Separacion Purificacion y Caracterizacion de Principios Activos

18/08/2009
SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN Y
CARACTERIZACION DE PRINCIPIOS ACTIVOS
Separación y purificación de principios activos
Las técnicas utilizadas para separar y purificar los compuestos

químicos presentes en las plantas medicinales son los mismos
que se emplean comúnmente en química orgánica:
•Extracción separativa.
•Cromatografía (de reparto, de absorción, de gases, etc.).
•Destilación (simple, fraccionada, a vacío, con arrastre de vapor).
•Cristalización / recristalización.
•Extracción liquido-liquido.
•Etc.
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Cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación versátil que
presenta distintas variantes.
En toda separación cromatográfica hay dos fases: una móvil y otra

estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra
manteniendo un contacto íntimo.
La muestra se disuelve en la fase móvil y los componentes de la

muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil.
Cromatografía
Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo

diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce
la separación.
Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil

el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la
mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y
su salida es mucho más lenta.
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Tipos de Cromatografía
fase
tipo fase estacionaria
movil
líquido--sólido
líquido sólido inerte como gel de
disolventes
sílice o alúmina
intercambio
soluciones
iónico resina cambiadora
acuosas
líquido--líquido líquido adsorbido en un

líquido
líquido
soporte sólido
gas--líquido
gas película de líquido adsorbida
gas
sobre un soporte sólido
Cromatografía en columna
Se emplea para la separación de mezclas o
purificación de sustancias.
Como fase estacionaria se usa gel de sílice
o alúmina dentro de una columna de vidrio.
La elección del disolvente es crucial para
una buena separación. Dicho disolvente
pasa a través de la columna por efecto de
la gravedad.
Se empaca la columna con la fase
estacionaria y a continuación se introduce
la muestra por la parte superior de la
columna y se eluye con el disolvente
elegido, recogiéndose por lo general en
tubos de ensayo
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Cromatografía en capa fina

La técnica de cromatografía en capa fina (TLC) es una de las
más comunes empleadas en un laboratorio de Química
Orgánica.
Entre otras cosas permite:
• Determinar el grado de pureza de un compuesto.

•Identificar un compuesto químico.
• Comparar muestras.
• Realizar el seguimiento de una reacción.
• Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en
cromatografía de columna.
La cromatografía en capa fina usa como fase estacionaria un sólido

como gel de sílice o alúmina conteniendo algún fijador que hace
que se mantenga la fase estacionaria sobre un soporte tal y como
placas de vidrio, aluminio e incluso materiales plásticos. Las placas
pueden prepararse en el laboratorio o adquirirse en el mercado.
Para realizar una cromatografía en capa fina se procede de la

siguiente manera:
1) Preparar o cortar, en su caso, una placa

de tamaño adecuado.
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2) Disolver una pequeña cantidad de la

muestra y, mediante un capilar de vidrio,
la muestra se aplica en la parte inferior
de la placa a cierta distancia del borde.
3) Introducir la placa en un recipiente con

el disolvente adecuado. Dicho recipiente
debe presentar una atmósfera saturada en
el vapor del disolvente por lo que se pone
trozo de papel de filtro en la parte
posterior y se tapa.
4. Cerrar el recipiente y dejar que el líquido ascienda por

capilaridad.
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5) Revelar la placa para poner de manifiesto donde se

encuentran los puntos .
6) Determinar las posiciones relativas de los puntos mediante

el cálculo del Rf.
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Cromatografía de gases
La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la
que la muestra se volatiliza y se inyecta en el inicio de una
columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una
fase móvil de gas inerte.
A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no

interacciona con las moléculas de las sustancias a separar; su
única función es la de transportar los compuestos a través de la
columna.
Esta técnica cromatográfica se emplea para separar mezclas de

sustancias volátiles o con puntos de fusión relativamente bajos.
1 6
5
3
1. Depósito de Gas y Controles de flujo / Presión.

2. Inyector (Vaporizador) de la muestra.
3. Columna Cromatográfica y Horno de la Columna.
4. Detector.
5. Amplificador de Señal.
6. Registro de la Señal (Registrador o Computador).
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Cristalización / recristalización
La cristalización es una técnica utilizada para la purificación de

sustancias sólidas, basada en general en la mayor solubilidad
que suelen presentar los sólidos en un disolvente en caliente
que en frío
El modo más frecuente es preparar una disolución saturada

en caliente del sólido a purificar, utilizando un disolvente
adecuado; filtrar para eliminar las impurezas insolubles que se
hallen presentes y dejar que se separe por enfriamiento la
sustancia que estaba disuelta, cristalizada y en un mayor
estado de pureza.
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DISOLVENTE
COMPUESTO IMPUREZA
DE INTERES
MEZCLA INSOLUBLE EN EL
DISOLVENTE FRIO
CALENTAR A
EBULLICION
MEZCLA INSOLUBLE EN EL MEZCLA SOLUBLE EN EL

DISOLVENTE FRIO DISOLVENTE CALIENTE
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FILTRAR
Y
ENFRIAR SECAR
MEZCLA SOLUBLE EN EL LAS MOLECULAS SE REACOMODAN FORMANDO

DISOLVENTE CALIENTE UN CRISTAL PURO Y LAS IMPUREZAS QUEDAN
DISUELTAS EN EL DISOLVENTE
PROCESO DE
RECRISTALIZACION
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MUESTRA + DISOLVENTE
INSOLUBLE A T.A. SOLUBLE A T.A.
CALENTAR A EBULLICION DESCARTAR
DISOLUCION DISOLUCION INSOLUBLE

PARCIAL TOTAL
AGREGAR MAS ENFRIAR HASTA

DISOLVENTE RECRISTALIZAR
BUSCAR NUEVOS
SI, SE ELIGE. NO, SE DESCARTA.
DISOLVENTES
Caracterización de los compuestos.
Una vez aislado y purificado el compuesto se deberá caracterizar

tanto por sus propiedades físicas como por métodos químicos y
espectroscópicos; así en la CARACTERIZACIÓN FISICA, se
determinan:
•Propiedades organolépticas.
•Punto de fusión (si el producto es sólido).
•Punto de ebullición (si es líquido).
•Densidad.
•Índice de refracción.
•Rotación óptica (si el producto es de origen natural).
•Etc.
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En la CARACTERIZACIÓN QUÍMICA, se considera:
•Análisis elemental cualitativo y cuantitativo.

•Clasificación por solubilidad
•Determinación de acidez o basicidad.
•Determinación de su constante de ionización.
•Determinación del coeficiente de reparto.
•Ensayos químicos preliminares.
Análisis espectroscópico.
Las técnicas espectroscópicas tienen por objeto lograr la

completa determinación estructural de una sustancia. De una
manera general, los objetivos que se persiguen en un análisis
espectroscópico completo son:
•Fórmula molecular y peso molecular.

•Presencia de insaturaciones.
•Identidad de los grupos funcionales.
•Posicionamiento de los sustituyentes y/o los grupos funcionales
sobre el esqueleto carbonado.
•Propiedades estereoquímicas.
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Técnicas espectroscópicas.
TECNICA INFORMACIÓN OBTENIDA
Espectrometría de Formula y peso molecular, así como subestructuras

masas a partir de los iones observados.
observados.
Existencia de cromóforos y/o conjugaciones en la
Ultravioleta--Visible
Ultravioleta
molécula a partir de las absorciones observadas
observadas..
Grupos funcionales a partir de las absorciones
Infrarrojo
observadas..
observadas
Grupos funcionales, subestructuras, conectividad,
Resonancia estereoquímica, etc.
etc. a partir de datos de
magnética nuclear desplazamiento químico, áreas de los picos y
constantes de acoplamiento observadas.
observadas.
Estructura total de la molécula incluida su
Rayos X estereoquímica..
estereoquímica
Espectrometría de masas.
Técnica denominada de Impacto Electrónico (EM-IE) consistente

en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada) con
una corriente de electrones a alta velocidad.
Ello produce que la sustancia pierda electrones y se fragmente

dando diferentes iones, radicales y moléculas neutras. Los
iones, son conducidos mediante un acelerador de iones a un
tubo analizador curvado sobre el que existe un fuerte campo
magnético y conducidos a un colector/analizador sobre el que se
recogen los impactos de dichos iones en función de la relación
carga/masa de los mismos.
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Espectroscopia ultravioleta.
Utiliza la radiación del espectro electromagnético cuya longitud

de onda está comprendida entre los 100 y los 800 nm (energía
comprendida entre las 286 y 36 Kcal/mol) y su efecto sobre la
materia orgánica, es producir transiciones electrónicas entre los
orbitales atómicos y/o moleculares de la sustancia.
Los máximos de absorción se deben a la presencia de

cromóforos en la molécula.
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Espectroscopia infrarroja.
Utiliza la radiación del espectro electromagnético cuya longitud de
onda (λ) está comprendida entre los 800 y los 4000 nm, y su
efecto sobre la materia orgánica, es producir deformaciones de los
enlaces de la sustancia.
Cada absorción observable en el espectro corresponde a una

vibración determinada de algún enlace dentro de la molécula.
Hay diferentes modos normales de vibración en las moléculas,

llevan asociado un movimiento característico de los átomos, los
principales son: las deformaciones de enlace, ángulos de valencia,
ángulos diedros, deformaciones fuera del plano, etc.
Este tipo de espectros determina sobre todo, los GRUPOS

FUNCIONALES presentes en la molécula.
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Espectroscopia de R.M.N.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear es una

técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras
moleculares, aunque también se puede emplear con fines
cuantitativos. Esta técnica se basa en el fenómeno físico de
resonancia magnética nuclear (RMN).
Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético

externo absorben radiación electromagnética (concretamente en la
región de las radiofrecuencias).
Como esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se

puede emplear para determinar la estructura de la molécula en
donde se encuentran éstos.
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Separación y purificación de principios activos

Las técnicas utilizadas para separar y purificar los compuestos

En toda separación cromatográfica hay dos fases: una móvil y otra

La muestra se disuelve en la fase móvil y los componentes de la

Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo

Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil

líquido--líquido líquido adsorbido en un

Cromatografía en capa fina

Entre otras cosas permite:

• Determinar el grado de pureza de un compuesto.

La cromatografía en capa fina usa como fase estacionaria un sólido

Para realizar una cromatografía en capa fina se procede de la

1) Preparar o cortar, en su caso, una placa

2) Disolver una pequeña cantidad de la

3) Introducir la placa en un recipiente con

4. Cerrar el recipiente y dejar que el líquido ascienda por

5) Revelar la placa para poner de manifiesto donde se

6) Determinar las posiciones relativas de los puntos mediante

A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no

Esta técnica cromatográfica se emplea para separar mezclas de

1. Depósito de Gas y Controles de flujo / Presión.

La cristalización es una técnica utilizada para la purificación de

El modo más frecuente es preparar una disolución saturada

MEZCLA INSOLUBLE EN EL MEZCLA SOLUBLE EN EL

MEZCLA SOLUBLE EN EL LAS MOLECULAS SE REACOMODAN FORMANDO

INSOLUBLE A T.A. SOLUBLE A T.A.

CALENTAR A EBULLICION DESCARTAR

DISOLUCION DISOLUCION INSOLUBLE

AGREGAR MAS ENFRIAR HASTA

Caracterización de los compuestos.

Una vez aislado y purificado el compuesto se deberá caracterizar

En la CARACTERIZACIÓN QUÍMICA, se considera:

•Análisis elemental cualitativo y cuantitativo.

Las técnicas espectroscópicas tienen por objeto lograr la

•Fórmula molecular y peso molecular.

TECNICA INFORMACIÓN OBTENIDA

Espectrometría de Formula y peso molecular, así como subestructuras

Técnica denominada de Impacto Electrónico (EM-IE) consistente

Ello produce que la sustancia pierda electrones y se fragmente

Utiliza la radiación del espectro electromagnético cuya longitud

Los máximos de absorción se deben a la presencia de

Cada absorción observable en el espectro corresponde a una

Hay diferentes modos normales de vibración en las moléculas,

Este tipo de espectros determina sobre todo, los GRUPOS

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear es una

Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético

Como esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se

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