TEMA 15 TCNICAS CITOLOGICAS. 1. INTRODUCCION.

La citologa, permite examinar grupos celulares de diferentes partes del organismo, convirtindola enana herramienta diagnstica muy importante para el clnico. La coleccin de muestras citolgicas es muy sencilla, econmica y segura para el paciente. En general existen 2 grandes mtodos de preparacin de muestras dependiendo de la cantidad de lquido que presenten, de esta manera tenemos: Mtodo directo: se emplea cuando la muestra es rica en clulas, es decir, presenta muy poca cantidad de lquido por lo que el material colectado se coloca directamente sobre un portaobjetos para realizar el frotis, como ejemplos tenemos la puncin aspiracin con aguja fina, los raspados e improntas. Mtodo indirecto: en caso de que las muestras obtenidas sean lquidas y para realizar el frotis habr que concentrar la poblacin celular mediante centrifugacin, ejemplos son la orina y lquidos procedentes de lavado. Los estudios citolgicos pueden agruparse en 4 grandes categoras:

una lesin de piel. s de una cito puncin, es decir, despus de una puncin hecha con aguja fina para recoger lquido tisular recogiendo clulas en suspensin y no un fragmento del tejido. impresiones. Los 2 primeros grupos forman parte de la citologa de deteccin precoz o exfoliativa basada en la investigacin de clulas anormales, a veces poco numerosas y muy alteradas que requieren del citlogo paciencia, atencin y gran experiencia. Los grupos 3 y 4 permiten en cambio el estudio de verdaderas poblaciones de clulas, con frecuencia numerosas y no alteradas, en las que se pueden observar las modificaciones morfolgicas ms o menos marcadas, al densidad, la cohesin, la diferenciacin y la reaccin celular del estroma avocando en numerosos casos a un verdadero citodiagnstico inmediato y al establecimiento de un ndice citolgico de malignidad que puede intervenir en el pronstico y las indicaciones teraputicas de los tumores. 2. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA EL ESTUDIO CITOLOGICO. 2. a. Tipos de muestras segn su procedencia. liquido prosttico, contenido gstrico Muestras procedentes de lquidos y fluidos patolgicos, liquido de derrames, pleural, peritoneal, contenido de un quiste, expectoracin bronquial, liquido procedente del lavado de esfago, estmago, colon. Y las procedentes de cito punciones como por ejemplo la puncin de mdula sea, la puncin heptica

2. b. Preparacin general de la muestra. La totalidad de las muestras que recibe el laboratorio de citologa se puede separar en 3 grandes grupos: de la obtencin de la muestra. Deben llegar al laboratorio adecuadamente identificadas con el nombre del paciente y uniformemente extendidos, normalmente se fijan con cito spray, estos portas que ya llegan al laboratorio fijados estn listos para proceder a la tincin rutinaria que se suele realizar al de papanicolau, ejemplos son las secreciones de mama, las muestras procedentes de cepillados y otros tipos de muestras citolgicas. secados al aire, estos frotis no fijados van destinados a ser teidos con la tincin de Romanowsky. generalmente en forma de fluido lquido o semislido, requiere mayor dedicacin y habilidad. El procesamiento de estas muestras puede ser por: o Extensin directa: es la tcnica ms rudimentaria especialmente til para muestras mucosas (esputo, lquido de aspecto mucoso, aspirado bronquial). Los pasos a seguir son: Identificar dos o ms portas con el nombre o nmero de orden del enfermo.

eben colocar las partes seleccionadas sobre un porta y extenderlas con otro hasta conseguir frotis uniformes, tambin se pude hacer con el asa de platino previamente esterilizada. e la tensin de Papanicolau) o se deja secar al aire (si se van a teir con Romanowsky).

Otra forma es mediante centrifugacin: es una tcnica til para muestras seromucosas y grandes volmenes de lquidos serosos (liquido qustico y procedentes de lavados). El mtodo consiste en:

centrifuga. 5 minutos, una vez centrifugado se decanta el sobrenadante, mezclar el sedimento con unas gotas de sobrenadante para resuspender las clulas y depositar con una pipeta pasteaur una gota de este sedimento sobre un porta previamente identificado. r una extensin directa con esta parte de la muestra o citocentrifugarla. Citocentrifugacin: esta tcnica se hace con una centrifuga llamada citospyn. Pequeas alcuotas (cantidades iguales) de muestra lquida se hacen girar lateralmente sobre un porta para formar una monocapa de clulas. Es una tcnica de gran utilidad y rapidez para la preparacin de muestras lquidas. o Filtros de membrana: constituyen una tcnica de concentracin de clulas en muestras lquidas de baja densidad celular (orina) ya que rescatan mayor nmero de clulas que la citocentrifugacin. Estos filtros son membranas porosas de plstico cuyos poros van de 10 - 8 micras. Los ms utilizados son: Tipo millipore (de acetato de celulosa). Filtros nucleopore (de policarbonato). Se realiza una filtracin con la muestra y posteriormente se examina el filtro. En citologa se usan sobre todo los filtros SM, cuyos poros van de 1 - 2 a 5 micras, cada cm2 de superficie contiene millones de poros capilares que ocupan ms del 80 % del volumen total. Este filtrado no necesita ningn fraccionamiento del lquido y no hay que extraer el sedimento y colocarlo sobre el pota objetos; ello permite una estimacin cuantitativa de las clulas cancerosas en un volumen de lquido dado pero en cambio pueden haber superposiciones celulares molestas y la membrana filtrante experimentar una desecacin rpida. El lquido se filtra a la presin atmosfrica o a una presin negativa de 25 mm de mercurio, una presin negativa ms fuerte no es aconsejable ya que podra deformar las clulas. La fijacin debe hacerse nicamente con alcohol etlico de 95 pues el alcohol absoluto, el ter o la acetona provocaran la disolucin del filtro. El filtro con la muestra sujeto con una pinza se coloca sobre un portaobjetos y se tie. 2. c Ejemplos de preparacin de algunas muestras. ORINA otros aconsejan hacer practicar ejercicios al enfermo especialmente en caso de tumor vesical ya que la agitacin de la orina contra la pared provoca una descamacin importante. Si se sospecha de un tumor de urter, pelvis renal o rin es preferible recoger la orina por cateterismo uretral. el fin de apreciar la cantidad de cristales, si hay muchos se eliminar ajustando el pH; si hay muchos hemates hay que hemolizarlos con actico al 5%. una tcnica de concentracin como la citocentrifugacin. o.

SANGRE Todos los mtodos se basan en la eliminacin de los hemates por hemlisis, por sedimentacin acelerada o por centrifugacin fraccionada. Se prctica mucho al tcnica de Seal, que se basa en la diferente densidad de las clulas cancergenas y los linfocitos por una parte y los eritrocitos y PMN por otra. Se usa como medio de separacin una mezcla de diferentes siliconas de densidad 1, 075 las clulas cancerosas y linfocitos se acumulan en la superficie de la silicona y los PMN y eritrocitos se acumulan por debajo de la silicona. SECRECIONES PROSTTICAS. Se obtienen por masaje de la prstata en el polo inferior ya que esta regin es frecuentemente el lugar de predileccin del desarrollo del cncer. Hay que hacer ligera presin con el dedo en el polo inferior y abstenerse de apretar las vesculas seminales a fin de evitar la descamacin de de clulas de este origen. Terminado el masaje se har presin sobre la uretra hasta el orificio del meato uretral para conducir las secreciones.

Una vez recogidas se depositan sobre los portas previamente impregnados de albmina de Mayer para asegurar la adhesin de las clulas. Cada gota es comprimida entre 2 portas que son separados por deslizamiento y fijados inmediatamente. DERRAMES PLEIRALES ASCTICOS O PERICRDICOS. Deben recogerse en frascos que contengan anticongelante, se centrifuga la muestra a 2000 rpm durante 10 minutos y se extiende el sedimento sobre dos portas, los cuales sern teidos uno con la tcnica de Papanicolau y otro con la tcnica de May Crundwald Giemnsa. LIQUIDO CEFALORRAQUDEO. Es centrifugado y el sedimento es extendido y teido. FIJACIN. Su principal objetivo es conservar el detalle morfolgico de la clulas ene l estado lo ms parecido posible a la clula en el tejido vivo. Esto se consigue con fijadores que deshidratan las clulas, inactivan los enzimas autolticos, coagulan las protenas y penetran en la membrana celular. Es un paso indispensable si no queremos una extensin deteriorada u oxidada que no tome bien los colorantes y que no permita una correcta lectura cuando se estudia al microscopio. La fijacin debe realizarse de inmediato a la toma y la extensin del material citolgico cuando la preparacin est todava hmeda. No existe el fijador perfecto, todos causan contraccin celular y cada uno acta con una velocidad diferente. Tipos de Fijadores. Fijadores alcohlicos: son la mayora de los fijadores usados en citologa, actan deshidratando las clulas y coagulando las protenas, su mayor ventaja es que son fijadores rpidos y su desventaja es que son voltiles e inflamables. Los ms usados son: o Etanol 96 %: es el fijador de eleccin cuando la tincin posterior es la de Papanicolau. Produce resultados muy satisfactorios. La extensin se pone en un bao de etanol al 96 % durante 15 - 20 minutos aunque puede conservarse indefinidamente siempre que el bao este tapado en el frigorfico. Se le puede aadir cido actico al 25 % con lo que se lisan los hemates, por ello en las preparaciones en que se sospecha existencia e suna buena solucin para evitar la dificultad que representara una existencia masiva de hemates recubriendo a los elementos celulares motivo de estudio. Esta mezcla no debe realizarse en casos en que se desee realizar una valoracin citolgica hormonal ya que se produce una falsa eosinoflia que puede llevar a confusin al realizar el recuento para el ndice de eosinoflia. o Metanol al 100 %. o Propanol e isopropanol al 90 %. o Mezcla de alcohol - ter a partes iguales: da unos excelentes resultados sobre todo tipo de materiales pero en la actualidad est en desuso por las peligrosas caractersticas fsico - qumicas del ter que es muy inflamable y voltil. Lquido de Carnoy: formado por etlico puro, cloroformo y cido actico. Citospray: es un fijador en forma de aerosol. Es un producto comercial que contiene una mezcla de alcohol isoproplico y una materia plstica, el polietilglicol, protectora de la desecacin. Con este spray se pulveriza toda la superficie del porta de forma rpida y sencilla, se debe aplicar a 25 - 30 cm. de distancia de la muestra. Se aplica al material citolgico inmediatamente despus de su extensin en el porta. Es muy usado por su simplicidad y buenos resultados, se recomienda sobre todo cuando las extensiones deben ser enviadas a otros laboratorios para su tincin (extensiones ginecolgicas, cepillados orofaringeos, esofgicos, bronquiales...). Por el contrario debe evitarse su uso en extendidos de materiales lquidos realizados en el propio laboratorio y en los hemticos para no provocar agrupamientos de los hemates. Antes de teir debe extraerse el citospray mediante pases sucesivos de 5 - 10 minutos cada uno por etanol al 96 %. Alternativamente y dado que el lquido del aerosol es soluble en agua, al extensin puede ser teida inmediatamente despus de rociarla, con lo que se acorta el tiempo total del proceso. El secado al aire sin fijar se emplea cuando se van a realizar ciertas tinciones como por ejemplo la de May Crundwald Giemnsa, con esta tincin no se ve bien la cromatina nuclear y se usa en citologas hematolgicas. ASPECTOS BSICOS SOBRE LA INTERPRETACIN DE EXTENSIONES EN CITOLOGA. Para la adecuada interpretacin se requiere: Puesta a punto del microscopio. Detenida lectura de los datos aportados en la hoja de peticin. Identificar el origen de la muestra cuando esta no est consignada. Examinar el porta detenidamente y en toda su extensin.

Sealar los hallazgos de inters: aspecto general del extendido, incluyendo la sustancia de fondo y la disposicin de las clulas (aisladas, agrupadas), el tamao y forma celular, al coloracin adquirida por la clula, estructuras, cantidad y relacin ncleo - citoplasma y caractersticas del ncleo (nmero, forma, tamao, membrana, situacin y relacin con el nucleolo). TCNICAS DE COLORACIN. Los principales objetivos de la tincin citolgica son: Visualizacin ptima de las clulas. Diferenciacin de los constituyentes celulares. Destacar lo ms posible la estructura nuclear y suavemente el citoplasma, solo para indicar si es eosinfilo o basfilo. Para ello se emplean distintos colorantes, si bien, los fundamentales son la Hematoxilina que tie bien los ncleos y Eosina para teir citoplasmas. Pero hay muchos ms colorantes como el Orange G, verde luz, Fucsina Un colorante debe colorear las clulas, no decolorarse son los disolventes habitualmente empleados y decolorarse minimamente tras largo tiempo de almacenamiento. En citologa es muy importante la calidad de la tincin del ncleo ya que la distincin entre clulas benignas y malignas se basa en la morfologa nuclear. La tincin del citoplasma proporciona informacin adicional respecto al origen y maduracin de la clula. Hay muchos mtodos de tincin, el ms recomendable y usado en citologa exfoliativa es el de Papanicolau. Tipos de tinciones. Tincin de Papanicolau: est particularmente indicada para el estudio de la queratinizacin de las clulas memalpighianas patolgicas. Fue introducida por Papanicolau en 1925, es una tincin diferencial o policroma. Usa tres colorantes bsicos (o mezclas), el colorante nuclear en la hematoxilina de Harris que produce una impregnacin excelente de la estructura cromatinica y tambin usa mezclas de color citoplasmtico como el naranja G, verde luz, pardo Brismark, eosina La hematoxilina de Harris se usa sin acidificar con cido actico y proporciona un color azul oscuro a los ncleos. El naranja G junto con la solucin eosina alcohlica (EA) constituye el colorante del citoplasma. Aunque la solucin puede realizarse en el laboratorio se encuentra comercializada bajo el nombre de OG - G, tie de naranja los citoplasmas celulares que contienen queratina como por ejemplo las clulas del carcinoma epidermoide. Las soluciones EA adems de este colorante contiene verde luz y pardo Bismark. Comercialmente se encuentran ya diluidos constituyendo las mezclas EA - 36, EA - SO y EA - &%, que si bien proporciona buenos resultados para cualquier muestra, en determinadas situaciones es recomendable el uso de alguna frmula en particular. Este es el caso de algunas muestras ginecolgicas con frecuencia gruesas donde es preferible emplear EA - 65 ya que al tener verde luz no colorea tan intensamente el fondo de la preparacin, adems el empleo de esta mezcla facilita la distincin entre adenocarcinoma de cerviz (citoplasma rosceo) y adenocarcinoma endometrial (citoplasma azulado). Procedimiento tcnico en una fotocopia. Un mtodo alternativo mas adecuado para teir extensiones urinarias y de lavados gstricos consiste en el empleo de agua destilada durante 10 inmersiones sucesivas rpidas y como colorante nuclear durante 45 segundos de Hematoxilina de Harris acidificada con actico y la omisin del lavado en solucin clorhdrica. Este procedimiento tiene la ventaja de que requiere menos tiempo y la desventaja de que la hematoxilina impregna algo mas estructuras basfilas no nucleares haciendo los citoplasmas menos transparentes. Tincin de Shorr: Es una tcnica de coloracin de excelentes resultados en la evaluacin hormonal de la citologa vaginal. Permite distinguir con gran facilidad las clulas queratinizadas (color naranja brillante) de las no queratinizadas (intermedias y parabasales que se tien de color azul verdoso). Los ncleos se tien de azul nunca tan claramente como la tcnica de Papanicolau. Otros componentes de la muestra como leucocitos hemates, bacterias, espermatozoides se distinguen satisfactoriamente. Tambin puede utilizarse para detectar cuerpos de inclusin intracitoplasmticos que se tien de color rojo vivo. Tincin de May - Grundwald Giemsa Esta coloracin tambin denominada Pappenheim se realiza sobre material secado al aire en preparaciones de citologa por puncin aspiracin. Consiste en una combinacin de dos coloraciones sucesivas, la de May - Grundwald y la de Giemsa que emplea diversas variantes de eosinato de azur o de metileno para producir una coloracin policroma ms brillante que la obtenida con cada uno. Adems presenta algunas ventajas sobre los mtodos clsicos de Papanicolau y hematoxilina - eosina para la percepcin de los finos detalles citolgicos sobre el diagnstico de malignidad.

Esta tincin resalta detalles del citoplasma como la presencia de vacuolas, grnulos o mucina y los distintos componentes del fondo como la matriz mixoide, el colgeno, la mucina o el coloide. Coloraciones extemporneas: Son coloraciones rpidas, el empleo de la citologa para el diagnstico peri operatorio necesita coloraciones rpidas, ejemplos: o Coloracin de Azul de Unna: en 15 segundos proporciona una coloracin legible. Es monocroma pero muestra suficientemente la morfologa celular: la anisonucleosis, las alteraciones nucleares para permitir un diagnstico exacto. o Coloracin de Giemsa: utiliza la secuencia siguiente: alcohol metlico puro de 1 - 2 minutos y seguidamente colorante Giemsa 2 minutos. o Coloraciones vitales con rojo neutro al 1 / 1000 - 1/ 500. o coloracin vital con Azul de metileno al 1 %. Coloraciones especiales: Tincin con anaranjado de acridina. Las tcnicas histoqumicas pueden ser aplicadas a la citologa para investigacin del glucgeno por el carmn de Best o el yodo, la coloracin de mucopolisacridos, las fosfatasas, las grasas, los cidos desoxiribonucleicos y los ribonucleicos; aqu veremos la coloracin que utiliza el anaranjado de acridina y la microscopia de fluorescencia. Tcnica de coloracin con el anaranjado de acridina en fluorescencia: Se basa en la fluorescencia roja que da el citoplasma de las clulas cancerosas a causa de su riqueza en ADN. Puede practicarse sobre material fresco y fijado. Procedimiento Tcnico: Se separa una solucin madre de anaranjado de acridina al 01 % en agua destilada. Esta solucin se conserva indefinidamente; para la coloracin se diluye una parte de dicha solucin en un tampn de fosfato 1/15 molar (M). Es necesario producir una diferenciacin de la fluorescencia del ARN, esto se realiza con una disolucin acuosa de cloruro de Ca. La fijacin se debe realizar inmediatamente despus de la extensin durante 5 - 10 minutos en alcohol o mezcla de alcohol - ter, debe evitarse la fijacin con formol. La secuencia de la tincin consiste en: l colorante de anaranjado de acridina.

de una coloracin verde clara transparente. eparaciones son lavadas nuevamente con tampn fosfato y montadas en hmedo bajo un cubre. RESULTADOS: Las clulas aparecen destacadas con formas claras y brillantes sobre un fondo oscuro. Las tonalidades son distintas segn la estructura celular, pasando desde verde por el amarillo, naranja y hasta el rojo dependiendo del contenido en ADN y ARN. En general se puede decir que la coloracin roja es indicadora de clulas atpicas malignas, en extensiones de clulas superficiales que son verdosas o intermedias que son amarillas o verdes. Despus del examen las preparaciones pueden ser decoloradas pasndolas durante unos minutos por alcohol de 50 y recoloreadas pasndolas por cualquier otro mtodo como Papanicolau. Despus de la coloracin pueden tambin conservarse indefinidamente en el fijador para recolorearlas ms tarde.