UNIVERSIDAD NACIONAL DE CUYO FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS ENOLGICAS Y AGROALIMENTARIAS CATEDRA DE ENOLOGA I

FERMENTACIN ALCOHLICA

INTRODUCCIN
La sntesis de la materia viva es endergnica, es decir que necesita un gasto de energa. Las levaduras, microorganismos quimiorgantrofos (quimiohetertrofos), obtienen energa por la degradacin de materia orgnica. En funcin de las condiciones de aerobiosis, las levaduras pueden degradar los azcares utilizando dos vas metablicas: la fermentacin y la respiracin, ambos procesos tienen su inicio comn en la gliclisis. La sucesin de reacciones que transforman la glucosa en piruvato con formacin de ATP, constituye una va casi universal en los sistemas biolgicos. El significado de la palabra fermentacin hace referencia a los fenmenos de descomposicin de la materia orgnica (lquido azucarado) con rpido y tumultuoso desprendimiento de gas. Como sntesis sobre las fermentaciones podemos establecer: 1. Las fermentaciones son reacciones en cadena catalizadas por una serie de enzimas. 2. Las secreciones enzimticas de las distintas especies microbianas que tienen en comn una fundamental actividad fermentativa presentan una gran diversidad cualitativa y cuantitativa, y a menudo sucede, aunque en menor medida, entre cepas, variedades o razas de una misma especie. 3. Los agentes fisicoqumicos del medio influyen notablemente sobre la produccin y funcionalidad de las enzimas microbianas. Por lo tanto, el desarrollo de cada fermentacin y el resultado final pueden ser diferentes tanto por las caractersticas fisiolgicas de las levaduras como por las condiciones en que se realice la fermentacin.

LAS ENZIMAS
Las enzimas intervienen en los procesos fermentativos catalizando las reacciones bioqumicas. En la Fermentacin Alcohlica (FA) interviene un nmero importante de enzimas, se las clasific en cuatro grupos: - Fosforilantes, que ligan o separan los radicales fosfato de la molcula orgnica, - Oxidorreductoras, que intervienen en reacciones de oxidoreduccin, transportando hidrogeniones, - Carboxilasas, que catalizan reacciones de descarboxilacin, con liberacin de CO2, y de carboxilacin; - y el cuarto grupo, integrado por las enzimas que catalizan otras reacciones tales como mutacin, isomerizacin, enolizacin, etc. Para ejercer su actividad cataltica, un cierto nmero de enzimas necesita de un cofactor que puede ser: un ion metlico; un grupo prosttico slidamente ligado a la protena enzimtica o una coenzima que no est ligada a la protena (o lo est poco) y se comporta como un sustrato de la reaccin. A continuacin se describen cuatro cofactores que desempean un papel importante en los mecanismos de las fermentaciones.

Nicotinadenindinucletido (Nicotinamida adenina dinucletido) o NAD

Su estructura comprende dos nucletidos, ligados por una unin pirofosfato.

Nicotinamida

Ribosa

OO O-P-O-P-O O O

Ribosa

Adenina

Nucletido

Nucletido

Interviene como coenzima de diversas deshidrogenasas que catalizan distintas reacciones de oxidorreduccin, fijando de manera reversible dos hidrgenos por medio de su ncleo nicotinamida.

CONH2 O | R P O R || O N+
-

CONH2 OH

+2H

| R P O R || O N

Forma oxidada

Forma reducida

En forma abreviada, el mecanismo se representa de la siguiente manera :

NAD+

NADH + H+

, o ms simplemente:

NAD + 2H

NADH2

En esta operacin, la sustancia que le cede los hidrgenos (dador) se oxida, y el NAD reducido, que hace de carrier, se reoxida recin cuando entrega los hidrgenos a otro cuerpo (aceptor), que a su vez se reduce.

Tiamina pirofosfato (TPP) o Cocarboxilasa

Su estructura es la siguiente:

Pirimidina

Tiasol

OO O - P - O - P - O O O

Es la coenzima de las descarboxilasas de los cidos -cetnicos segn la siguiente reaccin general:

R - CO - COOH

R - CHO + CO2

Interviene asimismo en reacciones de condensacin (acetonica y formacin de 2-3, butanodiol) y de carboxilacin. Es un transportador de agrupamientos aldehdicos, en especial del acetaldehdo. Las reacciones requieren tambin de otro cofactor, el ion Mg++.

Adenosina difosfato o ADP y Adenosina trifosfato o ATP

La estructura molecular de los diferentes steres de la adenosina es la siguiente :

Adenina

Ribosa

OOO O - P - O - P - O - P - O O O O

Adenosina monofosfato o AMP Adenosina difosfato o ADP Adenosina trifosfato o ATP

Estos cuerpos desempean un rol fundamental en los procesos de incorporacin y transferencia de energa. En la molcula de ATP, la tercera molcula de fosfato est ligada a la precedente por una unin llamada rica en energa y la ruptura de este enlace se acompaa de una liberacin de energa. Recprocamente, se necesita una energa externa para formar el enlace rico en energa. Se puede decir que a partir de ADP y de fosfato mineral, las reacciones qumicas que liberan energa (exergnicas) permiten la formacin de molculas de Energa ATP que constituyen una forma de almacenamiento de energa directamente utilizable. Los ATP, nica forma asimilable de energa, se utilizan en las reacciones de ATP + H2O ADP + Fosfato sntesis y en otras que necesitan energa ++FosfatoFFosfat (endergnicas), indispensables a los microorganismos o para asegurar sus funciones vitales y en particular su Energa crecimiento.

Coenzima A
Este cofactor, formado por adenosina difosfato, cido pantotnico y tioetilamina, en forma abreviada se representa as: Co-A-SH. Esta notacin pone de manifiesto el agrupamiento qumico tiol (SH) que es la base de sus propiedades. Con los cidos forma las acilcoenzimas A (R-CO-SCoA), con gran capacidad de reaccin permitiendo la fijacin del radical R-CO sobre otras molculas. Interviene en numerosas sntesis, en particular bajo la forma de acetilcoenzima A o acetato activo (CH3 -CO-S-CoA). Es la base de la sntesis de los cidos grasos (ciclo de los cidos tricarboxlicos) y de los lpidos.

QUIMISMO DEL PROCESO FERMENTATIVO

En la figura que sigue se observa el desarrollo del proceso fermentativo:

Figura 1: esquema de la fermentacin alcohlica

El transporte de hexosas del mosto a travs de la membrana, pone en juego un complejo sistema de transportadores proteicos incompletamente dilucidado. Aunque no se trata de un transporte activo que requiere de gasto de energa, ya que el movimiento se realiza a favor de un gradiente de concentracin, lo que es energticamente favorable. Luego la gliclisis se efecta enteramente en el citosol de la clula de levadura. La fermentacin alcohlica es una transformacin enzimtica que, si parte de la glucosa, tiene 11 reacciones y termina en la produccin de etanol y CO2. La transformacin de la fructosa o levulosa tiene una reaccin enzimtica menos. La primera parte, llamada etapa inductiva, comprende reacciones de fosforilacin, y transfosforilacin, mecanismo bioqumico basado en razones energticas. El adenosin trifosfato (ATP), compuesto rico en energa, impulsa estas reacciones y los steres formados poseen enlaces ricos en energa. Se pierden dos ATP por mol de azcar. La energa que la fructosa-1,6-difosfato tiene acumulada es suficiente para producir la escisin de la molcula formndose dos triosas ismeras. Saccharomyces cerevisiae posee dos hexokinasa (PI y PII) capaces de fosforilar la glucosa y la fructosa. La PII es constitutiva y mayoritariamente se expresa sobre la fase de crecimiento en un medio rico en azcar. La PI es parcialmente reprimible por glucosa, slo se expresara a partir de la fase estacionaria (Bisson, 1993). El segundo estadio de de la gliclisis es la formacin del gliceraldehido-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato, bajo la accin cataltica de una aldolasa. La fructosa-1,6-difosfato est fragmentada en dos triosas. Aunque en equilibrio la forma cetosa sea ms abundante que la aldosa, la transformacin de la dihidroxicetona al gliceraldehdo es rpida, pues este compuesto es eliminado en las siguientes reacciones de la gliclisis.

La tercera fase de la gliclisis incluye dos etapas que intentan recuperar una parte de la energa del gliceraldehido-3-fosfato. Las molculas de fosfato pueden dar con ciertos radicales orgnicos enlaces ricos en energa. Esto ocurre al formarse el cido 1-3 difosfoglicrico ya que el NAD+ permite la nueva fosforilacin del gliceraldehdo-3-fosfato y produce NADH2, que es necesario en la fase final para pasar el etanal a etanol. Esta reaccin est catalizada por la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. Cuatro ATP vuelven a la levadura cuando el cido 1-3, difosfoglicrico se convierte en cido 3, fosfoglicrico y el cido fosfoenolpirvico pasa a cido pirvico. Por ello, la ganancia neta es de 2 ATP. La fosfogliceromutasa cataliza la conversin del 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato. La deshidratacin de este ltimo, catalizada por una enolasa conduce al fosfoenolpiruvato; este compuesto posee un alto potencial de transferencia del grupo fosforilo y se forma por fosforilacin, cido pirvico y ATP. Con la formacin del cido pirvico termina la gliclisis que constituye el primer estadio de la FA. Luego, la piruvato descarboxilasa (cofactor tiamina pirofosfato), transforma el cido pirvico en acetaldehdo. Esta es la nica fase donde se desprende CO2. Finalmente, el etanal es reducido a alcohol por la enzima alcohol deshidrogenasa en presencia de NAD reducido. El etanol es el otro producto principal de la FA. En resumen, la ganancia neta de la gliclisis es de dos molculas de ATP por molcula de hexosa metabolizada. Es en este sentido, marcando el fin del tronco comn de la gliclisis que se diferencian la fermentacin alcohlica, la fermentacin gliceopirvica y la respiracin. En algunos pasos tambin se requiere el concurso de algunos cationes como Mg++, Zn++, Co , Fe++, Ca++ y K+.
++

El poder reductor producido por la gliclisis bajo la forma de NADH, debe ser transferido a un receptor de electrones para regenerar el NAD+. En la fermentacin alcohlica no es el piruvato sino su producto de descarboxilacin: el acetaldehdo es quien sirve de aceptor final de electrones. Por lo tanto en comparacin con la gliclisis, la fermentacin alcohlica involucra dos reacciones enzimticas suplementarias: la descarboxilacin del piruvato y la reduccin del acetaldehdo en etanol por el NADH.

FERMENTACION GLICEROPIRUVICA (FGP)

La fermentacin alcohlica incluye exclusivamente la formacin de etanol a partir de los azcares segn la ecuacin de Gay-Lussac:

C6 H12 06

2 CH3 - CH2OH + 2 CO2

Pero sabemos que en una vinificacin un cierto nmero de molculas de azcar es degradado por otra va llamada fermentacin gliceropirvica, que se realiza segn la ecuacin de Neuberg, que conduce a cantidades equivalentes de glicerol, CO2 y acetaldehdo.

C6 H12 O6 Glucosa

CH2OH - CHOH - CH2OH + CH3 - CO - COOH glicerol cido pirvico

Al describir los mecanismos de la fermentacin alcohlica se puso en evidencia la necesidad de la reoxidacin del NADH2, formado al comienzo de la fermentacin, cuando se produce la fosforilacin de la D-gliceraldehida-3-fosfato. Este NADH2 es necesario para el paso final de reduccin de acetaldehida a alcohol. Al comienzo de la fase de crecimiento; es decir, al principio de la fermentacin, se encuentran elevados niveles de etanal; pero las concentraciones caen cuando el proceso se inicia "en serio"
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(Ough, 1994). Cuando las levaduras comienzan a actuar en el mosto de uva, la produccin de etanol no es inmediata, ya que las enzimas esenciales de la fermentacin alcohlica, piruvato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, son inducibles por la glucosa y no se encuentran en sus niveles mximos al principio de la fermentacin alcohlica. Como consecuencia se forman numerosos compuestos secundarios adems del etanol, tales como: glicerol, piruvato, succinato, y otros cidos orgnicos. As se explica la existencia de un perodo de induccin durante el cual la reoxidacin del NADH2 se realiza a expensas de la dihidroxiacetona fosfato que pasa a glicerina-3-fosfato y finalmente una fosfatasa la transforma en glicerol. CH2OH C=O CH2O - P
Dihidroxicetona fosfato

NADH2

NAD

CH2OH CHOH CH2O - P

H2O

PO4H3

CH2OH CHOH CH2OH

glicerol

glicerol 3 fosfato

La cantidad de glicerina que se forma, vara segn las condiciones del medio. Aumenta, por ejemplo, con el aumento de la temperatura de fermentacin. Cada vez que se forma una molcula de glicerina, una molcula de cido pirvico (eventualmente descarboxilada formando etanal) no puede reducirse a alcohol etlico porque los dos hidrgenos necesarios (provenientes del NADH2) fueron invertidos en la formacin de glicerina. Este cido pirvico se acumula, o bien sirve de base para la sntesis de un cierto nmero de productos secundarios: cido actico, cido succnico, acetona, 2-3 butanodiol, diacetilo, etc. La figura 2 nos muestra en forma resumida el desarrollo del proceso. La confrontacin de los esquemas de las fermentaciones alcohlica y gliceropirvica (figuras 1 y 2) muestra muy bien la competencia entre los dos aceptores de hidrgeno: acetaldehida y dihidroxiacetona fosfato.

Figura 2. Esquema de la Fermentacin Gliceropirvica.

La acetaldehida es ms fcil de reducir y es la que fija preferentemente los hidrgenos del NADH2 cuando los dos compuestos estn en concentraciones equivalentes. Pero si no hay acetaldehida disponible, lo que ocurre al comienzo de la fermentacin como ya se dijo, la dihidroxiacetona sirve de aceptor de hidrgeno y al mismo tiempo permite la acumulacin de etanal, que servir para impulsar la fermentacin alcohlica. El vino contiene aproximadamente 8 g/l de glicerina. Se calcula que alrededor del 8 % de las molculas de azcar, siguen la va de la fermentacin gliceropirvica y el 92% la de la fermentacin
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alcohlica propiamente dicha. Por lo que es el segundo componente cuantitativamente ms importante del vino despus del etanol y que le confiere caracteres de suavidad y aterciopelado

Interpretacin de Oura
La fermentacin gliceropirvica y, en consecuencia, la formacin de glicerina, predomina al principio del desarrollo de la levadura. Pero, se ha comprobado que, an en plena fermentacin, no hay nunca una fermentacin alcohlica pura y la liberacin de glicerol persiste hasta el final de la fermentacin. De manera que la explicacin anterior no da cuenta de todo el glicerol producido. Oura, en 1977, ha aportado una explicacin diferente que hace intervenir el equilibrio redox de la clula, que debe estar comprendido entre 0,7 y 0,9. NAD+ NADH2 NAD+/ NADH2 = 0,7 a 0,9

Durante la fase de crecimiento de la levadura se han verificado variaciones del equilibrio. Se libera NADH2 excedentario. Para restablecer el equilibrio redox de la clula, este excedente reducir una cantidad equivalente de dihidroxiacetona fosfato. En resumen, ms que una va normal, la produccin de glicerina constituye, segn Oura, una vlvula de seguridad.

LOS PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA FERMENTACIN GLICEROPIRVICA

El cido pirvico y el etanal, provenientes de la fermentacin gliceropirvica servirn para formar diversos productos secundarios segn mecanismos comunes a muchos tipos de fermentaciones. Terminada la fermentacin, hay una pequea cantidad de cido pirvico en el vino, aproximadamente 80 mg/l. Es mayor en los vinos blancos que en los tintos y tambin mayor cuanto ms alta sea la temperatura de fermentacin o si sta ha sido incompleta. Veamos los principales productos que derivan de l o de la acetaldehda.

Formacin de cido lctico

En la fermentacin de los azcares por la levadura aparece siempre cido lctico, alrededor de 400 mg/l (Peynaud, 1967). El cido pirvico puede escapar a la accin de la descarboxilasa y funcionar como aceptor de los hidrgenos del NADH2, reducindose a cido lctico por accin de la lacticodeshidrogenasa.
COOH H-C-OH CH3 cido D (-) lctico

D (-) lcticodeshidrogenasa
NADH2 NAD

COOH C=O CH3 cido pirvico L (+) lcticodeshidrogenasa

NADH 2 NAD

COOH HO-C-H CH3 cido L ( +) lctico

Figura 3: Formacin de los ismeros del cido lctico a partir del cido pirvico

Existen dos ismeros, cido D (-) lctico y cido L (+) lctico, formados a partir del cido pirvico por las lacticodeshidrogenasas correspondientes. En anaerobiosis, la levadura sintetiza sobre todo D (-) lacticodeshidrogenasa. En consecuencia, en el curso de la fermentacin se forma casi exclusivamente cido D (-) lctico, y solo algunas decenas de mg de cido L (+) lctico.

cido succnico
En la fermentacin alcohlica siempre se produce cido succnico, que es uno de los principales productos secundarios y es el que ms impresiona al gusto por su sabor particular entre salado y amargo, confiriendo especificidad a las bebidas fermentadas. En condiciones de anaerobiosis, el ciclo del cido ctrico no puede ser completo, pues la actividad de la succino-deshidrogenasa necesita la presencia de FAD, coenzima estrictamente respiratoria. La cadena de respiraciones se interrumpe a nivel de succinato que se acumula y representa de 0,5 a 1,5 g/L generado por el funcionamiento de esta porcin del ciclo de Krebs. Adems de la va propuesta por Oura, hay otros mecanismos posibles para su formacin. Sin embargo, segn Radler (1977) el cido succnico proviene esencialmente del cido -cetoglutrico, procedente de la desaminacin oxidativa del cido glutmico.

COOH (CH2 )2 CHNH2 COOH

O2

cido glutmico

COOH COOH COOH NH3 (CH2) CH2 CH2 C=O CH2 CH2 CO2 O2 COOH CHO COOH cido -cetoglutrico semialdehda succnica cido succnico

Reafirmando esta opinin, Radler ha aislado una -cetoglutaratodeshidrogenasa activa de levaduras desarrolladas en anaerobiosis.

Metabolitos del ciclo diacetilo acetonico

Los compuestos acetonicos (acetona, diacetilo y 2-3 butanodiol), siempre presentes en el vino, participan de forma muy directa en las caractersticas organolpticas y a determinadas concentraciones perjudican su bouquet y aroma. Estos compuestos se pueden formar a partir del cido pirvico o del etanal, mediante reacciones de condensacin activadas por la Tiamina Pirofosfato. La carencia de Tiamina, elemento activo de las carboxilasas, disminuye notablemente la formacin de acetona, diacetilo y butanodioles. La formacin de acetona, va piruvato, por la piruvato descarboxilasa, implica una doble descarboxilacxin. La acetona formada se reduce en parte por la accin de una deshidrogenasa, contribuyendo a la formacin del 2-3 butanodiol. Otra va en que interviene el cido pirvico para formar acetona es por reaccin con acetil CoA, dando como compuesto intermedio el diacetilo, del que una pequea parte se acumula y el resto se reduce gastando una molcula de NADH2. Los butanodioles y la acetona no tienen ninguna importancia sensorial. En cambio el diacetilo, si est presente en cierta cantidad, ms de 3 a 5 mg/l, confiere un gusto indeseable a manteca rancia, pero no se manifiesta tan desagradable en cantidades prximas al umbral de percepcin

cido actico
Hasta no hace mucho, la presencia de cido actico en el vino, junto a otros componentes de la acidez voltil, era atribuida a alteraciones biolgicas de origen bacteriano. Sin embargo se forma siempre en el curso de la fermentacin, siendo este cido y sus steres (acetato de etilo) elementos negativos en la apreciacin sensorial de cualquier vino. Exceptuando la formacin de cido actico por va bacteriana, a las levaduras fermentativas de primera fase (Kloeckera, Candida, Hanseniaspora) y las del metabolismo aerobio (Hansenula y Picchia) se les atribuye el principal protagonismo en la formacin de estos compuestos. En los mostos de uvas sanas, con moderado tenor de azcar (220 g/L) Saccharomyces cerevesiae produce cantidades relativamente bajas (100 300 mg/L) pero es variable segn la cepa. La via bioqumica de la formacin de cido actico no ha sido claramente precisada. Puede ser producida por hidrlisis de la acetilcoenzima A, proveniente de la descarboxilacin oxidativa del cido pirvico por el complejo de la piruvato deshidrogenasa. Asimismo, la carencia de cido pantotnico, componente de la coenzima A, favorece la formacin de actico. El cido actico puede provenir de la oxidacin del acetaldehdo por la alcohol desidrogenasa; esta enzima cuyo cofactor es el NADP+ es activa durante la fermentacin alcohlica. El NADPH formado puede ser utilizado para la sntesis lipdica.

Las condiciones prcticas de la vinificacin, pueden conducir a cantidades anormales del cido actico. Cuanto ms elevado es la riqueza en azcares del mosto mayor es la cantidad de cido actico. Otros factores de vinificacin que favorecen la formacin de cido actico son la anaerobiosis, pH muy bajos (- de 3,1) o por el contrario muy altos (mayores de 4), temperaturas muy elevadas (25 a 30 C) durante la fase de multiplicacin de las levaduras.
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Otros productos
La levadura produce cido citramlico (0 300 mg/L) y el dimetilglicrico (0 600 mg/L), por condensacin del cido actico (en forma de acetil-CoA) y cido pirvico. La incidencia organolptica de estos compuestos es desdeable. Tambin se originan otros diversos cidos grasos. Los de 6 a 12 tomos de carbono presentan aromas lcteos que recuerdan a ciertos quesos. Sus steres juegan un papel muy favorable en el aroma afrutado de los vinos blancos.

OTRAS RUTAS METABLICAS Formacin de alcoholes superiores

Los fenmenos bioqumicos de la nutricin nitrogenada de las levaduras comprenden sntesis y degradaciones diversas. Entre los productos del metabolismo de los aminocidos, los alcoholes superiores son los ms importantes en Enologa, los cidos cetnicos originados en la desaminacin de los aminocidos pueden ser excretados luego de la descarboxilacin y la reduccin el alcohol. En efecto, estos constituyentes de los aromas secundarios, intervienen por s o por sus steres en los caracteres organolpticos del vino. La cantidad de alcoholes que se encuentran en los vinos vara segn las cepas de levadura, la temperatura de fermentacin y la cantidad de nutrientes. Los principales son: isoamlico, isobutlico, n-butanol, n-propanol y tirosol. Segn Erlich (1907) los aminocidos son los principales precursores de los alcoholes superiores. Su mecanismo lleva implcitos sucesivos pasos de desaminacin, formando un cido cetnico, descarboxilacin de ste dando una aldehda y, finalmente, reduccin de la aldehda a un alcohol superior que tiene un carbono menos que el aminocido que le dio origen. Estudios posteriores demuestran que los alcoholes superiores (aceite de fusel) se forman por tres mecanismos diferentes: uno de ellos, lo hace a partir de los aminocidos presentes en el medio, posiblemente sintetizados por las mismas levaduras (va catablica); en los otros dos, se forman anablicamente a partir de la glucosa o levulosa (fermentacin alcohlica). Los tres mecanismos dan como producto intermedio un cido -cetnico. Estos cidos son los verdaderos precursores de los alcoholes superiores y la reaccin final es comn a los tres mecanismos.

R Descarboxilasa C=O COOH Acido -cetnico CO2

Deshidrogenasa

R COH Aldehda

NADH2

NAD

R CH2OH Alcohol

Sntesis de SO2 y SH2

Las clulas de levaduras tienen necesidad absoluta de azufre, que utilizan en sus procesos biosintticos localizndolo en aminocidos y protenas y, en menor cantidad, como componente de vitaminas y enzimas (CoA-SH).
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A partir del sulfato las levaduras forman SO2 y SH2 en una reaccin en que primero lo reducen a sulfito, requiriendo para ello 2 ATP, y luego a sulfuro. Las levaduras podran realizar esta reaccin para disponer de sulfuro con el que sintetiza cistena, serina y metionina. Normalmente esto sucede solamente cuando los aminocidos del mosto son insuficientes y, de hecho, los vinos con bajo contenido de aminocidos tienen un ligero olor a sulfhdrico. Se puede evitar este inconveniente aadiendo al mosto compuestos de amonio. La carencia de pantotenato tambin origina SH2 que las clulas excretan.

Formacin de otros compuestos voltiles con caractersticas aromticas

Con bastante frecuencia se ha destacado el rol de las levaduras sobre la calidad aromtica de los vinos, ponindose en evidencia la incidencia de las distintas especies y cepas sobre los aromas y los precursores de aromas de las uvas. Adems de los alcoholes superiores, otros compuestos voltiles con caractersticas odorantes tienen su origen en la actividad de las levaduras, durante el proceso fermentativo o con posterioridad a l. Algunos son agradables y eventualmente especficos de un cepaje y otros son desagradables y constituyen en s defectos olfativos. Veamos algunos de ellos.

Los vinilfenoles
Entre los numerosos componentes del aroma de los vinos blancos, ciertos fenoles voltiles, el vinil-4-fenol y el vinil-4-guayacol, presentes en cantidades variables, les confieren olores farmacuticos desagradables, sobre todo el primero. Los precursores directos de los vinilfenoles son los cidos fenoles libres. En la uva madura existe de 2 a 5 veces ms en forma de steres que en forma de cidos libres. Estos steres son susceptibles de ser hidrolizados para dar los cidos fenoles (hidroxicinmicos) correspondientes. En 1992, se demostr que una esterasa especfica, una cinamil-esterasa, es responsable de esta transformacin. Cinamil esterasa fermentacin alcohlica steres de cidos fenoles Acidos fenoles Vinilfenoles Es evidente que el riesgo de que un vino tenga defectos fenlicos es tanto mayor cuanto ms importante sea la concentracin de steres de cidos fenoles y la actividad cinamil-esterasa. La actividad enzimtica est presente en la mayora de las preparaciones pectolticas comerciales y su empleo puede conducir a un contenido de vinilfenoles elevado y originar gustos desagradables en los vinos blancos. Recientemente se han obtenido preparaciones pectolticas purificadas para eliminar la actividad cinamil-esterasa y as limitar los contenidos de vinilfenoles en los vinos, independientemente de la cepa de levadura utilizada. Los vinilfenoles provienen esencialmente de la descarboxilacin no oxidativa de los cidos hidroxicinmicos de la uva y son los cidos p-cumrico y ferlico. La Cinamato Descarboxilasa es endocelular, especfica slo de estos dos cidos y acta solamente durante la fermentacin.
OCH3 HO CH = CH -COOH CO2 OCH3 HO CH = CH2

Cinamato descarboxilasa CO2

cido ferlico
HO CH = CH - COOH

Vinil-4-guayacol
HO CH = CH 2

Cinamato descarboxilasa

Acido p-cumrico

Vinil-4-fenol
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En lo que concierne a los vinos tintos, los tenores en vinilfenoles son siempre muy limitados. Esto se debera a que la actividad descarboxilasa de la levadura es inhibida por ciertos compuestos fenlicos de la uva, en particular, ciertos taninos catquicos poco polimerizados. La mayora de las cepas de levaduras activas utilizadas en enologa poseen la actividad cinamato descarboxilasa. Trabajos de seleccin realizados han permitido obtener cepas con baja actividad.

Formacin (revelacin) de aromas

Una mercaptopentanona (4-mercapto-4-metilpentano-2-ona) ha sido identificada como el constituyente esencial del aroma de Sauvignon. Este compuesto no existe en el mosto, sino que aparece en el curso de la fermentacin en muy pequea concentracin, lo que supone la existencia de un precursor aromtico del Sauvignon (PAS). Este precursor ha sido aislado de mosto de Sauvignon y agregado a un medio modelo en fermentacin, libera mercaptopentanona. La aptitud de las cepas de Saccharomyses cerevisiae para revelar el aroma de Sauvignon es extremadamente variable.

Formacin de urea y carbamato de etilo

Los aminocidos entran en las clulas de levadura mediante diversas permeasas, una vez dentro, pueden sintetizar directamente protenas y otros compuestos. Tambin pueden transaminarse con cidos -cetnicos para formar otros aminocidos. Es interesante el catabolismo de los aminocidos, en especial cuando interviene la arginina. Las levaduras, mediante la arginasa dan lugar a la formacin de ornitina y urea y la urea puede ser transformada en amoniaco y CO2. Esta reaccin es importante por otras razones. La pequea cantidad de urea que existe en el citosol de la clula puede ser transportada por las permeasas y difundirse en el vino. Y la urea, en cantidades significativas, puede transformarse en un producto txico como es el carbamato de etilo, dependiendo de la temperatura, el pH y la concentracin de etanol.
NH2 C = O + C2H5 -OH
NH2

O C- 0 - C2H5 + NH3
NH2

rea

Etanol

Carbamato de etilo

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BALANCE QUMICO DE LA FERMENTACIN

Los productos principales de la fermentacin del mosto de uva son el alcohol etlico y el anhdrido carbnico y se originan de la fermentacin alcohlica. Junto a estos, aparecen, otros muchos compuestos, llamados productos secundarios, formados como consecuencia de la fermentacin gliceropirvica y otros procesos colaterales de la fermentacin alcohlica.

Balances fermentativos
Lavoisier fue el primero en establecer un balance de los productos de la fermentacin alcohlica. Sirvindose de la balanza demostr en 1789 que durante la fermentacin el azcar es descompuesto en alcohol y anhdrido carbnico. Gay-Lussac, en 1813, represent el proceso fermentativo mediante su famosa ecuacin. C6H12O6 2 CH3 -CH2OH + 2 CO2

Ms tarde (1819), elabor una frmula matemtica de la reaccin: Azcar 100 g alcohol + gas carbnico 51,84 g 48,16 g

Pasteur estableci que la ecuacin de Gay-Lussac es vlida para el 90 % del azcar transformado. El resto lo forman otras sustancias como la glicerina y el cido succnico, que l mismo descubri como productos de la fermentacin. En 1860, nos da un balance de la fermentacin de 100 g. de sacarosa, que al hidrolizarse forman 105,4 g. de azcar invertido (glucosa + levulosa): Alcohol....................................... Anhdrido carbnico................... Glicerina..................................... Acido succnico.......................... Consumido por las levaduras.... total 51,1 g. 49,4 g. 3,2 g. 0,7 g. 1,0 g. 105,4 g.

Con el correr de los aos, otros productos de la fermentacin han sido identificados: cido actico (Bechamp, 1863), 2-3- butanodiol (Henninger, 1882), cido lctico (Peynaud, 1946), cido butrico y acetona (Bertrand y Ribereau-Gayn, 1968), cido pirvico (Blouin y Peynaud, 1963), cido oxaloactico (Carles y otros, 1967), cido propinico, cido citramlico o metilmlico (Carles y otros, 1958), cido dimetilglicrico (Carles y otros, 1966), diacetilo, acetona o acetilmetilcarbinol, acetaldehida. Farkas (1988) sugiere que alrededor del 10-12 % del azcar presente es desviado a biomasa de levaduras y productos secundarios. Varios autores contemporneos han presentado balances fermentativos (Garoglio, Amerine y Joslyn, Peynaud y otros), pero siempre algn otro producto secundario ha sido identificado a posteriori. A continuacin, se transcribe el balance de la fermentacin de 170 g. de azcar, presentado por Peynaud en 1976. Las cantidades medias se expresan en miligramos.

Alcohol etlico................ Anhdrido carbnico...... Glicerina........................ Acido succnico............. 2-3 Butanodiol............... Acido actico................. Acido lctico.................. Alcoholes superiores.....

80.000 76.000 6.000 1.800 400 300 300 300

Acido citramlico......... Acetaldehida................ Acido pirvico............... Acido a-cetoglutrico... Acetato de etilo............ Acetona....................... Levadura seca..............

80 80 60 40 40 10 2.000
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Rendimiento en alcohol
De acuerdo al balance de Peynaud, 170 g de azcar producen 80 g de etanol, o sea 100,8 ml (la densidad a 15 C es de 0,7936). Para producir un grado de alcohol (un ml de alcohol absoluto en 100 ml de vino, o lo que es lo mismo 10 ml/l), se necesitan 16,864 g de azcar [( 170 x 10) / 100,8]. Este rendimiento es muy difcil de alcanzar a nivel industrial. Esto se debe a que: 1. Ordinariamente se produce una mayor multiplicacin de levaduras y, consecuentemente, un mayor consumo de azcar para la formacin del cuerpo celular. 2. A veces, hay una mayor formacin de productos secundarios como consecuencia de la presencia de otros microorganismos. 3. Se verifican prdidas de alcohol durante la fermentacin debido al calentamiento y otras causas como el fulado, los remontajes, etc. En la prctica, se calcula que para producir un grado alcohlico se necesitan 17 g de azcar, ndice adoptado por algunos pases como Francia y aceptado por la Organizacin Internacional de la Vid y el Vino (O.I.V.). En nuestro pas, fundado en estudios tcnicos que contemplan las caractersticas de nuestra industria y modalidades de trabajo, se ha establecido legalmente un rendimiento mximo de 17,5 g de azcar para producir un grado de alcohol.

Produccin de anhdrido carbnico

La cantidad de anhdrido carbnico que se produce es enorme. De acuerdo al balance de Peynaud, 170 g de azcar producen 76 g de CO2, que a 0C y 760 mm. de presin ocupan un volumen de 38,442 l. (un litro de CO2, medido a 0C y 760 mm. de presin pesa 1,977 g). Supongamos un mosto de 12 B (210 g/l de azcar). Un hectlitro que fermenta desprende 4750 litros de a CO2 que se incorporan al ambiente y que, de no tener el local de fermentacin las condiciones adecuadas para evacuarlos, entraan un peligro cierto para las personas que trabajan all. El mosto en fermentacin esta saturado de anhdrido carbnico. La cantidad depende de la temperatura, la presin y el grado alcohlico. Cuando termina la fermentacin el CO2 tiende a desprenderse del vino, favorecido por el trasiego y otras operaciones y movimientos. Un detalle importante es el arrastre de alcohol producido por el desprendimiento del anhdrido carbnico. Se ha intentado recuperar el alcohol (Bremond, 1950; Furlotti, 1967), pero tambin se ha hecho notar que el valor del alcohol recuperado no compensa los gastos que exige la operacin. Con ms criterio se ha insistido en mejorar las condiciones de elaboracin (temperaturas de fermentacin, operaciones tecnolgicas, etc.) para reducir al mnimo las prdidas de alcohol. El anhdrido carbnico de la fermentacin ha sido utilizado para la gasificacin de los vinos (Carpen) y tambin para inertizar las maquinarias utilizadas en el procesamiento de la uva para la obtencin del mosto (moledoras, escurridores, prensas).

ENERGESIS: BALANCE ENERGETICO DE LA FERMENTACION ALCOHLICA

El balance qumico de la fermentacin alcohlica pura, se expresa as: C6H12O6 + 2 ADP + 2 H3PO4 2 CH3 - CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP

En el plano energtico, la variacin total de energa es de 40 kcal/mol de hexosa (Conn y Stumpf, 1972). De las 40 kcal, 14,6 corresponden a los 2 ATP formados (la formacin de una unin ATP demanda 7,3 kcal), nica forma de energa "biolgicamente asimilable", que son utilizados por las clulas de levaduras para asegurar sus funciones vitales, en particular su multiplicacin. La diferencia, o sea 25,4 kcal, constituye la energa libre que se incorpora al medio en forma de calor y provoca el calentamiento del mosto en fermentacin. No toda la energa libre se resuelve en un aumento de la temperatura. En un sistema absolutamente cerrado (aislado trmicamente) la temperatura aumentara 25,4C; pero en la
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industria, el aumento de la temperatura esta regulada por la relacin entre dos factores: la tasa de fermentacin (depende de la energa fermentativa de la levadura, temperatura de fermentacin, nmero de clulas, contenido de azcar, contenido de alcohol) y la disipacin de la temperatura al medio externo. La disipacin de la temperatura depende tanto de las caractersticas constructivas de la vasija: material (coeficiente de conductividad trmica), espesor de las paredes, tamao y forma (relacin superficie/volumen), individualidad (paredes compartidas o no); como de la temperatura y ventilacin del cuerpo de fermentacin. Tambin influye, aunque en menor medida, el sistema de vinificacin y el calor latente de vaporizacin de sustancias voltiles que se desprenden junto con el anhdrido carbnico. En definitiva, para nuestras condiciones de vinificacin slo unas 15 kcal se resuelven en un aumento de la temperatura, el resto se disipa. De cualquier modo, se debe recurrir a refrigeraciones oportunas para mantener el mosto en fermentacin dentro del rango de temperatura adecuado, segn el sistema de vinificacin. De ah la importancia de disponer de suficiente capacidad de refrigeracin para manejar eficientemente la temperatura de fermentacin, an en la peor situacin imaginable. Si las vasijas "escapan" y se tornan muy calientes, el control es difcil, sino imposible, y la calidad del vino sufre.

FENOMENOS FISICOS QUE SE PRODUCEN EN LA FERMENTACION

Mientras se suceden los fenmenos bioqumicos ligados a la fermentacin alcohlica y el mosto va transformndose en vino, se observan los siguientes fenmenos fsicos: disminucin de la densidad, produccin de calor, disminucin del volumen y precipitaciones.

Disminucin de la densidad
La densidad del mosto de uva oscila normalmente entre 1,090 y 1,110 y depende fundamentalmente del tenor azucarino. El mosto de uva madura contiene normalmente entre el 15 y 25 % de hexosas (glucosa y levulosa) y a veces ms en uvas sobremaduras o donde es habitual la podredumbre noble producida por Botrytis cinerea. De ah que la densidad oscile entre 1,080 y 1,110, ya que los azucares por s mismo tienen una densidad prxima a 1,613. Al producirse la fermentacin el azcar va transformndose en alcohol etlico como producto principal, cuya densidad a 15C es de 0,7936. Esto hace que la densidad vaya disminuyendo a medida que avanza la fermentacin. El vino que ha fermentado totalmente, debido al contenido de alcohol tiene una densidad menor que 1; tanto ms bajo cuanto ms rico en azcar era el mosto y, por lo tanto, mayor la cantidad de alcohol producida. En un vino que no ha terminado de fermentar, la densidad ser de 1 o ms, tanto ms alto cuanto mayor sea la cantidad de azcar residual.

Disminucin del volumen

El volumen del vino producido es inferior al del mosto que le dio origen. Esto se debe a las siguientes causas: el fenmeno de contraccin de la mezcla alcohol-agua, prdidas por el desprendimiento del CO2 y el arrastre de algunas sustancias voltiles (alcohol y otras) y las precipitaciones de sales tartricas. Para un vino de 12,5 % v/v, considerando que el coeficiente de contraccin es de 0,07 por 1 % de alcohol, la disminucin de volumen ser de 0,875 ml. cada 100 ml. (12,5 x 0,07). Las prdidas atribuidas al anhdrido carbnico (desprendimiento y arrastre) sumadas a las precipitaciones, superan ligeramente el 1 %. Sumadas a la disminucin de volumen debida a la contraccin nos da un volumen de vino inferior al 2 % aproximadamente, con relacin al del mosto original.

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Produccin de calor
Como hemos visto al tratar el balance energtico de la fermentacin alcohlica, 25,4 kcal se incorporan al medio en forma de calor provocando el calentamiento del mosto. Pero debido a las causas que ya hemos analizado, se pierden unas 10 kcal. Existe un coeficiente prctico, de uso generalizado en nuestro medio, que permite calcular rpidamente el aumento de temperatura que podra esperarse: 1,4C por cada grado Baum. Desde el punto de vista prctico, se observa que un mosto que tiene 12,5B, por efecto de la fermentacin aumentara su temperatura en 17,5C (12,5 x 1,4). En consecuencia, si la temperatura de campo fuese de 25C, llegara tericamente a una temperatura de 42,5C, lo que hara imposible la vida del fermento. Es necesario entonces intervenir mediante los medios enotcnicos adecuados en el control de la temperatura. Al tratar el tema de las operaciones comunes a todas las vinificaciones, veremos en detalle los sistemas de refrigeracin.

Precipitaciones
Las precipitaciones ms corrientes en el pasaje de mosto a vino, son el tartrato neutro de calcio y el bitartrato de potasio o cremor trtaro. El mosto de uva constituye una solucin saturada de bitartrato de potasio. La solubilidad de esta sal depende de la temperatura, a mayor temperatura aumenta la solubilidad, y del contenido de alcohol que hace que la solubilidad disminuya. Al avanzar la fermentacin se va acumulando alcohol etlico y, consecuentemente, disminuye la solubilidad del bitartrato. El exceso de soluto precipita, depositndose en las paredes y el fondo de la vasija de fermentacin. Por efectos del alcohol, tambin se insolubilizan en parte las gomas y muclagos.

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INFLUENCIA DEL MEDIO Y DE LAS EXIGENCIAS TECNOLOGICAS SOBRE LAS LEVADURAS

Condiciones para el desarrollo de las levaduras Temperatura: La temperatura ptima se sita entre 18 y 30 C. Con menos de 10 C la fermentacin no empieza y si supera los 35 C, se detiene. La velocidad de transformacin de azcar, crece con la temperatura. A medida que la temperatura es ms elevada, la entrada en fermentacin es ms rpida, pero el grado alcohlico obtenido es menor. Con respecto a los nutrientes: Los mostos estn bien provistos de los azcares y minerales que necesitan las levaduras, no as de sustancias nitrogenadas. Las levaduras necesitan nitrgeno amoniacal. Un mosto en fermentacin queda desprovisto de nitrgeno amoniacal en 36 horas. En vinificaciones en blanco hay que recurrir al agregado de nutrientes a base de sales de amonio, que se agregan dentro de las 48 horas de iniciada la fermentacin por medio de un remontaje. Tambin puede requerirse un suplemento vitamnico, como Tiamina y Pantotenato (50 mg/hL). Existen mezclas de nutrientes en el mercado que adems traen cscaras de levaduras que sirven para absorber toxinas. La acidez no influye en el desarrollo de las levaduras, ya que son resistentes; pero una alta acidez impide una multiplicacin peligrosa de bacterias en caso de que la fermentacin alcohlica se detenga. En el mosto, las levaduras encuentran los constituyentes que les son necesarios para asegurar sus funciones vitales. Entre ellos, se encuentran los hidratos de carbono, los cidos orgnicos, sales minerales, pH, constituyentes nitrogenados y factores de crecimiento y supervivencia. De manera general, con una correcta inoculacin (106 cl/mL) la fermentacin se inicia rpidamente y llega a su trmino. Por lo tanto, el correcto desenvolvimiento de la fermentacin alcohlica, y en consecuencia, la calidad del vino resultante, dependen de numerosas variables; algunas de naturaleza qumica, otras estn referidos a carencias nutricionales y a la presencia de inhibidores. Estos factores se podran clasificar en tres grupos: a. la composicin del mosto: concentracin de azcares, acidez, disponibilidad de nutrientes y factores de crecimiento y el contenido en sustancias fenlicas; b. la microbiota y c. las condiciones operativas. Un perfecto manejo de la fermentacin es una de las primeras funciones del enlogo. Los problemas de fermentacin han constituido serios obstculos tcnicos para el normal desarrollo del proceso de vinificacin; entre ellos estn: comienzos de fermentacin tardos, fermentaciones "languidecientes", detenciones de la fermentacin antes del agotamiento completo del azcar. Una interrupcin de la fermentacin constituye un peligro grave, no solamente para la dificultad de reiniciarla, sino tambin porque en tal situacin puede temerse que ocurran desviaciones bacterianas que provocaran un aumento de la acidez voltil, deteriorando la calidad del producto final. Para comprender la explicacin de estos fenmenos es necesario considerar la fermentacin bajo su aspecto biolgico. La fermentacin alcohlica no es solamente un balance analtico en el que figura la equivalencia entre el peso de azcar degradado y la suma de productos principales y secundarios. Esencialmente, la fermentacin es la consecuencia del conjunto de actividades bioqumicas por las que la levadura se procura la energa necesaria para la biosntesis de la sustancia celular, asegurando la edificacin
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de su esqueleto carbonado, su multiplicacin, su conservacin, es decir, el conjunto de sus funciones vitales. Asimismo, el mosto de uva presenta una constitucin diferente segn el cepaje, el suelo y las condiciones climticas del ao. Su composicin se encuentra tambin fuertemente condicionada por las modalidades tecnolgicas; tanto en lo que se refiere al manejo del viedo, al cultivo y al momento de recoleccin de los frutos, como a la obtencin y tratamientos del mosto, todas ellas variables en funcin del tipo de vino deseado. Tambin las tcnicas y condiciones en que se realiza la vinificacin condicionan el desarrollo y actividad de las levaduras. La influencia del medio y de las exigencias tecnolgicas se manifiesta sobre el crecimiento y el metabolismo de las levaduras. CONTROL DE LA FERMENTACIN Ciclo de crecimiento de las levaduras y cintica de fermentacin En el desarrollo normal de una fermentacin alcohlica el ciclo muestra tres fases principales. La primera, de crecimiento limitado de 2 a 5 das en que aumenta la poblacin progresivamente hasta un valor comprendido entre 107 108 clulas ml-1. La segunda fase es cuasi estacionaria y dura alrededor de ocho das. Por ltimo la fase de declinacin donde se reduce progresivamente la poblacin viable hasta 105 clulas ml-1, esta fase puede durar muchas semanas. Durante ese ciclo, particularmente largo, el crecimiento est limitado a cuatro o cinco generaciones. Existe una desproporcin entre la duracin de las diferentes fses, en particular la fase de declinacin que es de tres a cuatro veces ms larga que la de crecimiento. La cintica de fermentacin est ligada directamente al ciclo de crecimiento. La velocidad de fermentacin es mxima y prcticamente constante durante un poco ms de 10 das, correspondiendo a las dos primeras fases del crecimiento. Luego disminuye cada vez ms, pero se prolonga durante varias semanas, las levaduras en ese momento se encuentran en una fase de supervivencia. Finalmente, la detencin en la fermentacin se da por crecimiento insuficiente y por una inhibicin de la actividad metablica de las clulas no proliferantes. La detencin del crecimiento no es consecuencia de la desaparicin del alimento energtico, sino que la paralizacin de la actividad metablica ha sido interpretada por la desaparicin del ATP celular, por la acumulacin de etanol en la clula o ms probablemente por las dificultades del transporte a travs de la membrana, causando la desaparicin de los esteroles celulares. Se observa que los sistemas enzimticos de la clula funcionan siempre, pero que la concentracin de azcar decrece progresivamente dentro de la clula. La disminucin y la interrupcin de la fermentacin pueden ser provocadas por una temperatura excesiva. Vigilar la marcha de la fermentacin es una necesidad que permite seguir las transformaciones, prever su evolucin e intervenir a tiempo de ser necesario. Dos controles deben efectuarse diariamente: el seguimiento de la fermentacin y la medicin de la temperatura. Las levaduras viables pueden ser enumeradas al microscopio directamente por el recuento en cmara de Neubauer con la ayuda de tincin vital. Tambin puede utilizarse la tcnica de epifluorescencia y, en algunos casos, la estimacin del ATP.
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Regulacin fermentacin - respiracin Pasteur fue el primero en comparar el crecimiento de las levaduras en aerobiosis y anaerobiosis, y en constatar una inhibicin de la fermentacin por respiracin. Cuando la levadura puede utilizar los azcares indiferentemente por respiracin o fermentacin (lo que slo es posible en bajas concentraciones de glucosa), la aireacin induce a un aumento en la cantidad de biomasa, a una disminucin en la produccin de etanol y del consumo de azcar. El fenmeno por el que la respiracin que inhibe a la fermentacin, tambin llamado Efecto Pasteur, recibi muchas interpretaciones. Puede explicarse por la competencia entre dos enzimas catalizadoras. La piruvato descarboxilasa, implicada en la va fermentativa, presenta frente al piruvato una afinidad muy inferior a la piruvato deshidrogenasa. Pero, la mejor explicacin del efecto es la inhibicin por ATP de las enzimas de la gliclisis. El ATP surgido de la fosforilacin oxidativa inhibe en particular a la fosfofructoquinasa, lo que trae aparejado una acumulacin de hexosas fosforiladas, una disminucin en el transporte de los azcares a travs de la membrana y en consecuencia de la gliclisis. Cuando la concentracin de azcares es elevada, como en el caso del mosto de uva, Saccharomyces cerevisiae slo metaboliza los azcares por va fermentaria, incluso en presencia de oxgeno la respiracin es imposible. Esto se denomina Represin catablica de la glucosa o contraefecto Pasteur, en donde las levaduras presentan un degeneramiento de las mitocondrias, una disminucin de la tasa de esteroles y de cidos grasos celulares y una represin de las enzimas del Ciclo de Krebs. Este efecto se manifiesta a partir de los 9 g/L. En el mosto, cualesquiera que sean las condiciones de aireacin la levadura est obligada a fermentar. La aireacin del mosto favorece la fermentacin alcohlica desde el punto de vista de la sntesis de cidos grasos y esteroles por las levaduras. Incidencia de la aireacin del mosto sobre la fermentacin Experiencias clsicas muestran que en fermentaciones conducidas con aireacin permanente, las poblaciones levadurianas mximas en el mosto de uva son duplicadas y la fermentacin es ms rpida y ms completa que en anaerobiosis. Este hecho, que no puede explicarse por el efecto glucosa, ha encontrado una aplicacin tecnolgica en la prctica de los remontajes en la vinificacin en tinto. El remontaje consiste en tomar el mosto en fermentacin y "remontarlo" por bombeo sobre el orujo, lo que equivale a una aireacin. Practicado al tercer da de la fermentacin espontnea del mosto, es decir cuando interviene sobre una poblacin levaduriana ya importante (pero siempre en fase de crecimiento), el remontaje permite desarrollar la actividad mxima con una velocidad fermentaria comparable a la de un mosto que fermenta en aerobiosis permanente. Practicado el octavo da o despus, es decir sobre una poblacin menos densa y estacionaria o en va de declinacin, se vuelve prcticamente ineficaz. Necesidades nutritivas Alimentacin carbonada La levadura encuentra en el mosto de uva, la glucosa y la fructosa que le sirven como fuentes de carbono y de alimentos energticos. No queda excluido que la
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riqueza del mosto en azcar influye en la seleccin de cepas de levaduras que aseguran la marcha de la fermentacin. Este proceso es lento en un medio que contiene unos pocos gramos de azcar por litro; su velocidad aumenta hasta 15 20 g/L, luego se estabiliza alrededor de 200 g/L. Por encima de esta cifra la fermentacin disminuye y finalmente la produccin de alcohol puede ser ms escasa en mostos que contengan cerca de los 300 g/L. Por lo tanto, una concentracin de azcar elevada, afecta al crecimiento de la levadura y disminuye la poblacin mxima; en consecuencia, la fermentacin se reduce, incluso antes de la aparicin de una cantidad significativa de etanol que agrega su efecto antisptico. Alimentacin nitrogenada La levadura encuentra en el mosto la alimentacin nitrogenada necesaria para su crecimiento. El catin amonio es particularmente asimilable y puede satisfacer l mismo la sntesis de aminocidos. Los polipptidos y las protenas no participan del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ya que no tiene la propiedad de hidrolizarlos, y tampoco tiene necesidad absoluta de recibir aminocidos en su alimentacin nitrogenada, pues es capaz de sintetizarlos individualmente. Sin embargo, su adicin presenta un efecto estimulante. Existen tres mecanismos para la utilizacin de aminocido por la levadura: 1. Integracin directa, sin modificaciones en las protenas. 2. Descomposicin del grupo aminado que es utilizado por la biosntesis de los diferentes constituyentes nitrogenados y la cadena carbonada es excretada. (ver formacin de alcoholes superiores). 3. Las molculas de aminocidos pueden ser utilizadas como fuente de carbono en las reacciones del metabolismo. Simultneamente la levadura recupera el nitrgeno amoniacal correspondiente. La asimilacin de los diferentes aminocidos depende del funcionamiento de los sistemas de transporte y de la regulacin de los sistemas metablicos. Aunque las mezclas complejas de sales de amonio y de aminocidos poseen una eficacia mxima, tanto en el crecimiento de la levadura como en la velocidad de fermentacin, por razones de simplicidad el enriquecimiento de mostos en alimento nitrogenado se hace exclusivamente con sales de amonio. La riqueza del mosto inicial en catin amonio es uno de los elementos ms importantes a tener en cuenta para fijar la oportunidad de un enriquecimiento. Se pudo estimar su necesidad cuando el tenor de NH4+ es inferior a 25mg/L. Con aportes excesivos, se puede temer, al trmino de la fermentacin la presencia de amonio residual no asimilado. Tambin hay que considerar que un exceso de nitrgeno amoniacal puede ocasionar una modificacin en los caracteres aromticos del vino, ya que la levadura no teniendo la necesidad de desaminar los aminocidos, forma menos productos secundarios. Por ltimo, la alimentacin nitrogenada implica la formacin de carbamato de etilo, el que por sus propiedades cancergenas es un constituyente no deseado y controlado por diferentes legislaciones. En lo que respecta a las condiciones de empleo de sales de amonio, el momento de su adicin parece importante. Se sugiere hacer este agregado en el mosto antes de iniciarse la fermentacin, tomando en cuenta la mejor reaccin de la levadura a toda intervencin en fase de crecimiento; en un medio con poco etanol pareciera mejorar la asimilacin.
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Factores de supervivencia La nocin de factores de supervivencia resulta de la interpretacin del modo de accin de los estores y de algunos cidos grasos de cadena larga sobre la actividad de las levaduras y la marcha de la fermentacin. En estudios realizados en medio de cultivo sinttico, adicionado de ergoesterol solubilizado en el tween 80 (ester de oleato), se pudieron obtener poblaciones de levaduras muy importantes en anaerobiosis estricta en el curso de cultivos sucesivos durante ms de 5 meses. A ttulo de ejemplo: en un mosto rico en azcar (260 g/L) S. cerevisiae fermenta en 10 das 175 g/L de azcar y 258 g/L cuando el mosto se encontraba adicionado con 5 mg/L de ergosterol. Contrariamente en aerobiosis, se observa un leve efecto inhibidor. Se demuestra as, que estas sustancias son indispensables para las levaduras que se desarrollan al abrigo total del aire, porque en esas condiciones no tiene la posibilidad de sintetizarlos; la presencia de esteroles es necesaria para asegurar la permeabillidad de las membranas. Por otra parte, el 6% en peso seco de la membrana citoplasmtica est constituido por esteroles; podran por lo tanto intervenir en el control de la permeabilidad de la membrana. Los principales esteroles de la levadura son el ergoesterol y el 24(28) dehidroergoesterol. Los esteroles aportados al medio de cultivo de las levaduras que se desarrollan en anaerobiosis permiten paliar la ausencia de oxgeno, de alguna manera, el ergosterol, es para la levadura un sustituto del oxgeno. El rol funcional de los esteroles ha sido precisado recientemente. Los esteroles segn resultados de Cobon (1973) favoreceran el pasaje de "gel en fase lquida" a la estructura membrana biolgica. Los esteroles asociados a los fosfolpidos de las membranas juegan un rol regulador. Participan en el control de la permeabilidad de la membrana celular y, por lo tanto, de los intercambios de la clula con el medio exterior. Propiedades anlogas a la del ergosterol se encuentran en otros esteroles y cidos grasos de cadena larga. En un estudio de la composicin de la cera cuticular de la uva, muestra que esta sustancia est esencialmente constituida por un triterpeno que comprende un grupo carboxlico, una funcin alcohlica y un doble enlace: el cido oleanlico. Brchot trata de explicar el crecimiento anaerobio de las levaduras en vinificacin por maceracin carbnica, lo que lo lleva a estudiar la accin de la cera cuticular sobre el desarrollo anaerobio de las levaduras. Efectivamente ella es activadora. Un poco ms tarde este efecto es relacionado nicamente al cido oleanlico, principal componente de la cera cuticular, que presenta un efecto "factor de crecimiento" anaerobio de las levaduras. El papel funcional del cido oleanlico es an poco conocido. A partir de las experiencias de Brchot se puede pensar que permite mantener el cido glutmico en un ndice estable en el conjunto de los aminocidos de la clula y que participa as en la activacin de las sntesis proteicas.

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