Tema 10.

Replicacin, transcripcin y traduccin

Bioqumica

TEMA 10

REPLICACIN, TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN

1. Introduccin En este tema estudiamos el metabolismo de los cidos nucleicos y la sntesis de protenas, explicaremos como la informacin gentica se transmite de una generacin a otra con absoluta fidelidad, pero a la vez que permite pequeos cambios en el material gentico para que tenga lugar la evolucin. Y descubrimos como esta informacin gentica se transcribe a ARNm y se expresa en ltimo lugar en la secuencia de aminocidos de una asombrosa variedad de molculas protecas. Mientras que en las reacciones del metabolismo intermediario solo la estructura tridimensional de la enzima condiciona la reaccin, los substratos o inhibidores que actuarn. Las reacciones que encontramos en el metabolismo de la informacin gentica, se caracterizan por la necesidad de un molde que acta junto a la enzima, para especificar la reaccin catalizada. 2. El ADN como portador de la informacin gentica Ya en el S XIX se conoca que en el ncleo celular haba una sustancia, la nucleina, formada por una parte cida (hoy ADN) y una parte bsica (hoy protena). Pero fue entre 1944 y 1952, cuando una serie de experimentos cruciales apuntaron claramente al DNA como el material gentico. Antes de esta fecha los cidos nucleicos se consideraban demasiado simples, estaban formados simplemente por 4 clases de monmeros y se consideraron simplemente como una sustancia estructural del ncleo

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celular. Se consideraba ms probable que los genes estuvieran formados por protenas, que eran molculas mucho ms complejas En 1944 Avery y sus colaboradores descubrieron que el ADN extrado de cepas patgenas de la bacteria Streptococcus Pneumoniae poda transferirse a cepas no patgenas, transformndolas en patgenas. Este experimento consista en inocular ratones con clulas de pneumococcus (S) patgenas que moran y clulas (R) no patgenas que permitan que el ratn permaneciera vivo. Si las bacterias patgenas (S) se sometan a calentamiento perdan su virulencia. Si se incubaban las bacterias no patgenas (R) con ADN extraido de las bacteras patgenas, y se inoculaban los ratones con estas bacterias, los ratones moran. Parece como si la cepa no virulenta recibiera algo de las bacterias patgenas. Avery y sus colegas concluyeron que el DNA extrado de la estirpe virulena portaba el mensaje hereditario de la virulencia. Algunos cientficos mantenan que las protenas presentes en el DNA como impurezas podran ser responsables de este cambio gentico. Esta posibilidad fue eliminada al encontrar que el tratamiento del DNA con ezimas proteolticas no destruia las propiedades transforadoras del ADN, mientras que el tratamiento con nucleasas si lo haca.

Un segundo experimento independiente proporcion la evidencia definitiva. Hersey and Chase (1952) demostraron, mediante el experimento de la batidora, el papel del ADN. Para esto usaron en fago T2, que solo tiene ADN y las protenas de la cpsida. Marcaron radioactivamente dos muestras de fago T2. En el primer caso las protenas del fago T2 con S35 y en segundo el ADN con P32 (las protenas no tienen P y los nucleicos no tienen S). Estas muestras se usaron para infectar muestras separadas de bacterias. Las suspensiones bacterianas se agitaron con una batidora y las capsidas se separaron de las bacterias por centrifugacin. Solo las bacterias infectadas con virus marcados con P32 tenan radiactividad, indicando que era el ADN el agente infectante. En el otro caso la radiactividad quedaba en el sobrenadante donde estaban las cpsidas marcadas con S35 3. Herencia y replicacin del ADN El ADN posee la informacin necesaria para transmitir los caracteres de una especie de generacin en generacin y conseguir la supervivencia de la especie. Por lo tanto la molcula de ADN constituye la base qumica de la herencia. La mayora de las
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molculas de ADN se encuentran en los cromosomas del ncleo de las clulas. El nmero de cromosomas depende de la especie, as por ejemplo, las bacterias poseen un nico cromosoma, mientras que las clulas humanas poseen 46 (23 de cada progenitor). La informacin gentica en forma de ADN se organiza estructuralmente dentro del cromosoma arrollndose alrededor de ciertas protenas (histonas) constituyendo asociaciones ADN-protena denominadas nucleosomas (Figura 1). Las cadenas de ADN de cada especie difieren en longitud y en la secuencia de las bases nitrogenadas, de tal manera que esta secuencia contiene la informacin gentica caracterstica de cada especie. La informacin gentica debe reproducirse exactamente cada vez que la clula se divide. El proceso por el que las molculas de ADN se copian a si mismas en el ncleo de las clulas recibe el nombre de replicacin del ADN. La replicacin pretende a partir de una cadena de ADN obtener dos iguales.

Figura 1. Organizacin estructural del ADN en el cromosoma.

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3.1. Principales caractersticas de la replicacin Las caractersticas principales del proceso son: su carcter semiconservador, la realizacin simultanea en ambas hebras, de forma secuencial y con carcter bidireccional y origen monfocal (procariotas) o multifocal (eucariotas). Semiconservador. Es decir cada hebra sirve como molde para la sntesis de una nueva cadena, produciendo dos nuevas molculas de ADN, cada una con una de las hebras viejas y una nueva hebra hija. Esta hiptesis fue propuesta pro Watson and Crick poco despus de la publicacin del modelo de la doble hlice, y fue probado definitivamente por los ingeniosos experimentos diseados por Meselson and Stahl en 1957. Solo caben tres posibles hipteisis para explicar el mecanismo de la repiclacin: conservadora (las dos hebras se copiaran para dar una nueva molcula, de forma que el ADN progenitor permanece intacto y el ADN hijo tendra dos hebras nueva), dispersante (el ADN progenitor se rompera antes de que se sintetizaran los nuevos fragmentos de ADN, estos luego se uniran a los fragmentos originales para dar ADN hijos con fragmentos tanto nuevos como de las dos hebras del progenitor) y semiconservadora (Las dos nuevas molculas de ADN formadas tienen cada una una hebra vieja y una hebra nueva). Meselson and Stahl cultivaron clulas de E.coli en medio con N15 (istopo pesado de N14) durante muchas generaciones, hasta que todo el ADN de E. coli estuviera marcado con N15. El ADN aislado de estas clulas tena una densidad un 1% mayor que el ADN normal con N14. Esta pequea diferencia puede apreciarse en una centrifugacin en gradiente de densidad CsCl. Las clulas de E. coli cultivadas con N15 se transfierieron a medio fresco con N14, y se dejaron crecer durante el tiempo suficiente para que la poblacin se duplicara. El ADN aislado de estas clulas formaba una sola banda en la centrifugacin en gradiente. Esto eliminaba al hiptesis de la replicacin conservadora. Si las clulas de E. coli se dejaban en el medio fresco con N14 durante dos generaciones se observaban en la centrifugacion en gradiente dos bandas. Una con la densidad

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correspondiente al ADN ligero y otra con la densidad del ADN mixto obtenido en la primera generacin. Esto descartaba tambin la hiptesis dispersante y confirmaba la replicacin semiconservativa como la nica hiptesis posible. Bidireccional. La separacin de las hebras progenitoras que comienza en cada origen de replicacin progresa en ambas direcciones. Los puntos de transicin entre la doble hebra y las hebras sencillas se llaman horquillas de replicacin y van alejndose entre si. Estos datos se obtuvieron utilizando el marcaje isotpico del ADN con Titrio H3. El ADN marcado, aislado y expuesto a una emulsin fotogrfica durante semanas poda fotografiarse. Si el titrio se aadia durante un corto perodo de tiempo y la reaccin se paraba observando los autoradiogramas poda observarse que el ADN marcada apareca a ambos lados de la horquilla de replicacin. El inicio de la replicacin en procariotas es monofocal, comienza siempre en un punto determinado del cromosoma circular denominado origen (ORI). La replicacin progresa formando dos horquillas de replicacin. Por el contrario en eucariotas la replicacin es multifocal, pues en cada cromosoma existen mltiples orgenes de replicacin (cientos o miles) que dan lugar a un nmero doble de horquillas de replicacin. Esto permite completar la replicacin de los cromosomas en un tiempo razonable. Esto puede visualizarse mediante microscopia electrnica. Vemos como la replicacin de un cromosoma circular se inicia un punto en concreto y es simultanea (las dos hebras se replican a la vez). Semidiscontinuo. Como veremos ms adelante la sntesis de la nueva cadena tiene siempre lugar en el sentido 5`-3`, siendo el grupo 3`OH el punto por el cual el ADN es elongado. Esto es vlido para todas las polimerasas tanto la ADN como las ARN polimerasas. Si las dos hebras son antiparalelas, como pueden las dos hebras ser sintetizadas de manera continua mientras progresa la horquilla de replicacin. La solucin que la clula adopta ante este problema fue descubierta por Okazaki. Que descubri que una de las hebras era sintetizada en pequeos fragmentos llamados fragmentos de okazaki. Por lo tanto una de las hebras es sintetizada de forma continua, y la otra de forma discontinua. La longitud de los fragmentos de okazaki

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puede variar desde unos cientos de nucletidos hasta unos miles, segn el tipo de clula.

3.2. Pasos de la replicacin del ADN en eucariotas La replicacin se lleva a cabo gracias a la ADN polimerasa III, esta enzima cataliza la unin de los desoxinucletidos trifosfato que son abundantes en el fluido del ncleo celular. Estos desoxinucletidos trifosfato se desplazan hacia la parte desenrollada de la molcula de ADN y se colocan por complementariedad enfrente de la base que les corresponde (A=T; C=G) de la cadena que acta como molde, y una vez que estn en el sitio adecuado se unen entre si por accin de la polimerasa III. La adicin de dos unidades nucletidicas consecutivas tiene lugar mediante la unin del grupo hidroxilo del carbono 3`de un nucletido con el grupo fosfato del extremo 5`del siguiente. El mecanismo por el que se produce esta unin es un ataque nucleoflico del grupo 3`-OH de un nucletido al 5`-trifosfato del nulcetido adyacente, eliminndose el pirofosfato y formndose un enlace fosfodister. La polimerasa lee la hebra que hace de molde en el sentido 3` 5` y sintetiza la nueva hebra en el sentido 5` 3`. Esta enzima necesita para iniciar la sntesis un pequeo fragmento de nucletidos que denominamos cebador. En la sntesis del cebador interviene un tipo de ARN polimerasa denominado primasa. Durante el proceso de replicacin, una de las cadenas madre se lee bien (en sentido 3` 5`) y, por lo tanto, la nueva cadena se sintetiza de corrido (hebra conductora), pero la otra est dispuesta en sentido contrario al que la polimerasa puede leer (hebra retardada). La solucin a este problema es sintetizar la cadena en pequeos fragmentos en el sentido 5` 3`. Los cebadores son luego eliminados por la accin exonucleasa de la ADN polimerasa tipo I y los nuevos fragmentos resultantes son unidos por la accin de la ligasa, que elimina las mellas que quedan entre fragmentos. La secuencia de pasos implicados la replicacin del ADN puede resumirse como sigue (Figura 2): Apertura de la doble hlice del ADN por accin de las helicasas. Sintesis de los cebadores para que la ADN polimerasa pueda actuar. Las enzimas implicadas denominan primasas. Se inicia la polimerizacin por accin de la ADN polimerasa III Cuando se alcanza el cebador del fragmento sintetizado anteriormente la Polimerasa I sustituye a la Pol III y, haciendo uso simultneo de sus actividades

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exonucleasa (degradadadora de nucletidos) y polimerasa, va sustituyendo los cebadores por el ADN correspondiente. Las ligasas cierran las mellas que hay entre cada dos fragmentos.

Figura 2. Visin general del proceso de replicacin del ADN.

4. Transcripcin y ARN La transcripcin consiste en la formacin de una molcula de ARN a partir de la informacin gentica contenida en un segmento de ADN. Es decir da lugar ana copia de ARN con secuencia complementaria y antiparalela, a partir de una secuencia molde en una de las hebras del ADN. Mientras que en la replicacin se copia el cromosoma entero, la transcripcin es ms selectiva. En un momento dado solo son transcritos ciertos genes o grupos de genes. La clula restringe la expresin de la informacin gentica a la formacin de los productos gnicos necesarios en cada momento, en un proceso finamente regulado por secuencias reguladoras especificas que indican el principio y el fin de los segmentos que deben ser trascritos. Estos procesos regulatorios sern estudiados con detalle en el tema siguiente.

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Existen tres clases principales de ARN. El mensajero que codifica la secuencia de amincidos de uno o ms polipptidos especificados por un gen. El ARN trasnferente que lee la informacin codificada en el ARNm y transfiere el amonicido adecuado a la cadena polipptidica en crecimiento durante la sntesis proteica y el ARN ribosmico que forma parte de los ribosomas, las complejas maquinarias celulares donde se sintetizan las protenas. El proceso empieza cuando la ARN polimerasa se une a unas secuencias especficas llamadas promotores. La doble hlice del ADN se desenrolla formado el bucle de transcripcin (unos 17 nucletidos) para servir de molde para la sntesis del ARN, de tal manera que solamente una de las dos cadenas es la que transcribe la informacin al ARN. La cadena de ADN que sirve de molde se denomina cadena molde, mientras que la complementaria se llama cadena codificante, identica en secuencia de bases al ARN transcrito excepto que la timina es sustituida por uracilo. Los ribonucletidos trifosfato existentes en el fluido celular (ATP, GTP, CTP y UTP) se desplazan hacia la parte desenrollada de la doble hlice del ADN y se sitan complementando la cadena (T=A; A=U; C=G). Cuando estos nucletidos se encuentran adecuadamente situados se unen entre si por accin de la enzima ARNpolimerasa (en el sentido 5` 3`). Finalmente, el ARN se separa y el ADN recupera la estructura de doble hlice. El ARNm as formado sufre pocas modificaciones en el caso de los procariotas, pero sufre importantes modificaciones postranscripcionales en el caso de los eucariotas, eliminndose los intrones (secuencias del genoma que no codifican nada), formando as el ARNm maduro que se traducir en protenas. El ADN se utiliza tambin como molde para la sntesis de los otros dos tipos de ARN, el transferente y el ribosmico. Las principales diferencias entre el proceso de trancripcin en procariotas y eucariotas pueden resumirse como sigue: En procariotas no hay separacin fsica entre transcripcin y traduccin, mientras que en los eucariotas la transcripcin tiene lugar en el ncleo, donde est el ADN, y la traduccin en el citoplasma donde estn los ribosomas. En procariotas los ARNm son policistrnicos (llevan varios genes) y en eucariotas por lo general son monocistrnicos. En procariotas hay un solo tipo de ARN polimerasa, mientras que en eucariotas hay al menos 3 tipos de ARN polimeras distintas (una para cada tipo de ARN).

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En Procariotas los ARNm sufren pocas modificaciones postranscripcionales, mientras que en eucariotas sufren muchas, entre ellas la eliminacin de intrones.

Figura 3. Visin general del proceso de transcripcin del ADN.

La ARN polimerasa necesita al igual que la ADN polimerasa los cuatro nucletidos trifosfato (ATP, GTP, CTP, UTP), Mg2+ y la cadena patrn de ADN cuya secuencia determinar la del ARN, pero a diferencia de la ADN polimerasa no necesita cebador para iniciar la sntesis de la cadena (Figura 3). La ARN polimerasa al igual que la ADN polimerasa slo lee en el sentido 3` 5` y sintetiza la nueva hebra en el sentido 5` 3`. La primera etapa del proceso de transcripcin es la unin de la ARN polimerasa a la molcula de ADN; esta unin se produce por unas zonas especficas del ADN denominadas promotores, que indican a la enzima que tiene que empezar a transcribir. El reconocimiento del promotor es un paso crucial de la transcripcin, tanto en lo que se refiere al mecanismo como para la regulacin de la transcripcin, como veremos en el prximo tema. Tambin la terminacin obedece a ciertas secuencias especficas denominadas secuencias de terminacin. Los promotores son zonas especficas del ADN donde se une la ARN polimerasa para empezar la transcripcin, y dirigen la transcripcin de los genes adyacentes. Las secuencias de los promotores no son idnticas pero se han encontrado en muchas bacterias ciertas secuencias que son particularmente comunes en ciertas posiciones (secuencia consenso). Se sitan unos 10 y 35 nucletidos a la izquierda

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de donde se inicia la transcripcin y se llaman secuencia 35 o caja de entrada y secuencia 10 o caja TATA (Figura 4).

Figura 4. Visin de la regin del promotor en el ADN.

5. Cdigo gentico y traduccin. Sntesis de protenas La traduccin es un proceso muy complejo con un elevado coste energtico (consume el 90% de la energa de la biosntesis) y con necesidad de una estrecha de regulacin. Es sin duda el proceso de sntesis en que participa mayor nmero de macromelculas diferentes. Las principales son: . Al menos 32 tipos de ARNt portadores de aminocidos . Ribosomas (formados por unas 70 proteinas y 5 ARNr difentes) . Un ARNm molde . Mas de una docena de enzimas y factores proteicos adicionales para asistir al inicio, elongacin y terminacin . Unas 100 proteinas adicionales para la modificacin de las distintas proteinas En total mas de 300 macromolculas diferentes Como hemos visto antes, el ADN es el molde mediante el cual la informacin gentica necesaria para la sntesis de protenas se transcribe al ARNm. Una vez formado, el ARNm sale del ncleo y se dirige a los ribosomas donde tendr lugar la

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sntesis proteca. La traduccin se realiza utilizando una secuencia especfica de tres bases del ARNm llamada triplete de bases o codn. Cada aminocido est codificado por, al menos un triplete, que constituyen en cdigo gentico y que se recogen en la Figura 5. Este cdigo es universal (vlido para todas las especies) y redundante (un aminocido puede estar codificado por varios codones), pero no es ambiguo (un codn codifica uno y slo un amincido). La traduccin del ARNm tiene lugar en los ribosomas y sigue los mismos pasos en procariotas y eucariotas. Cada triplete de nucletidos o codn del ARNm determina un aminocido especfico. Cada molcula de ARNt porta el aminocido correspondiente a un codn. El reconocimiento entre el ARNt y el codn tiene lugar gracias al anticodn. Entre los dos aminocidos consecutivos debe formarse el enlace peptdico, este paso est catalizado por la enzima peptidil transferasa. Luego el ribosoma se transloca, desplazandose a lo largo de la cadena peptdica que se est formando y dejando un sitio vacante para un nuevo ARNt-aminocido. La traduccin contina hasta que aparece un codn de terminacin. El desciframiento del cdigo gentico fue un trabajo complejo y se ha considerado el mayor descubrimiento cientfico del SXX. Fundamentalmente se baso en la sntesis in vitro de moldes de ARNm artificiales que incubados con extractos celulares, GTP, ATP y los 20 aa en 20 tubos (cada uno con un aa marcado radioactivamente con 14C) permitan obtener polipptidos de cuya secuencia se establecieron las claves del cdigo gentico. Se comenz con con ARN muy sencillos (con homopolmeros)
Homopolmero UUUUUU... CCCCCC... AAAAAA... Heteropolmeros simples (AC)n ACA Thr CAC His Polipptido Phe-Phe-Phe... Pro-Pro-Pro... Lys-Lys-Lys.. Asignacin codn UUU Phe CCC Pro AAA Lys

Que luego se fueron completando. En 1963 se descifr el cdigo gentico completo. Los codones escritos en el sentido 5`-3`. Todos los aa excepto la Met y el trip tienen

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ms de un codn, que normalmente se diferencian en la tercera base. Adems el codn AUG es tambin el codn de iniciacin y hay tres codones de parada. El codigo gentico es: . Redundante: porque un aa puede ser codificado por ms de un codn . No ambiguo. Pero cada codn especifica un solo aa . Universal o casi universal (salvo pequeas variaciones en las mitocondrias, en algunas bacterias y algunos eucariotas unicelulares) El ser humano, E.coli, las plantas o virus. Indicando que todas las formas de vida provienen de un ancestro comn cuyo cdigo gentico se ha preservado a lo largo de la evolucin.

Figura 5. El cdigo gentico.

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En este proceso el reconocimiento del aminocido por su correspondiente RNAt es fundamental. Este reconocimiento se debe a una enzima la aminoacil-ARNt sintetasa que tiene dos sitios especficos, uno presenta afinidad por el aminocido y otro por el ARNt. De forma, que gracias a la especificidad de esta enzima es posible la especificidad de un ARNt por su aminocido. En esta fase se forma el complejo de iniciacin, formado por un ribosoma unido al ARNm y aun ARNt iniciador cargado. Primero se unen el ARNm y el ARNt inicador cargado a la subunidad pequea, luego se unir la grande. El proceso requiere la intervencin de varios factores de iniciacin. La traduccin siempre comienza en un codn AUG. El crecimiento de la cadena polipeptdica en el ribosoma se produce por un proceso cclico que se repite tantas veces como aa haya en la cadena. Intervienen tres sitios del ribosoma donde puede unirse el ARNt. El sitio P(peptidil), A (aminoacil) y E (de salida). Al comienzo cada ciclo la cadena naciente est enganchada a un ARNt del sitio P y los lugares A y E vacios. Cuando elsegundo ARNt cargado con el aa adecuado se une al sitio A. Se produce un ataque nuclefilo del grupo amino del aa-ARNt entrante que est en el sitio A, sobre el carboxilo del peptido en crecimento del sito P con lo que se forma un enlace peptdico entre el nuevo aminocido y el pptido en crecimiento y el bloque del pptido en crecimiento se transfiere del sito P al sitio A. Esta reaccin la cataliza una actividad peptidiltransferesa localizada en el ARNr 23s (28s en eucariotas) componente de la subunidad grande (se trata pues de una ribozima aunque varias protenas ribosmicas parecen contribuir a que se activa). En este ltimo paso de la elongacin el ribosoma se desplaza un codn en el sentido 5`-- 3.. Con este desplazamiento conseguimos que ARNt (ya descargado) que estaba en el sitio P pase al sito E, mientras que el peptidil-ARNt del sito A pasa al P. El nuevo codn queda enfrentado al sito A que ahora est vacio.

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Figura 6. Visin general del proceso de traduccin del ARNm

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