Lisina Hierro Agar (LIA)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Frmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina Extracto de levadura Glucosa Lisina Citrato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Instrucciones 5.0 Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro 3.0 de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. 1.0 Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y 10.0 hervir durante un minuto hasta la disolucin 0.5 completa. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 0.04 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo 0.02 vertical apto para la puncin. 15.0 pH final: 6.7 0.2

Siembra Por puncin profunda con aguja de inoculacin. Incubacin En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C. Resultados 1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminacin de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Produccin de cido sulfhdrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo) Color en el pico de flauta Rojo Prpura Prpura Rojo Prpura Rojo Prpura Prpura Prpura Color en la base del tubo Amarillo Prpura Prpura Amarillo Amarillo Amarillo Prpura Prpura Prpura

Microorganismos Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Providencia spp. Citrobacter freundii Morganella spp.* Edwarsiella spp. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922

Ennegrecimiento del medio Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo

MIO (Movilidad Indol Ornitina)

Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

Fundamento Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarIllo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura.El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo. Frmula (en gramos por litro) Dextrosa Extracto de levadura Peptona Triptena Clorhidrato de L-ornitina Agar Prpura de bromocresol Instrucciones 1.0 3.0 Suspender 31 g del polvo en un litro de agua 10.0 destilada. Calentar a ebullicin hasta completa 10.0 disolucin. Distribuir en tubos y esterilizar 15 5.0 minutos a 121C. 2.0 0.02 pH final: 6.5 0.2

Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con ansa recta. Incubacin En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C. Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color prpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento. Microorganismo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 Crecimiento Bueno Bueno Bueno Movilidad + + Indol + Ornitina decarboxilasa + +

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. Frmula (en gramos por litro) Citrato de sodio Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Fosfato monoamnico Sulfato de magnesio Azul de bromotimol Agar Instrucciones Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar en posicin inclinada.

2.0 5.0 1.0 1.0 0.2 0.08 15.0

pH final: 6.9 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar. Incubacin A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin. Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Microorganismo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 S. typhimurium ATCC 14028 E. coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 Citrato permeasa Positivo Positivo Negativo Negativo Color del medio Azul Azul Verde Verde

TSI (Agar triple azcar y hierro)

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 3.0 Pluripeptona 20.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua Cloruro de sodio 5.0 destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Lactosa 10.0 Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Sacarosa 10.0 Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar en pico Glucosa 1.0 de flauta profundo. Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0 pH final: 7.3 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubacin A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico. Microorganismo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853 A: cido K: alcalino Pico/Fondo A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/K Produccin de gas + + + + Produccin decido sulfhdrico + + + -

Urea
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad uresica. Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros.Para organismos que hidrolizan la urea lentamente, es recomendable usar el medio de Christensen (B02109-05, B02-109-06). Frmula (en gramos por litro) Urea Fosfato monopotsico Fosfato disdico Extracto de levadura Rojo fenol Instrucciones 20.0 Suspender 3, 87 g del medio deshidratado por cada 9.1 100 ml de agua destilada. Disolver sin calentar y 9.5 esterilizar por filtracin. Distribuir en tubos pequeos 0.1 estriles, entre 0,5 y 2 ml. 0.01 pH final: 6.8 0.2

Siembra Sembrar un inculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas. Incubacin A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12,24 y 48 horas de incubacin. Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas. Resultados

Microorganismo Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 S. typhimurium ATCC 14028

Actividad uresica Positiva Negativa Negativa Negativa

Color del medio Rojo-rosado Amarillo Amarillo Amarillo