I.- TITULO: CARACTERIZACIN Y EVALUACIN NUTRICIONAL DE DOS TIPOS DE HARINA DE PEPA DE PACAE (Inga edulis Mart). II.

- PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACION DEL TEMA 2.1.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: 2.1.2 DESCUBRIMIENTO DEL PROBLEMA: Las semillas del pacae se utilizan como alimento animal en nuestra amazona, esto nos conlleva a pensar que contienen alto contenido proteico que puede ser aprovechado para satisfactoriamente salvaguardar los previa altos transformacin en alimentacin humana

ndices de desnutricin de algunas zonas de nuestra regin.(1) 2.1.2 HECHOS: Los altos ndices de desnutricin de algunas zonas de nuestra regin nos motiva a encontrar alternativas alimenticias de productos de la zona que contengan un alto valor nutritivo que ayude a disminuir estos ndices y crear bienestar corporal que nos conlleve a un desarrollo como regin. 2.1.3Planteamiento del problema Cual de las dos variedades de pacae preponderantes en la selva central de nuestra regin nos permite obtener harinas con mayor contenido nutricional, alto poder de digestibilidad y funcionalidad?

2.2.- JUSTIFICACIN La semilla del Pacae posee propiedades nutritivas como el alto contenido de calcio, fsforo y protenas con alto grado de digestibilidad .Por ende previos anlisis se pueden aprovechar dichos nutrientes mediante la elaboracin de harinas que puedan ser utilizada como reforzamiento de alimentos como papillas y mezclas tradicionales para elaboracin de productos que combatan el grado de desnutricin de nuestra regin.(3)

III.- OBJETIVOS 3.1 General: Evaluar las dos variedades de pacae que nos permitan obtener harinas con mayor contenido nutricional, alto poder de digestibilidad y funcionalidad. 3.2 Especficos: Caracterizacin fisicoqumica de las pepas del pacae (Humedad, ceniza, Extracto seco, Protena bruta, fibra bruta, extracto no nitrogenado). Elaboracin de las curvas de secado para las pepas del pacae. Realizacin de pruebas fitoqumicas en las pepas deshidratadas (Saponinas, fenoles, esteroides). Evaluacin cromatogrfica para harinas. Caracterizacin biolgica de las protenas en las harinas (PER, NPU). la cuantificacin de aminocidos en las

IV.- MARCO TEORICO 4.1. El Pacae: Es un rbol pequeo de 8-3 m. de altura; fuste de 15-40 cm, muy ramificado, casi desde la base y corteza externa lisa de color pardo grisceo. Hojas compuestas, alternas, paripinnadas, con estpulos decduas y rquis alado pardo tometoso.. El fruto es una vaina cilndrica indehiscente, con surcos longitudinales mltiples, de 40-120 cm. de largo y 3,5- 3,7 cm. de dimetro, verde oscuro pardotomentoso. Semillas en nmero de 10-20 por fruto, oblongas, negro a negro violceo y cubiertas por un arilo blanco, algodonoso y dulce. El arilo de la semilla de los frutos maduros es comestible; es pulposo, suculento y dulce. Se consume directamente al estado fresco. Se utiliza tambin en la preparacin de refrescos, y tiene potencial en la produccin de alcohol de buena calidad. (1) Tradicionalmente, los frutos de segunda calidad son consumidos por el ganado vacuno, porcino, aviar y en piscicultura; la semilla contiene protenas en cantidad importante, que le dan potencial como ingrediente en alimentacin animal. (1) 4.1.1 Variedades del Pacae: En la estrella fluvial del Maran se conocen 22 variedades y especies de Pacae, como lo atestiguan los esposos Berln en etnobiologa, subsistencia y nutricin en una sociedad de la selva tropical: los

Aguaruna, 1978. En Nuestra preponderantes son : o o

selva central las

dos variedades mas

Inga Grenadensis Urb Inga benthamiana meisn

Estas dos variedades son conocidas comnmente como la variedad blanca y la amarilla por el color del arilo respectivamente. (1)

4.1.2 Usos de las Pepas de Pacae : Algunas comunidades indgenas de la Amazona, adems de consumir la fruta como alimento, utilizan las semillas y hojas con fines medicinales: antidiarreico y antirreumtico. Las semillas de especies seleccionadas son consumidas por ciertos grupos indgenas de Araracuara. En El Salvador se emplea la corteza de algunas especies para la produccin de taninos. En el Vaupes, Colombia, los indgenas utilizan la goma de ciertas especies para fijarlos colores destinados a pintar sombreros, canastas y otras artesanas.(2)

4.1.3

Composicin Fisicoqumica y Fitoqumica de Las Pepas del Pacae: Las semillas de Inga edulis de la variedad grenadensis, comidas como vehculos, se divulgan para contener por 100 g, 118 caloras, 63.3% humedad, 10.7 protena de g, 0.7 grasas de g, carbohidratos total de 24.0 g, fibra de 1.6 g, ceniza de 1.3 g. Pulpa de Inga spp. contiene por 100 g, 60 caloras, 83.0% humedades, 1.0 protenas de g, 0.1 grasas de g, 15.5 carbohidratos total de g, 1.2 fibras de g, 0.4 cenizas de g. Semillas secadas de Inga spp. contener por 100 g, 339 caloras, 12.6% humedad, 18.9 protena de g, grasa de 2.1 g, carbohidratos total de 62.9 g, fibra de 3.4 g, ceniza de 3.5 g. Las semillas del gnero Inga se divulgan para contener los inhibidores de la tripsina y los inhibidores del chymotrypsin.(3)

4.2 Tendencia de los Sustitutos Proteico:

Alimenticios con Harinas de Alto Valor

En la dcada de 1970-1980 en varios pases del mundo se implementaron programas de investigacin tendientes a formular alimentos con un alto contenido de protena de buena calidad, utilizando principalmente protenas vegetales. La idea era utilizar estas formulaciones en sustitucin de las protenas de origen animal, que por su baja disponibilidad y alto costo no estaban disponibles para las poblaciones de escasos recursos. Para estos fines se han empleado protenas de oleaginosas, de Cereales y de leguminosas, que combinadas, dan origen a alimentos de alto valor protenico y contienen otros nutrientes que son deficitarios en la dieta de la poblacin. Muchas formulaciones de esta naturaleza se han desarrollado y sometido a pruebas biolgicas de calidad nutricional, utilizando animales experimentales, y finalmente el hombre. Se consideran dos grupos: a) sustitutos de leche, y b) extensores de alimentos de origen animal.(4) Consideraciones Generales: La planificacin y el desarrollo de estos alimentos debe tomar en cuenta consideraciones, de orden tecnolgico-nutricional, cultural, social y econmico, tales como: 1. Materia Prima: en lo posible debe ser local, ya que al importarla, no slo se crea una dependencia, sino que se incrementa el costo final del producto. 2. Evaluacin de Calidad: se han diseado guas y metodologas para el control y la garanta de calidad de las frmulas. Estas comprenden procedimientos de orden Tecnolgico (aceptabilidad y estabilidad del producto), nutricional (calidad y digestibilidad de la protena y tolerancia por los nios, y efecto suplementario a la dieta), toxicolgico y sanitario. 3. Procesamiento y Comercializacin: se han establecido procedimientos generales para el sistema de produccin con respecto a la disponibilidad y caractersticas de la materia prima y la adicin de suplementos y sabores. Con respecto a la

comercializacin, se ha puesto especial atencin a la forma de presentacin, precio, estabilidad, envase, distribucin y propaganda. Ms que un concepto, las harinas compuestas son ya una realidad traducida en alimentos que se comercializan y se consumen, y que pueden contribuir significativamente al mejoramiento de la seguridad alimentaria y nutricional de la poblacin centroamericana.(4)

4.2.1 Harinas Compuestas a base de Leguminosas y Otros: La tecnologa para la preparacin de harinas precocidas de frijol consiste en someter el grano a un proceso de coccin, deshidratacin y molienda. El producto as obtenido est listo para consumo despus de cocinarse durante 10 a 15 minutos. Este tipo de producto puede usarse en la preparacin de harinas compuestas basadas en diferentes leguminosas de grano. La combinacin del frijol comn con otros frijoles como el caup (Vigna sinensis) o el gandul (Cajanus cajan) pueden utilizarse posiblemente reduciendo el precio del producto y creando el inters para producir otras leguminosas en determinadas regiones. Este tipo de harina compuesta puede ser usado como sopa de diferentes tipos y sabores, o puede combinarse con otros alimentos en la preparacin de sopas de alto valor nutritivo. (4)

4.3 Elaboracin de harinas Precocidas: Son aquellas en la cual el ndice de solubilidad y el ndice de absorcin es mayor que las harinas crudas. Se tienen dos fases que son la tecnolgica y la fase nutricional (formulacin de mezclas). (5)

Materia Prima Clasificacin y Seleccin Lavado Tratamiento Trmico (89C) Secado o deshidratado (50-60C) Molienda Tamizado Harina El tiempo de tratamiento trmico para leguminosas es de 20-25 min.Los criterios que se deben tomar para la elaboracin de una mezcla alimenticia son: (5) Deben tener un alto valor nutricional: Protenas de alto poder nutricional, carbohidratos fcilmente digestibles, densidad energtica adecuada (0.81Kcal/g de alimento preparado) Estar libre de factores antinutricionales (Saponinas, inhibidores de proteasas, oligosacaridos, etc) Preferentemente se debe usar materias primas locales Debe corresponder a los hbitos alimenticios locales. Debe tener una vida til larga.

Debe tener un costo moderado.

4.4 El HPLC: Esta tcnica se ha convertido, sin lugar a dudas, en la ms popular y verstil de las tcnicas analticas modernas en los laboratorios de hoy. Los sistemas de HPLC se utilizan actualmente en una amplia variedad de campos. Da a da aumentan los requerimientos de confiabilidad de los datos analticos y de eficiencia en el flujo de trabajo del laboratorio, para un desarrollo ms rpido de nuevas drogas, para mejorar la seguridad de los alimentos, y para cumplir con estndares ms altos en regulaciones ambientales. Un aspecto importante en el anlisis de los aminocidos es el hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionan con los aminocidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para anlisis cualitativos o cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatizacin de los aminocidos. Los mtodos fluorimtricos tienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometra para el anlisis de aminocidos. Necesidades proteicas . Se requiere un criterio para fijar las necesidades o exigencias en protenas para el ser humano. Por ello se establece una "protena de referencia" o "patrn".(6) A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminocidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metablicos como en las investigaciones de la estructura de las protenas. El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el nmero y la cantidad relativa de los diferentes aminocidos presentes en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los anlisis cuantitativos es necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos . (6) 4.4.1 Cromatografa en capa fina. Una importante aplicacin de la

cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona una idea rpida de los aminocidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la

columna.En la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes volmenes de muestra, lo que permite la elucin posterior de un aminocido en particular para su posterior purificacin y anlisis, factor que tiene gran importancia en la identificacin de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales cromoprotenas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de amoniaco y lavando despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de R f (factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. En general, aumentando la proporcin de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de R f e introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminocidos bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composicin qumica del disolvente puede tambin limitar el rango de reactivos de localizacin que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el cido sulfanlico no puede utilizarse con disolventes fenlicos. El poder de resolucin de la cromatografa de capa fina puede aumentarse empleando tcnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separacin cromatogrfica de una dimensin (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensin. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ngulo de 90 y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado,

se sumerge en el reactivo de localizacin elegido. En la cromatografa de dos dimensiones, la composicin de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse.(6)

Las separaciones bidimensionales permiten la resolucin de un gran nmero de aminocidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensin se separan en la segunda. Esto es muy til en la deteccin de los componentes que estn en muy baja concentracin y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentracin alta cuando se utiliza la cromatografa en una dimensin. (6) 4.5 MTODOS BIOLGICOS QUE SE UTILIZAN PARA EVALUAR LA CALIDAD DE LA PROTENA: 4.5.1 RELACION DE EFICIENCIA PROTEICA (PER).- Este crecimiento de las ratas es el reflejo de la mtodo fue

desarrollado por Osborne y Col. en 1979, el introdujo por primera vez que el eficiencia de la protena suministrada, lo cuantifico con la relacin cantidad de ganancia de peso por gramos de protena consumida. Originalmente esta relacin se realizaba a diferentes niveles de protena, cuanto mas alto es el nivel de una protena, es mas sensible a los cambios del PER, hubo necesidad de estandarizar el porcentaje de protena, fijar un nivel para todas las protenas, para evitar variaciones, se recomend el 10% de protenas para ratas en crecimiento. Para comparar la calidad de varias protenas, adems de estandarizar el porcentaje de protenas es necesario considerar otros factores como: Edad.-LA edad de las ratas tiene un efecto en la medida de la calidad de las protenas, generalmente se usan ratas destetadas de 21 a 23 das. Raza.-Diferentes razas de ratas presentes con diferentes rangos de peso, entre las razas que se usan tenemos alas ratas albinas raza Holtzman (mansas), Winster (agresivas) y otras.

Sexo.-El sexo de la rata usada tiene un efecto en el peso, los machos presentan mayor rapidez en el crecimiento recomienda el uso de las ratas machos. Numero de animales.-Diez ratas para cada una de las muestras problema y 10 para la muestra control Periodo de Experimentacin.- Es de cuatro semanas a 28 das que las hembras, se

notndose que los valores disminuyen con el tiempo ,la primera semana, el crecimiento es rpido y las subsiguientes es mas lento El PER de las protenas de algunos de los alimentos se presentan en el cuadro siguiente:

ALIMENTO INCAPARINA CORN-SOY-MILK FORTESAN PERUVITA SOYA HABAS TRIGO AVENA GRANO DE GIRASOSL GRANO DE ALGODON TUBERCULO PATATA CASEINA (TESTIGO) DE

PROTEINA (%) 27 19 23 35 40 30 14 13 30 53 9

PER 2-5 2-4 2-6 2-4 2-3 1-8 1-8 2-2 2-1 2-3 2-0

---

2-5

10

PER = Ganancia en peso/protena consumida

4.5.2 UTILIZACION NETA DE LA PROTEINA (NPU).- Este mtodo fue desarrollado por Miller y Bender (1975) mide directamente la utilizacin de la protena determinando la cantidad de nitrgeno retenido proveniente del consumo de protena de un alimento, es decir manifiesta en un solo ndice tanto la digestibilidad de la protena como el valor biolgico de la mezcla de aminocidos absorbidos por el intestino (7). En forma prctica el nitrgeno retenido se determina por la deferencia entre el nitrgeno corporal de un grupo de ratas alimentadas con una dieta aproteica. Se calcula usando la siguiente formula:

UNP

N corporal ratas dieta de ensayo N corporal ratas dieta aproteica = ___________________________________________________________ Nitrgeno Ingerido

X 100

Los factores condicionales son:

11

Raza.-Se puede

determinar el NPU en razas diferentes de ratas blancas,

dando resultados similares. (7) Sexo.-No hay significativa diferencia entre ambos sexos, se puede emplear en la experimentacin ratas machos, hembras y ambos sexos, los valores del NPU no sern alterados. (7) Nmero de animales.-16 ratas en edad de destete ,8 ratas ser alimentados con la para ser

alimentados con la muestras de ensayo (4 para cada una),cuatro ratas para dieta aproteica y cuatro para ser alimentado con casena que sirven como grupo control. (7) Periodo de experimentacin.-Es de 10 das despus de este tiempo los

animales son sacrificados y el nitrgeno de las caracasa es analizado. (7) Antes de empezar a experimentacin se dar a los animales una dieta de estock o de acostumbramiento con la finalidad de que todos empiecen el ensayo en las mismas condiciones en cuanto a alteraciones fisiolgicas de adaptacin enzimticaDebemos de distinguir los siguientes trminos: a. de los NPU Calculado.-.Se denomina cuando se obtiene a partir valores determinados de la digestibilidad y del valor biolgico.

NPU calculado=V.B X D/100

b. NPU operativo (NPU op).- Se refiere a la utilizacin de una protena en las condiciones en que realmente se consume, obtenindose experimentalmente a cualquier concentracin proteica. (7) c. NPUestandarizado (NPU est).- Es una expresin pura de la calidad de una protena, que se obtiene experimentalmente a de su peso (7) 4.5.3 Digestibilidad de las Protenas. La digestibilidad de las protenas resulta particularmente importante teniendo en cuenta que se trata de un principio nutritivo eminentemente de comportamiento plstico .Junto con el llamado valor biolgico, una concentracin proteica igual o inferior necesaria para la manutencin

12

determina la utilizacin neta proteica (NPU).Por razones de tcnica de laboratorio, cuando se trabaja con protenas se prefiere hacerlo en trminos de nitrgeno, elemento mas fcil de cuantificar y multiplicado por distintos factores (el mas comn 6.25) se puede matemticamente transformar en protena. Las protenas de los alimentos principales tienen 15% de nitrgeno, lo que explica el uso de ese factor y camia si los contenidos son mayores o menores; por ejemplo 5.97 para protenas de algunos vegetales,6.38 si provienen de la leche, etc (8) La digestibilidad de una protena teniendo en cuenta lo dicho en el prrafo precedente, es la proporcin de nitrgeno alimentario absorbido y se expresa por la formula:

A/I = (I-(F-Fk))/I = Verdadera digestibilidad

Donde: A = nitrgeno absorbido. I = nitrgeno ingerido F = nitrgeno fecal Fk = nitrgeno endgeno segregado por el intestino

Por lo tanto el Valor biolgico de las protenas es la proporcin de nitrgeno absorbido, que es retenido por el organismo, para mantener la integridad de los tejidos y permitir si fuese necesario el desarrollo y crecimiento si coincide con esa etapa de la vida. (8)

V.- FORMULACION DELA HIPOTESIS 5.1.- HIPTESIS GENERAL La harina elaborada a partir de la variedad grenadensis Urb. posee una alta calidad proteica y elevado poder de digestibilidad y funcionalidad. c

13

5.2.1 VARIABLES INDEPENDIENTES Semillas de pacae.

5.2.2 VARIABLES DEPENDIENTES Protena bruta Cantidad de de aminocidos esenciales Eficiencia proteica (PER) Utilizacin neta de protena (NPU)

VI.- EXPLICACION DEL METODO DE TRABAJO 6.1.-Lugar de ejecucin La parte primera del proyecto de caracterizacin fisicoqumica y Fitoqumica se realizar en los laboratorios de la facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Per. La etapa final de anlisis cromatogrfico (HPLC) y caracterizacin biolgica (PER, NPU) se llevara a cabo en los laboratorios de la facultad de de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina. 6.2.- Materia prima e insumos

Para el desarrollo de la investigacin se tomaran muestras aleatorias de dos variedades de Pace (Inga Grenadensis Urb e Inga benthamiana meisn) de la finca Carpa pata, ubicada en el distrito de Mazamari, del departamento de Junn (Per). Estos sern obtenidos de manera aleatoria, de acuerdo a la norma ISO 874 (muestreo de frutas y vegetales frescos). De esta muestra global por su estado fitosanitario y madurez, se seleccionaran los frutos destinados a los anlisis.
6.3.- Equipos y materiales 6.3.1.- Equipos de laboratorio Equipo de extraccin soxhlet de 250 mL Condensadores rectos

14

Campana de extraccin Equipo de filtracin al vaco de 250 mL Nevera no frost marca HACEB N/f12 10 modelo 53 N12-2 LF Balanza triple brazo marca OHAUS serie 700-800 (precisin 0.1 g), capacidad para 2610 g Horno de secado FISHER SCIENTIFIC ISOTEMP OVEN 737 G Equipo de destilacin semiautomtico para determinacin de nitrgeno Balanza analtica PRECISA XT 220 A (0.0001g precisin) . Cromatgrafo. Jaulas de metal con bebederos especiales

con

marca BUCHI modelo K314

6.3.2.- Materiales Recipientes de aluminio y acero inoxidable Cucharas Cajas de petri de 20 g de capacidad Crisoles de porcelana de 15 mL Balones de fondo plano de 100 mL Erlenmeyers de 250 mL Micro bureta de 10 mL

Tubos de ensayo de 5 mL de capacidad (1 cm de dimetro X 7 cm de longitud) Mortero Papel filtro whathman N 604 Embudo de separacin de 100 mL Embudo de caa de 9cm. de dimetro

6.3.3.- Reactivos Metanol Agua Destilada Eter de petrleo Anhdrido actico

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Solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporcin 12:3:5. Acetnica de ninhidrina al 0.25%. Ad-libitium-agua

6.4.- Mtodos de Anlisis:

6.4.1 Determinacin de las caractersticas fsicas del la semilla Se valoraran organolpticamente, el color, olor, forma, textura, as como el peso promedio, que se determin por pesaje de las muestras en la balanza. Tabla 2 Tabla 2 Caractersticas
Variedad 1 Variedad 2

Forma Peso promedio Color Textura

6.4.2 Caracterizacin Qumica de las semillas A la materia prima se le realizarn todos los anlisis en un diseo al azar, con dos repeticiones. Los mtodos a emplear se presentan en la tabla 3.

TABLA 3. Mtodos analticos para caracterizacin de las semillas del Pacae (Inga edulis mart) DETERMINACION Humedad METODO Desecacin a 100- 105 C en estufa a presin constante hasta peso constante Ceniza Extracto etreo Protena bruta Fibra bruta Extracto no nitrogenado (NNP) Calcinacin a 550 C, por 4 horas Soxhlet, por 4 horas Kjeldahl Mtodo Weende Por diferencia

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En la tabla 4 se mostrarn los resultados del anlisis qumico y caracterizacin de los componentes nutricionales principales de la semilla del fruto del pacae (Inga edulis mart) .Debido a que la mitad del contenido de la semilla es agua, es de vital importancia realizar un proceso de secado para evitar el deterioro del material por ataque de microorganismos e incrementar la vida til del producto. Como se puede observar este proceso adems concentra los macro nutrientes y su inters nutricional.

TABLA 4. Anlisis Qumicos realizados a las semillas secas del pacae (g/100g) Contenido base Humedad Determinacin variedad 1 variedad 2 Humedad Ceniza Protena* Fibra Grasa ENN (Extracto no nitrogenado) *factor utilizado 5.7 6.4.4 Pruebas Cualitativas fitoqumicas Las pruebas se realizaran por triplicado a la materia prima. 6.4.4.1 Preparacin de la muestra: Se tomaran 10g de semilla deshidratada, se maceraran en un mortero y se aadirn 30 mL de ter de petrleo y 30 mL de una mezcla de 9:1 de metanol-agua; la mezcla se dejara por variedad 1 variedad 2 Contenido base seca

17

espacio de 15 minutos, se filtrara y posteriormente se separaran la fase acuosa de la fase etrea, en un embudo de separacin. 6.4.4.2 Saponinas: Se tomara 1 ml de la fraccin de metanol- agua del proceso anterior y se aadirn 9 ml de agua. Se filtrara y se transvasara 1 ml del filtrado a un tubo de ensayo, se agit vigorosamente por 30 segundos y se dej en reposo durante 15 minutos. La presencia de saponinas, se establecer de acuerdo a la espuma sobrenadante y su altura en la muestra. Los resultados, se interpretaran segn los siguientes parmetros: TABLA 5. Nivel del contenido de saponinas Altura (mm) Contenido de saponinas 5-9 10-14 Mayor a 15 Menor a 5 Bajo Moderado Alto Prueba negativa

6.4.4.3 Fenoles: A cinco tubos de ensayo de 5 mL, se adicionaran a cada uno, tres (3) gotas de la fraccin metanlica-agua, posteriormente se aadi, tres (3) gotas de agua destilada con lo que se logr un color amarillo. Uno de los tubos se dejar como testigo y a los restantes se ira adicionando respectivamente una, dos, tres, cuatro, gotas de cloruro frrico (5%) La caracterizacin de fenoles se hace de acuerdo a la coloracin as:

Ninguna reaccin (no cambia de color) = no hay presencia de fenoles o taninos.

Cambio en el color azul oscuro = fenoles o taninos piroglicos (hidrosolubles). Cambio de color a verde oscuro = fenoles o taninos de tipo catecol (flavonoides o taninos concentrados).

18

6.4.4.4 Esteroides (prueba de Lieberman-Buchard): Se colocar 1 mL de la fraccin no polar (capa de ter de petrleo) en un crisol; se evaporar casi hasta sequedad y se adicionaran tres (3) gotas de cloroformo. Luego se secaran en campana de extraccin y se adicionaran dos (2) Prueba Resultado muestra 1 Resultado muestra 2 Saponinas Esteroides Fenoles gotas de anhdrido actico seguido por una gota de cido sulfrico concentrado. Los cambios de color indican: Azul o verde = esteroides Rojo, rosado o violeta = triterpenos Amarillo plido = esteroides o triterpenos saturados

En la tabla 6 se presentaran los resultados de las pruebas realizadas Para las dos muestras de pepas de pacae. TABLA 6. Resultados de pruebas fitoqumicas

Si se presentaran pruebas positivas para esteroides y fenoles, se realizaran estudios fitoqumicos posteriores para las pruebas positivas, que permitirn corroborar, la presencia de este tipo de sustancias cuantitativamente, que pueden ser un factor de interferencia en la asimilacin de nutrientes. 6.4.5 ANLISIS DEL CONTENIDO DE AMINOCIDOS POR HPLC EN LAS DOS HARINAS

19

A continuacin, se incluye un protocolo tpico del anlisis de harinas: - Dejar a reflujo las muestras con HCl 6N durante 24 horas. -Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio. - Aadir agua y evaporar a sequedad.

aminocidos en

- Realizar el examen cromatogrfico de las soluciones problemas al las muestras tratadas en solucin acuosa de isopropanol a 10%. - El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporcin 12:3:5. - Soporte papel Whatman n1. - Longitud del papel 50 cm. - Mtodo cromatogrfico descendente. - Duracin: 12 horas. - Solucin reveladora: solucin acetnica de ninhidrina al 0.25%. - Condiciones de revelado: 20 min a 105C.

10% de

- Comparacin frente a muestras puras de clorhidratos de aminocidos.

6.4.6

METODOS BIOLGICOS PARA LA EVALUACION DE LA PROTEICA DE LAS HARINAS 6.4.6.1 RELACIN DE EFICIENCIA PROTEICA (PER) Se cogeran 30 ratas ,20 de ellas para ser estudio(10 en cada

CALIDAD

alimentadas

con

nuestras harinas en

tipo) y las otras 10

restantes con las raciones que contienen casena. Se pesaran cada rata y se colocaran en una jaula independiente y se anotaran inmediatamente en las hojas de registro. El peso promedio de los 3 grupos de ratas de menos 5 gramos. Administrar a cada rata del grupo del problema 10 gramos de la dieta con las harinas en estudio, en los primeros das ,sucesivamente 15 gramos,20 gramos, etc.

20

Administrar a cada rata del grupo control,10 gramos de la dieta preparada con casena los primeros das, sucesivamente 15 gramos,20 gramos.

Administrar Ad-libitium agua en unos bebedores preparados de frascos con tubos de vidrio y tapn de jebe.

Alimentar a las ratas por un periodo de 4 semanas.

Registrar el peso de cada rata semanalmente ,el consumo y desperdicio de alimentos diariamente y anotar en la ficha de control correspondientemente.

Calculamos el PER

PER = Ganancia en peso promedio/protena consumida promedio

Esto para cada animal y se calcula un promedio para cada grupo de protena. Los resultados se muestran como:

PER del alimento control (Casena) PER del alimento en estudio (Muestras) El PER de los alimentos en estudio se respecto al PER de la casena, segn: Comparacin= (PER Alimento/PER Casena) X 100 Segn la FAO un PER para considerarse alto, es decir de alta calidad proteica debe ser mayor o igual a 80% respecto al PER de la casena. 6.4.6.2 UTILIZACIN NETA DE LA PROTENA: Pesar 12 ratas de 21 a 23 das de edad de ambos sexos para ser compara con

alimentados con las harinas y cuatro con la dieta aproteica.

21

Colocar

cada

rata en una

jaula y

suministrar

una

dieta

de

acostumbramiento Administrar Ad-libitium agua en unos bebedores preparados de frascos con tubos de vidrio y tapn de jebe. A partir del quinto da suministrar a 8 ratas la dieta preparada con el alimento (4 para cada tipo de harina) y a 4 ratas la dieta que no tiene protena, previamente pesado, durante un periodo de 10 das Despus sacrificar a los animales ,abrir el crneo ,la cavidad torxica y los residuos del tubo digestivo Pesar el cuerpo de los animales, secar la carcaza a 105 C por 48 h.

Pesar el animal seco y moler con todo el pelo, homogenizar y luego sacar una alcuota para determinar protena

Determinaremos entonces la protena con el mtodo kjetdahl.

Sacar

promedio

de

nitrgeno

de

la

carcasa de

los

animales

alimentados(Cp) con la dieta de las harinas y el promedio de las cuatro ratas alimentadas con la dieta que no contiene protenas(Co). NPU = Cp-Co I I = Nitrgeno ingerido Con la formula de NPU hallar NPU1 Y NPU2. x 100

6.5.- Metodologa Experimental: 6.5.1.- Descripcin del diagrama de flujo:

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Se seleccionaran las materias primas de las dos variedades de pacae para obtener sus respectivas semillas y analizar las humedades, cenizas, extracto seco, protena bruta, extracto no nitrogenado. Se tendr en cuenta variedad de pacae y el estado de madurez de dicha leguminosa. la

Se proceder a secar dichas semillas previo un tratamiento trmico de 89 C, cuando estas estn completamente secas se realizaran las pruebas cuantitativas fitoqumicas de saponinas, fenoles y esteroides.

Despus de esta etapa se elaboraran harinas de dichas variedades de pepas para luego analizarlas cromatograficamente (HPLC) y determinar su composicin de aminocidos.

Como paso final caracterizaremos biolgicamente estas harinas para ver su valor biolgico y compararlas.

Materia Prima Clasificacin y Seleccin Lavado Tratamiento Trmico (89C) Secado o deshidratado (50-60C) Molienda Tamizado

23

Harina

6.5.2

Esquema Experimental :

Se elaboro el siguiente diagrama experimental de elaboracin de harinas de pepa de pacae (Inga edulis mart) para su respectiva evaluacin y caracterizacin proteica nutricional.

24

6.5.2.- Diseos experimentales: 6.5.2.1 Diseo experimental para la caracterizacin fisicoqumica de las pepas de las dos variedades con tres repeticiones:

Base Seca Muestra 1 N de Rep 1 2 3 H C PB F G ENN H C PB F G ENN H Muestra 2

Base hmeda Muestra 1

Muestra 2

C PB F

G ENN H

C PB F

G ENN

Donde H= Humedad C= Ceniza PB=Protena Bruta

25

 6.5.2.2

G=Material graso ENN=Extracto no nitrogenado

Diseo experimental para la caracterizacin fitoqumica de las pepas secas de pacae con tres repeticiones:
VARIEDAD 1 VARIEDAD 2 Saponinas Fenoles Esteroides

N repet. 1 2 3

Saponinas

Fenoles

Esteroides

6.5.2.3 Diseo experimental para el PER de las Harinas obtenidas: PARA CASEINA (PATRON)
N de ratas Peso inicial 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana Consumo de Casena GP (Ganancia en Peso) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CP (Consumo de Protena)

Para Harina 1
N de ratas Peso inicial 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana Consumo de alimento GP (Ganancia en Peso) CP (Consumo de Protena)

1 2 3

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4 5 6 7 8 9 10

Para Harina 2
N de ratas Peso inicial 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana Consumo de alimento GP (Ganancia en Peso) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CP (Consumo de Protena)

6.5.2.4 Diseo experimental para el NPU:

PARAMETROS Nmero de animales Contenido de nitrgeno promedio (g) de la carcasa (Nitrgeno corporal). Contenido de (g) de nitrgeno las dietas

HARINA1 (PROTEINA)

HARINA 2(PROTEINA)

DIETA APROTEICA

(Nitrgeno ingerido). NPU

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6.5.2.5 Cuadro de comparacin Muestras NPU PER

Harina de variedad 1

Harina de variedad 2

28

VII.- CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Tiempo Estimado : 11 Meses

29

1mes

2mes

3mes

4mes

5mes

6mes

7mes

8mes

9mes

10mes

11mes

12mes

Recoleccin de la materia prima Seleccin clasificacin y pelado Anlisis fisicoqumico de las pepas Secado y deshidratado Anlisis Fitoqumico Molienda y tamizado Anlisis Cromatogrfico de la harina PER de la Harina NPU de la Harina
Impresin, Encuadernacin y empastado Otros

X X X X

X X X X

VIII.- PRESUPUESTO
CODIGO 05 ASIGNACION DE GASTO DENOMINACION GASTOS CORRIENTES IMPORTE EN S/. 2 500,00

30

05.03 05.03.20 05.03.20.01 05.03.30 05.03.30.01 05.03.30.02 05.03.32 05.03.32.01 05.03.33 05.03.33.01 05.03.39 05.03.39.01 05.03.39.02 05.03.39.03 05.03.46 05.03.46.01 05.03.49 05.03.49.01 05.03.52 05.03.52

BIENES Y SERVICIOS VIATICOS Y FLETES Viticos BIENES DE CONSUMO Jaulas y Bebederos Material Biolgico (Ratas) PASAJES Y GASTOS DE TRANSPORTE Pasajes SERVICIO DE CONSULTORIA Asesoria OTROS SERVICIOS DE TERCEROS Impresin, Encuadernacin y empastado Refrigerio Fotocopiados INSUMOS DE LABORATORIO Reactivos MATERIALES DE ESCRITORIO Materiales de Escritorio Diversos ALQUILER DE BIENES MUEBLES Alquiler de Equipos de Laboratorio (Corridas de HPLC) TOTAL

2 500,00 200,00 200,00 500,00 350,00 150,00 150,00 150,00 100,00 100,00 850,00 400,00 100,00 350,00 150,00 150,00 100,00 100,00 450,00 450,00

2 500,00

IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1. BRACK, E.W. Experiencias tradicionales y posibilidades de desarrollo en Selva Central In: (Prez, C.O. de.). Actas del Curso Taller sobre Agroforestera Tropical, San Ramn. INADE, Lima. 1984. 2. Portal Agrario [base de datos en lnea] .Per: Recursos naturales [fecha de acceso 1 de septiembre de 2006]. Disponible en:

http://www.minag.gob.pe/rrnn_guaba.html. 3. Duque de James A. Manual de las cosechas de energa; 1983 [en lnea] [fecha de acceso 15 de septiembre de 2006]. Disponible en:

http://www.minag.gob.pe/rrnn_guaba.html.

31

4. Dr. Lus G. Elas. Notas tcnicas del Instituyo de Nutricin de Centro Amrica (INCAP).Editorial Panam. Panam; 2000. 5. Msc. Clara espinoza Silva. Manual de Tecnologa de Cereales y

Leguminosas UNCP. Huancayo; 2002. 6. Monografias.com [en lnea]. Anlisis del contenido de Aminocidos en Alimentos Con Fines Nutricionales; 2006. [fecha de acceso 30 de octubre del 2006].URL disponible: ttp://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.html. 7. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) [en lnea]. BrooKhaven

national Laboratory [fecha de acceso 5 de octubre del 2006].URL disponible en:

www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/hplcmytry.html 8. .Jc.Cheftel-Jl CUQ-D. Larrent. Protenas Alimentarias. Editorial Acribia Espaa; 1989. 9. Rolando Salinas. Alimentos y Nutricin. Bromatologa aplicada a la salud. Editorial el ateneo. Buenos aires-Argentina; 1988.

ANEXOS
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CROMATOGRAFA LQUIDA DEL ALTO RENDIMIENTO (HPLC): UNA GUA DE LOS USUARIOS El HPLC es un mtodo de anlisis popular porque es fcil aprender y utilizar y no es limitado por la volatilidad o la estabilidad del compuesto de la muestra. La seccin de la historia ilustra la evolucin del HPLC a partir de los aos 70 a los aos 90. El HPLC moderno tiene muchos usos incluyendo la separacin, la identificacin, la purificacin, y la cuantificacin de varios compuestos. Es importante para sos que usan HPLC para entender la teora de la operacin para recibir el anlisis ptimo de sus compuestos. Para sas interesadas al comprar o usar un HPLC hemos incluido una lista de fabricantes, gua de localizacin de averas, asistencia tcnica, y una bibliografa a la ayuda reduce tu investigacin personal y tiempo el referirse. Una vez que hayas terminado la teora de la operacin, te calificarn tomar un concurso )/rpido para probar tu comprensin de los sistemas del HPLC. (5)

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Historia del HPLC : Antes de los aos 70, pocos mtodos cromatogrficos confiables eran disponibles en el comercio al cientfico del laboratorio. Durante los aos 70, la mayora de las separaciones qumicas fueron realizadas usando una variedad de tcnicas incluyendo la cromatografa de la abrir-columna, la cromatografa de papel, y la cromatografa de capa delgada. Sin embargo, estas tcnicas cromatogrficas eran inadecuadas para la cuantificacin de compuestos y de la resolucin entre los compuestos similares. Durante este tiempo, ejercer presin sobre la cromatografa lquida comenz a ser utilizado disminuir tiempo del flowthrough, as reduciendo tiempos de la purificacin de los compuestos que son aislados con chromatogaphy de la columna. Sin embargo, los ndices de corriente eran inconsistant, y la cuestin de si era mejor tener caudal constante o presin constante fue discutida. (Qum. analtica vol. 62, no 19, 1 Oct de 1990). (5)

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La cromatografa lquida de alta presin fue desarrollada en los mediados de los aos setenta y mejorada rpidamente con el desarrollo de los materiales de embalaje de la columna y la conveniencia adicional de detectores en lnea. En los ltimos aos 70, los nuevos mtodos incluyendo la cromatografa lquida de la fase reversa permitieron la separacin mejorada entre los compuestos muy similares. Por los aos 80 el HPLC era de uso general para la separacin de compuestos qumicos. Las nuevas tcnicas mejoraron la separacin, la identificacin, la purificacin y la cuantificacin lejos sobre las tcnicas anteriores. Las computadoras y la automatizacin agregaron a la conveniencia del HPLC. Mejoras en el tipo de columnas y reproductibilidad fueron llevadas a cabo as mientras que los trminos tales como microcolumna, columnas de la afinidad, y HPLC rpido comenzaron al immerge. La ltima dcada ha considerado una empresa extensa en el desarrollo de las microcolumnas, y otra especializ columnas. Las dimensiones de la columna tpica del HPLC son: XXX milmetro en longitud con un dimetro interno entre 3-5 milmetros. El dimetro generalmente de microcolumnas, o las columnas capilares, se extiende a partir del m el 3 al m 200. El HPLC rpido utiliza una columna que sea ms corta que la columna tpica, con una longitud de cerca de 3 milmetros desea, y l se embala con partculas ms pequeas. (5) Actualmente, uno tiene la opcin de considerar tipos excesivos del x# de columnas para la separacin de compuestos, tan bien como una variedad de detectores interconectar con el HPLC para conseguir el anlisis ptimo del compuesto. Esperamos que esta revisin proporcione una referencia que todos los niveles de los usuarios del HPLC puedan encontrar respuestas rpidas a sus problemas del HPLC. Aunque el HPLC se considera extensamente ser una tcnica principalmente para la investigacin biotechnological, biomdica, y bioqumica as como para la industria farmacutica, estos campos corrently abarcan el solamente cerca de 50% de usuarios del HPLC. (Qum. analtica vol. 62, no 19, 1 Oct de 1990). El HPLC es utilizado actualmente por una variedad de campos incluyendo los cosmticos, la energa, el alimento, y las industrias ambientales. (5)

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Tendencias del futuro: El HPLC continuar siendo una de las tcnicas ms importantes de la separacin del laboratorio para los propsitos analticos y preparatorios. La biotecnologa y las ciencias de vida es donde estar un procedimiento el HPLC crucial. Las compaas de la biotecnologa utilizarn HPLC para continuar probando al gobierno que sus productos son no txicos, puros, y activos. Las columnas rpidas y del microbore sern importantes en el analtico y masa-escalan los usos preparatorios para los biologicals y los productos heterologously expresados del gene. Las tcnicas de la afinidad y del immunoaffinity sern utilizadas ms con frecuencia para la produccin de productos farmacuticos biotechnological debido a la necesidad del ultrapurification para quitar todo el material indeseado de la clula huesped. El HPLC continuar siendo el apoyo principal en la purificacin y la separacin de protenas, de peptides, y de nucleotides. Columnas analticas ms pequeas sern necesarias traz el genoma humano. La necesidad de columnas chiral de la separacin de una capacidad ms exacta y ms alta ser necesitada por las compaas farmacuticas para optimizar eficacia en la masa-produccin de compuestos enantiomeric activos. La especializacin en mtodos de la deteccin y de la identificacin aumentar de importancia. Esto implicara la supervisin de agentes contaminadores ambientales, usando el embalaje especial del chelate para detectar los contaminantes del metal en el agua, desarrollando separaciones rpidas para supervisar mtodos rpidos de la fermentacin, y el convertirse en la identificacin de virus y de bacterias. HPLC-MS ser importante en medicina forense y tableros que gobiernan atlticos. El uso de HPLC-MS permitir que los ciertos anlisis y evidencia estn parados para arriba ante el tribunal. El HPLC solamente o conjuntamente con otros mtodos puede supervisar para las drogas en atletas. La silicona era la resina/la ayuda de los aos 80; posiblemente, las resinas orgnicas tomarn vuelo en aos para venir puesto que son unreactive, ellas funcionan en una amplia gama de pH, reproductibilidad son favorables, pueden ser stereoselective, y pueden ser utilizadas con SEC (Knox, 1989). La cromatografa de Polytyptic aumentar de renombre al igual que los lasers debido a su selectividad y sensibilidad crecientes. Los detectores de la dispersin ligera pueden manar substituyen los detectores de RI en el futuro. Los detectores mltiples por sistema son un possiblity y la optimizacin originada en ordenador de

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las condiciones del HPLC aumentar y guardar paso con el movimiento del conocimiento de informtica.(5) Usos para el HPLC: (5) El HPLC preparatorio refiere al proceso del aislamiento y a la purificacin de compuestos. Importante es el grado de pureza del solute y del rendimiento de procesamiento, que es la cantidad de compuesto producida por tiempo de la unidad. Esto diferencia de HPLC analtico, donde est obtener el foco la informacin sobre el compuesto de la muestra. La informacin que puede ser obtenida incluye la identificacin, la cuantificacin, y la resolucin de un compuesto. Las separaciones qumicas se pueden lograr usando HPLC utilizando el hecho de que ciertos compuestos tienen diversas tarifas de la migracin dadas una columna particular y una fase mvil. As, el chromatographer puede separar compuestos (ms en separaciones chiral) de uno a que usa HPLC; el grado o el grado de la separacin es determinado sobre todo por la opcin de la fase inmvil y de la fase mvil. La purificacin refiere al proceso de separar o de extraer el compuesto de la blanco de otro (relacionado posiblemente estructural) los compuestos o los contaminantes. Cada uno compuesto debe tener un pico caracterstico bajo ciertas condiciones cromatogrficas. Dependiendo de qu necesidades de ser separado y cmo de cerca est relacionado las muestras ser, el chromatographer puede elegir las condiciones, tales como la fase mvil apropiada, para permitir que la separacin adecuada para recoger o para extraer el compuesto deseado mientras que se enjuaga a partir de la fase inmvil. La migracin de los compuestos y los contaminantes a travs de la columna necesitan diferenciar bastante para poder ser recogido o extraer el compuesto deseado puro sin incurrir en ningn otro compuesto indeseado.

La identificacin de compuestos de HPLC es una parte crucial de cualquier anlisis del HPLC. Para identificar el compuesto de HPLC un detector debe primero ser seleccionado. Una vez que el detector se seleccione y se fije a los ajustes ptimos de la deteccin, un anlisis de la separacin debe ser desarrollado. Los parmetros de este anlisis deben ser tales que un pico limpio de la muestra sabida

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est observado de la cromatografa. El pico que identifica debe tener un rato razonable de la retencin y se debe separar bien de picos extraos en los niveles de la deteccin que el anlisis ser realizado. Para alterar la poca de la retencin de un compuesto, varios parmetros pueden ser manipulados. El primer es la opcin de la columna, otra es la opcin de la fase mvil, y pasada es la opcin en caudal. Todos estos asuntos se repasan detalladamente en este documento. Identificar un compuesto de HPLC es lograda investigando la literatura y por ensayo y error. Una muestra de un compuesto sabido se debe utilizar para asegurar la identificacin del compuesto desconocido. La identificacin de compuestos puede ser asegurada combinando dos o ms mtodos de deteccin. La cuantificacin de compuestos de HPLC es el proceso de determinar la concentracin desconocida de un compuesto en una solucin sabida. Implica el inyectar de una serie de concentraciones sabidas de la solucin compuesta estndar sobre el HPLC para la deteccin. La cromatografa de estas concentraciones sabidas dar una serie de picos que correlacionen a la concentracin del compuesto inyectada. (5)

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