Problemas de Oxidación en Explante Cultivados Invitro, PVP, Carbón Activado

AGRONOMA MESOAMERICANA 20(1): 153-175.
2009
ISSN: 1021-7444
1
Recibido: 5 de febrero, 2008. Aceptado: 20 de marzo, 2009.
2
Centro para la Investigacin en Granos y Semillas (CIGRAS). Facultad de Ciencias Agroalimentarias, Universidad de Costa Rica. 2060 San
Pedro de Montes de Oca, San Jos, Costa Rica. [email protected]
PROBLEMAS DE OXIDACIN Y OSCURECIMIENTO DE EXPLANTES
CULTIVADOS IN VITRO
1
lvaro Azofeifa
2
RESUMEN
Problemas de oxidacin y oscurecimiento de explantes
cultivados in vitro. En el presente trabajo se hace una revisin
de literatura sobre aspectos relacionados al oscurecimiento
de los explantes cultivados in vitro, fenmeno frecuente en
varias especies, especialmente en las leosas, con importantes
implicaciones prcticas y econmicas. Con el propsito de
alcanzar un mayor entendimiento del fenmeno se abordan
aspectos sobre causas, desarrollo, utilidad biolgica, factores
desencadenantes, entre otros. Finalmente se indican una serie
de medidas y estrategias exitosas que se han empleado para
solventar este problema.
Palabras clave: Antioxidantes, estrs oxidativo, feno-
les, oscurecimiento de tejidos, necrosis.
ABSTRACT
Oxidation and browning of problems in explants
grown in vitro. The present review focuses on several
aspects related to the browning of tissue culture explants
grown in vitro. This situation is frequently observed in se-
veral species, especially in woody plants, with important
economic and practical implications. In order to achieve a
better understanding of the phenomenon, this review discus-
ses aspects of the causes, development, biological utility and
triggering factors, among others. Finally, a list containing a
series of measures and strategies that have been successfully
employed to solve the problem is presented.
Key words: Antioxidants, browning, oxidative stress,
necrosis, phenolic compounds.
INTRODUCCIN
La oxidacin es el proceso a travs del cual un
tomo, o grupo de tomos, pierde uno o ms electro-
nes (se oxida) y los cede a otro (el cual se considera
reducido). En sustratos orgnicos, la oxidacin y
reduccin involucra la participacin de tomos de
carbono enlazados en forma covalente a otros tomos
(Karp 1998).
La oxidacin u oscurecimiento de tejidos cultiva-
dos in vitro, se puede defnir como la oxidacin, por
radicales libres, de diferentes componentes celulares,
as como, la oxidacin de compuestos fenlicos ca-
talizado por la enzima polifenol oxidasa (PPO) para
producir quinonas, las cuales son especies qumicas
muy reactivas y propensas a reaccionar, generando
dao e incluso la muerte celular (Amiot et al. 1996,
Bray et al. 2000).
REVISIN BIBLIOGRFICA
ISSN: 1021-7444 AGRONOMA MESOAMERICANA 20(1): 153-175. 2009
154 AZOFEIFA: PROBLEMAS DE OXIDACIN EN EXPLANTES CULTIVADOS IN VITRO
ORIGEN Y FACTORES DESENCADE-
NANTES
La mayora de radicales libres se producen a
partir del metabolismo del oxgeno y se les llama
especies de oxgeno reactivo o intermediarios de ox-
geno reactivo (ROS). Estas son formas parcialmente
reducidas del oxgeno atmosfrico y tpicamente re-
sultan de la excitacin del O
2
para formar el oxgeno
singulete (
1
O
2
) o tambin mediante la transferencia de
uno, dos o tres electrones al O
2
para formar el radical
sper xido (O
2
-
), perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) o el
radical hidroxilo (HO
) respectivamente. En las clu-

las vegetales, stos se forman constantemente durante
las reacciones redox de varias vas metablicas; la in-
completa reduccin del oxgeno o de la oxidacin del
agua en el cloroplasto o la mitocondria, en la cadena
de transferencia de electrones tanto de la fotosntesis
como de la respiracin, en la - oxidacin de los
cidos grasos, oxidacin del glicolato, del NADPH,
oxalato y de las xantinas (Bray et al. 2000, Mittler
2002, Turrens 2003, Apel e Hirt 2004). Los ROS tam-
bin se pueden generar en otras organelas celulares,
como los peroxisomas y los lisosomas, a consecuen-
cia de los cortes realizados en los explantes (Karp
1998). Adicionalmente, el O2
-
puede reaccionar con
el xido ntrico para formar su radical (NO
). Este y
otras formas oxidantes del xido ntrico; dixido de
nitrgeno (NO
2
), perxido ntrico (ONOO

-
), nitrosil
catin (NO
+
), etc., reciben en conjunto el nombre de
especies reactivas de nitrgeno (RNS). El estrs oca-
sionado por ROS se le conoce como estrs oxidativo y
el originado por RNS como estrs nitrosativo (Turrens
2003, Valderrama et al. 2007).
En condiciones normales de crecimiento la pro-
duccin de ROS en la clula es baja: 240 M/s O
2
-
y
0,5 M/s de H
2
O
2
en los cloroplastos. En situacin de
estrs, el nivel de O
2
-
en la clula se incrementa entre los
240 - 720 M/s y entre los 5 - 15 M/s

de H
2
O
2
en los
cloroplastos (Mittler 2002). La produccin de especies
reactivas puede ser activada por inductores especfcos
(como parte del metabolismo normal de la planta) o
tambin por mecanismos no especfcos, por ejemplo
en respuesta a un tipo de estrs. Minutos despus de la
estimulacin inicial ocurre, en respuesta, una produccin
elevada de especies reactivas de oxgeno (Arauz 1998).
La clula vegetal sometida a un estrs reacciona
produciendo mayores niveles de ROS y, o RNS; los
cuales generan una reaccin en cascada, cuando el
electrn libre se transfere de una molcula a otra. Una
de las consecuencias que trae consigo es la accin de
enzimas oxidasas, frecuentemente nombradas como
polifenol oxidasas (PPOs), fenolasas y tirosinasas, as
como de las peroxidasas (POX). Las cuales son libera-
das, sintetizadas o estn presentes en ciertos sustratos
y en condiciones oxidativas cuando los tejidos son
lesionados o se encuentran senescentes. En muchos ca-
sos, la oxidacin se ha relacionado directamente con el
acmulo de PPO y decrecimiento de putrescina, esper-
midina, y espermina de los tejidos. Los sustratos para
estas enzimas, que pueden variar entre los diferentes
tejidos, son comnmente la tirosina o los fenoles. Estas
enzimas normalmente se encuentran compartimentali-
zadas, por ejemplo: PPO en cloroplastos, POX en pe-
roxisomas, o se ubican en las membranas subcelulares
y los sustratos son almacenados dentro de la vacuola.
La enzima y el sustrato entran en contacto cuando la
clula sufre algn dao, estrs o se encuentra senes-
cente y, generalmente, da como resultado la muerte
del explante (Bhat y Chandel 1991, George, 1996, Va-
tanpour-Azghandi et al. 2002, Tang y Newton, 2004,
Grato et al. 2005, Pompeu et al. 2008).
Factores ambientales como: intensidad de luz,
cortes, herbicidas, senescencia, patgenos, metales
pesados, lesiones, sustancias abrasivas pueden desen-
cadenar el estrs oxidativo y nitrosativo (Bray et al.
2000, Pompeu et al. 2008). En el caso particular del
cultivo de tejidos in vitro, los procesos de oxidacin
son causados principalmente por el efecto abrasivo del
agente desinfectante aplicado durante la asepsia del
explante, los cortes que sufre el explante, composicin
del medio de cultivo, volumen y calidad del frasco de
cultivo (George 1993, Tabiyeh et al. 2006, Van Staden
et al. 2006, Abdelwahd et al. 2008).
PROBLEMTICA Y SU DESARROLLO
IN VITRO
El establecimiento in vitro de tejidos vegetales de
algunas especies de plantas, especialmente leosas,
est, en gran medida, limitado por la ocurrencia de
oscurecimientos letales en los explantes y en el medio
de cultivo. Esto constituye uno de los problemas ms
serio y frecuente, desde el inicio y durante el mante-
nimiento de un tejido cultivado in vitro (George 1996,
Laukkanen et al. 2000, Murkute y Shanti-Patil 2003,
Tang y Newton 2004). El desarrollo de este problema
est estrechamente relacionado al estrs oxidativo y
nitrosativo que sufren las clulas del explante cultiva-
do. Este fenmeno se produce por el desbalance entre
las reacciones pro-oxidacin (excesiva formacin de
ROS y, o RNS o de naturaleza enzimtica) y los me-
canismos antioxidantes para detoxifcar (antioxidantes
enzimticos y no enzimticos), generalmente causado
por una generacin incrementada de radicales libres
(Novoa et al. 2001, Turrens 2003).
A nivel celular, los ROS y, o RNS son capaces de
oxidar irrestrictamente varios componentes celulares
y pueden conllevar a una destruccin oxidativa de la
clula. Estas molculas, especialmente el OH, son
altamente destructoras de lpidos, polisacridos, pro-
tenas y cidos nucleicos, pudiendo ocasionar el co-
lapso celular (Bray et al. 2000, Cassells y Curry 2001,
Turrens, 2003, Apel e Hirt 2004, Mittler et al. 2004).
Por ejemplo, en clulas de Pinus virginiana, Tang et
al. (2004), correlacionaron la muerte celular con altos
contenidos de H
2
O
2
. Asimismo, en la etapa de estable-
cimiento in vitro, luego de ser cortados, muchos de los
explantes empiezan a perder el color verde e inician un
oscurecimiento, liberando frecuentemente exudados
oscuros al medio de cultivo, cuya naturaleza no es pre-
cisa, aunque se conoce que son una mezcla compleja
de sustancias fenlicas (metabolitos secundarios que
modulan el desarrollo de la planta y su respuesta a es-
treses biticos y abiticos). Por ejemplo, en explantes
cultivados de tomate se ha reportado la presencia de
vainilina, cido p-coumrico, p-hidroxibenzaldehdo
y siringaldehdo (Harms et al. 1983, Rao et al. 1985,
Abdelwahd et al. 2008). No todos los exudados libera-
dos al medio de cultivo son inhibitorios o txicos, pero
en la mayora de los casos el crecimiento del explante
es inhibido, perdiendo gradualmente su capacidad de
proliferar y, si no se remedia la situacin, puede morir
(George 1996, Ogita 2005). En Eucalyptus tereticornis
y Spondias purpurea, el problema es tan severo que en
torno de pocas horas el explante se oscurece y muere
(Das y Mitra 1990, Azofeifa 2007).
La toxicidad de los exudados est en relacin
con el incremento en la produccin de compuestos
fenlicos ya que estos son oxidados para formar qui-
nonas, debido a la actividad de enzimas oxidativas, y
posteriormente polimerizados (Tabiyeh et al. 2006).
Adems, se puede deber a la oxidacin de protenas, a
que fenoles se unan con protenas mediante puentes de
hidrgeno (Harms et al. 1983), a la accin de enzimas
peroxidasas, las cuales pueden calalizar su oxidacin
en presencia de perxido. Este y otros radicales libres
son liberados o generados durante el proceso de es-
cisin, limpieza, desinfeccin y cultivo del explante
(George 1996, Uddin y Titov 2007). La presencia de
algunas sustancias fenlicas dainas puede tener un
efecto autocataltico en su sntesis.
El dao que resulta de la produccin de exudados
es usualmente ms severo durante los estados iniciales
de cultivo. El problema tiende a cesar cuando el ex-
plante inicia su crecimiento. Por ejemplo, el cultivo de
brotes y yemas de Alnus oregona produjo liberacin
y oxidacin de sustancias durante las 10 primeras
semanas en cultivo, provocando prdidas importantes.
Luego de la semana 22, cuando los explantes iniciaron
su multiplicacin, el problema desapareci (Garton y
Moses 1986). Un fenmeno semejante se observ en
Gossypium hirsutum L. (Ozyigit et al. 2007).
Aparte del oscurecimiento de explantes, al estrs
oxidativo se le ha relacionado con el desencadena-
miento de otros desordenes fsiolgicos, morfolgicos,
epigenticos y genticos que ocurren en los explantes
cultivados, tales como recalcitrancia, hiperhidricidad,
variacin somaclonal y habituacin (Cassells y Curry
2001, van Staden et al. 2006).
UTILIDAD BIOLGICA Y APROVE-
CHAMIENTO
Tradicionalmente las ROS han sido consideradas
txicas. No obstante, en aos recientes esta percepcin
ha cambiado. Actualmente se sabe que las plantas
producen activamente ROS como molculas seali-
zadoras de diferentes vas y procesos metablicos,
controlando actividades normales del crecimiento y
desarrollo de la planta; germinacin, mitosis, elonga-
cin celular, senescencia, muerte celular, lignifcacin
de tejidos, formacin de elementos cribosos del foema
y xilema, regulacin de la expresin gnica asociada
a estrs bitico y abitico, sistema de defensa contra
patgenos, etc. (Bray et al. 2000, Apel e Hirt 2004,
Mittler et al. 2004, Kawiak et al. 2007, Marczak et al.
2008, Shao et al. 2008).
Por otro lado, investigaciones realizadas en culti-
vo in vitro asocian efectos benfcos en el desarrollo
de los explantes con la presencia de algunas formas de
ROS. En estos trabajos se describe cmo la adicin in-
tencional al medio de cultivo de algn agente reductor
u oxidante puede estimular un tipo de respuesta parti-
cularmente benfca. Por ejemplo, la adicin de H
2
O
2

increment la produccin de embriones somticos en
explantes de conferas (Kapik et al. 1986); de manera
similar, la escisin de explantes de Vitis sp. y Paulo-
wnia sp. en presencia de oxgeno reactivo favoreci
la formacin de embriones somticos (Krul y Worley
1977, Radojevic 1988). Tambin se ha informado que
el uso de agentes antioxidantes, mercaptoetanol, ditio-
treitol y cido ascrbico, favoreci la embriognesis
en anteras de tabaco cultivadas in vitro (Harada e Ima-
mura 1983). Finalmente, Mittler (2002) menciona la
posibilidad de utilizar las concentraciones de los ROS
como indicadores del estrs celular. De esta manera
sera posible monitorear el estatus del explante en de-
terminado ambiente de crecimiento.
MEDIDAS PRCTICAS PARA EL MA-
NEJO DEL OSCURECIMIENTO DE LOS
EXPLANTES CULTIVADOS IN VITRO
Estrategias
Las estrategias para evitar los procesos de oxi-
dacin que conllevan al oscurecimiento de los tejidos
del explante cultivado in vitro, son numerosas. Para
empezar, la prevencin y disminucin de las circuns-
tancias que provocan o estimulan el estrs oxidativo
en el explante es el mejor procedimiento para impedir
el desencadenamiento de eventos que conllevan a la
oxidacin del mismo. Cuando el estrs oxidativo no se
logra evitar, se puede recurrir a una serie de medidas
prcticas. En el Cuadro 1, se presenta un resumen
de las estrategias generales abordadas en la presente
revisin. Posteriormente cada estrategia se ampliar
en detalle.
Para algunas especies los investigadores sol-
ventaron el problema con la utilizacin de una sola
estrategia. Por ejemplo, uso de medio lquido (Zepeda
y Sagawa 1981), cambio del agente gelifcante (Finch
et al. 1992), uso de carbn activado (Harikrishnan et
al. 1997), de polivinil pirrolidona (Chacn y Gmez
1996) o la sustitucin del regulador de crecimiento
(Jambor-Benczur et al. 1997). Desafortunadamente,
un nico mtodo no siempre es sufciente debido a la
complejidad del problema, requirindose una solucin
integral que involucre un mayor nmero de variantes.
En este sentido, Thomas y Ravindra (1997) mencio-
nan, para el cultivo in vitro de pices de Mangifera
indica, que la oxidacin de tejidos y la exudacin de
fenoles, estuvieron interrelacionadas e infuenciadas
por un nmero de factores que incluyeron al genoti-
po, tipo y poca de escisin del explante, tratamiento
de desinfeccin y medio de cultivo. Por ejemplo, se
observ menor exudacin de fenoles y mayor sobre-
vivencia de explantes cuando se utiliz el medio de
cultivo Murashige y Skoog, MS (1962) a mitad de su
concentracin en sales, comparado a un MS normal.
Lo mismo al utilizar un MS semislido que uno lqui-
do. Respecto al tipo de explante, los factores: grado de
desarrollo, incidencia de luz en el explante, longitud y
grosor del pice, daos en el explante y el nmero de
pecolos en contacto con el medio de cultivo fueron
importantes. La edad del rbol y el nmero de hojas
en el pice no lo fueron. Adems, la poca de escisin
del explante fue prominente, tanto en la exudacin
de fenoles como en la contaminacin y viabilidad del
Cuadro 1. Resumen de las principales estrategias utilizadas
en el cultivo in vitro, para evitar o disminuir los
problemas oxidativos que ocurren en los explantes
vegetales.
Nombre de la estrategia
Uso de explantes en estado juvenil o de material en creci-
miento activo.
Crecimiento del explante a baja luminosidad o en oscuridad.
Crecimiento del explante en una temperatura baja.
Subcultivos frecuentes.
Cultivo en medio lquido.
Uso de adsorbentes, en la preparacin del explante para su
cultivo o en el medio de cultivo.
Uso de antioxidantes en la preparacin del explante para su
cultivo o en el medio de cultivo.
Eleccin del medio de cultivo.
Eleccin de los reguladores del crecimiento.
Cambio del potencial osmtico del medio de cultivo.
pH del medio de cultivo bajo.
Inactivacin de enzimas.
explante. La mejor edad fsiolgica para la toma de
material fue con pices semi maduros.
A continuacin se describe y discute una serie de
estrategias, por medio de las cuales, diferentes investi-
gadores solventaron de manera importante el problema
del oscurecimiento de tejidos.
Reduccin del posible dao durante el estableci-
miento
El problema de oxidacin se puede disminuir
reduciendo la duracin del proceso de escisin y de
esterilizacin del explante o con la sustitucin del
agente desinfectante. En algunas especies, este agente
es el responsable de acentuar el problema del oscure-
cimiento. Este es el caso de explantes de Syzygium cu-
minii (Yadav et al. 1990) y de Anacardium occidentale
(Jha y Das 2004, Aliyu 2005). Cuando es evidente la
participacin del agente desinfectante en el problema
de oxidacin, se deben probar otros agentes. As, Se-
neviratne y Wijesekara (1996), quienes trabajaron con
brotes de Hevea brasiliensis para su establecimiento
in vitro, encontraron que la desinfeccin de los ex-
plantes con hipoclorito de sodio (NaOCl), a diferentes
concentraciones, promovi el oscurecimiento de los
tejidos y la exudacin de fenoles. Por su parte, el uso
de cloruro de mercurio (HgCl
2
) como agente desinfec-
tante provoc menos problemas de oscurecimiento en
los tejidos. En Strelitzia reginae, el uso de HgCl
2
al
0,3% fue menos lesivo que el hipoclorito de calcio al
9% (Ziv y Halevy 1983).
Remocin de sustancias fenlicas
La presencia de sustancias fenlicas en el medio
de cultivo, liberadas por el explante, tiene un efecto
autocataltico. Por lo que la remocin y, o dispersin
de las mismas se considera un mtodo de control efec-
tivo (George 1996). Esto se puede lograr mediante:
Pretratamientos
En especies que generan exudados con efectos
perjudiciales, la implementacin de un pretratamiento
aplicado al explante puede ser de mucha utilidad. Por
ejemplo, Prez et al. (1985) y Peuela et al. (1988)
mencionan la utilidad de aplicar un bao de agua
continua durante 16 a 24 horas para la remocin
de sustancias fenlicas producidas en semillas de
Corylus sp. y Juglans sp., respectivamente, antes de su
desinfeccin. Tambin, la aplicacin de enjuagues al
explante, con agua destilada estril, luego del proceso de
desinfeccin es necesario para eliminar efectivamente el
agente desinfectante, as como para remover los fenoles
oxidados y otros productos del dao celular formados
durante la preparacin y desinfeccin del explante. En
algunos casos se utiliza la inmersin y agitacin de los
explantes en agua destilada estril, sola o con algn
aditivo, durante un cierto tiempo (que pueden ser 2 - 48
horas) antes de su cultivo defnitivo (George 1996).
Subcultivos frecuentes
La implementacin de subcultivos (transferen-
cias) frecuentes a un medio de cultivo fresco en poco
tiempo se torna imperativo si el medio de cultivo
donde se encuentra el explante muestra indicios de
oscurecimiento. El intervalo entre subcultivos se debe
ajustar segn la severidad del problema. Con frecuen-
cia es necesario transferir, al inicio, a intervalos de uno
a siete das, requirindose, normalmente, entre cinco
y seis subcultivos para que la produccin u oxidacin
de fenoles cese. No obstante, ste es un procedimien-
to demandante de tiempo y reactivos, por lo que si
existiera otra alternativa para evitar el deterioro del
explante sera preferible (George 1996).
El uso de subcultivos frecuentes, para evitar o
reducir los problemas de oxidacin, se ha utilizado en
diferentes especies: Rubus sp. (Broome y Zimmerman
1978), Musa sp. (Banerjee y De Langhe 1985; Utino
et al. 2001), Psidium guajava (Amin y Jaiswal 1988),
Eucalyptus tereticornis (Das y Mitra 1990), Hevea
brasiliensis (Seneviratne y Wijesekara 1996), Fra-
garia indica (Bhatt et al. 2000), Punica granatum
(Murkute y Shanti-Patil 2003), Anacardium occiden-
tale (Jha y Das 2004, Aliyu 2005), Phyllostachis nigra
(Ogita 2005). En otras especies, como Spondias pur-
purea, su uso no fue sufciente para evitar el deterioro
de los explantes (Azofeifa 2007).
Poda del tejido necrosado y uso de sellos en el ex-
plante
Tulecke et al. (1988) y George (1996) reco-
miendan eliminar el tejido lesionado del explante,
producido durante la escisin de la planta donadora
o al momento de la desinfeccin, previo a su cultivo.
Asimismo, Ogita (2005) elimin el tejido necrosado
en callos de Phyllostachis nigra para promover su
recuperacin y crecimiento.
Otro tipo de estrategia implica el uso de sellos en
las reas cortadas de los explantes. As, Bhat y Chan-
del (1991) redujeron la liberacin de fenoles en Dios-
corea alata y el oscurecimiento del medio de cultivo,
mediante el uso de sellos de cera parafna en los bordes
cortados del explante.
Estado fsico y volumen del medio de cultivo
Con frecuencia, los explantes son menos pro-
pensos al oscurecimiento si inicialmente se estable-
cen en un medio de cultivo lquido, ya que, en este
estado fsico se propicia la dispersin de sustancias
txicas. En los medios de cultivo slidos, el agente
gelifcante favorece la retencin de fenoles u otras
sustancias dainas en las inmediaciones del explante
(George 1996). Por ejemplo, en el establecimiento in
vitro de Ananas comusus (Zepeda y Sagawa 1981),
Cocos nucifera, (Sugimura y Salvaa 1988), Cattleya
spp. (Gutirrez 1993) y Cynodon transvaalensis x
C. dactylon (Qu y Chaudhury 2001) se redujeron los
problemas del oscurecimiento y liberacin de fenoles
al utilizar medios de cultivo lquidos en agitacin. De
manera similar, Traumann y Visser (1989) y Linington
(1991) mitigaron los problemas del oscurecimiento en
callos de Porthenium argentatum y embriones cigti-
cos de Dipterocarpus sp., respectivamente, utilizando
un medio de cultivo lquido con puentes de papel fltro
como soporte de los explantes. Con este sistema logra-
ron mantener un fujo continuo del medio de cultivo y
evitaron la acumulacin de sustancias txicas. Con-
trario a lo mencionado, en Mangifera indica, Thomas
y Ravindra (1997) observaron menor exudacin de
fenoles y mayor sobrevivencia de explantes cuando se
utiliz un medio semislido comparado a uno lquido.
Finalmente, en Eucalyptus tereticornis, Das y Mitra
(1990) no encontraron diferencia signifcativa entre
medio lquido o slido respecto de la exudacin de
fenoles.
En relacin con la cantidad del medio de cultivo,
Bhat y Chandel (1991) sugieren que el volumen que
se utiliza de ste en cada recipiente juega un papel
importante en el desarrollo del oscurecimiento. Men-
cionan que en Dioscorea alata el oscurecimiento de
los explantes fue ms severo cuando se trabaj con
volmenes pequeos.
Con relacin al tipo y calidad del agente gelif-
cante, Finch et al. (1992) observaron que el cultivo
de brotes apicales de arroces silvestres en un medio
de cultivo gelifcado con agar desencadena el oscure-
cimiento de los explantes. Esto no ocurre si el agar es
sustituido por agarosa como agente gelifcante.
Uso de adsorbentes
Carbn activado (CA)
Mediante la adicin de CA al medio de cultivo
es posible remover compuestos fenlicos. Evitando
o disminuyendo el deterioro del explante. Este es el
caso de Sequoiadendron giganteim (Bon et al. 1988),
Hevea brasiliensis (Seneviratne y Wijesekara 1996) y
Anacardium occidentale (Aliyu 2005).
El efecto benfco del CA se atribuye a su capaci-
dad para remover sustancias inhibitorias o txicas del
medio de cultivo que son producidas durante el auto-
clavado del medio o liberadas por el explante. Dentro
de las sustancias producidas durante el autoclavado,
se ha reportado la presencia del 5-(hidroximetil)-2-
furaldehdo (HMF). Este es un compuesto inhibitorio,
formado primeramente a partir de la fructuosa, ya sea
agregada al medio de cultivo, o formada por hidrlisis
de la sacarosa durante el proceso de autoclavado. Otras
sustancias removidas son producidas por el mismo
explante. Por ejemplo las quinonas (Ebert et al. 1993,
Petersen et al. 1999, Bhatia y Ashwath 2008).
Como se observa en el Cuadro 2, el empleo del
CA agregado al medio de cultivo es muy frecuente,
especialmente en especies de la familia Arecaceae.
As, Sugimura y Salvaa (1988) mencionan que el cul-
tivo in vitro de diferentes tipos de palmeras presentan
graves problemas de oxidacin y la inclusin de CA
al medio de cultivo tiene un papel preponderante en la
disminucin de este problema.
Las concentraciones empleadas que se observan
en la literatura varan entre 0,5 y 10 g/l, siendo ms
frecuentes las dosis de 2,0 y 3,0 g/l.
No obstante las referencias anteriores, en inves-
tigaciones realizadas en Anacardium occidentale (D
Silva y D Souza 1993), Punica granatum (Murkute
y Shanti-Patil 2003) y Parakmeria lotungensis (Men-
gyun y Jingmin 2004), la adicin de CA al medio de
cultivo no fue sufciente para solventar los serios y
frecuentes problemas de oxidacin.
Polivinil pirrolidona (PVP) y polivinil polipirro-
lidona (PVPP)
El PVP es una poliamida. Esta sustancia fue
inicialmente utilizada como adsorbente en la tcnica
de separacin por cromatografa de sustancias cidas
aromticas, aldehdos y fenoles. Para el caso de los
fenoles, estos son adsorbidos a travs de uniones hi-
drgeno, previniendo su oxidacin y polimerizacin
(George 1996).
Tanto el PVP como el PVPP han sido utilizados
en la prevencin del oscurecimiento de tejidos, ya
sea, aplicado como enjuague al explante o mediante
su incorporacin al medio de cultivo. El PVP se ha
aplicado como tratamiento al momento de separar el
explante de la planta donadora (Amin y Jaiswal 1988),
como pretratamiento anterior o posterior al proceso
de desinfeccin (Gannoun et al. 1995, Figueiredo et
al. 2001). En ambos casos, los explantes son inmer-
sos en la solucin de PVP, la cual generalmente se
encuentra en agitacin durante cierto tiempo (desde
unos minutos, 45 minutos, hasta de un da para otro).
Adems, Gupta et al. (1980) mencionan que el PVP
se puede disolver en una solucin de sacarosa (20 g/l)
para mejorar su accin (Cuadro 3). La gran mayora de
referencias encontradas utilizan el PVP incorporado al
medio de cultivo (Cuadro 4).
Adicionalmente, Amin y Jaiswal (1988), Teixeira
et al. (1993), Gannoun et al. (1995) y Abdelwahd et
al. (2008) mencionan la conveniencia de combinar
el uso del PVP con algn agente antioxidante u otro
adsorbente para disminuir la oxidacin en los tejidos.
Contrario a las referencias anteriores, en Anacardium
occidentale (D Silva y D Souza 1993), Dendro-
calamus latiforus (Huang et al. 2002), Parakmeria
lotungensis (Mengyun y Jingmin 2004), Phyllostachis
nigra (Ogita 2005) y Spondias purpurea (Azofeifa
2007), la adicin de PVP al medio de cultivo no ayud
a controlar el problema. Como efecto indirecto, Bonga
y Durzan (1982) mencionan que el PVP agregado al
medio de cultivo, con el fn de reducir la actividad de
la PPO, fue inhibitorio para el crecimiento de callos
en Eucalyptus grandis, pero en embriones somticos
de Dendrocalamus strictus lo promovi (Saxena y
Dhawan 1999).
Modifcacin de las condiciones ambientales
Factores ambientales dentro del recipiente de cul-
tivo, en el cuarto de crecimiento o en el que se encuen-
tra la planta donadora, se pueden modifcar para evitar
Cuadro 2. Dosis de carbn activado adicionadas al medio de
cultivo para mitigar los problemas de oxidacin de
tejidos en especies vegetales.
Cultivo Dosis
(g/l)
Referencia
Acorus calamos 2,0 Harikrishnan et al. (1997)
Anacardium occidentale 5,0 Sudripta et al. (1996)
Azaleas 2,5 George (1996)
Coco 2,5 Fisher y Tsai (1978)
Dioscorea oppositifolia 3,0 Poornima y Ravishankar
(2007)
Dioscorea pentaphylla 3,0 Poornima y Ravishankar
(2007)
Eucalyptus tereticornis
Smith.
2,0 Das y Mitra (1990)
Forestales 3,0 Bonga y Durzan (1982)
Palma Aceitera Africana 0,5 Teixeira et al. (1993)
Palma Aceitera Africana 0,5 Kanchanapoom y
Domyoas (1999)
Palma Aceitera Africana 1,0 Upadhyay et al. (1999)
Palma Datil 3,0 Reynolds y Murashige
(1979)
Paphiopedilum 2,0 George (1996)
Vicia faba 10 Abdelwahd et al. (2008)
Zingiber 3,0 Wang y Huang (1976)
Cuadro 3. Dosis de polivinil pirrolidona o polivinil polipirro-
lidona utilizadas durante el enjuague del explante
al momento de su desinfeccin, previo a su esta-
blecimiento in vitro.
Especie Dosis de
PVP (g/l)
Referencia
Pinus sylvestris. 10 Hohtola (1988)
Pistacia terebinthus 10 Gannoun et al. (1995)
Pistacia vera 10 Gannoun et al. (1995)
Psidium guajava 5 (PVPP) Amin y Jaiswal (1988)
Rollinia mucosa 0,5 Figueiredo et al. (2001)
Rosa hydrida 4 Mederos y Rodrguez
(1987)
Tectona grandis 7 (+ 20 g/l
de sacarosa)
Gupta et al. (1980)
Tomate 10 Fish y Jones (1988)
Vicia faba 1 Abdelwahd et al. (2008)
los problemas del oscurecimiento en los explantes. De
acuerdo con la literatura consultada, el factor ambien-
tal que con mayor frecuencia se modifca es la luz,
tanto en su intensidad, calidad o duracin. La modif-
cacin generalmente la realizan, ya sea, en el ambiente
donde crece la planta donadora de los explantes o en el
cuarto de crecimiento donde se colocan los explantes
luego de su cultivo. Al respecto tenemos:
Plantas donadoras creciendo en oscuridad
Algunas investigaciones enfatizan la importancia
de aplicar tratamientos al material donante, as como,
considerar su origen, a modo de controlar la oxidacin.
En este sentido, George (1996) indica que la oxidacin
del explante puede ser evitada o reducida si este se toma
de plantas donadoras etioladas, sea, que han crecido en
oscuridad total, con intensidad de luz baja o incluso en
das cortos. Al respecto, Zavaleta-Mancera et al. (2007)
mencionan que en das con alta irradiacin, la cantidad
de energa lumnica recibida en el cloroplasto es mayor
a la requerida para la fjacin del CO
2
durante la fotosn-
tesis, los excesos de energa son entonces captados por
aceptores de electrones alternos, estimulando la forma-
cin de ROS. Adems, Kefeli et al. (2003) indican que
la luz incrementa la biosntesis de sustancias fenlicas
(entre ellas, los favonoides) en el cloroplasto, el cual
constituye su principal sitio de sntesis. Posteriormente
los fenoles son acumulados en la vacuola en cantidades
relativamente altas o depositados como lignina en las
paredes celulares. Asimismo, Marks y Simpson (1990)
demostraron que el mecanismo de oxidacin fenlica y
la inhibicin del crecimiento en plantas leosas pueden
ser controlado por el nivel de irradiacin recibido por la
planta donante. Estos autores basaron su estudio en el
metabolismo de fenoles, ya que la actividad de muchos
sistemas enzimticos, que participan en la sntesis y
oxidacin de los mismos, es inducida por la luz. En
su investigacin, con arbustos ornamentales, redujeron
considerablemente la oxidacin de los explantes cuan-
do estos fueron tomados de plantas que crecieron en
oscuridad total (Hamamelis sp.) o bajo cubierta plstica
(Garrya elliptica), que permita el paso de apenas un
1% de la luz del da. No obstante, para Quercus robur
este benefcio fue relativo, ya que, los efectos detrimen-
tales de la liberacin de polifenoles aparecieron a los
56 das en el 70% del material expuesto a la luz. En
relacin, con lo anterior, Watad et al. (1992) mencionan
que para evitar la oxidacin y muerte de explantes de
Protea obtusifolia, fue muy til cubrir previamente
con bolsas de papel los brotes de la planta donadora.
Tambin, en Psidium guajava (Pirela 1996, Len et al.
1997) la sobrevivencia de los explantes estuvo afectada
por la exposicin de las plantas donantes a la irradiacin
solar. Se observ mayor sobrevivencia en los explantes
tomados de plantas tratadas en oscuridad o con baja
intensidad de luz. Adems, indican que la proteccin
solar de la planta donadora result en una reduccin del
contenido de fenoles preexistentes en los explantes. Por
lo anterior, consideran la relacin entre el contenido de
compuestos fenlicos preexistentes en los meristemos
apicales y la sobrevivencia de los mismos durante su
cultivo in vitro.
Crecimiento de explantes en oscuridad o en baja
irradiancia
La oxidacin de explantes, en varias especies
vegetales, disminuye o se evita si stos, luego de
Cuadro 4. Dosis de polivinil pirrolidona o polivinil polipi-
rrolidona incorporadas al medio de cultivo, para al
manejo de la oxidacin en explantes de diferentes
especies vegetales.
Especie Dosis de
PVP (g/l)
Referencia
Aconitum napellus 0,5 (PVPP
insoluble)
Cervelli (1987)
Cynodon transvaalensis
x C. dactylon
6 (PVPP) Qu y Chaudhury
(2001)
Dendrocalamus strictus 0,25 Saxena y Dhawan
(1999)
Elaeis guineeses 5 Teixeira et al. (1993) (1993)
Eucalyptus tereticornis 0,5 Subbaiah y Minocha
(1990)
Hamamelis 10 Christiansen y
Fonnesbech (1975)
Malus 5 20 Walkey (1972)
Pinus brutia 0,001 (PVP
insoluble)
Abdullah et al. (1987)
Pinus virginia 5 (PVPP) Tang et al. (2004)
Pouteria lucuma 1- 3 Jordan y Oyanedal
(1992)
Quercus spp. 0,05 - 0,1 Ahuja (1986)
Quercus spp. 0,5 Bellarosa (1988)
Rubus sp. 10 Chacn y Gmez
(1996)
su establecimiento in vitro, son puestos a crecer en
una condicin de oscuridad por algunas semanas.
Posteriormente, los explantes se transferen a un
ambiente con luz normal, o en ciertas ocasiones, a
una condicin de baja luminosidad (7-15 mol.m
-2
s
-1
)
para ayudar a prevenir la oxidacin (George 1996).
En relacin con sto, Villalobos y Arias (1987) con
caa de azcar, Seneviratne y Wijesekara (1996) con
Hevea brasiliensis, as como Sudripta et al. (1996)
y Jha y Das (2004) en Anacardium occidentale,
implementaron el crecimiento de explantes en
oscuridad durante la primera semana de cultivo
para prevenir los problemas de oxidacin. Adems,
Kvaalen y Appelgren (1999) reportan diferencias
signifcativas en la oxidacin de explantes (embriones
somticos de Picea abies) segn la fuente de luz
(intensidad, tipo de luz, marca comercial de la fuente)
que se utiliza en las cmaras de crecimiento. No
obstante, la oscuridad o los bajos niveles de luz
no siempre pueden reducir la oxidacin. Este es
el caso de Eucalyptus tereticornis (Das y Mitra
1990) y Hamamelis sp. y Garrya elliptica (Marks y
Simpson 1990), en donde la oxidacin de fenoles en
los explantes no disminuy a pesar que los mismos
fueron puestos a crecer en oscuridad desde el inicio.
Tratamientos con baja temperatura
George (1996) menciona que el oscurecimiento
de los tejidos cultivados in vitro de algunas especies
de plantas se puede disminuir o evitar aplicando a los
explantes una temperatura, en el cuarto de crecimien-
to, ligeramente menor a la normalmente empleada,
sin que sea lesiva al explante. La disminucin en la
temperatura persigue reducir la actividad fenolasa y
la disponibilidad de su sustrato. Esta temperatura se
mantiene hasta obtener crecimiento y, o morfogne-
sis en los explantes. Por ejemplo, Selva et al. (1989)
evitaron el oscurecimiento de brotes de Vicia faba
cambiando la temperatura, de 22 C a 14 - 18 C, en
el cuarto de crecimiento. Similar resultado se logr en
Begonia venosa (Pierik y Tetteroo 1987), utilizando
una temperatura entre los 17 y 21C.
Por otro lado, Andersone y Ievinsh (2002)
mencionan que la implementacin de un pretratamiento,
almacenamiento de las plantas donadoras por cuatro
meses en un ambiente fro, permiti disminuir la
actividad de la peroxidasa y consecuentemente la
oxidacin de explantes en Pinus sylvestris. Tambin,
el uso de un pretratamiento trmico, 4 C durante dos
horas, aplicado al explante previo a su cultivo, fue
sufciente para reducir los problemas de oxidacin en
Parakmeria lotungensis (Mengyun y Jingmin 2004).
Composicin del medio de cultivo
Sales
El oscurecimiento de tejidos es con frecuencia
ms pronunciado en un tipo de medio de cultivo
que en otro, lo que implica que el mismo puede ser
causado por el uso inapropiado de alguno de los nu-
trimentos empleados en el medio. Con frecuencia el
oscurecimiento es menor en un medio diluido que en
uno alto en sales, como el MS (George 1996, Cassells
y Curry 2001).
Entre las modifcaciones que frecuentemente se
emplean, segn se puedo observar en la literatura con-
sultada, estn diluciones en las concentraciones de N
y K y en su fuente, la dilucin general de las sales del
medio de cultivo o el uso de medios de cultivo bajos en
sales. As, Anderson (1975) indica que los altos niveles
de K del MS acentuaron el oscurecimiento observado
en explantes de Rhododendron. El oscurecimiento no
fue evidente cuando se redujo el KNO
3
a la mitad de su
concentracin normal. Tambin, Hohtola (1988) men-
ciona que los explantes de Pinus sylvestris se oscure-
cieron y necrosaron cuando se cultivaron en un MS
normal. Su crecimiento fue satisfactorio cuando las
concentraciones de NH
4
NO
3
, KNO
3
y CaCl
2
se reduje-
ron a la mitad y la del KH
2
PO
4
se duplic. En Begonia
venosa (Pierik y Tetteroo 1987), Hevea brasiliensis
(Seneviratne y Wijesekara 1996) y Musa AAB (Utino
et al. 2001) se redujo el oscurecimiento de los tejidos
cuando se cultivaron los explantes en un medio MS
diluido a la mitad o a un cuarto de su concentracin
de sales. De manera ms extrema, Uosukainen (1987)
evit el oscurecimiento de brotes apicales de varias
especies leosas recin establecidas in vitro, mediante
el empleo de un MS diluido diez veces. Posteriormente
los explantes se transfrieron a un MS normal.
Segn George (1996), se ha encontrado que el
medio de cultivo para plantas leosas, WPM (Lloyd
y McCown 1981) reduce el oscurecimiento de los
explantes, comparado a otros medios. La razn de
sto no es obvia, aunque se sugiere que ciertos com-
ponentes del medio de cultivo estn implicados en el
oscurecimiento de los tejidos. Tambin, Afele y De
Langhe (1991) utilizaron el medio Knudson (Knudson
1950) para el cultivo de Musa balbisiana, ya que es
un medio de cultivo bajo en sales y sin la presencia de
varios nutrimentos, lo que ayud a evitar la oxidacin
de los tejidos del explante.
Otra estrategia empleada es evitar el uso de Cu
2+
,
Mn
2+
, Fe
3+
y de Zn
2+
en la elaboracin de medios
nutritivos, ya que estn involucrados en la actividad
de enzimas oxidativas (George 1996, Skellern 1989).
As, Banerjee y De Langhe (1985) redujeron el oscu-
recimiento de brotes de Musa sp. empleando un MS
desprovisto de Cu
2+
y de Zn
2+
. Barghchi (1986) redujo
la oxidacin en Pistacia sp. al omitir el FeSO
4
(Fe
3+
)
del medio de cultivo. Como estrategia relacionada,
Parra y Amo-Marco (1996) redujeron el oscurecimien-
to en explantes de Myrtus communis, al preincubar
temporalmente los explantes en un medio de cultivo
desprovisto de sales minerales.
Carbohidratos
Davies (1972) y Lux-Endrich et al. (2000) su-
gieren que los carbohidratos son requeridos para la
biosntesis de compuestos fenlicos. Mencionan res-
pectivamente, que en suspensiones celulares de rosa
y en el cultivo de brotes de manzano, la reduccin de
los niveles de sacarosa en el medio de cultivo conllev
a decrecer los contenidos de polifenoles presentes en
los explantes, por lo que el problema de oxidacin
disminuy.
Reguladores del crecimiento
La produccin de polifenoles est infuenciada
por los reguladores del crecimiento agregados al me-
dio de cultivo (George 1996). No obstante, su efecto
y relacin con el oscurecimiento de explantes no
es consistente, pues un mismo regulador que induce
oscurecimiento en una especie en otra no tiene igual
efecto. Esto se debe, segn Van Staden et al. (2006) a
las diferencias genticas entre los materiales. Adems
sealan, que un desbalance hormonal, debido al tipo,
combinacin y concentracin de reguladores del cre-
cimiento agregados al medio de cultivo, puede generar
un estrs oxidativo, de tal manera, que los ROS gene-
rados alteran diferentes vas metablicas y respuestas
fsiolgicas del explante, pudiendo incluso matarlo.
De acuerdo con la literatura consultada, primero
las auxinas y luego las citoquininas son los grupos de
reguladores del crecimiento ms relacionados con el
problema de oscurecimiento de explantes. Dentro de
las auxinas, el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D),
y en las citoquininas, la 6-bencilaminopurina (BAP),
son los reguladores que cuentan con un mayor nmero
de referencias que asocian su uso con el problema del
oscurecimiento.
Auxinas
Baker y Wetzstein (1994) cultivaron cotiledones
inmaduros de Arachis hypogaea en niveles crecientes
de auxinas, sea el cido naftalenactico (ANA) 20 a
50 mg/l, o el 2,4-D 5 a 60 mg/l. Estos autores sealan
que conforme aumentaron los niveles de auxinas en el
medio de cultivo se incrementaron los problemas de
oxidacin en los explantes (especialmente con el uso
del 2,4-D). La mayora de explantes se oxid a partir
de dosis mayores a 40 mg/l de 2,4-D. El fenmeno de
oxidacin no fue importante cuando se utiliz ANA en
el medio. Asimismo, Brisson et al. (1988) mencionan
que en Chrysosplenium americanum el oscurecimiento
de brotes ocurri con la adicin de 2,4-D al medio de
cultivo pero no cuando se utiliz ANA o el cido indol
- 3 - actico (AIA). Por su parte, Giri et al. (1993)
indican que los callos de Aconitum heterophyllum
cultivados en un medio con 1 mg/l de 2,4-D liberaron
sustancias fenlicas. Cuando los mismos se transfrie-
ron a un medio de cultivo al cual se le cambi el 2,4-D
por 5 mg/l de ANA, el problema no se present. De
manera similar, Caas y Benbadis (1988) evitaron los
problemas de oxidacin, en callos de olivo, al sustituir
el 2,4-D por el cido indolbutrico (AIB). Sugimura y
Salvaa (1988) mencionan que en Cocos nucifera y en
la mayora de palmeras, la disminucin de los niveles
de 2,4-D en el medio de cultivo tiene un efecto benf-
co en la disminucin de la oxidacin.
En otras especies la respuesta puede ser diferente.
Mathur (1993) logr la formacin de callos de Nardos-
tachys jatamansi en un medio MS adicionado con 1,6
M de ANA. Los callos obtenidos a concentraciones
ms elevados de ANA mostraron altos niveles de oxi-
dacin y muerte de tejidos.
Citoquininas
A pesar de que el BAP previene o retraza la degra-
dacin de la clorofla, ligado a decrecimientos de clo-
roflasa, Mg-dequelatasa y peroxidasas (Hrtensteiner
1999, Costa et al. 2005, Zavaleta-Mancera et al. 2007),
su incorporacin al medio de cultivo se ha relacionado
con decoloraciones y oscurecimiento del explante.
Por ejemplo, en Phyllostachis nigra (BAP a 1 30
M) caus un fuerte oscurecimiento de tejidos (Ogita
2005). Lo mismo que en Ailanthus altissima cv. Pur-
ple Dragon (Jambor-Benczur et al. 1997). Para evitar
el problema, estos investigadores, sustituyeron el BAP
por su ribsido (BAR). Este cambio redujo a la mitad el
nmero de explantes oscurecidos. Tambin, Brisson et
al. (1988) mencionan que en el cultivo de Chrysosple-
nium americanum el oscurecimiento de brotes ocurri
cuando se utiliz BAP. El problema se evit con el
uso de kinetina (kin) o Zeatina. Al contrario, callos de
Aconitum heterophyllum, cultivados en un medio con
0,5 mg/l de kin liberaron sustancias fenlicas. Cuando
stos se transfrieron a un medio con 1 mg/l de BAP el
problema no se present (Giri et al. 1993). Finalmente,
Debergh y Maene (1977) mencionan que con niveles
mayores de 1 mg/l de kin, los explantes de Pelargo-
nium liberaron exudados oscuros al medio de cultivo,
los cuales afectaron la sobrevivencia de los mismos. El
cultivo de brotes recin establecidos en un medio sin
reguladores, durante una semana previa a su transferen-
cia al medio con kin, disminuy el problema.
Modifcacin del potencial redox (E
h
)
El E
h
de una solucin acuosa es una medida de
su propensin a tomar o dar electrones (es decir a ser
reducida u oxidada). Un mayor valor positivo indica
un poder oxidante superior y un valor negativo, en con-
cordancia, su poder reductor. El E
h
de una solucin est
afectado por el pH (E
h
incrementa con reducciones en
el pH), la temperatura, la presin de gases, la concentra-
cin de oxgeno disuelto, con la actividad respiratoria de
las clulas o tejidos en crecimiento, entre otros (George
1993).
La tendencia de un compuesto a ser oxidado o
reducido depende del E
h
de la solucin, por lo que la
modifcacin del mismo constituye una herramienta til
en el manejo del oscurecimiento de explantes (George
1996). Segn se observ en la literatura consultada,
la modifcacin se realiza principalmente mediante el
empleo de sustancias antioxidantes. stas se utilizan
en tres momentos principales: a) en forma de aspersin
o en inmersin del explante recin aislado de la planta
donadora y hasta el inicio del proceso de desinfeccin,
b) luego del proceso de desinfeccin o c) agregado al
medio de cultivo. Los antioxidantes ms empleados,
para el cultivo de clulas vegetales in vitro, son el cido
ascrbico (AA), cido ctrico (AC) y la cistena (CIS),
ya sea solos o en mezcla. Es importante mencionar, que
aunque el AA y AC son productos que se degradan
con el autoclavado (George 1996) y se deben agregar
al medio de cultivo, o utilizar en una solucin asptica,
mediante un fltrado estril, se observa en el Cuadro 5,
que solamente en cuatro de 25 referencias se indica que
fueron esterilizados mediante fltracin. En este mismo
cuadro, se aprecia que la principal tendencia es aplicar
el tratamiento mediante la incorporacin del antioxidan-
te al medio de cultivo, siendo el AA el de mayor uso.
Cuando el tratamiento se aplica en solucin, la tenden-
cia es mezclar el AC con el AA.
Antioxidantes
En trminos generales, un agente antioxidante es
un compuesto que inhibe o demora la oxidacin de un
sustrato propenso al fenmeno. La descomposicin
de los ROS y, o RNS formados o la prevencin de su
formacin, son los posibles mecanismos de su accin.
De esta forma evitan las reacciones en cascada de los
radicales libres (Matkowski 2008). Los antioxidantes
incluyen agentes reductores, los cuales pueden remo-
ver oxgenos de molculas e incluso de compuestos
que actan con mecanismos alternativos, tales como
capturadores o desactivadores de iones; reaccionando
con intermediarios en el equilibrio redox o en la cat-
lisis del transporte de electrones. Agentes reductores
con bajo Eh en solucin, previenen el oscurecimiento
de tejidos, ya que evitan la oxidacin de fenoles y ayu-
dan a una rpida remocin de las quinonas formadas.
Los principales antioxidantes endgenos de plantas
superiores mencionados incluyen a la glutationa, as-
corbato, tocoferol, prolina y la betaina (George 1996,
Shao et al. 2008).
Antioxidantes en solucin
Para solventar la fuerte oxidacin de explantes en
Anacardium occidentale, DSilva y DSouza (1993)
implementaron un pretratamiento, que consisti en
la inmersin de los mismos, durante una hora, en
una solucin de AA (49,32 mg/l). Esto ayud a
reducir considerablemente el problema pero no en su
totalidad. Cuando la estrategia anterior se acompa
con una solucin de CIS o una mezcla de AC y AA
aplicado al momento de la escisin del explante, as
como la incorporacin de 176 mg/l de AA al medio de
cultivo, se logr eliminar el problema. Para especies
forestales, Bonga y Durzan (1982) sugieren el empleo
de una solucin antioxidante (100 mg/l de AA + 150
mg/l de cido actico) para mantener los explantes
recin separados de la planta donadora y hasta su
establecimiento. En microinjertos de Anacardium
occidentale (Ramanayake y Kovoor 1999), se
implement el uso de baos, aplicados tanto al patrn
como al injerto, con una solucin de AC para evitar los
problemas de oxidacin. Contrario a lo mencionado,
Seneviratne y Wijesekara (1996) encontraron que
la aplicacin de un pretratamiento de inmersin de
explantes de Hevea brasiliensis en una solucin de
AC 50 mg/l y AA 100 mg/l increment la oxidacin de
los mismos. En el Cuadro 5 se presenta un listado de
referencias que utilizan el AC, el AA o una mezcla de
ambos, como tratamientos en solucin para combatir
los problemas de oxidacin de explantes.
Adicin de antioxidantes al medio de cultivo
Murashige (1974) seala que en la etapa de esta-
blecimiento in vitro de los explantes algunas veces es
necesario agregar al medio de cultivo un antioxidante
que retarde o evite la oxidacin, sea del explante o del
medio de cultivo. Por ejemplo, Seneviratne y Wijese-
kara (1996) mencionan que en Hevea brasiliensis, la
incorporacin al medio de cultivo del AA y del AC
disminuy considerablemente la oxidacin que ocurre
en los explantes. Esto contrast con resultados previos
poco efectivos, en donde, el AA y el AC solo fueron
utilizados para la inmersin de los explantes durante
Cuadro 5. Dosis de cido ctrico o cido ascrbico utilizadas como tratamiento, aplicado en solucin al explante o incorporado al
medio de cultivo, para el manejo de la oxidacin del explantes durante su establecimiento in vitro.
cido ctrico
mg/l
cido ascrbico
mg/l
Especie Aplicacin Referencia
25* Banano y pltano Al medio Gupta (1986)
50 Caf Al medio Duhem et al. (1988)
2.000 Cynodon transvaalensis
x C. dactylon
En solucin Qu y Chaudhury (2001)
50 100 En general Al medio Constabel (1984)
100 Mangifera indica Al medio Litz et al. (1984)
500 Maytenus ilicifolia En solucin Flores et al. (1998)
25 Musa AAB Al medio Utino et al. (2001)
10 Musa balbisiana Al medio Afele y De Langhe (1991)
10 Musa spp Al medio Banerjee y De Langhe (1985)
1.250 ** Musa sp cv. Kanthali En solucin Titov et al. (2006)
1.500 1.000 Musa textilis En solucin Mante y Tepper (1983)
70 140 Nicotiana tabacum Al medio Joy et al. (1988)
10 Parakmeria lotungensis Al medio Mengyun y Jingmin (2004)
10* 10* Phleum pratense Al medio Guo et al. (1999)
150 150 Phoenix dactylifera En solucin Tisserat et al. (1979)
100 Pistacia terebinthus Al medio Gannoun et al. (1995)
100 Pistacia Vera Al medio Gannoun et al. (1995)
10.000 Platanus occidentalis L. Al medio Feng-jie et al. (2007)
75 50 Psidium guajava En solucin Amin y Jaiswal (1988)
75 50 Psidium guajava En solucin Pirela (2002)
10000 Ruscus hypophyllum En solucin Ziv (1983)
300 Spondias purpurea Al medio Azofeifa (2007)
5 - 10 1 Triticum aestivum Al medio Trottier et al. (1993)
1* Vicia faba Al medio Abdelwahd et al. (2008)
100 100 Vigna radiata En solucin Mathews (1987)
* Esterilizado por fltracin. ** Solucin de Citrato de potasio:Citrato (relacin 4:1 p/p).
su preparacin previa a su cultivo y no evitaron el
problema. En el Cuadro 5 se presenta un listado con
referencias que utilizan el AC, el AA o una mezcla de
ambos incorporados al medio de cultivo, como trata-
miento antioxidante.
Otros antioxidantes
La literatura hace referencia a otros antioxidantes
utilizados en menor frecuencia. As, Rugini y Fonta-
nazza (1981) implementaron la inmersin de explantes
de olivo (recin separados de la planta donadora y
hasta su cultivo in vitro) en una solucin de glutationa
reducida (200 ml/l). De manera similar se hizo con ex-
plantes de Pistacia vera con una solucin de 0,1 mM
(Tabiyeh et al. 2006). Para la CIS, Gutirrez y Kuan-
Jou (1993) sumergieron ejes forales de Phalaenopsis
Golden Emperador Sweet en una solucin de 100
mg/l durante 10 minutos previo a su establecimiento
in vitro. Tambin se agreg este compuesto, incor-
porado al medio, para el cultivo de fresa, en dosis de
4 g/l (Snchez-Cuevas y Salaverra 2004). Por otro
lado, Bonga y Durzan (1982) informaron que la CIS
y la tirosina, agregadas al medio de cultivo, con el fn
de reducir la actividad de la PPO, para el cultivo de
callos de Eucalyptus grandis, fue inhibitorio para su
crecimiento. Otro efecto, reportado por Harada e Ima-
mura (1983), refere al incremento de la embriognesis
en anteras de tabaco, debido a la incorporacin de los
agentes antioxidantes mercaptoetanol, ditiotreitol y
AA al medio de cultivo. Asimismo, se redujo la forma-
cin de races en Prunus avium con ditiotreitol (0,25
mM). Se cree que estos efectos benfcos se deben a
la proteccin antioxidante que reciben las hormonas
endgenas presentes en los explantes (Vasar 2004).
Otros antioxidantes, agregados al medio de cultivo, se
mencionan en el Cuadro 6.
Compuestos que pueden acomplejar iones metli-
cos (Agentes quelatantes)
Los agentes quelatantes o acomplejantes pueden
proporcionar una cierta interferencia a la actividad
de enzimas involucradas con el estrs oxidativo.
Weinstein et al. (1951) descubrieron que el cido eti-
lendiaminotetractico (EDTA) inhibi la actividad de
la PPO en los tejidos de hoja de girasol cultivados in
vitro, lo cual sugiere que estos compuestos remueven
iones metlicos que son esenciales para la activi-
dad de enzimas oxidasas. Tambin el ditiocarbamato
(DIECA) y la 8-hidroxiquinolina (8-HQ) son fuertes
agentes acomplejantes del Cu
2+
. Entre los primeros
informes, Wetmore y Morel (1949), se menciona que
el DIECA utilizado a una dosis de 250 mg/l redujo el
oscurecimiento en brotes de Equisetum. Con el mismo
fn, Jonard et al. (1983) y Jelaska (1987) lo utilizaron
en solucin (1 2 g/l) aplicado a cortes de los microin-
jertos, as como Muneta (1981), en el cultivo de papa
in vitro. Otro compuesto que forma complejos estables
del tipo quelato con el Mn
2+
, Zn
2+
y particularmente
con el Cu
2+
es la tiourea. Posiblemente, mediante esta
accin es capaz de inhibir varias enzimas con actividad
peroxidasa (Skellern 1989). Al respecto, Traumann y
Visser (1989) agregaron 50 mg/l de tiourea al medio
Cuadro 6. Dosis de cistena, mercaptoetanol, ditiotreitol y tiosulfato de sodio, agregadas al medio de cultivo como
antioxidantes, para disminuir la oxidacin del explante durante su establecimiento in vitro.
Antioxidante Dosis (mg/l) Especie Referencia
Cistena 10-50 Caf Monco et al. (1977)
Cistena 100 Caa de azcar Villalobos y Arias (1987)
Cistena 20 Dioscorea sp. Ng (1988)
Cistena 50 Musa Jarret et al. (1985)
Ditiotreitol 0,5 Parakmeria lotungensis Mengyun y Jingmin (2004)
Ditiotreitol 2.000 Pinus virginiana Tang et al. (2004)
Ditiotreitol 400 Strelitzia reginae Ziv y Halevy (1983)
Mercaptoetanol 1 (ml) Parakmeria lotungensis Mengyun y Jingmin (2004)
Mercaptoetanol 1 (ml) No indica Ziv y Halevy (1983), Han y Liu (1990)
Tiosulfato de sodio 1.000 No indica Ziv y Halevy (1983), Han y Liu (1990)
B5 logrando retardar el oscurecimiento en callos de
Parthenium argentatum.
Reduccin de la disponibilidad de oxgeno
George (1996) indica que la tasa de oscureci-
miento del explante tambin depende del Eh de la
superfcie cortada del tejido, por lo que se puede espe-
rar que el oscurecimiento se reduzca si se disminuye
la exposicin del explante al oxgeno. Se menciona,
adems, que el oxgeno se disuelve rpidamente en la
sopa celular del explante seccionado cuando este se
encuentra expuesto al aire, pero, al estar inmerso en
un lquido, la tasa de absorcin ocurre ms lentamen-
te. Algunas estrategias mencionadas en la literatura,
con la fnalidad de disminuir el dao oxidativo son:
reducir el tiempo entre la obtencin del explante y su
inmersin en una solucin antioxidante o su cultivo
defnitivo (Navarro 1988, Guerra y Handro 1988),
realizar los cortes con el material vegetal inmerso en
agua o en alguna solucin antioxidante, por ejemplo al
momento de separar el explante de la planta donadora
(Lidemann et al. 1970), fnalmente disminuyendo el
rea de corte en el explante (Ripley y Preece 1986).
Fenoles, actividad fenolasa y disponibilidad de
sustrato
El oscurecimiento enzimtico de los tejidos, cau-
sado por la oxidacin de compuestos fenlicos para
formar quinonas, est principalmente catalizado por
las PPOs (Fraignier et al. 1995), y la tasa de oxidacin
fenlica puede ser disminuida mediante una reduccin
en la actividad de las enzimas oxidativas o mediante la
disminucin del sustrato disponible para su oxidacin
(George 1996).
Como la actividad de las enzimas relacionadas
con la biosntesis y la oxidacin de los fenoles puede
ser manipulada, y disminuye en ausencia de luz, en
diversos estudios (Villalobos y Arias 1987, Marks
y Simpson 1990, Pirela 1996, Sudripta et al. 1996,
Seneviratne y Wijesekara 1996, Len et al. 1997), se
incluy el acondicionamiento del material donante o
de los explantes establecidos in vitro a crecimiento en
oscuridad durante cierto tiempo a fn de lograrlo. Asi-
mismo, Ichihashi y Kako (1977) plantean la alteracin
del pH del medio de cultivo como una forma de redu-
cir la actividad de las PPOs, la cual es muy importante
a un pH de 6,5, y decrece a pH menores. Por ejemplo,
Huang et al. (2002) mencionan una correlacin directa
entre la actividad de la PPO con el oscurecimiento de
explantes en Dendrocalamus latiforus y Phyllosta-
chys nigra. Indican que la actividad de la PPO en los
explantes fue mayor a pH 8 en el medio de cultivo, y
decrece a pH menores. En su estudio demostraron, con
extractos de la PPO, que su actividad enzimtica es
casi nula a pH menores de 7 y considerablemente alta
a 9. As, el uso temporal de un medio de cultivo ms
cido reducira los problemas de oxidacin.
Tambin, George (1996) considera que se debe
prestar atencin al tipo de gelifcante que se utiliza,
pues algunos tipos de agar presentan altos conteni-
dos de cobre, cofactor enzimtico, y en los explantes
propensos a oxidarse puede ser un problema serio.
Adems indica, que el potencial osmtico del medio
de cultivo puede aumentar o inhibir la biosntesis de
compuestos fenlicos, su difusin y oxidacin.
En relacin con la disponibilidad del sustrato,
los compuestos fenlicos, principalmente los steres
de Cafeoil y Catequinas, son los principales sustratos
para la actividad de la PPO (Amiot et al. 1996). Si la
disponibilidad del sustrato es limitada la actividad de
la enzima se ver disminuida. Por esta razn, Dalal
et al. (1999) prefrieron cultivar brotes laterales (con
menor contenido de fenoles con respecto de los brotes
apicales) para el establecimiento in vitro de dos varie-
dades de uva. Con esta medida lograron disminuir los
problemas de oxidacin.
Material donante
Diferentes factores como el genotipo, la ubica-
cin, el tipo y tamao del explante, la edad, as como
la poca del ao en que se toma el material de la planta
donadora infuyen en los problemas del oscurecimien-
to. A continuacin se presentan algunos ejemplos
publicados.
La oxidacin del tejido y el grado de inhibicin del
crecimiento en el explante son muy dependientes del
genotipo. Esto es especialmente cierto en aquellos g-
neros de plantas (por ejemplo: Castanea, Hamamelis,
Juglans, Quercus, Paeonia, Rhododendro, y muchas
conferas) que naturalmente contienen altos niveles de
taninos u otros hidroxifenoles, y que presentan mayor
tendencia a que los tejidos cultivados in vitro se oxiden
(George 1996). Muchas veces se encuentran diferencias
entre especies del mismo gnero (Huang et al. 2002) e
incluso cultivares de una misma especie. Tal es el caso
de Anigozanthos sp. (McComb y Newton 1981), Aco-
nitum napellus y A. noveboracense (Cervelli 1987),
Sorghum bicolor (Cai y Butler 1990) y de variedades
de uva (Dalal et al. 1999). Asimismo, se ha informado
que materiales clonales de Hevea brasiliensis, mostra-
ron diferentes susceptibilidades y grados de oxidacin
durante su cultivo in vitro (Seneviratne y Wijesekara
1996). La diferencia entre genotipos no es evidente
solamente en la cantidad de sustancias fenlicas pro-
ducidas, sino tambin en su toxicidad. Muchas de las
respuestas diferenciales estn bajo control gentico
(George 1996, Jha y Das 2004). En el caso de Oryza
sativa ssp. Indica, un nico gen, Ic1 (Induced callus 1),
ubicado en el cromosoma 1, regul el oscurecimiento
del explante (Zhong et al. 2007). En Arabidopsis se
estima que ms de 152 genes estn involucrados en el
manejo de los niveles de ROS (Mittler et al. 2004).
Respecto a la ubicacin de los explantes en la
planta donadora, en el cultivo in vitro de Eucalyptus
tereticornis, Das y Mitra (1990) encontraron que las
yemas de brotes apicales terminales del tronco prin-
cipal presentaron mayor propensin a oxidar que sus
iguales ubicadas en las ramas laterales basales. Un
comportamiento similar fue reportado en el cultivo
de uva por Dalal et al. (1999), quienes indican que la
respuesta observada se debe al mayor contenido de
sustancias fenlicas en los brotes apicales.
En relacin al tipo y tamao de explante, la re-
generacin en Syzygium cuminii se vio limitada por
la alta oxidacin ocurrida en los brotes apicales y
segmentos nodales utilizados como explantes (Yadav
et al. 1990). Para evitar el problema y contar con
material vegetal adecuado para sus investigaciones,
debieron utilizar como explante plntulas provenientes
de semillas germinadas en condiciones aspticas. En
Cocos nucifera, Sugimura y Salvaa (1988) indican
que fue preferible usar explantes tomados del pedn-
culo foral con forma de rodajas en vez de cilndricas.
Asimismo, los segmentos de inforescencia pequeos
presentaron mayor sobrevivencia respecto de los ex-
plantes grandes, debido a una menor oxidacin. En
Digitaria sanguinali, Van Le et al. (1997) utilizaron
el cultivo de capas celulares delgadas (0,1 a 0,3 mm
de espesor) cortadas transversalmente, a travs de
diferentes tipos de tejidos, o longitudinalmente, con
tres a seis capas de clulas epidermales y corticales.
Este procedimiento permiti reducir la secrecin de
compuestos fenlicos en caso de presentarse.
Con respecto a la edad del material donante, las
plantas muestran diferentes comportamientos depen-
diendo de su ontogenia. As, George (1996) indica que
los tejidos juveniles son menos propensos al oscureci-
miento que los tejidos adultos. Por esta razn, Thomas
y Ravindra (1997) utilizaron el cultivo de pices nue-
vos en crecimiento para el establecimiento in vitro de
Mangifera indica. De igual forma, Sugimura y Salvaa
(1988) mencionan que, en Cocos nucifera, los proble-
mas de oxidacin se pueden minimizar seleccionando
el estado de desarrollo y tamao ms adecuado del
explante. No obstante lo indicado, en cultivares de
Saccharum spp., el cultivo de explantes tiernos, con
menos de 20 a 25 das de formados, presentaron una
fuerte oxidacin, comparados a los explantes ms de-
sarrollados (Aftab e Iqbal 1999).
Con respecto a la poca del ao idnea para la
toma de material, Das y Mitra (1990) realizaron prue-
bas durante todo un ao, para el cultivo in vitro de
Eucalyptus tereticornis. Encontraron diferencias im-
portantes relativas a su propensin a exudar sustancias
fenlicas segn la poca en que se recolecta el material
de la planta donadora.
AGRADECIMIENTO
Se agradece a Ph.D. Vctor M. Jimnez y Ph.D. Eric
Guevara por la revisin realizada al presente trabajo.
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