5.333
16
2011
180
4.833
4.167
10
3.833
12
3.5
3.333
2.833
2.5
En la prueba de Tukey para la interaccin entre los

Tratamientos y Auxinas vs Citoquininas tuvimos que todos los
tratamientos se encuentran en el rango a, el efecto que se
debe al coeficiente de variacin de alta y a la heterogeneidad
debido a que se trabaj con 1 tubo con un meristemo como
repeticin.
Los tratamientos 6 (ANA 0.25-IBA 0.5 ppm, BA 0.25 ppm);
11(ANA 0.5 ppm-IBA 1 ppm, BA 0.5 ppm);13 (ANA 0 ppm-IBA
0 ppm, BA 1 ppm); 14(ANA 0.25-IBA 0.5 ppm, BA 1 ppm) se
encuentran en los primeros lugares como podemos observar
stos tratamientos dentro de la escala se ubicaron en el rango
7, los tratamientos de este grupo se encontraban entre valores
que son 6 viable y 7 muerto parcial y para los tratamientos
9_11 (ANA 0 ppm-IBA 0 ppm, BA 0.5 ppm)
2011
se ubic con
181
exactitud en la escala de colores 6 en el cual representa

viabilidad, cambio de forma, y de color verde, porque todas sus
repeticiones se encontraron en desarrollo, los tratamientos 5
(ANA 0 ppm-IBA 0 ppm, BA 0.25 ppm); 15(ANA 0.5ppm-IBA 1
ppm, BA 1ppm); estadsticamente fueron del mismo valor 5.8
estos tratamientos en una de sus repeticiones no cambi en su
totalidad para ubicarse en el rango 6, el tratamiento 4 (ANA 1
ppm-IBA 2 ppm, BA 0 ppm); con valores promedio 5.3 este
tratamiento se mantuvo en color verde, no progres a cambiar
de forma, el tratamiento 16 (ANA 1 ppm-IBA 2 ppm, BA 1
ppm); se ubic en su totalidad en el rango 5 se mantuvo de
color verde.
El resto de tratamientos evaluados se encuentran en la escala
de colores de 2 y 3 los cuales indicaron con su coloracin
marrn y blanca marrn que no son viables.
de los meristemos con diferentes dosis de Citoquininas (BA) en
Maxillaria grandis para los tratamientos a los 60 das.
Dosis/Citoq BA Promedios Rango
4
0.25 5.208
ab
0.5
ab
6.083
4.875
2011
182
3.708
Para las Citoquininas tuvimos que el rango a ocupa la dosis

(BA 1 ppm) con un promedio de 6.083 al comparar con las
evaluaciones a los 45 das se not que el incremento de valor
de 0.54 fue importante ya que el valor promedio codificado
5.54 a 6.083 esto nos dio un indicio que el comportamiento de
los meristemos ha progresado de verde a verde y cambio de
forma, los rangos ab comparte las dosis 2 (BA 0.5 ppm) con
un promedio de 5.208, se increment en 0.758 al comparar
con los 45 das este cambio fue debido posiblemente a que las
citoquininas contienen esta dosis han pasado de color negro a
color verde y la dosis 3 de (BA 0.5 ppm) se mantiene en su
promedio se encontraban entre color negro a verde, para la
dosis 1 (BA 0 ppm) ocup el rango b con un aumento de
1.37 al comparar con los 45 das.
Grfico 8. Codificacin del comportamiento de los
los 60 das.
2011
183
Escala de colores
Tratamientos
El tratamiento 1 se mantiene en el valor 3 este fue de color

blanco marrn, para el tratamiento 5 (ANA 0 IBA 0; BA 0.25)
se mantuvo del color verde y cambi de forma, para el
tratamiento 9(ANA 0 IBA 0; BA 0.5) mantuvo su forma y
color, estos datos se muestran en la fotografa 63, el
meristemo de este tratamiento se desarroll mejor en
comparacin con los otros tratamientos. El tratamiento 13 pas
de color verde y forma a fenolizado. Al concluir el anlisis de
este grupo de tratamientos podemos decir que las dosis bajas
de BA resultaron mejor en las dosificaciones de 0.25 y 0.5 de
BA pero sin interaccin.
2011
184
Para los tratamientos subsiguientes de ANA 0.25 y 0.5 de IBA

tenemos:
Tratamiento 2 pas de color blanco a blanco marrn, el
tratamiento 6 se encontr fenolizado y se mantuvo de esta
forma desde los 45 das. El tratamiento 10 pas de color verde
a color negro, el tratamiento 14 cambi de color verde a
fenolizado, por lo que podemos concluir que al aumentar las
dosis de auxinas (ANA-IBA) tenemos altos porcentajes de
fenolizacin de los meristemos. Para el tratamiento 3 se
mantiene de color blanco marrn, para el tratamiento 7 cambi
de forma y se mantiene de color verde, el tratamiento 11(ANA
0.5 IBA 1; BA 0.5) de blanco marrn paso a verde y cambio
de forma, el tratamiento 15 (ANA 0.5 IBA 1; BA 1)
el
meristemo cambio de forma y se mantiene de colore verde. Al

comparar estos tratamientos con la evaluacin de los 45 das
el tratamiento 3 no cambia de forma ni color posiblemente por
la alta concentracin de ANA-IBA y la ausencia de BA en su
medio de cultivo, para el tratamiento 7 paso de blanco marrn
a verde, para el tratamiento 15 el meristemos cambia de forma.
Para el ltimo grupo de tratamientos el nmero 4 pasa de
color negro a verde este cambio se produjo probablemente por
el cambio de medio que se realiz a los 45 das y el meristemo
reaccion favorablemente pero este cambio no se mantuvo
2011
185
por un periodo prolongado de tiempo ya que las dosis son muy

altas de auxinas y no contiene dosis de citoquininas, al no
tener dosis de BA el meristemo no se desarroll. El tratamiento
8 se mantiene de color blanco marrn posiblemente este
cambio se dio a que la dosis de BA no est equilibrado con las
dosis de auxinas, el tratamiento 12 se mantiene de color negro
esto es debido probablemente a la reducida concentracin de
BA y para el tratamiento 16 se mantuvo de color verde. En la
siguiente tabla podemos observar el comportamiento de cada
uno de los tratamientos.
Tabla 5 Escala de colores y ubicacin de los tratamientos de
acuerdo a las caractersticas cualitativas que manifestaron a
los 60 das.
Escala Cdigos Codificacin
1
C/c/b
C/c/m
Tratamientos
Cambio de color a blanco y

3
C/c/b/m
marrn
1_3_8_
C/c/n
2_12_
C/C/v
4_7_10_16_
Cambio de color a verde y

6
C/c/f/v
forma
5_9_11_15_
2011
186
Muerto
Mantiene
6_13_14_
Cuadro 29. ADEVAde la codificacin del comportamiento de

la siembra.
F
F.V.
Gl
SC
CM
FC
Tab
0.05%
0.01%
Total
95
446.24 -
15
117.41 7.827 1.89
Tratamiento
s
1.8175 2.31
1.906
Auxinas
23.698 7.899 3
NS 2.74
4.085
NS 2.74
4.085
NS 2.02
2.68
NS 2.74
3.298
1.718
Citoquininas 3
21.365 7.122 6
1.939
Auxi Vs Cito 9
72.344 8.038 8
Repeticione
s
0.871
5
18.05
3.61
2011
187
310.78
Error
75
4.144
C.V. = 35.73%
A los 75 das de desarrollo en medio de cultivo in vitro con

diferentes dosis de ANA e IBA, al realizar el ADEVA con los
datos originales del anexo 6 nos da como resultado que todos
los tratamientos fueron estadsticamente diferentes y por su F.
calculado dio significativo.
El C.V. a los 75 das tuvo un valor de 35.73% este fue alto

debido a que los meristemos no se consolidan dentro de la
escala de desarrollo de los meristemos, pero al comparar el
coeficiente de variacin con la etapa anterior de evaluacin
vemos que bajo de 45.37 a 35.73, lo que significa una
respuesta ms uniforme de cada una de las unidades
experimentales.
2011
188

Auxin
Vs
Tratamiento Citoq
Rangos
13
6.833
14
6.667
6.333
11
6.167
15
6.167
16
6.167
5.833
5.667
10
4.667
12
4.667
2011
189
La prueba de Tukey forma 1 solo rango entre los valores

promedios de codificacin de 3 a 7, esto se debe al efecto que
tiene el coeficiente de variacin sobre la prueba de Tukey.
El tratamientos 13 y 4 se encuentran en el valor de la escala
de colores es 7 que representa que el meristemo ha muerto
parcialmente su tejido.
Del grupo de tratamientos que presentan caractersticas
favorables para desarrollo y sobrevivencia de los meristemos
se encuentran los tratamientos 2, 11, 15, 16, 9, 1, 5 y 1 se
encuentra en evolucin su promedio se encuentra entre 5 y 6.3
definido entre la escala de viabilidad.
Para el tratamiento 9 es el que se encontr en el rango 6 al
comparar con la evaluacin anterior se mantiene en este rango
al observar cada una de sus repeticiones se detecto un
incremento en su desarrollo, adems que se tuvo la
sobrevivencia del 100% de los meristemos y con un
comportamiento homogneo, entre ellos podemos observar en
la fotografa 64.
2011
190
Para el tratamientos 10 todas sus repeticiones se encontraron

de color verde, en forma descendente el resto de tratamientos
se encontraron en la escala de color blanco marrn a negro.
Grfico 9.Codificacin del comportamiento de los meristemos
con diferentes dosis de Auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA)
en Maxillaria grandis para los tratamientos a los 75 das desde
Escala de colores
la siembra.
Tratamientos
Como se puede observar el tratamiento 1 cambio de blanco

marrn a verde y de forma esta reaccin de dio posiblemente
ya que se realiz movimientos del meristemo dentro del mismo
tubo para una mejor absorcin del nutriente, el tratamiento 5
se mantiene de color verde y sigue su divisin fotografa 64
para el tratamiento 9 se mantiene como el tratamiento 5, en
esta etapa se observ que algunos tratamientos han muerto
2011
191
parcialmente o definitivamente como es el caso del tratamiento

4, 6, 13,14.
Para los otros tratamientos como el 2 este cambi de color
negro a verde posiblemente este cambio no sea definitivo ya
que este tratamiento ha sido irregular se ubico encontr entre
los colores de blanco, negro, verde, los meristemos tambin
ocurri en el tratamiento 10.
Los tratamientos 3_7 se mantienen en el color blanco marrn
a partir de la evaluacin de los 60 das estos tratamientos no
manifestaron cambios, para el tratamiento 11_15 se mantienen
de color verde pero no se continua se desarrollo progresivo de
los meristemos.
Para el tratamiento 8 cambi de color de blanco marrn a
negro, el tratamiento 12 pas a color negro a color verde, para
el tratamiento 16 pas de color verde y cambi de forma, estos
cambios se dieron probablemente por el movimiento de los
meristemos dentro del tubo.
Tabla 6 Escala de colores y tratamientos al que pertenecen a
los 90 das
Escal
a
Cdigos Codificacin
Tratamientos
2011
192
C/c/b

Cambi
C/c/m
de
color
marrn
Cambio de color a blanco
C/c/b/m y marrn
3_
C/c/n
Cambio de color a negro 8_
C/C/v
Cambio de color a verde 7_10_12_

Cambio de color a verde 1_2_5_9_11_15_1
C/c/f/v
Muerto
y forma
6_
4_6_13_14_
Mantien
8
Tabla 6 se ubican los tratamientos de acuerdo a las

caractersticas cualitativas que manifestaron los tratamientos y
de la escala de colores, la mayora de tratamientos se
encuentran en la escala 6.
2011
193
Cuadro 31. ADEVA de la codificacin del comportamiento de

la siembra.
F.V.
Gl SC
CM
FC
F Tab 0.05%
0.01%
15.2
Total
95 4
Tratamiento
s
15 6.74 0.449
4.17
**
1.8175 2.31
2.94
Auxinas
0.983
1.36
Citoquininas 3
0.455
4.085
**
2.74
4.085
2.02
2.68
NS
2.74
3.298
2.505
0.27
0.42
Repeticiones 5
2.74
4.225
2.42
Auxi Vs Cito 9
9.129 **
0.793
0.085
8.07
Error
75 3
0.108
C.V. % = 4.82 %
2011
194
A los 90 das de evaluacin con los datos originales del anexo

7 tenemos como resultado que los datos para Tratamientos,
Auxinas, Citoquininas, fueron altamente significativos, y la
interaccin entre auxinas y citoquininas fue significativo.
El C.V. baja a 4.82%, es bajo y aceptable para trabajar dentro
del laboratorio debido a la uniformidad de las unidades
experimentales.
en Maxillaria grandis para los tratamientos a los 90 das desde
la siembra.
Dosis/Auxi
Auxinas
Promedios
Rango
0.5
6.917
0.25
0.5 6.75
6.542
ab
b
Para la ltima etapa de evaluacin el rango a se encuentra

compartido por las dosis 4(ANA 1-IBA 2) con un promedio de 7
y dosis 3(ANA 0.5-IBA 1) con un promedio de 6.917, los
tratamientos con estas dosificaciones, los meristemos han
2011
195
muerto
totalmente
adems
han
mantenido
con
estas
caractersticas desde las anteriores evaluaciones, en la escala

de colores con los 2 rangos ab se ubic la dosis 2 (ANA
0.25-IBA 0.5) con un promedio de 6.75 en estas dosis el valor
promedio fue afectado con otros comportamientos que
determino las auxinas y en ltimo lugar tenemos la dosis 1
(ANA 0-IBA 0) con un promedio de 6.542, promedio que nos
manifiesta un alto porcentaje de valores que se encuentran en
7 que corresponde a muerte de meristemos.
a los 90 das.
Auxin
vs
Tratamiento Citoq
Rangos
16
12
2011
196
15
6.833
13
6.833
11
6.833
6.833
6.833
10
6.667
14
6.5
ab
6.5
ab
Al observar los rangos de evaluacin para los tratamientos a

los 90 das, todos los tratamientos con excepcin del 9 se han
definido en el rango a.
Los tratamientos 14, 5 y 9 son los que manifestaron
caractersticas
adecuadas
para
el
desarrollo
de
los
meristemos.
de los meristemos con diferentes dosis de Citoquininas (BA) en
Maxillaria grandis para los tratamientos a los 90 das desde la
siembra.
Dosis/Citoq Citoquininas Promedios Rango
2011
197
6.958
0.25
6.833
ab
6.792
ab
0.5
6.625
Para los 90 das la dosis de auxinas
tuvo el siguiente
comportamiento, al incrementar las dosis de BA hasta 3 se

pas a cero etapa de sobrevivencia de meristemos, la dosis 4
determin una mayor mortandad que la dosis 3.
Grfico 10. Comportamiento de los meristemos con
diferentes dosis de Auxinas (ANA, IBA) y Citoquininas (BA) en
Maxillaria grandis para los tratamientos a los 90 das desde la
Escala de colores
siembra.
Tratamientos
2011
198
El tratamiento 9 present caractersticas favorable para el

comportamiento de los meristemos con diferentes dosis de
Auxinas (ANA, IBA) y Citoquininas (BA) en Maxillaria grandis.
Tabla 7 Escala de colores y tratamientos al que pertenecen a

los 90 das
Escal Cdigo
a
Codificacin
Tratamientos
Cambi de color a
1
C/c/b
blanco
Cambi de color a
C/c/m
marrn
Cambio de color a
C/c/b/m blanco y marrn

Cambio de color a
C/c/n
negro
Cambio de color a
C/C/v
verde
Cambio de color a
C/c/f/v
verde y forma
9_
1_2_3_4_5_6_7_8_10
Muerto
_11
2011
199
12_13_14_15_16_
Mantien
8
En la tabla 7se ubican los resultados que se obtuvieron dentro

de la investigacin, el tratamiento 9 con dosis de(ANA 0, IBA 0,
BA 0.5) es el tratamiento que dio resultado al 100% de
sobrevivencia y su comportamiento fue similar en los 6
repeticiones, para el resto de tratamientos la mayora de los
tratamientos y en sus repeticiones murieron al tomar una
coloracin negra.
Cabe indicar que se realiz una evaluacin sobre las
repeticiones que sobrevivieron, sus porcentajes van de 17% al
50%
2011
200
Grfico 11. Porcentaje delos meristemos vivos con diferentes

dosis de Auxinas (ANA- IBA) y Citoquininas (BA) en Maxillaria
grandis para los tratamientos a los 132 das.
T9 100
T14 50
T5 50
T 10 33
T 11 17
T 6 17
T 1 17
T 7 17
T 13 17 T15 17
Tabla 8. Porcentaje de sobrevivencia por tratamientos y

repeticiones
Tratamientos ANA
IBA BA
Porcentaje Rep
17
Rep 3
0.25
50
Rep 1,3,5
0.25
0.5 0.25
17
Rep 4
0.5
17
Rep 3
0.25
Rep
9
0.5
2011
100
1,2,3,4,5,6
201
10
0.25
0.5 0.5
33
Rep 4,6
11
0.5
0.5
17
Rep 3
13
17
Rep 2
14
0.25
0.5 1
50
Rep 3,5,6
15
0.5
17
Rep 4
El tratamiento 9 con dosis de (ANA 0 ppm-IBA 0 ppm, BA 0.5

ppm) resulta al 100% en el desarrollo de los meristemos
sembrados.
El 50% de sobrevivencia se encuentran en los tratamientos 5
y 14, el tratamiento 10 tuvo un porcentaje del 33%, los
tratamientos 1, 6, 7, 11, 13 y 15 comparten el 17%, stos
porcentaje se deben a que dentro de cada una de las unidades
experimentales se sembr y manejo 1 meristemo que fue
cambiando de ubicacin por 10 veces y a medio de cultivo 2
veces que gener daos por la manipulacin dentro y fuera del
tubo de ensayo y conservados en el cuarto de crecimiento
intensivo.
Grfico 12. Valores codificados para los Tratamientos del
comportamiento de los meristemos cada 15 das de Maxillaria
grandis.
2011
202
15 das
30 das
45 das
Escala de colores
60 das
75 das
90 das
Con los promedios del ADEVA del anexo 8 se realiz el grfico

11, en el cual los tratamientos con cada uno de los meristemos
se comportaron de la siguiente manera: para cada una de las
diferentes etapas de evaluacin. Desde los 9 a 15 das se
realizaron 4 movidas de ubicacin de los meristemos dentro
del medio de cultivo.
Primera evaluacin.- el color de los meristemos se caracteriz
por encontrarse dentro de un color marrn, blanco marrn y
negro (2, 3, y 4) dentro del rango se encontraron los siguientes
tratamientos 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 12, 16.
Entre los 15 y 30 das se cambiaron la ubicacin de los
meristemos 2 ocasiones dentro del tubo de ensayo.
2011
203
Los meristemos de acuerdo a la escala de colores se

manifestaron un descenso de los valores dentro de la escala
de colores; los tratamientos formaron 3 grupos, en el primero,
los de color blanco y blanco marrn (1, 3) se localizan los
tratamientos: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 16 y el otro grupo de los
tratamientos 6, 9, 11, 12, 13, 14, 15
sus meristemos
mantuvieron una coloracin negro dentro de la escala de

colores para el tratamientos 5 manifest un color verde con
cambio de forma del meristemo.
Entre los 30 y 45 das, se realiz 1 movida, adems se efectu
a los 45 das el cambio a medio fresco, y manifestaron un
incremento de los valores que corresponde a las evaluaciones
cualitativas del color de los meristemos, esta caracterstica no
manifiesta los tratamientos 2, 5, 11 y 12. Los colores blanco
marrn y negro en los meristemos, se present en los
tratamientos 1, 3, 7, 8, 11, 12 y 15. Otro grupo se encuentra
conformada por los tratamientos 6, 9, 10, 13, 14 y 16 pues los
meristemos presentaron coloracin verdes.
La evaluacin realizada a los 60 das, los meristemos se
desarrollaron en medio de cultivos frescos, adems de su
cambio existi el efecto de extraccin y exposicin a efectos
del aire de la cmara de flujo laminar, que se refleja en los
tratamientos 1, 3, 6, 10, 16 y se mantuvieron en el mismo valor
2011
204
de la escala de colores, en el tratamiento 8 podra ser la causa

de muerte de los meristemos como se dio en el caso del
tratamiento 13, como consecuencia del nuevo medio de cultivo
con la misma dosificaciones de auxinas y citqouininas utilizada
para la siembra de meristemos, se encontr un incremento en
sus valores de la codificacin del color para los tratamientos 2,
4, 5, 7, 9, 11, 12, 14, y 15, los tratamientos 9 y 11 se
incrementaron de color verde y con un cambio de forma de los
meristemos.
A los 75 das de desarrollo in vitro de los meristemos de
Maxillaria grandis se encontr el siguiente comportamiento: no
se determino cambios en relacin a la evaluacin de los 60
das los tratamientos 9, 11, 15 y 16 se ubican los meristemos
con un color verde adems presentaron cambios de forma.
A los 90 das los meristemos presentaron el siguiente
comportamiento: los tratamientos 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 15
y 16 se ubicaron dentro de la escala de colores en el valor
codificado 7 el cual representa muerte. Los tratamientos 4 y 6
se mantuvieron desde la evaluacin anterior en la escala 7,
con una muerte total, de los meristemos. Los tratamientos 13 y
14 bajan su valor dentro del comportamiento de los
meristemos pero al tener un porcentaje alto de mortandad se
ubic dentro de la escala 7. Para el tratamiento 9 con todas
2011
205
sus repeticiones se ubicaron en el rango 6, el cual determin el

cambio de forma y su desarrollo para el comportamiento de los
meristemos.
Grfico 13. Promedios del Anlisis de ADEVA para Auxinas
de los meristemos con en Maxillaria grandis para los
tratamientos.
Ttulo del eje
Series1
Series2
Series3
Series4
Del grfico 16, las dosis de auxinas mantuvieron en

comportamiento de descenso de los 9 a los 30 das, luego
presentaron un incremento hasta la evaluacin de los 90 das
en sus colores codificados.
A los 15 das los meristemos se caracterizaron por presentar
colores entre verde y negro, a los 30 das las dosis de 2, 3 y 4
presentaron un color blanco marrn, a los 45 das las dosis 1 y
2011
206
2 se ubic prximo al verde y las dosis 3 y 4 en un valor negro,

a los 60 das las dosis 1, 2, y 3 de color verde y dosis de color
negro, a los 75 das las dosis 1 y 2 los meristemos estn de
color verde y cambio de forma y las dosis de 3 y 4 de color
verde, a los 90 das prximos a su muerte.
Grfico 14. Promedios de valores codificados para las dosis
de Citoquininas del comportamiento de los meristemos de
Escala de colores
Maxillaria grandis en cada una de las etapas de evaluacin.
Series1
Series2
Series3
Series4
En el grfico 17 se define el siguiente comportamiento: de los

valores codificados para los 9 das existi un descenso para
los 15 das y luego se presenta un incremento, la dosis de
citoquininas 3 son las evaluaciones de los 45 y 60 das,
2011
207
manifest similitud en sus valores, de igual manera se

comport la dosis 2 entre las evaluaciones a los 60 y 75 das.
2011
208
V.
Conclusiones.
El tratamiento 9 (ANA 0 ABA 0 y BA 0.5) se mantuvo
con una coloracin
verde y cambio de forma una
sobrevivencia del 100%, con un 50% de sobrevivencia

se encontraron los tratamientos 5 (ANA 0 ABA 0,
BA 0.25) y 14 (ANA 0.25 ABA 0.5 y BA 1) a los 90
das.
A los 15 das de evaluacin los meristemos tuvieron un
descenso de comportamiento segn la escala de
colores que se ubic entre blanco marrn y negro.
A los 30 das el tratamiento 5 (ANA 0 ABA 0, BA
0.25) tuvo un cambio de color a verde y forma pero
este cambio no se mantuvo.
A los 45 das los tratamientos 6 (ANA 0.25 ABA 0.5,
BA 0.25), 9 (ANA 0 ABA 0, BA 0.5); 10 (ANA 0.25
ABA 0.5, BA 0.5); 13 (ANA 0 ABA 0, BA 1); 14 (ANA
0.25 ABA 0.5 y BA 1); y 16 (ANA 1 ABA 2, BA 1)
presentaron coloracin verde.
2011
209
A los 60 das los tratamientos se 9 (ANA 0 ABA 0, BA

0.5)y 11 (ANA 0.5 ABA 1 y BA 0.5) manifestaron
cambio de color a verde y de forma en sus meristemos.
A los 75 das posteriores a la siembra los tratamientos
9 (ANA 0 ABA 0, BA 0.5) y 11 (ANA 0 ABA 0 y BA
0.25) mantuvieron y los tratamientos 5 y 16 se ubicaron
con un cambio de color y forma.
Para la investigacin se realiz 10 movimientos de los

meristemos dentro de cada uno de los tubos, y con 2
medios de cultivos con cada una de las
concentraciones y dosificaciones de sales minerales
planteadas.
2011
210
VI.
Recomendaciones.
Utilizar el medio de cultivo Phytamax al 33.3% ms

ANA 0 IBA 0 y BA 0.5 ppm que conforma el
tratamiento 9 para obtener el 100% de sobrevivencia.
Se debe mejorar el medio de cultivo para el gnero
Maxillaria para obtener plantas vigorosas in vitro; e
investigar los efectos a diferentes intensidades de luz y
temperatura; dejar en obscuridad hasta los 30 das
para evitar fenolizaciones de los meristemos.
Trabajar con ms de un tubo por unidad experimental
para conformar una repeticin.
No trabajar con el tratamiento 4 (ANA 1 IBA 2; BA 0)

y 8 (ANA 1 IBA 2; BA 0.25)
debido a que estos
tratamientos no cambiaron de color a verde se

mantuvieron dentro del los rangos de color blanco a
negro.
2011
211
Investigar dosis de auxinas y citoquininas para producir

callosidades
incrementar
los
coeficientes
de
multiplicacin in vitro.
Realizar trabajos similares o diferentes con otras
especies de orqudeas.
2011
212
VII. Resumen
INTRODUCCIN
Uno de los principales problemas que se presentan en la
familia de las Orchidaceae son los virus, que eliminan por
completo al cultivo y por ende la produccin de la flor cortada.
Comprendiendo la importancia econmica, medicinal, y de
endemismos de las orqudeas, y sabiendo que nuestro pais
cuenta con una adecuada biodiversidad para el desarrollo de
este tipo de plantas, encontramos una gran gama de especies
que llaman la atencin no slo por sus atractivos, sino tambin
para la investigacin cientfica. Entre las principales especies
de orqudeas tenemos a la Maxillaria grandis, la misma que se
encuentra en peligro crtico, por ello nos vemos en la
obligacin de realizar estudios referentes a salvaguardar las
especies. Por esta razn la investigacin se encamina en
desarrollar a nivel in vitro meristemos, con diferentes dosis de
Auxinas (ANA-IBA) y Citoquininas (BA) en la especie de
Maxillaria grandis, as como determinar el comportamiento y
variaciones que pudieron tener. Para obtener los resultados
planteados se procedi a la recopilacin y clasificacin de
informacin para determinar las caractersticas de la especie
en estudio, toda esta investigacin se realiz en el Laboratorio
de Cultivo de Tejidos de la Facultad de Ciencias
2011
213
OBJETIVOS E HIPTESIS
Objetivo general.
- Desarrollar meristemos de Maxillaria grandis a nivel in
vitro
Objetivos especficos.
- Evaluar el porcentaje de meristemos vivos despus de la
siembra.
- Evaluar los comportamientos y
variaciones de los
meristemos in vitro
Hiptesis.

CITOQUININA (BA) actan de manera diferente para el
desarrollo de meristemos in vitrio en la especie Maxillaria
grandis?
CITOQUININA
(BA)
no
tienen
efecto
en
el
comportamiento para el desarrollo de meristemos in vitrio

en la especie Maxillaria grandis?.
MATERIALES Y MTODOS
2011
214
La presente investigacin se realiz en el Laboratorio de

Tejidos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad de Cuenca, ubicada en:
Cantn:
Cuenca.
Provincia:
Azuay
Parroquia:
Yanuncay.
Altitud: 2 584 m.s.n.m.

UTM: E 719768
N 9677340.
Temperatura Laboratorio (cmara del cultivo): 20 a 25 C

Precipitacin promedio: 847 mm/ao
La metodologa de esta investigacin fue la misma que se
utiliza en el trabajo de laboratorio de la Facultad, esta ha sido
impartida por el Ing. Francisco Merchn, resumida as:
Primera fase.-Se prepar los reactivos y soluciones de
acuerdo a las dosis y concentraciones del medio de cultivo
para la investigacin.
Segunda fase.-Se prepar los medios de cultivo de acuerdo
a los tratamientos y nmero de repeticiones; dispensados en
tubos.
2011
215
Tercera fase.-Esterilizacin de materiales y medio de cultivo

(vidriera, papel, agua, medio de cultivo) en auto clave.
Cuarto fase.-Preparacin del material vegetal, laboratorio,
estufa, cmara de flujo laminar, pinzas, bisturs, papel, para
los frascos, flameado, y destapado, eliminacin de medios
de cultivo no aptos para la siembra.
Quinta fase.- Dentro del material vegetal se identific los
mejores explantes que se encontr en los frascos para la
extraccin de meristemos.
Sexta fase.- Extraccin y siembra de meristemos dentro de
la cmara de flujo laminar uso de papel estril, bisturs, y
jeringuillas hipodrmicas de insulina para el corte del
meristemo, flameados de tubos, corte del agar para dejar el
meristemo en el medio de cultivo, flameado del tubo,
tapado, trasporte a la cmara de crecimiento cada uno de
los tubos, mover los meristemos cada da y cambiar a nuevo
medio.
Sptima etapa.-Toma de datos.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
El tratamiento 9 (ANA 0 ABA 0 y BA 0.5) se mantuvo
con una coloracin
verde y cambio de forma una

2011
216
sobrevivencia del 100%, con un 50% de sobrevivencia

se encontraron los tratamientos 5 (ANA 0 ABA 0,
BA 0.25) y 14 (ANA 0.25 ABA 0.5 y BA 1) a los 90
das.
A los 15 das de evaluacin los meristemos tuvieron un
descenso de comportamiento segn la escala de
colores que se ubic entre blanco marrn y negro.
A los 30 das el tratamiento 5 (ANA 0 ABA 0, BA
0.25) tuvo un cambio de color a verde y forma pero
este cambio no se mantuvo.
A los 45 das los tratamientos 6 (ANA 0.25 ABA 0.5,
BA 0.25), 9 (ANA 0 ABA 0, BA 0.5); 10 (ANA 0.25
ABA 0.5, BA 0.5); 13 (ANA 0 ABA 0, BA 1); 14 (ANA
0.25 ABA 0.5 y BA 1); y 16 (ANA 1 ABA 2, BA 1)
presentaron coloracin verde.
A los 60 das los tratamientos se 9 (ANA 0 ABA 0, BA
0.5)y 11 (ANA 0.5 ABA 1 y BA 0.5) manifestaron
cambio de color a verde y de forma en sus meristemos.
2011
217
A los 75 das posteriores a la siembra los tratamientos

9 (ANA 0 ABA 0, BA 0.5) y 11 (ANA 0 ABA 0 y BA
0.25) mantuvieron y los tratamientos 5 y 16 se ubicaron
con un cambio de color y forma.
Para la investigacin se realiz 10 movimientos de los

meristemos dentro de cada uno de los tubos, y con 2
medios de cultivos con cada una de las
concentraciones y dosificaciones de sales minerales
planteadas.
RECOMENDACIONES
Se debe mejorar el medio de cultivo para el gnero
Maxillaria para obtener plantas vigorosas in vitro; e
investigar los efectos a diferentes intensidades de luz y
temperatura; dejar en obscuridad hasta los 30 das
para evitar fenolizaciones de los meristemos.
No trabajar con el tratamiento 4 (ANA 1 IBA 2; BA 0)
y 8 (ANA 1 IBA 2; BA 0.25)
debido a que estos
tratamientos no cambiaron de color a verde se

mantuvieron dentro del los rangos de color blanco a
negro.
2011
218
Investigar dosis de auxinas y citoquininas para producir

callosidades
incrementar
los
coeficientes
de
multiplicacin in vitro. Realizar trabajos similares o

diferentes con otras especies de orqudeas.
2011
219
VIII. Summary
INTRODUCTION
One of the main problems that arise in the family Orchidaceae
are viruses, which completely eliminated the crop and hence
the production of cut flowers. Understanding the economic,
medicinal, and endemic species of orchids, and knowing that
our country has an adequate biodiversity for development of
these plants, we found a wide range of species that call the
attention not only for its attractions, but also for scientific
research. Among the main species of orchids have to Maxillaria
grandis, the same as critically endangered, so we feel obliged
to conduct studies relating to safeguarding the species. For this
reason the research is aimed at developing in vitro meristems,
with different doses of auxin (NAA, IBA) and cytokinin (BA) in
the species of Maxillaria grandis, and to determine the behavior
and variations that might have. To get the results raised
proceeded to the collection and classification of information to
determine the characteristics of the species under study, all this
research was conducted in the Tissue Culture Laboratory,
Faculty of Science
OBJECTIVES
General objective
2011
220
- Develop grandis Maxillaria meristems in vitro

Specific objectives
- Evaluate the percentage of living meristems after
planting.
- Evaluate changes in behavior and in vitro meristems
Hypotheses.
- Different doses of Auxins (IBA and NAA) and cytokinin
(BA) to act differently in meristem development in the
species Maxillaria Vitria grandis?
- Different doses of Auxins (IBA and NAA) and cytokinin
(BA) have no effect on the behavior of meristem
development in Maxillaria species Vitria in grandis?.
MATERIALS AND METHODS

This research was conducted at the Laboratory of Textiles,
Facultyof Agricultural Sciences, University of Cuenca, located
at:
City: Cuenca.
Province: Azuay
Parish: Yanuncay.
2011
221
Altitude: 2584 m.s.n.m.

UTM:E 719768 N 9677340.
Temperature Laboratory (crop camera): 20 to 25 C
Average rainfall: 847 mm / year.
The methodology of this research was the same as that used in

laboratory work at the School, this has been provided by Mr.
Francisco Merchan, summarized as follows:
The first phase.- reagents and solutions prepared according to
thedose and concentration of the culture medium for research.
Second phase.- Prepared
culture media
according
to
treatment and number of repetitions, dispensed into tubes.

Third phase.- Sterilization of materials and culture media
(glass,paper, water, culture medium) in an autoclave.
Fourth phase.- Preparation of plant material, lab oven, laminar
flow chamber, forceps, scalpels, paper, for bottles, flamed, and
uncovered, removal of culture media unsuitable for planting.
Fifth phase of the plant material.- Within identified the
bestexplants was found in the vials for the extraction of
meristems.
2011
222
Sixth phase.- Meristem removal and planting within the

laminar flow chamber using sterile paper, scalpels and
hypodermic syringes, insulin meristem cutting, flame tubes, cut
to leave the meristem agar in the culture medium flame tube ,
covered, transport to the growth chamber each tube, move the
meristems each day and switch to new media.
Seventh phase.- Data collection.
RESULTS AND CONCLUSIONS
The treatment 9 (ANA 0 - ABA BA 0 and 0.5) was maintained
with a green color change is a 100% survival, with 50%
survivaltreatments were 5 (ANA 0 - 0 ABA, BA 0.25) and 14
(ANA 0.25 -0.5 ABA and BA 1) at 90 days.
At 15-day trial meristems had a decrease in behavior that the
color scale was between brown and black white.
At 30 days of treatment 5 (ANA 0 - 0 ABA, BA 0.25) had a color
change to green, but this change is not sustained.
At 45 days of treatment 6 (ANA 0.25 - ABA 0.5, BA 0.25), 9
(ANA0 - 0 ABA, BA 0.5), 10 (ANA 0.25 - ABA 0.5, BA 0.5), 13
(ANA 0 -ABA 0, BA 1), 14 (ANA 0.25 - 0.5 ABA and BA 1),
and 16 (ANA 1- ABA 2, BA 1) is colored green.
2011
223
At 60 days the treatments were 9 (ANA 0 - 0 ABA, BA 0.5) and

11 (ANA 0.5 - ABA BA 1 and 0.5) showed color change to
green and how their meristems.
At 75 days after sowing treatments 9 (ANA 0 - 0 ABA, BA 0.5)
and 11 (ANA 0 - ABA BA 0 and 0.25) and kept the treatments 5
and 16 were placed with a change of color and form .
For the research was carried out 10 moves of meristems
withineach of the tubes, and 2 medium with each of the
concentrationsand dosages of minerals raised.
RECOMMENDATIONS
It should improve the culture medium for the genus Maxillaria
vigorous plants for in vitro and investigate the effects of
different intensities of light and temperature in the dark leave to
30 days to avoid phenolized of meristems.
We do not recommend working with treatment 4 (ANA 1 - IBA
2;BA 0) and 8 (ANA 1 - IBA 2, BA 0.25) because these
treatments do not change color to green remained within the
ranges from white to black.
Investigate doses of auxins and cytokinins to produce calluses
and increase in vitro multiplication coefficients. Similar work or
different orchid species
2011
224
IX.
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2011
230
X.
Anexos
Anexos 1. Datos originales para realizacin del analisis
de ADEVA para los 9 das de comportamiento de los
meristemos.
Tratamientos Auxinas Citoquininas Repeticiones 9 das

1
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Anexo 2. Datos originales para realizacin del analisis de

ADEVA para los 15 das de comportamiento de los
meristemos.
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10
10
10
10
10
10
11
11
11
11
2011
263
11
11
12
12
12
12
12
12
13
13
13
13
13
13
14
14
14
14
14
14
15
15
15
2011
264
15
15
15
16
16
16
16
16
16
2011
265
Anexo
8.
Datos
originales
de
los
promedios
del
comportamiento de los meristemos para cada una de las

etapas de evaluacin.
Tratamiento 15
s
das
30
das
45
das
60
das
75
das
90
das
4.5
2.16
7
3.333
2.5
5.833
6.833
3.333
1.33
3
1.167
4.167
6.333
2.5
2.33
3
3.333
2.833
1.5
1.5
1.5
5.333
4.833
6.16
7
4.5
5.833
5.667
6.5
4.833
4.66
7
7.167
6.833
6.833
6.833
4.5
1.5
4.833
4.667
4.5
2.66
7
3.167
3.333
3.833
4.5
5.5
10
2.5
3.33
5.333
3.833
6.667
2011
266
3
11
5.333
4.5
6.167
6.167
6.833
12
4.5
4.5
4.167
3.5
4.667
13
3.5
6.167
6.833
14
4.833
4.16
7
5.667
6.5
6.667
6.5
15
4.5
5.833
6.167
6.833
16
3.833
2.83
3
5.833
6.167
2011
267
Anexo 9. Datos originales de los promedios del

comportamiento de los meristemos para cada una de las dosis
de Auxinas para las diferentes etapas de evaluacin.
Dosis 9
15
das das
30
das
45
das
60
das
75
das
90
das
8 5.042 4.083 4.875 5.333 6.125 6.542
8 3.875 3.375 4.833 5.333 6.208
8 4.833 3.208 3.833 4.917
8 3.583 2.875 3.667 4.292 5.458
2011
6.75
5 6.917
7
268
Anexo
10.
Datos
originales
de
los
promedios
del
comportamiento de los meristemos para cada una de la dosis

de Citoquininas para las diferentes etapas de evaluacin.
Dosis 9
das
15
das
30
das
45
das
60
das
75
das
90
das
8 2.958 1.833 2.333 3.708 5.542 6.958
8 4.667
8 4.042 4.333 4.875 4.875 5.458 6.625
8 5.667 3.625 5.542 6.083
3.75 4.458 5.208 5.292 6.833
2011
6.5 6.792
269
Anexo 11. Fotografas de los resultados obtenidos.
Fotografa 60.- Desarrollo de los meristemos de Maxillaria

grandis a los 9 das.
2011
270
Fotografa 61.-Desarrollo de los meristemos de Maxillaria

grandisa los 15 das

grandisa los 30 das.
2011
271

2011
272

Fotografa 65- Desarrollo de los meristemos de Maxillaria

2011
273
Fotografa 66: Divisin de meristemos para formar

protocormos.
Fotografa 67: Segunda etapa de divisin en los meristemos.

2011
274
Fotografa 68: Formacin de las primeras hojas de los

meristemos en Maxillaria grandis
2011
275
Fotografa 69.- Formacin de hojas en los meristemos de

Maxillaria grandis

2011
276
Fotografa 71.-Desarrollo completo de hojas de Maxillaria

grandis
2011
277

Fuente:Paola Cruz (2011)
2011
278
Fotografa 73.- Nivel adecuado del meristemo dentro del

medio de cultivo para evitar ahogamientos.
Fotografa74: Fenolizacin de los meristemos de Maxillaria

grandis
2011
279
Fotografa 75.-Coloracin de fenolizacin en otros

tratamientos.
2011
280
Anexo 12. Costo de los reactivos por gramo

SALES
CANTIDAD/GRAMOS
INORGANICAS
COSTO DE COSTO
STOCK
GRAMO
Nitrato de amonio
500 gramos
15,55
0,03
Sulfato de amonio
500 gramos
23,65
0,02
Acido brico
500 gramos
11,15
0,03
Clorhidrato de calcio
500 gramos
22
0,04
500 gramos
17,35
0,02
100 gramos
34,5
0,5
19,45
0,08
Nitrato
de
POR
calcio
4H2O
Clorhidrato de cobalto
6H2O
Sulfato cprico 5H2O 500 gramos

Acido,
Na,
2H2O
(EDTA)
500 gramos
37,85
0,08
Sulfato ferroso 7H2O
100 gramos
0,03
500 gramos
31,05
0,19
H2O
500 gramos
15
0,04
Molybdicacid
500 gramos
68,05
0,05
PotassiumIodide
500 gramos
61,05
0,29
Nitrato de poatasio
500 gramos
17,85
0,04
Magnesium
sulfate
Anhytrate
Sulfato de magnesio
2011
281
Fosfato
de
potasio
monobsico
500 gramos
24,3
0,11
Sulfato de zinc 7H2O 500 gramos
19,5
0,02
Agar
450 gramos
105
0.20
benzylaminopurine
250 gramos
159,9
0,1
MES (free acid)
250 gramos
100,5
0,09
myo inositol
500 gramos
58,75
0,1
naphthaleneaceticacid 100 gramos
22,45
0,08
Nicotinicacid (feeacid) 500 gramos
18,2
0,07
Peptone
500 gramos
42,22
0,16
Pyridoxine HCL
100 gramos
41,5
0,1
Sucrose
500 gramos
16,35
0,05
Thiamine HCL
250 gramos
51,9
1,16
1082,97
5,236
alpha
TOTAL
(SIGMA C. 1930)
Universidad de Cuenca Facultad de Ciencias Qumicas.
Anexo 13.Precios de algunos materiales que se utilizaron en
la investigacin.
MATERIALES CANTIDAD
UNIDAD
2011
PRECIO
TOTAL
282
UNITARIO
(DLARES)
Tubo de
ensayos
100
Unidades
0.82
82,00
Alcohol
Litro
3,00
9,00
Algodn
Funda
2,00
2,00
Unidad
1,00
2,00
Marcadores
indelebles
Papel
aluminio
Caja (2.32
1
m)
4.15
4.15
laboratorio
Unidad
10,00
10,00
Mascarilla
Unidad
0.50
1.50
Cubre pelo
Unidad
0.50
1.50
Mandil de
TOTAL
112,15
2011
283
Anexo 14. Croquis de la ubicacin del laboratorio de Cultivo

de tejido de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad de Cuenca donde se realiz la investigacin.
2011
284
2011
285

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UNIVERSIDAD DE CUENCA

FCULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

determino claramente el desarrollo, que se verifico de acuerdo

II. Objetivos e Hiptesis

2.1. Objetivo general.

2.2. Objetivos especficos.

III. Revisin de literatura.

3.1. Perspectiva histrica de las orqudeas.

3.2. Importancia econmica

3.3. Distribucin y diversidad

3.3.1. Ecologa y hbitat

3.3.2. Patrones generales de endemismo de las orqudeas

3.4. Estructura botnica del gnero maxillaria.

3.4.1. Clasificacin botnica.

3.5. Tipos de crecimientos de las orqudeas.

AUTORA: PAOLA CRUZ JARAMILLO

3.5.1. Crecimiento simpodial

3.5.2. Crecimiento monopodial.

3.6. Morfologa de Maxillaria sanderiana o Maxillaria

3.6.2. Los rizomas y pseudobulbos.

3.7. Conservacin de orqudeas

3.8. Resea histrica del cultivo de tejidos

3.8.1. Infraestructura adecuada para la micropropagacin

3.9. Cultivo de tejidos in vitro

3.9.1. Importancia del cultivo de tejidos in vitro

3.9.2. Tipos de cultivos in vitro

3.9.3. Cultivo de meristemos

b. Divisin dentro de los meristemos

AUTORA: PAOLA CRUZ JARAMILLO

c. Zonas de segmentacin del meristemo

3.10.1. Los Virus

3.10.2. La termoterapia o tratamiento trmico

3.11. Tcnicas del cultivo in vitro

3.12. Vitrificacin o Hiperhidricidad

3.12.1. Consistencia del medio productora de vitrificacin

3.12.2. Sistema de doble fase

3.13. Asepsia y esterilizacin del material vegetal

3.14. Medio de cultivo.

3.14.1. Tipos de medio de cultivos

3.14.2. Medios definidos

3.14.3. Medios indefinidos.

3.14.4. Componentes del medio de cultivo.

3.14.5. Proceso para la realizacin del medio de cultivo.

3.14.6. Tcnica para la preparacin del medio de cultivo.

3.14.7. Condiciones fsicas del medio de cultivo.

3.14.8. Esterilizacin del Medio.

IV. Materiales y mtodos.

4.1. Ubicacin del lugar de la investigacin.

4.2. Caractersticas de los laboratorios.

4.2.1. Primer laboratorio.

4.2.2. Segundo laboratorio.

4.2.3. Tercer laboratorio.

4.3. Materiales y equipos del

4.3.2. Materiales qumicos.

4.3.3. Materiales fsicos.

4.4.1. Material experimental.

4.5. Factores en estudio.

4.5.1. Tratamientos estudiados.

4.5.2. Diseo experimental.