5.

Evaluacin y Validacin de
Mtodos Analticos
TM Alfonso Hernndez Monsalves, PhD
08 de abril de 2014
Validacin
La validacin de un mtodo analtico es un proceso de
evaluacin sistemtico para demostrar que el mtodo
cumple con los requisitos necesarios para el uso que se
le va a dar

Cundo es necesario validar?
Cuando se est desarrollando una tcnica nueva.
Antes de incorporar una nueva tcnica a la rutina del
laboratorio.
Cuando se desea comparar el desempeo de dos tcnicas.

Validacin
Confirmacin mediante el examen y la obtencin de
evidencias objetivas que aseguran el cumplimiento de
una serie de requerimientos particularmente definidos
para aplicaciones concretas (ISO 8402-1994, ISO 17025).
Debe ser tan exhaustiva como sea necesario para
responder a las necesidades de la aplicacin en
cuestin.
Puede incluir procedimientos para el muestreo, manejo
y transporte de muestras.


Desarrollo de un mtodo de prueba en el
laboratorio analtico
Seleccin de un mtodo analtico
Elaboracin y validacin del mtodo
Implantacin del mtodo
Monitoreo/seguimiento del mtodo
Seleccin de un mtodo analtico
Caractersticas de aplicacin
Caractersticas de metodologa
Caractersticas de desempeo
Qu considerar al elegir un Mtodo
analtico?
Uso que se le dar (rutina, confirmatorio)
Cantidad de tests a realizar
Instrumentacin requerida
Sensibilidad, especificidad, exactitud y precisin
Costo
Tipo de muestra
Tipo de analito
Seguridad
Validez internacional y cientfica
Que no sea obsoleto
Espacio y ambiente
Seguridad ocupacional


Caractersticas de metodologa
Sensibilidad y especificidad analtica
Seleccin de la reaccin qumica
Optimizacin de las condiciones de
reacciones qumicas
Principios de calibracin y estandarizacin
Robustez del procedimiento analtico
Caractersticas de desempeo analtico:
Parmetros de calidad
Validacin
Analtica
Precisin
Exactitud
Especificidad
Lmite de
deteccin
Lmite de
cuantificacin
Linealidad e
intervalo de
linealidad
Robustez
9
VALIDACIN
ANALTICA
Validacin Metodolgica

1. Espectro de absorcin
2. Estabilidad de la reaccin de color
3. Linealidad
4. Lmite de dilucin
5. Recuperabilidad
6. Sensibilidad
7. Lmite de deteccin

Validacin Estadstica

1. Precisin
2. Exactitud
Validacin Metodolgica
Linealidad
Es la capacidad de producir resultados proporcionales a
la concentracin del analito en las muestras dentro de
un rango determinado de concentracin ya sea
directamente o por medio de una transformacin
matemtica bien conocida.
Se analizan muestras de concentraciones conocidas o
series de muestras diluidas en al menos 5 niveles de
concentracin.
Repetir 3 veces en forma independiente.
Se grafican los datos resultantes en un grfico de
dispersin, colocando en el eje y (Variable dependiente)
y los valores conocidos o esperados en el x (variable
independiente).

Anlisis estadstico:

*Curva regresin y = a + b x
*Coeficiente de determinacin r
2

*Anlisis de varianza (regresin) con:


Estimacin falta de ajuste
Error residual puro.
Si p>0,05 es
significativo y por
ende los datos
tienden a ser
lineales.
Linealidad
1 Seleccin del modelo: Normalmente una lnea recta
y = a + b x

(donde a es la pendiente de la recta y b la ordenada al origen)

2 Establecimiento del diseo experimental:
dominio experimental: rango de concentraciones
distribucin de las medidas
nmero de medidas

3 Estimacin de los parmetros del modelo.
Regresin por mnimos cuadrados.

4 Validacin del modelo: ANOVA

Etapas De La Regresin
Rango de Linealidad y lmite de dilucin
Rango de linealidad: intervalo entre las concentraciones ms baja y ms alta
de analito determinadas por una tcnica especfica, para las cuales se cumple
la ley de Beer.
Lmite de Dilucin: Concentracin mas alta que cumple la Ley de Beer.

Rango de Linealidad:

0 10 g/dL

Lmite de Dilucin:

10 g/dL
Curvas de calibracin
X log(X) Y log(Y) Y log(Y)
11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977
5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827
2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611
1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332
0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013
0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544
Concentracin (mg/dL) Medicin 1 Medicin 2
CONCENTRACION mg/dL
L
E
C
T
U
R
A

0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
Curva Calibracin IgG
log conc.
l
o
g

l
e
c
t
u
r
a

INMUNONEFELOMETRA
-0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
Curva Calibracin IgG
Errores de una calibracin inadecuada
Desviaciones de la ley de Beer: Radiacin
policromtica
menor absorvanca=
menor absortbdad
moar =menor
sensbdad a a
concentracon de
anato.
Recuperabilidad
Capacidad de un mtodo de determinar todo el analito
presente en la muestra, segn el alcance del mtodo
(algunos solo determinan algunas especies del analito).

La mejor manera de determinar la eficacia de extraccin
del mtodo es adicionar diferentes concentraciones del
analito a las muestras y procesarlas por el mtodo
completo
Recuperabilidad
Aunque es la manera ms comn de cuantificar la
recuperacin, el analito adicionado puede no enlazarse
tan fuertemente a la matriz como el presente de
manera natural y dar como resultado la impresin de
una elevada eficacia de extraccin.

La alternativa es efectuar el proceso con MR en la
matriz deseada, si existen; si estos MR han sido
generados mediante caracterizacin de muestras
naturales el estudio de recuperacin representar con
mayor precisin la extraccin de muestras reales.

Ensayo de recuperacin
Tambin llamado de adicin estndar.
Se puede llevar a cabo de dos maneras: con placebo o
con muestra, que se enriquece con estndar.
Realizar las medidas por triplicado.


Criterio de Aceptacin

% de recuperacin obtenido entre 85 - 115 %
Sensibilidad
La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para
una determinada cantidad de analito.

Tambin se indica mediante dos factores analticos:

El Lmite de Deteccin (LOD).

El Lmite de Cuantificacin (LOQ).

Lmite De Deteccin (LOD)
Es la concentracin ms baja del analito que se puede
detectar pero no necesariamente cuantificar.

En general, es el punto al que la seal del analito es
igual a tres veces el ruido de la medida.

Para algunos espectrofotmetros se puede establecer
que el LOD es, aproximadamente, tres veces la
desviacin estndar.

promedo de banco +3 SD
Lmite de cuantificacin (LOQ)
El LOQ es la concentracin ms baja del analito que se
puede determinar con una precisin y exactitud
aceptables.

Para calcular el LOQ se deben de definir por tanto los
lmites aceptables de precisin y exactitud.

Se puede aproximar a la relacin entre la precisin de
la medida analtica y la sensibilidad del mtodo.

Robustez
Es una medida de la capacidad de un procedimiento de
permanecer inalterado por pequeas pero deliberadas
variaciones en los parmetros del mtodo y provee
informacin de su comportamiento en la rutina.
Parmetros estudiados:
1. Efectos del congelado- descongelado
2. Tiempos de incubacin
3. Temperaturas de incubacin
4. Longevidad de los reactivos
5. Preparacin de la muestra
6. Conservacin de la muestra

Especificidad
Habilidad de evaluar inequvocamente el analito en
presencia de componentes que se puede esperar que
estn presentes.
Se refiere a la propiedad del mtodo de producir una
seal medible debida slo a la presencia del analito,
libre de interferencia de otros componentes en la matriz
de la muestra.
Se puede estudiar agregando sustancias de naturaleza
similar a la del analito y estudiando si producen
resultados aumentados.

Interferencias
Efecto de una sustancia presente en una muestra que
causa que el resultado de un test sea errneo.

Puede ser dependiente del analito o independiente del
mismo y puede aumentar o disminuir la medida
realizada.

Son difciles de detectar.

Anlisis de muestras enriquecidas
Se prepara una muestra agregando el material
interferente a una muestra real que contenga el
analito.

Una segunda alcuota de la muestra original se diluye
con un solvente y ambas se analizan determinndose
la diferencia entre ambas.

Validacin estadstica
Gua para la validacin de mtodos de ensayo
Principios y conceptos generales
5 Procedimiento de validacin
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditacin
deben contar con procedimientos y directrices para planificar y
controlar el proceso de validacin de mtodos de ensayo. Sin
embargo, la discusin anterior ha indicado claramente que no
puede desarrollarse un procedimiento nico. En consecuencia,
tiene que desarrollarse una gama de diferentes alternativas de
tcnicas de validacin. Cun detallada deba ser la validacin,
depende de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).
Norma NCh 2446.Of1999
DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola de
Bioq. Cln. y Patologa Molecular
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clnico debera establecer requisitos y verificar, al menos
las siguientes caractersticas metrolgicas:
1.-Error sistemtico (sesgo). El fabricante del calibrador deber
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deber proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados. Sin
embargo, el Laboratorio debera obtener sus evidencias que el proceso
proporciona resultados satisfactorios.
2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deber
proporcionar la informacin de las interferencias.

SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
3.-Imprecisin interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Lmite de deteccin. El fabricante deber propocionar
especificaciones de imprecisin, sensibilidad y lmite de deteccin. El
Laboratorio debera estudiar el lmite de deteccin cuando observa
diferencia.
5.-Contaminacin
6.-Verificar dilucin
DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola de
Bioq. Cln. y Patologa Molecular
Precisin v/s Exactitud
Exactitud
Expresa la cercana entre el valor que es aceptado, sea
como un valor convencional verdadero (material de
referencia interno), sea como un valor de referencia
(material de referencia certificado o estndar) y el valor
promedio obtenido al aplicar el procedimiento de
anlisis un cierto nmero de veces.
El trmino exactitud cuando se aplica a un conjunto de
resultados de mediciones implica la combinacin de los
componentes aleatorios y de un error sistemtico comn
o de un componente de sesgo (Norma ISO 5725-1 e ISO
3534-1)

Exactitud (Norma ISO 3534-1)
Precisin: grado de concordancia entre resultados
de mediciones obtenidas independientes bajo
condiciones establecidas (repetibilidad y
reproducibilidad).
Exactitud = Precisin + Veracidad
Veracidad: grado de concordancia entre el
promedio obtenido a partir de una serie de
resultados y un valor de referencia aceptado.
Determinacin de la Exactitud
1. Comparacin con mtodos de referencia.
2. Anlisis de muestras de referencia certificadas.
3. Ensayos de recuperacin.

4. Ensayos interlaboratorios. ensayos externos
Comparacin con mtodos de referencia

Se analizan muestras de pacientes por el mtodo en
estudio y otro mtodo de comparacin, luego se estima
el error sistemtico basndose en las diferencias
observadas para ambos mtodos.

El mtodo de comparacin debe en lo posible ser el de
referencia (gold standard). Es una tcnica cuyos
resultados se han comparado con mtodos definitivos
y/o trazables a materiales estndar de referencia.

Comparacin con mtodos de referencia
trabajo del mtodo y representar el espectro de
enfermedades esperadas en la aplicacin de rutina
del mtodo.
Es mejor realizar ensayos de las muestras por
duplicado (a partir de dos alcuotas diferentes) en
diferentes corridas o por lo menos en diferente orden.
Perodo de tiempo:
Mnimo de 5 das, lo ideal 20 das, corriendo 2 a 5
muestras de pacientes por da.

Nmero de muestras a usar
Mnimo de 40 para los dos test.
Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de
Comparacin con mtodos de referencia
Anlisis de datos:
Graficar los resultados y hacer una inspeccin visual de
los mismos.
Cualquier muestra con resultados discrepantes debe ser
reanalizada.
Para los mtodos que se espera coincidan hacer
primero un grfico de diferencias. Las mismas debern
oscilar alrededor de la lnea del cero.

Comparacin con mtodos de referencia
Comparacin con mtodos de referencia
Clculos estadsticos
Para la comparacin de resultados que cubren un
amplio rango analtico lo mejor es el clculo de la
regresin lineal.
Permite estimar el error sistemtico a ms de una
concentracin de decisin mdica.
Tambin se puede calcular el coeficiente de correlacin
r que permite saber si el rango de datos es lo
suficientemente amplio para dar buenos estimados de
la pendiente y la ordenada en el origen (r > 0.99).

Anlisis de muestras de referencia
certificadas
Se analiza un mnimo de 3 concentraciones y 5
determinaciones por el mtodo a validar y se compara
el resultado obtenido con el valor verdadero declarado.
Criterio de aceptacin:
El valor medio debe estar dentro del 15% del valor

nominal para el LDeteccion excepto en el Lmite de
cuantificacin (LDC) que puede ser el 20%.
EXACTITUD
Precisin
Grado de concordancia entre resultados de
mediciones obtenidas de una serie repetida de
anlisis, sobre una muestra homognea, bajo
condiciones establecidas (Norma ISO 3534).
La precisin depende slo de la distribucin de
errores aleatorios y no tiene ninguna relacin con
el valor verdadero o el valor especificado.
Puede considerarse a tres niveles:

Repetibilidad
Precisin intermedia o reproducibilidad intralaboratorio
In situ.
Reproducibilidad
Precisin
A
1
A
2
A
3
A
4
A
5
A
6
A
7
A
n
Muestra
Alcuotas
Anlisis
Resultado
Precisin
REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisin obtenida bajo
las mismas condiciones de operacin en un intervalo corto
de tiempo (mismo da), por un mismo analista, en la misma
muestra homognea y en el mismo equipo.

PRECISION INTERMEDIA: Precisin obtenida dentro del
laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, das
distintos con la misma muestra homognea.
como resultado de estudios interlaboratoriales diseados
para estandarizar la metodologa.


REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisin entre mas laboratorios
Precisin
Se estudia mediante experimentos de replicacin.
El propsito es observar la variacin esperada en el
resultado de un test bajo las condiciones de operacin
normal de un laboratorio.
Estima el error causado por factores como el pipeteo,
condiciones de reaccin (T, mezclado).
Suele ser mayor en sistemas no automatizados.

Precisin
Las muestras de ensayo comnmente usadas son:
soluciones estndar, materiales de control, pooles de
pacientes o muestras frescas de pacientes individuales.

Se emplean los resultados de 20 alcuotas de cada
material y se calcula la media, la desviacin estndar y
el coeficiente de variacin.

Perodo de tiempo que abarca el experimento: Tiempo
ideal 20 das.

Gua para la validacin de mtodos de ensayo
Principios y conceptos generales
5 Procedimiento de validacin
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditacin
deben contar con procedimientos y directrices para planificar y
controlar el proceso de validacin de mtodos de ensayo. Sin
embargo, la discusin anterior ha indicado claramente que no
puede desarrollarse un procedimiento nico. En consecuencia,
tiene que desarrollarse una gama de diferentes alternativas de
tcnicas de validacin. Cun detallada deba ser la validacin,
depende de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).
Norma NCh 2446.Of1999
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clnico debera establecer requisitos y verificar, al menos
las siguientes caractersticas metrolgicas:
1.-Error sistemtico (sesgo). El fabricante del calibrador deber
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deber proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados. Sin
embargo, el Laboratorio debera obtener sus evidencias que el proceso
proporciona resultados satisfactorios.
2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deber
proporcionar la informacin de las interferencias.

DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola
de Bioq. Cln. y Patologa Molecular
Sobre responsabilidades en la obtencin de evidencia objetiva de la
validacin de mtodos normalizados:
3.-Imprecisin interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Lmite de deteccin. El fabricante deber propocionar
especificaciones de imprecisin, sensibilidad y lmite de deteccin. El
Laboratorio debera estudiar el lmite de deteccin cuando observa
diferencia.
5.-Contaminacin
6.-Verificar dilucin
Documento A, 0/2 de la Soc. Espaola de Bioq.
Cln. y Patologa Molecular
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement
Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,
College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)
Recomendacin de validacin de mtodos de acuerdo a la
complejidad de la prueba o determinacin:
Pruebas de mnima complejidad (waived tests).
No hay recomendacin para la validacin de mtodo.
Seguir directrices del fabricante.
Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el
FDA los estudios de validacin de mtodos deberian seguir las siguientes
recomendaciones:
Verificar los parmetros de calidad o especificaciones de desempeo
(demostrar resultados comparables a los establecidos por el fabricante):
Exactitud
Precisin
Rango de los resultados analticos reportado por el mtodo
Verificar que los intervalos de referencia del fabricante son apropiados
para la poblacin de pacientes del laboratorio.
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,
College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement
Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados
por el FDA
reportado por el fabricante
Obtener valores de referencia para verificar intervalo de referencia
indicado por el fabricante
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,
College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement
Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
Actividades a realizar por el laboratorio:
Comparacin de mtodos para estimar la inexactitud o sesgo.
Replicar muestra referencia o control para estimar la imprecisin
Hacer estudio de linealidad para estimar el rango de la determinacin
Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio, la validacin de los mtodos requiere:
Exactitud
Precisin
Sensibilidad analtica
Especificidad analtica, incluyendo el estudio de sustancias
interferentes
Rango de los resultados analticos reportado por el mtodo
Intervalo de referencia (valores normales)
Cualquier otro parmetro requerido para el desempeo del mtodo

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,
College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement
Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio
Actividades a realizar por el laboratorio:
Comparacin de mtodos para estimar la inexactitud o sesgo.
Replicar muestra o control para estimar la imprecisin
Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar
Lmite de deteccin para estimar interferencias permanentes
Experimentos de recuperacin para estimar proporcin de interferencias
Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,
College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement
Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
Anlisis Estadstico de la Precisin
Media:

Desviacin estndar
=
(

)
2
( 1)

Coeficiente de variacin
=

100
Anlisis de varianza F (comparacin de la desviacin estndar)

Estudio homogeneidad muestra:
Anlisis de varianza (F)
Prueba de t de Student.


REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA LA DETERMINACIN IgG
(Homogeneidad Muestra)
Muestra Contramuestra
n 6 6
Media 1557.50 1554.67
s 52.129 82.199
CV 3.347 % 5.287 %

t calculado = 0.0713 < t tabla
5;0.025
= 2.571
No existe diferencia estadstica significativa y por lo tanto las
muestras son iguales y homogneas.
=

Ejemplo: Repetibilidad
Reproducibilidad Inmunonefelometra para
Determinacin de IgG
IgG mg/dL

DA 1 DA 2 DA 3

1556 1568 1564
1568 1543 1606
1624 1556 1585
1481 1598 1556
1598 1602 1535
1518 1413 1568

Ejemplo: Reproducibilidad
n 18 (en tres das diferentes)
media 1557.72
DE 12.27
CV 0.8 %
Precisin 99.2 %
Anlisis de Varianza (ANOVA)
--------------------------------------------------------------------------------------
Fuente var. SC G. libertad
2
de la media F P
--------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626
Intra grupos 40682,8 15 2712,19
--------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 42179,6 7
Si F < P no existe
diferencia
estadstica
significativa en
las mediciones
de los grupos.
Reproducibilidad Inmunonefelometra para
Determinacin de IgG
Ejemplo: Reproducibilidad
Veracidad
Grado de concordancia entre el valor medio obtenido
de una serie de resultados y el valor de referencia
aceptado (certificado). Norma ISO 353.

Anlisis estadstico
Media experimental
Desviacin estndar experimental
Prueba de t de Student

VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA
PARA DETERMINACIN DE IgG
MRC HUMATROL P Lote 0007
IgG mg/dL
n = 10
Media experimental 930.9
Media certificada 925.0
931,8
942,3
951,8
924,8
918,6
927,1
920,5
938,4
935,2
918,8
Veracidad
Veracidad inmunonefelometra
para determinacin de IgG
=

=
,
,

Valor exp. MRC
media 930,9 925
s (DE) 11,05
= ,
Existe trazabilidad
Veracidad inmunonefelometra
para determinacin de IgG
=

=
,
,

Valor exp. MRC
media 930,9 925
s (DE) 11,05
= ,
t calculado = 1,6963 <t (tabla)
9;0.025
= 2,262
Mtodos Cualitativos y/o
Semicuantitativos
En los laboratorios de anlisis se generan cada
vez ms mediciones que dan respuesta rpidas
de tipo cualitativo.
Respuesta de tipo binario: Si / No .
Presencia o ausencia de determinado analito.
Presencia o ausencia de un determinado nivel del analito.
Se denominan sistemas de screening.


Mtodos Cualitativos y/o
Semicuantitativos
Sistemas de Screening
Muchas veces se utilizan como una etapa previa
para luego realizar un anlisis cuantitativo y
confirmatorio.
Evita anlisis cuantitativos a muestras que dan
negativo.
A nivel microbiolgico generalmente en
identificacin bacteriana son diagnsticos y no
presuntivos.
Anlisis Cualitativo
Sistema de
tamizaje
(screening)
Anlisis
cuantitativo
No se
analiza
> 2 ng/mL
< 2 ng/mL
NO
SI
Menor experimentacin.
Decisin rpida.
De fcil manejo, porttiles, etc.
Sin necesidad de equipos.
Ahorro.

Presencia del analito
Ausencia del analito
Mtodo Confirmatorio
Sistemas de Medida
Cualitativos
Anlisis cualitativo clsico o sensorial:
Color: cambio, aparicin.
Olor.
Turbidez.
ELISA.
Crecimiento bacteriano.
Deteccin instrumental:
UV: fluorescencia, potenciometra.
Sensores: qumicos, bioqumicos, etc.
ELISA.
Anlisis Cualitativo Clsico o
Sensorial
La respuesta binaria SI/NO se obtiene
directamente.

En general la presencia del analito se determina
por comparacin con un blanco.
Pruebas bateras bioqumicas

Se encuentran tambin las pruebas de Kits.
Son dispositivos comerciales para pruebas concretas.
Contienen todos los reactivos necesarios.
Pueden contener algn instrumento sencillo.

Anlisis Cualitativo Clsico o
Sensorial
Pruebas de kits:
Ltex para serotipificar
Streptococcus.
Tiras de orina.
Pruebas rpidas para meningitis
bacterianas.
API.
Mtodo de CIM por microdilucin
en microplacas.
Coaglutinacin.
Mtodo ELISA rpido para deteccin
C. difficile

Anlisis Cualitativo Sensorial
La determinacin se hace mediante una
medida instrumental:
Colorimetra.
Fluorescencia.

La presencia o no de un determinado analito
puede ser el nivel lmite de deteccin o a un
nivel superior.
Anlisis Cualitativo Sensorial
La respuesta instrumental que se obtiene se
transforma en respuesta binaria SI/NO e implica un
tratamiento de datos.
Primero hay que establecer la respuesta
instrumental:
Valor de absorbancia para la concentracin
correspondiente.
Si el valor es superior la respuesta es Si.
Ej. Mtodos automatizados para Hemocultivos.
Ej. Mtodos automatizados para CIM.
Ej. Estandarizacin automatizada a 0,5 MF.

VALIDACIN CLNICA
Validacin Clnica
La toma de decisiones clnicas es un proceso
extremadamente complejo en el que deber finalmente
ser valorada la utilidad de la prueba diagnstica para el
manejo del paciente.

Debo conocer la exactitud, es decir, su capacidad para
clasificar correctamente a los pacientes en categoras o
estados en relacin con la enfermedad (tpicamente
dos: estar o no estar enfermo, respuesta positiva o
negativa a la terapia).

Clasificacin de enfermedades por
diagnosis
Debe tenerse muy en cuenta el tipo de
enfermedad que se est analizando y el grado de
avance de la misma en el paciente, as como sus
consecuencias .
Tipo I
Son todas aquellas enfermedades donde la peor
equivocacin que se puede cometer en el diagnstico
es un falso negativo.
Incluye:
Enfermedad curable si se detecta a tiempo
Enfermedad grave que no puede dejarse pasar inadvertida
Los falsos positivos no trauman ni psicolgicamente, ni
econmicamente al paciente, pero los diagnsticos falsos
negativos si lo hacer.

Ej. Infarto de miocardio, enfermedades venreas,
fenilcetonuria, cncer de mama o tero.
Tipo II
Son todas aquellas enfermedades donde la peor
equivocacin que se puede cometer en el diagnstico es un
falso positivo.
Enfermedad grave, pero difcilmente curable o sin remisin.
Es muy importante para el paciente o para la poblacin el saberse
un verdadero negativo.
Los falsos positivos trauman seriamente al paciente, en cambio los
falsos negativos no.
El tratamiento de los falsos positivos ocasiona serios perjuicios al
paciente.

Ej. Estado terminal o sin remisin de la enfermedad, cncer
oculto, esclerosis en placa, tratamientos como
quimioterapia o radioterapia, ciruga innecesaria, estado IV
de la sfilis cuando ya no tiene remedio.
Tipo III
Son las restantes donde no se puede clasificar
claramente como una de las anteriores.

Ej. Lupus eritematoso, ciertas formas de leucemia o
linfoma, diabetes.
Se incluye al SIDA, pues un caso falso positivo puede ser
muy daino para el paciente pero un falso negativo sera
muy peligroso para la sociedad y ambos peligros son
graves.
Validacin Clnica
Notar que una misma enfermedad puede clasificarse de
maneras diferentes segn al estado de avance que tiene
en el paciente.
Un cncer que puede ser curado si se detecta a tiempo
es un tipo I pero una vez que se produjo metstasis
pasa a ser tipo II.
Diseo de los estudios de Validacin
clnica
En el diseo debe considerarse:

Intervalos de referencia o rangos normales. Existe
diferencia con la edad, sexo u otro factor? Pueden
usarse valores de literatura?.
Valores de cut off o umbral de decisin: pueden usarse
los generalmente aceptados?.
Seleccin de las muestras
Debe tomarse una porcin que sea representativa de
la poblacin total.
Idealmente deben elegirse los sujetos por un proceso
al azar para evitar sesgos.
Es conveniente elegir los sujetos antes de comenzar los
ensayos.
Determinacin de la respuesta verdadera
a la pregunta clnica
La validez de la evaluacin del test est limitada por la
exactitud con la que est determinada la respuesta a la
pregunta clnica.
En general los test de rutina tienen una sensibilidad y
especificidad alta pero distinta del ideal. Si comparo mis
resultados con el puedo concluir errneamente que la
tcnica no sirve.
Una respuesta definitiva puede requerir:
realizacin de biopsias
exploracin quirrgica
autopsia
seguimiento evolucin del paciente
Determinacin de la respuesta verdadera
a la pregunta clnica
Los test que estn relacionados en forma muy
cercana al test a evaluar no deben ser incluidos en
los criterios diagnsticos.

Si el criterio depende de observaciones subjetivas es
preferible que el resultado sea de consenso entre
varios expertos.
Ensayo de las muestras
Para evitar sesgos el ensayo debe hacerse a ciegas, es
decir sin que el laboratorista sepa la condicin clnica
del paciente.

Si se comparan varios test en el mismo estudio, deben
hacerse todos los test en todos los sujetos y en el
mismo punto del curso de su enfermedad .
Evaluacin del desempeo

un individuo cuyo estado real sea el definido
como positivo respecto a la condicin que
estudia la prueba, razn por la que tambin es
denominada fraccin de verdaderos positivos
(FVP).
Sensibilidad clinica:
Es la probabilidad de clasificar correctamente a
Evaluacin del desempeo

un individuo cuyo estado real sea el definido
como negativo. Es igual al resultado de restar a
uno la fraccin de falsos positivos (FFP)
Especificidad clinica:
Es la probabilidad de clasificar correctamente a
Evaluacin del desempeo

Prevalencia:

Indica la proporcin de sujetos en la poblacin
estudiada que realmente tienen la enfermedad.
Evaluacin del desempeo
Un test perfecto tiene S y E de 100%.
En realidad existe un par S-E para cada umbral o nivel
de decisin.
Hay que decidir que par S-E funciona mejor para las
circunstancias en que quiero usar el test.
En el momento de decidir que test usar se elige uno de
alta sensibilidad para las enfermedades del tipo I, alta
especificidad para las de tipo II y el ndice de Youden
para las de tipo III.
ndice de Youden
Analiza la capacidad del mtodo de diagnstico, usando
un nico valor en reemplazo de la forma dual de
hacerlo (sensibilidad y especificidad)
Se define como:
Y = Sen + Esp 1

Vara de (1) a (+1).
Si es inferior o igual a 0, la prueba no tiene ningn valor
informativo.
La prueba es tantode mejor cuanto el ndice de Youden
se acerca a 1.
Tipos de diagnsticos

Curva ROC (o caractersticas operativas
del receptor)
Despliega grficamente el espectro completo del
desempeo de un test para un grupo particular de
sujetos afectados y no afectados.
Tambin sirve para comparar un test con otro, para ello
se grafican ambos en un mismo para de ejes.

Supongamos que, tanto para la poblacin sana como
para la enferma, la variable de decisin que representa
el resultado de la prueba diagnstica se distribuye
normalmente, con media y desviacin tpica conocidas.

Mediante esta representacin de los pares (1-
especificidad, sensibilidad) obtenidos al considerar
todos los posibles valores de corte de la prueba , la
curva ROC nos proporciona una representacin global
de la exactitud diagnstica.

Si la prueba no permitiera discriminar entre grupos, la
curva ROC sera la diagonal que une los vrtices inferior
izquierdo y superior derecho.
Curvas ROC
Consideraciones

La fraccin de falsos positivos est influida por la
poblacin de sujetos no enfermos incluida en el ensayo.

Verdaderos positivos: si tomo pacientes con
enfermedad muy activa o reciente el perfil cambiar.
Eficiencia y valor predictivo
Sensibilidad (S) y Especificidad (E) dependen del
umbral de decisin y son independientes de la
prevalencia (fraccin de la poblacin que tiene la
condicin).

Valor predictivo (VP) y eficiencia: varan con el umbral
de decisin y la prevalencia.

Eficiencia: n total de resultados correctos (tanto
positivos como negativos) expresado como % del total
de resultados.
Costos
Cuando un test no funciona bien y se clasifica
errneamente a un paciente esto genera un costo.

Falso negativo: se demora el inicio de una terapia

Falso positivo: se realiza un tratamiento innecesario y
provoca ansiedad en el paciente.
Costos
Si conozco el costo de estos errores puedo calcular el
costo total relativo de todas esas decisiones incorrectas
asociadas con cierto umbral de decisin.
Falso negativo (FN): indica la proporcin de sujetos en la
poblacin estudiada que realmente tienen la
enfermedad pero sern diagnosticados como negativos
por el test.
PREV x FN: proporcin de todos los sujetos testeados
que sern clasificados incorrectamente como que estn
sanos.
Costos

Costo de FN: PREV X FN x (costo de decisin FN)
Costo de FP: (1- PREV) x (FP) x (costo de decisin FP)
La cuestin es donde ocurre el balance de menor costo.

Si grafico el costo total de clasificacin errnea vs el nivel
de decisin puedo identificar el nivel menos costoso.