UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

GUA DE PRCTICA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

AUTORES: Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal Ing. Karina Moran Medina Mg. Jacqueline Zanabria Glvez

AREQUIPA PER 2013

PROLOGO
El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos. Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la elaboracin de infinidad de productos tiles al hombre, en la generacin de procesos productivos con menor contaminacin del medio ambiente y con consumos de energa muchos menores. Los microorganismos son objetos de manipulaciones genticas para que puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos bioprocesos. El conocimiento de la microbiologa se hace imperiosa para su aplicacin a diversas disciplinas del saber humano. La presente Gua de Prctica se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las tcnicas bsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de Ingeniera Qumica.

Los Autores

NDICE
PROLOGO NDICE Pgs. RECOMENDACIONES GENERALES........................................................4 PRCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA...........................................5 PRCTICA 2 : MICROSCOPIA; OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS IN

VIVO, COLORACION VITAL.................................................10 PRCTICA 3 : PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:

COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL...........................10 PRCTICA 4 : COLORACIONES ESPECIALES: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS............................................................................20 PRCTICA 5 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO,

ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN .......................30 PRCTICA 6 : PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ............................35 PRCTICA 7 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS......................................47 PRCTICA 8 : CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE

COLONIAS....................................................................58 PRCTICA 9 : CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO..............................63 PRCTICA 10 : CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS................67 PRCTICA 11 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE

DILUCIN EN PLACA...........................................................49 PRCTICA 12 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM.......................74 PRCTICA 13 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS

CONTAMINADAS.................................................77 FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRCTICAS .......................................................................80 BIBLIOGRAFA..........................................................................................83 3

Recomendaciones Generales
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no se permitir al acceso al laboratorio Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla completamente, slo podr quitrsela al salir de ste. Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado y en su equipo de trabajo. Hablar slo lo necesario con los compaeros. Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se suspender para todo el equipo. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de su uso. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno. Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud. Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio. Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.

PRCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA

I. OBJETIVOS
Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio. Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio Identificar cada una de las partes del microscopio ptico, conocer su funcin y el cuidado de cada uno de ellas. Dominar el mecanismo de iluminacin, la observacin de una muestra con todos los objetivos.

II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn que tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biolgicos fsicos, psicolgicos y mecnicos. 2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se est dentro del laboratorio Precauciones estndar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminacin de una persona, evitando la exposicin directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilizacin de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras por ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente 2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR - Barreras de proteccin - Lavado de manos 6

Desinfeccin y esterilizacin. Manejo de objetos punzo cortantes. Manejo y eliminacin de desechos Ventilacin e iluminacin adecuadas Limpieza y desinfeccin de ambientes

2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN 1. La boca Comer, beber y fumar en el laboratorio. Realizar transferencias con pipetas sin proteccin.

utilizar

ningn

tipo

de

2. La piel Cortaduras o rasguos. Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados (lpices, bolgrafos, etc.). 3. Los ojos Salpicaduras de materiales infecciosos. Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados. 4. Los pulmones Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles). 2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION - Lavado de manos (antes y despus) - Guantes - Mascarilla o barbijo - Mandil - Gorro 2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente cerrado. Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin prctica. Lavar las manos con agua y jabn: antes de realizar las actividades programadas antes de salir del laboratorio despus de usar materiales contaminantes. Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo lo indispensable. No comer, beber, fumar. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirjase al profesor. Usar mascarillas para casos indicados 2.2 MICROSCOPIA 7

El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolucin de un microscopio est en relacin inversa a la longitud de onda de la luz usada. 2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. Parte mecnica: - Pie - Columna (pilar, charnela y brazo) - Tubo: Revlver - Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido - Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento - Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales - Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo 2. Parte ptica del Microscopio: - Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador - Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra Los objetivos traen impresas las siguientes caractersticas: o Magnificacin: Ej. x 25 o Apertura numrica (A.N.): Ej. 0,45 o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromtico o Longitud del tubo: Ej. 160 mm o Correccin de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm o Aparato de iluminacin. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma 2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el tornillo micromtrico. 2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares estn limpios y en posicin correcta. 3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas oin vivo debe mantenerse la platina horizontal. 4. Verificar que los objetivos en el revlver estn en orden progresivo de aumento. 5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico girando el revlver hasta que haga clik. 6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el diafragma totalmente. 7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente ms cercano. 8. Observe por el ocular la iluminacin del campo y trate de lograr la mxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador. 8

9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales. 10. Para iniciar la observacin, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panormico 10X) y procure que la distancia objetoobjetivo sea la mnima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macromtrico y observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultneamente suba al tubo con el tomillo macromtrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo micromtrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lmina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observacin integral, siempre utilizando el tomillo micromtrico para no perder la nitidez. Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo macromtrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm. 11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste. 12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de revlver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente con el tomillo micromtrico. Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse con el tomillo macromtrico porque corre el riesgo de romper la lmina o la lente frontal del objetivo. 13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersin, coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre ste sector de lmina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersin. Luego, contine girando el revlver hasta que el objetivo de inmersin (100X) contacte con la gota y encaje en el eje ptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo micromtrico. Una vez terminada la observacin limpie el objetivo de inmersin y la lmina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol. 2.2.3.AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLCULO APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES 1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del ocular. Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X 40 x 10 = 400 aumentos 2. Para el clculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el dimetro del campo microscpico que vara de acuerdo al objetivo que se usa. Dimetro del campo microscpico 9

Ocular 10X 10X 10X Ejemplo:

Objetivo 10X 45X 100X

Dimetro del campo en micras 1500 400 150

Si observamos una clula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y ocular 10X, y si sta ocupa la tercera parte del campo microscpico, concluiremos que la clula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micromtrico. 2. Los objetivos y oculares constituyen la parte ms delicada del Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. As, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razn debe desmontarse los objetivos. El objetivo de inmersin no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio despus de su uso, para lo cual use el campo ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol. 3. Al finalizar la observacin microscpica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico dejando un espacio de 2 cm. entre ste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.

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III.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X. Observe las diferencias en el campo ptico y el acercamiento.

IV.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

CUESTIONARIO
Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes? A qu se denomina campo ptico? Por qu decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal. Qu es el poder de resolucin qu entiende por bioseguridad Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio. qu barreras de proteccin debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar.

8. Cmo promovera la cultura de bioseguridad.

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PRCTICA
MICROSCOPIA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS IN VIVO, COLORACION VITAL

I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares. 2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in vivo.

II. OBSERVACIN UNICELULARES

IN

VIVO

DE

ORGANISMOS

Indicaciones: 1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en posicin horizontal. 2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio. 3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera que la luz del Microscopio la atraviese. 4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de iluminacin y poca visin de la muestra corrija ste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris. 5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen caractersticas especiales y un fondo de partculas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse: - Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos. - Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son brillantes, amarillentas, poco mviles; van desde la forma de un barril pequeo hasta cigarros o prismas. - Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observacin. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el ncleo y vacuolas. - Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo. 12

Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado). - La ameba, difcil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudpodos en la superficie de su cuerpo. - Tambin puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del cliz est rodeada de cilios. 6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares. 7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes. Grafique la Observacin y Resultados

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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

1. Examen en Fresco Es la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para su examen microscpico. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Hay 2 tipos de tcnicas: a. Preparacin en fresco simple entre porta y cubre. Consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos. b. Gota pendiente Consiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una excavacin central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin. La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo. 2. Coloraciones Vitales Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observacin, 13

mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfologa, agrupacin, observacin de huevos y quistes de parsitos.

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EXAMEN EN FRESCO Material - Microscopio - Lminas cubreobjetos - Lminas portaobjetos - Agua destilada - Asas de Kolle - Grmenes varios - Muestras fermentadas - Cultivo de microorganismos Metodologa - Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca una gota de lquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto. - Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una gota de suero fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una suspensin y colocar un cubreobjetos. - Observar al microscopio con objetivo 40X. Grafique la Observacin y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

COLORACIONES VITALES Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como tcnicas intermedias entre stas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teidas. Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solucin de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Grmenes diferentes Procedimiento - Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000). - Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o slida). - Observar al microscopio con el objetivo de 40X. 15

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Grafique la Observacin y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

V. CUESTIONARIO Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco? Qu ventaja presenta una preparacin gota pendiente? Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?

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PRCTICA
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL

I.

OBJETIVOS . Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes procedimientos de coloracin. II. MARCO TEORICO Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su protoplasto posee un ndice de refraccin cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas. Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y difieren uno de otro en cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a la sustitucin de los tomos de hidrgeno por otras molculas. Algunos de los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2. La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de radicales cromforos del compuesto. 2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES PARED CELULAR El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las clulas de cultivo antiguo. GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas est constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptdicos. Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad de cidos teicocos, polmeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato 18

y aminocidos como D-alanina o azcares como la glucosa estn unidos a los grupos glicerol y ribitol. GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antgeno o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075 m.

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Este tipo de preparaciones son las ms frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clnicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos. Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y coloreada son: a. Confeccin del Frotis. Puede prepararse a partir de productos lquidos o slidos. Producto lquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino. Cultivo en medio slido. puede prepararse una suspensin del material en una gota de solucin salina colocada previamente en el portaobjetos, extendindola con ayuda del asa de platino. b. Secado. Se dejar secar el frotis a temperatura ambiente. c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de las estructuras del material a estudiar en un estado lo ms prximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida de los microorganismos, debida a la coagulacin de las albminas protoplsmicas. Existe un gran nmero de fijadores, tanto en forma simple (etanol, cido pcrico). Las formas ms habituales de fijacin son: por el calor y alcohol en fro. d. Coloracin. Es el proceso de coloracin de los microorganismos. e. Lavado. Eliminacin del exceso de colorante. f. Secado. Se secar la preparacin al aire. CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES La clasificacin de los colorantes es algo confusa, pero est basada en los cromforos presentes. a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o Bsico, trmino que no ndica sus reacciones de pH en solucin, sino, si una parte de la molcula es aninica o catinica.

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Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear de las clulas. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina. Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas, tales como estructuras citoplsmaticas, y como colorante de contraste. Ej: cido pcrico. Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante cido con uno bsico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina. Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej: Sudn III.

CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfologa y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincin azul de metileno, Tincin fucsina. b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto las caractersticas de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tincin Gram, Tincin cido-alcohol resistente. c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tincin de flagelos, Tincin de esporas, Tincin de cpsulas, Tincin de corpsculos metacromticos III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Preparacin del Frotis Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porcin azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como sea posible. Djela enfriar (cuente hasta 20). Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posicin plana en la superficie del lquido. Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en el centro de ste (el portaobjeto deber estar numerado). Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvala trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos. Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.

Fijacin Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre. Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba. - Djelo enfriar antes de aplicar la tincin. 20

3.2. TINCIONES SIMPLES Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno (solucin acuosa al 1%), Safranina (solucin acuosa 1%), Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol TINCIN DE AZUL DE METILENO Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables. Procedimiento - Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis. - Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos. - Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijacin del frotis. - Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos. - Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante. - Secar al aire, a temperatura ambiente. - Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.

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Grafique la Observacin y Resultados

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TINCIN DE SAFRANINA Las bacterias aparecen de color rojo. Procedimiento - Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis. - Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos. - Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijacin del frotis. - Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos. - Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante. - Secar al aire, a temperatura ambiente. - Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin. Grafique la Observacin y Resultados

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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin de Gram, Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol TINCIN GRAM El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, an luego del tratamiento con un decolorante orgnico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas. Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en su pared celular, pierden la coloracin primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares. Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables. Reactivos - Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95 = 20 ml, Agua destilada csp=100 ml) - Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada= 100 ml) - Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial - Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml) Procedimiento - Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lmina portaobjeto limpia. - Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijacin del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso de tincin. - Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de cao. - Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua. - Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos ms o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como decolorante , en este caso dar ms tiempo aproximadamente 1 minuto. - Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de cao. - Secar al aire, a temperatura ambiente. 23

Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.

Grafique la Observacin y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

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IV. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. Qu es un colorante y cules son sus propiedades? Por qu se le llama a un colorante cido o bsico? A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria? De qu manera influye el pH en la coloracin? Por qu es necesario utiliza mtodos de tincin para visualizar a las bacterias? 6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina 7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos 8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales 9. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique la funcin que cumple cada uno de ellos. 10. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique la funcin que cumple cada uno de ellos. 11. Explique el fundamento de la coloracin de Gram y esquematice. 12. A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos? 24

13. Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo. 14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta 15. Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.

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PRCTICA
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

I. OBJETIVOS
Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras microscpicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas las especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.

II. MARCO TERICO

1. ASPERGILLUS A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezas conidiales, Morfologa de los conidiforos, filides y metulas, y en la presencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:

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B. ETIOPATOGENIA Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive como saprofitos en el suelo, vegetales en descomposicin, cualquier tipo de materia orgnica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropa vieja, recipientes con agua sin usar, reactivos qumicos, paredes de refrigeradores, sistemas de ventilacin, cuartos de hospital, lentes de contacto blancos, en las capas altas de la atmosfera. Las especies que actan como patgenos son termotolerantes. Tras la exposicin a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalacin o se instalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquier origen, como cavernas por TBC. C. APLICACIONES INDUSTRIALES En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera: ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del pncreas. En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados. INVERTASA O SACARASA. Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar invertido) puede ser
realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (ASPERGILLUS ORYZAE).RANGO DE PH: 4-6.

La aplicacin de enzimas en los detergentes Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y perodos ms cortos de lavado. Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los materiales que constituyen las manchas, facilitando la remocin de estos materiales y de forma ms efectiva que los detergentes convencionales. Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por hidrlisis, pero las lipasas son
solubles en agua y los lpidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo ocurre en la interfase entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remocin de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinacin de bsqueda y manipulacin gentica ha conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Hamicola , QUE SE LOGR PRODUCIR EN Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos

Extraccin de aceite. El uso de algunos preparados celulolticos en el proceso de extraccin ha tenido un efecto positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimtico producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extraccin del aceite de soya. En condiciones ptimas, el contenido de aceite de soya extrable (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperacin del aceite de soya (99 %).

El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta
principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extraccin de aceite a partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de

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aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % PARA EL ACEITE DE AJONJOL, DE 51.0 a 53.2 % EN EL CASO DEL ACEITE DE CACAHUATE Y DE 55.3 a 57.1 %

Extraccin de colorantes. La extraccin de colorantes es otra aplicacin atribuida a algunos

preparados enzimticos.

Extraccin de antioxidantes con preparados enzimticos con actividades mixtasmixtas El preparado enzimtico comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente pectinasa, pero AMBIN CELULASA Y HEMICELULASA, PRODUCIDO POR Aspergillus niger, NO SLO FUE EFECTIVO AL AUMENTAR LA EXTRACCIN DE LOS FENOLES DEBIDO A LA DEGRADACIN DE LOS POLISACRIDOS (CELULOSA,.HEMICELULOSA Y PECTINA) QUE CONSTITUYEN LA pared celular de la cascara de uva, sino que mejor tambin la actividad antioxidante de los extractos fenlicos 2. PENICILLIUM Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras del espora-cojinete. Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fales en forma de botella. Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora ms joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes. La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente. Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Olor aromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina). ECOLOGIA El Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, y generalmente el gnero ms abundante de hongos en suelos. La ocurrencia comn de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier moho. Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohosos donde deteriora diferentes materiales de construccin, entre los que resaltan el papel de decoracin (crece bien en la cola empleada para su adhesin a las paredes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las reas urbanas que en las rurales). APLICACIONES DEL PENICILLLIUM Por otra parte unas ciertas especies DE PENICILLIUM SON BENEFICIOSAS A LOS SERES HUMANOS. LOS
QUESOS TALES COMO ROQUEFORT, BRIE, CAMEMBERT, SON ABSOLUTAMENTE SEGUROS DE COMER.

STILTON, ETC. SE MADURAN CON LA ESPECIE

DE

PENICILLIUM Y

La

CEPA DE

CULTIVO, POSTERIORMENTE SE ENCONTR QUE OTROS

Penicillium notatum aislada por A. Fleming PRODUCA 2 MG DE PENICILINA POR CADA LITRO DE Penicillium eran mejores productoRES DE PENICILINA Y SE

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ELIGI A

Penicillium chrysogenum como cepa sper productora de este antibitico. Finalmente, la seleccin de

sucesivos

MUTANTES SPER PRODUCTORES Y LA MEJORA EN LAS TCNICAS DE FERMENTACIN REALIZADAS POR LA INDUSTRIA BIOTECNOLGICA HAN HECHO QUE ACTUALMENTE SE OBTENGAN 20 G/L DE PENICILINA SE LE EMPLEA EN LA PRODUCCIN DE ALGUNOS ALCALOIDES COMO LA ROQUEFORTINA C, meleagrina y chrisogina.

Incluye las siguientes especies: PENICILLIUM BILAIAE > Penicillium CAMEMBERTI, QUE ES USADO PARA PRODUCIR LOS QUESOS CAMEMBERT Y BRIE. > Penicillium CANDIDA, DEM. > Penicillium GLAUCUM, QUE ES USADO PARA PRODUCIR QUESO GORGONZOLA. > Penicillium MARNEFFEI, QUE DESARROLLA UNA MICOSIS SISTMICA EMERGENTE QUE > > > Penicillium NOTATUM, QUE ES USADO PARA PRODUCIR LA PENICILINA. Penicillium PURPUROGENUM Penicillium ROQUEFORTI, QUE ES USADO para producir los quesos
RECIENTEMENTE TAMBIN GORGONZOLA

AFECTA A

ROEDORES Y HUMANOS, ESPECIALMENTE A PERSONAS INMUNODEPRIMIDAS, CONOCIDA COMO PENICILIOISIS

ROQUEFORT, DANISH BLUE Y

III. PROCEDIMENTO
A. MATERIAL Asa de kolle KOH al O% Mechero Azul de lactofenol Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Microscopio

B. MATERIAL BIOLOGICO Cultivo de ASPERGILLUS FLAVUS Cultivo de ASPERGILLUS NIGER Cultivo de ASPERGILLUS FUMIGATUS Cultivo de Penicillium

C. REACTIVOS C.l. Hidrxido de potasio al 10% KOH Agua destilada C.2. Azul de lactofenol. Fenol cido lctico Glicerol
AGUA DESTILADA

10 G 100 ML

20 G 20 G

40 ml
20 ML

Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el

COLORANTE. SE PUEDE EMPLEAR CUALQUIERA DE LOS SIGUIENTES: AZUL DE ALGODN 0.05G AZUL DE METILENO 0.05 G

Azul de COTTON DE PERRIER 0.05 G 29

1. EXAMEN DIRECTO CON KOH 10% Se realiza a partir del esputo, membranas expectoradas o fragmentos de tejido que se obtienen por broncospia. Se encuentran filamentos hialinos, largos, sinuosos y ramificados de 3 a 4 de dimetro. En los aspergilomas puede observarse masas de filamentos con sus cabezas aspergilares. Se puede trabajar a partir del cultivo, con la finalidad de observar sus estructuras que permitan identificar el gnero. Colocar una gota de KOH al 10% en un portaobjeto y mezclar con una pequea cantidad del material a examinar (micelio areo proveniente del cultivo). Colocar un cubre objeto (18 x 18 mm) sobre la gota. El hidrxido de potasio acta disolviendo la queratina e intensificando el contraste de las estructuras fngicas con otros materiales presentes en este preparado microscpico. Examinar microscpicamente en busca de hifas u otras estructuras nicticas. 2. CULTIVOS Se realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Las colonias crecen con rapidez, son de color blanco y por la produccin de esporas se tornan de diferentes colores. La superficie es aterciopelada o pulvurulenta. Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentacin de la colonia. 2.1. AGAR SABOURAUD A. FUNDAMENTO Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatolgicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar presentes en la muestra. B. COMPOSICION

C. PREPARACION

30

IV. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... B. ASPERGILLUS FUMIGATUS

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... 31

C. ASPEGILLUS FLAVUS

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... D. PENICILLIUM

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... 3. RHYZOPUS

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

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Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se decae y las heces del vehculo, ani MALES, Y EL VIEJO PAN. EN
CIERTAS ESPECIES DEL RHIZOPUS SON CAUSAS OCASIONALES DEL ZYGOMYCOSIS (PHYCOMYCOSIS). PUEDEN CAUSAR INFECCIONES SERIAS (Y A MENUDO FATALES) EN SERES HUMANOS Y ANIMALES DEBIDO A SU TARIFA DE CRECIMIENTO RPIDA. EN CIERTAS ESPECIES SON PATGENO DE LA PLANTA, Y UNO, OLIGOSPORUS DEL RHIZOPUS, SE UTILIZA EN LA PRODUCCIN DEL TEMPEH, UN ALIMENTO FERMENTADO DERIVADO DE LAS SOJAS.

Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son gentico idnticos a su padre, los zygospores se producen despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccin sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.

EL GNERO MUCOR Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente los medios de cultivo. EL GNERO RHYZOPUS Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios de cultivo. En este Gnero los esporangiforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides. EL GENERO ABSIDIA Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides. APLICACIONES INDUSTRIALES Importancia econmica, sntESIS DE
CTRICO, SUCCNICO, OXLICO, ETC.

PRODUCTOS INDUSTRIALES: PRODUCCIN Y ALIMENTOS POPULARES ORIENTALES: SU-FU Y TEM-PE

DE CIDOS LCTICO,

Mucor

racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se desarrolle. Una forma tpica o filamentosa, en medios slidos y otra forma atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios lquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de mostos azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas (amilasas).

Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente fermenta los azcares formados en la
hidrlisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es en sntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma tpica se emplea para la fabricacin de amilasas. Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar el almidn y producir etanol, pero en menor proporcin que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentacin alcohlica, en cambio, en los ltimos aos se

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A. CULTIVOS Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente. Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rpido crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa petRI.
INICIALMENTE SON BLANCAS PERO CAMBIAN A GRIS, MARRN O NEGRO CON LA MADUREZ A MEDIDA QUE SE FORMAN ESPORAS.

B. OBSERVAR a. RHYZOPUS

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ........................................................... b. MUCOR

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

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c. ABSIDIA

Caracteres Macroscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

Caracteres Microscpicos ........................................................... ........................................................... ........................................................... ...........................................................

V. CUESTIONARIO
1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus? 2. Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus? 3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y microscpicas) ? Dibuje. 4. Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium? 5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus? 6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium? 7. Qu es una enzima? 8. Dibuje e indique las partes del Penicillium? 9. Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium? 10. Cul es la estructura bsica de la Penicilina? 11. Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes? 12. Cmo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de cultivo se trata de un Zygomycete? 13. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes? 14. Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una Absidia? 15. Qu enfermedades producen estos hongos? 16. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?

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PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO; ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN

I.

OBJETIVOS

1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de materiales y equipos ms empleados en un laboratorio de microbiologa industrial. 2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el anlisis microbiolgico. 3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el control microbiolgico de los alimentos.

II. MARCO TERICO

El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer paso en el control microbiolgico de los alimentos, pues de l depender el xito del anlisis. 2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR El calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas. 2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECO Se requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de calentamiento que la esterilizacin con vapor. Su uso est limitado primariamente a la esterilizacin de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor. El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos. En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena peptdica y se requiere ms energa para abrir las molculas, de all la aparente mayor estabilidad del organismo. 36

Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una temperatura de 160-170C durante 1 hora. a) Flameo o Llama Directa. esterilizar (asas y agujas de contacto de la llama de un microorganismos del entorno; Consiste en exponer los materiales a kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al mechero para eliminar rpidamente los Ejemplo: mechero de Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio. 2.1.2 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm 3 sobre la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas de cadena nica en el ADN, y la prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica, como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa. El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la membrana y filtracin de pequeas molculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente es resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARN ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas a temperaturas elevadas. a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 15-35 minutos. b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo. c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y 121C por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin. c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:
Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una

camisa metlica cilndrica. 37

 Dispositivos

para la instalacin de la fuente calorfica electricidad o vapor de agua). Orificios superiores para purga de gases de combustin. Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro. Canastilla para colocar el material a esterilizar. 2.2 ESTERILIZACIN POR FILTRACIN

(gas,

Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de sustancias termolbiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.

II.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la regin espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste mtodo presenta muchas dificultades tcnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO

- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri - Erlenmeyer, tubos de ensayo - Papel craff, algodn, gasa, tijeras - Mechero de Bunsen - Horno Pasteur de aire caliente - Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR a)Preparacin de tubos matraces Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones de algodn respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente: De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodn de fibra, extendida, rectangular Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra. Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud. Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de cono truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el recipiente hasta la 38

mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento. Tubos de Ensayo - Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas. Frascos y Matraces - Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo. - Colocar el nombre del medio de cultivo - Rotular la fecha de preparacin. b)Preparacin para proteger las pipetas - En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de algodn con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado. - Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsin para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante. - Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilizacin. c) Preparacin de las placas Petri - Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las placas petri completas. - Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa ponindose esta en el centro, se envuelve la placa tomndose dos extremos opuestos del papel, dndose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos, rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dndosele una apariencia de paquete de regalo. 4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal. a)Procedimiento para la esterilizacin en horno - Ponga el termostato a l75C y encienda el horno. - Si hay un ventilador verifique que est funcionando. - Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase calentando durante 60 minutos ms. - Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60C. Abra la puerta del horno. - El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color marrn oscuro, si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado. 39

4.3

ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO a)Procedimiento para la esterilizacin con autoclave - Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cercirese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje. - Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada. - Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado. - Abrir la vlvula de salida del aire. - Inicie el calentamiento de la autoclave. - Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicar que todo el aire ha sido expulsado de la autoclave. - Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente. - Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos. - Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido. - Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave. - Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estriles.

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VI. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos ejemplos? 2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control microbiolgico, por qu? 3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el autoclave. 4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia. 5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.

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PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO

I.

OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano. b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa. c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms corrientes. d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier medio de cultivo.

II. MARCO TEORICO

2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no energtica como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su desarrollo. 2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS MICROORGANISMOS A. FUENTES DE CARBONO En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn. Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO 2 hecho que es caracterstico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas. Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium. Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes. 42

B. FUENTE DE NITROGENO Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso protenas an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc. Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son tambin protenas que estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal. El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de carne. La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos. La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y ciertos grmenes como Neisserias. Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio, aminocidos, etc. 2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS MICROROGANISMOS A. FUENTE DE AZUFRE Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc. Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS. B. FUENTE DE FSFORO En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato. C. IONES METLICOS Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc. Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno. Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros. - Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous. - Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus. D. FACTORES DE CRECIMIENTO Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems 43

una serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por s solas. A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc. Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: - Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas. - El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo. - Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de apreciar. - Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B para el crecimiento del Flavobacterium. E. FACTORES INHIBIDORES Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por bloqueo de sus procesos metablicos. Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria. La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos. Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los Grampositivos. Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos. Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas bioqumicas de las bacterias. Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias Gramnegativas. El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias. Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes. 2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario: - Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. - Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra que considerar: A. TEMPERATURA PTIMA Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes en funcin de los rangos de temperatura de crecimiento. 44

- Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o inferior, la mxima es de 20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden crecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20 a 30C y la mxima de casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccin de alimentos refrigerados. - Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la mnima de 15 a 20C y la mxima de casi 45C. La mayora de los microorganismos pertenecen a esta categora. Las bacterias patgenas para el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C. - Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. La temperatura mnima es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a 65C. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberas de agua caliente, aguas termales. - Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no crecen por debajo de 55C. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.

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RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO Temperaturas cardinales (C) Mxim Mnima ptima a -10 23-24 28-30 -4 10 24 4 25-30 40 6.5 30-37 46 0 37 44 10 37 45 30 35-36 38 45 59 62 30 60-65 75 60 80 85 67 96 102 82 105 110 90 106 113 0 4-15 15 1-3 28 40 21-23 45-50 50-58

Microorganismo Bacillus psichrophilus Microcococcus cryophilus Pseudomona fluorescens Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Thermoplasma acidophilum Bacillus stearthermophilus Sulfolobus acidocaldarius Pyrococcus abyssi Pyrodictium occultum Pvrolobus fumarii Candida scotti Saccharomyces cerevisiae Mucor pusillus

B. GRADO DE HUMEDAD Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento. En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua. En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin. C. pH Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de crecimiento. - Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5. - Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0 - Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5 La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos. La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6. Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras. El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad. Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0. Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8. El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9. En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica 46

utilizando la bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice el medio. Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro de los lmites fisiolgicos.

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EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO Microorganismo Picrophilus oshimae Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius Lactobacillus acidophilus Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Escherichia coli Clostridium sporogenes Pseudomonas aeuriginosa Nitrosomonas Bacillus pasteurii Bacillus alcalophilus Lmite inferior 0 0.5 1.0 4.0-4.6 4.2 4.4 4.4 5.5-5.8 5.6 7.0-7.6 8.5 8.5 pH ptimo 0.7 2.0-3.5 2.5 5.8-6.6 7.0-7.5 6.0-7.0 6.0-7.0 6.0-7.6 6.6-7.0 8.0-8.8 SD 10.6 Lmite superior SD 6.0 4.0 6.8 9.3 8.4 9.0 8.5-9.0 8.0 9.4 SD 11.5

D. PRESIN OSMTICA Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores. Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos; este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y sta se rompa. En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus. Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw). Actividad del Ambiente Agua 1.00 (agua pura) Sangre 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 Pan Jamn Salami Conservas Lagos salados Pescado salado Cereales, dulces Chocolate Leche deshidratad a Microorganismo Mayora de Gramnegativos no halfilos Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus Staphylococus, Saccharomyces Penicillum Halobacterium, Aspergillus Actinospora Aspergillus Saccharomyces Xeromyces

E. CONCENTRACION DE OXGENO Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO. 48

Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia. Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia. Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia. Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la respiracin aerobia y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo. Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno. 2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en: 2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA A. MEDIOS SLIDOS Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del 15%. La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificacin y visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin a travs de medios especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc. Ejemplo de medios de cultivo: - Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos. - Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes. - Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus. - Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos. - Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias. B. MEDIOS LQUIDOS Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin de recuentos bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la realizacin de inculos, para obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibiticos, cidos lcticos, etc. Ejemplo de medios de cultivo: - Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa. - Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol. - Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas - Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de cultivar. C. MEDIOS SEMISLIDOS 49

Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semislida. Son tiles para algunas pruebas bioqumicas: - Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol. - Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina. 2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, segn sea su composicin, se pueden a su vez dividir en: A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de los componentes bsicos, uno o varios elementos, como por ejemplo casena soja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento de algn tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que buscamos. A.2. MEDIOS SELECTIVOS Son medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el crecimiento de algn tipo bacteriano. - Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme. A.3. MEDIOS DIFERENCIALES Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms caracterstico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria y especfica, es decir, diferencial; por ejemplo: - El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracin caracterstica para cada tipo de microorganismo. Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de aislamiento e identificacin. - Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, adems si puede producir H2S. - Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminocido Lisina. - Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono. B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL Son medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias. Su composicin va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales y agua. Dentro de los medios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est 50

compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico y agua. C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses. 2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICIN A. MEDIOS NATURALES B. MEDIOS SEMISINTTICOS C. MEDIOS SINTTICOS D. MEDIOS COMPLEJOS 2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIN A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS B. MEDIOS YA PREPARADOS C. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRI D. MEDIOS SLIDOS EN TUBO D.1. Con Agar Inclinado D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta E. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO

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III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO - Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Esptula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo. e. MEDIOS DE CULTIVO - Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey Agar Sabouraud. Agar LIA . Agar Manitol salado.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. PREPARACIN - Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada. - El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est indicada en la etiqueta del medio de cultivo. - Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin homognea, despus incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. - Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolucin. - Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y resbala libremente. - Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos. 4.2. ESTERILIZACION - Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario. - El tiempo es de 15 minutos a 121C. 4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO - Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C. - Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio. - Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en la posicin deseada: o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado o Pico o inclinado o Fondo o El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda. - Repartir: 52

o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo: Agar nutritivo Agar Mac Conkey Agar EMB Agar Sabouraud

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o En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml) Agar TSI Agar LIA o En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml) Agar Citrato de Simmons o En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml) Agar SIM 4.4. ALMACENAMIENTO - Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien cerrados. - Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo limitado de conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservacin es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 8C. - Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa. 4.5. COMPOSICION Y PREPARACIN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS AGAR NUTRITIVO Composicin Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m Preparacin _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripcin del Medio Requerimiento Energtico Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrgeno: _______________________ Requerimiento no Energtico Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fsforo: ________________________ Iones metlicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ Segn su proporcin en agua _________________________________________________________ Segn su uso o utilizacin _________________________________________________________ Segn la composicin _________________________________________________________ Segn su presentacin 54

_________________________________________________________ AGAR MAC CONKEY Composicin Peptona de casena 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g. Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g Agar Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml. Preparacin _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripcin del Medio Requerimiento Energtico Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrgeno: _______________________ Requerimiento no Energtico Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fsforo: ________________________ Iones metlicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: _______________________ Segn su proporcin en agua _________________________________________________________ Segn su uso o utilizacin _________________________________________________________ Segn la composicin _________________________________________________________ Segn su presentacin _________________________________________________________ AGAR TSI Composicin Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa, Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa, Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g Agua destilada, 1000 ml Preparacin _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripcin del Medio Requerimiento Energtico 55

Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrgeno: _______________________ Requerimiento no Energtico Fuente de azufre: ________________________ Fuente de fsforo: _______________________ Iones metlicos: _________________________ Factores de crecimiento: ___________________ Factores de arranque: _____________________ Factores inhibidores: _____________________ Segn su proporcin en agua _________________________________________________________ Segn su uso o utilizacin _________________________________________________________ Segn la composicin _________________________________________________________ Segn su presentacin _________________________________________________________ MEDIO EMB. Composicin Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml Preparacin _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripcin del Medio Requerimiento Energtico Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrgeno: _______________________ Requerimiento no Energtico Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fsforo: ________________________ Iones metlicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ Segn su proporcin ___________________________________________ Segn su uso o ___________________________________________ Segn la _____________________________________________ Segn su _____________________________________________ CALDO LURIA BERTANI (LB) Composicin Extracto de levadura,.. g. , Cloruro de sodio.. g. 56

en

agua utilizacin composicin

presentacin.

Triptonag Agua destilada. ml Preparacin _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripcin del Medio Requerimiento Energtico Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrgeno: _______________________ Requerimiento no Energtico Fuente de azufre: ________________________ Fuente de fsforo: _______________________ Iones metlicos: _________________________ Factores de crecimiento: ___________________ Factores de arranque: _____________________ Factores inhibidores: _____________________ Segn su proporcin en agua _________________________________________________________ Segn su uso o utilizacin _________________________________________________________ Segn la composicin _________________________________________________________ Segn su presentacin _________________________________________________________

V. CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo. Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo? Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo? Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw? A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos. Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos. Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos. Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos. Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano, y clasifique en categoras diferentes segn los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrfilos. Psicrtrofos, mesfilos, termfilos, Hipertermfilos? Con qu sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4. Qu es un medio de transporte y para qu sirve? De 2 ejemplos. Qu medios diferenciales conoce? Qu utilidades tienen? Qu es un medio selectivo y qu funcin tiene? Mencione por lo menos 3 y qu sustancias se le agregan para que cumpla esa funcin? Cmo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos? 57

10. 11. 12. 13. 14.

15. Cmo pueden incubarse los microorganismos microaerfilos? 16. Para qu sirve utilizar un medio de cultivo semislido? Cmo se obtiene la consistencia del agar blando?

58

PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I.
-

OBJETIVOS
Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse. Saber llevar a cabo los diferentes mtodos de siembra e inoculaciones. Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de asepsia y esterilidad.

II. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas: - Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca. - Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. 2.1. SIEMBRA Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades: a. Para hacer un aislamiento. b. Para hacer un transplante. AISLAMIENTO Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr 59

caractersticas especiales, la morfologa bacteriana ser tambin distintiva. TRANSPLANTE Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la identificacin especfica. Los trasplantes se pueden realizar: 1. De lquido a slido. 2. De lquido a lquido. 3. De slido a slido. 4. De slido a lquido. 2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION Existen los siguientes materiales: ASAS DE SIEMBRA El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilndrico para un uso sencillo. Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos, presentan un arco bastante cerrado en su extremo cuyo dimetro es ms o menos especfico es decir muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las ms utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.

HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA) Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, nicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semislidos y slidos.

ASAS DE DIGRASKY Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se utiliza para extender el inculo lquido previamente adicionado en la 60

placa, a travs de una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.

HISOPOS Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecacin, deterioro o contaminacin. Sirve para extender la muestra a travs del hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estril listo para utilizar y desechables. PIPETAS Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilizacin o de plstico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen volmenes especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volmenes graduados son muy utilizados en bacteriologa y cuya aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio de cultivo. 2.3. PREPAPACION DE INOCULOS Un inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismos problema. As pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentracin adecuada de microorganismos problema. Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el aislamiento mediante tcnicas especficas, como es el caso de la siembra por estras en placa o por agotamiento, o la tcnica de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento ms o menos separado de los microorganismos. Es muy til usar medios de cultivo enriquecidos especficos y diferenciales que permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como puro. METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta pasteur estril en cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizar 2.4. PREPARACIN DE INCULOS 61

Si la muestra es slida o semislida se tomara siempre con asa de siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipera pasteur estril en cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizar posteriormente en el medio especfico de cultivo. Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un medio lquido se homogenizar y se dejar crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patgenos coincidir con la temperatura corporal, dejndolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilizacin de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin posterior y de la cantidad de inculo que se requiera. Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un medio de cultivo slido, se utilizara diferentes tcnicas de siembra y posteriormente se verificar el cultivo, ej. siembra por agotamiento. Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido, se homogenizar la mezcla inicial por agitacin y se dejar crecer a una temperatura de 37C por 24 horas. Es importante que los inculos sean siempre jvenes. Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se aade a un medio slido, se extender con el asa de Digrasky, previamente estril a travs de toda la placa incubndose a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren tambin cultivos jvenes. Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina estril o caldo de cultivo base. A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados de microorganismos problema. En estos casos, los inculos se establecen en medios lquidos y el nmero de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparacin de medios lquidos con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batera de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez segn la concentracin de sulfato brico. Cada tubo corresponder a una determinada concentracin de microorganismos. 2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MTODOS DE AISLAMIENTO) El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea lquido o slido se denomina siembra o inoculacin. El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. La siembra del inculo puede realizarse en medio slido o en medio lquido. 2.5.1. SIEMBRA DEL INCULO EN EL MEDIO SLIDO Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 62

2.5.2. SIEMBRA DEL INCULO EN PLACA Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio slido. Se va descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos planos del medio queden escasas clulas aisladas que en el ambiente nutritivo se irn multiplicando, logartmicamente hasta formar colonias puras. Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inculo. Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo de superficie del medio se logra el aislamiento de mayor nmero de cepas microbianas. CLASES DE SIEMBRA - Siembra por agotamiento o por estras. - Siembra por difusin. - Siembra por diseminacin. a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aqu se realizar movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa no tomndose en ningn momento nuevos inculos y no levantndose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.

- ESTRIA MLTIPLE Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente estril y dicho inculo se depositar en el extremo superior de la placa, extendindose de un extremo a otro de sta solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde qued la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma direccin se repite la operacin hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar hacia el interior de la misma. El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia de que cada vez que se va arrastrando y separando ms la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en cada estra un flameado previo del asa de siembra.

63

- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos lneas perpendiculares que debern cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad de inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig zag. Realizamos la misma operacin sin flamear el asa en todos los dems cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema observndose en el ltimo cuadrante las colonias ms aisladas o separadas. - TECNICA DE LOS TRES GIROS Se rotula la placa en forma anloga al caso anterior. Se toma inculo con el asa de platino y se siembra por estra la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90 y volveremos a sembrar una segunda vez. As sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) sta tcnica no es muy utilizada.

b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)

64

En este mtodo, el medio de cultivo se mezcla con el inculo, al solidificar las colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirn para contaje de colonias. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se adicionar la cantidad de inculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizar la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril y se dejar solidificar, la mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin de CMI (concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a determinados microorganismos. c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY). Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.

2.6.

SIEMBRA DEL INCULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SLIDO INCLINADO Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de sta realizando movimientos ascendentes en zig zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante largos perodos, as como para la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas como la prueba de ureasa.

b. SIEMBRA POR PICADURA 65

Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posicin central. Esta tcnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semislidos ej. medio de oxidacin - fermentacin de Hugh-Leiffson.

c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo se lleva a cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estra ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA CELULARES El empleo de microorganismos en Biotecnologa se fundamente en la obtencin de cultivos puros, que estn constituidos por una nica especie microbiana. La mayora de las aplicaciones en biotecnologa conlleve el uso de cultivos puros. La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en algn mtodo de dilucin. El mtodo ms til y prctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las clulas individuales queden separadas una de otras. Cada clula aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las clulas que componen la colonia son la progenie de una nica clula original. Existen varios mtodos para confirmar la pureza de un cultivo: 1. Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en placa inicial debera dar lugar al repetir la operacin a colonias todas del mismo tipo, y cuya morfologa concuerda con la del aislamiento inicial. 66

2.

El examen microscpico de los organismos procedentes de una colonia deberan mostrar un nico tipo celular. Los mtodos diferenciales de tincin Gram, son tiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.

Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando aspticamente, el biotecnlogo tome prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminacin o de las soluciones con microorganismos no deseados.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Material de Vidrio - Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100) - Placas petra - Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml - Erlenmeyer Equipos - Estufa 37C - Autoclave Otros materiales - Gradillas - Mechero Bunsen - Asas de siembra - Algodn - Pinzas Reactivo y Medios de cultivo - Medios de cultivo Agar Mc Conkey Agar nutritivo Agar Saboraud Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta) Agar SIM (tubos fondo) Caldo SIM

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IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS

4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY Muestra: Inculo de un cultivo puro Medio de cultivo: Agar nutritivo ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA Muestra: Microorganismos Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Medio de cultivo: Agar EMB Medio de cultivo: Agar nutritivo Medio de cultivo: Agar Sabouraud Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4.3. TCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos Medio de cultivo: Agar Sabouraud Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Medio de cultivo: Agar EMB Medio de cultivo: Agar nutritivo Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 68

____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________

V. CUESTIONARIO
1. Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen? 2. Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia? 3. Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia? 4. Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado. 5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es necesario tocar una parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de siembra? 7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?

69

PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE COLONIAS

I.
-

OBJETIVOS
Aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial utilizadas en la identificacin de bacterias. Estudiar caractersticas culturales de crecimiento de los microorganismos en medio slido Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos en medio lquido

II. MARCO TERICO

GENERALIDADES: Para estudiar las caractersticas de los microorganismos (forma, estructura, tamao, consistencia, cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados segn el tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios slidos y lquidos. Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos. Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme. Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, adems de stas caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una identificacin completa. 70

La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una clula individual pero es la caracterstica de la masa celular. As pues, por ejemplo, la pigmentacin es aparente en la colonia, pero no en la clula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande. Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros. Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas. Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar.. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa. Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patgenos uno de los pigmentados ms importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares muy pequeos para verse con luz transmitida.

III. MATERIALES Y EQUIPO

Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior. 1 mechero Bunsen 2 asa bacteriolgica

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IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO

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SUPERFICIE Lisa Rugosa Plegada CONSISTENCIA (probarla con el asa) Cremosa Membranosa COLOR Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido Difusible o no. CARACTERSTICAS PTICAS LUZ TRANSMITIDA (observar a travs de la colonia) Opaca: no permite el paso de luz Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos Observados a travs de la colonia. Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a travs de la colonia. LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia) Opaca Brillante CULTIVO EN CALDO Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo Inoculado como son: Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento. Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar Crecimiento en caldo Nutritivo

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Crecimiento en medio semislido

PRESENTACIN DE RESULTADOS Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el Texto, las figuras: AGAR EN SUPERFICIE Bacteria Forma Borde Elevacin Superficie Consistenc ia Color Luz transmitid a Luz reflejada CALDO Bacteria Pelcula Turbidez 74

Sedimento

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MEDIO SEMISLIDO Bacteria Movilidad

IV. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y envejecido. 2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una caracterstica de forma de pelcula. 3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede corresponder? 4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene? 5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de hidratos de carbono?

76

PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO

I.

INTRODUCCIN
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la siguiente manera: Absorbancia = 2 - log % de transmitancia Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro. Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy til el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.

II. OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano. 2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.

III. FUNDAMENTO TERICO

77

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula aumentan en cantidad, en la mayora de organismos el crecimiento continuo hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas, proceso denominado fisin binaria. Cada una de las clulas hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromolculas, monmeros e iones inorgnicos. El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin,na entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das. 3.1. CURVA DE CRECIMIENTO Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo que ha crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas variables por minuto peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes: 1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie. 2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin celular y las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial. 3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metablicos txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin. 4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.

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Fases de Crecimiento
Latencia
Rezago Adaptacin

Exponencial
Logaritmo Divisn celular Crecimiento

Estacionaria
Nutrientes se agotan Acumulan metabolitos txicos Sesa crecimiento

Muerte
Declinacin

9,0 Log 10 organismos viables/ml

8,0

Viables

Turbidez (densidad ptica)

0,75 0,5

Densidad ptica

7,0

6,0

0,25

5,0 Tiempo

0,1

IV. PARTE EXPERIMENTAL

4.1 MATERIALES Y REACTIVOS - Cubres - Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo - Cubetas - Caldo Luria Bertani estril - Jeringa descartable de 10 cc. - Contmetro Equipo - Mechero Bunsen - Estufa de incubacin a 37C - Microscopio - Espectrofotmetro

V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo discontinuo (en un matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las clulas en fase de latencia, que proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida. Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rpido. La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inculo, de la temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo. Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado en la fase de crecimiento logartmica (log) o exponencial. 79

En este estadio las clulas crecen rpidamente, y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la mayora de las clulas se hallan en el mismo estado fisiolgico. La velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o tiempo de generacin). Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las clulas no estn todas en el mismo estado fisiolgico; algunas todava se estn dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la poblacin total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al nmero de clulas que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte. Realizacin (Fig. 1) (Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.) 1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin. 2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo Luria Bertani estril. 3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm). 4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Luria Bertani estril antes de cada medida. 5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas en refrigeracin hasta su lectura 6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.

80

V. CUESTIONARIO:
1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estril? 2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de multiplicacin de una bacteria? 3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.

81

PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS

I.

OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de contaje celular.

II. FUNDAMENTO TERICO

Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje de stas que son viables. Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje celular como el Cell Coulter. Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos basta con una cmara de contaje celular, por ej. La cmara de Neubauer, y un microscopio. Una cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo presente unas seales que determina un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen. La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 82

0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser: Concentracin en la suspensin (clulas / mL) == 10000 (x/4) En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopa. En la imagen puedes observar una cmara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prcticas.

El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar la cantidad de clulas microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones: 1) No se distinguen las clulas muertas de las clulas vivas. 2) Las clulas pequeas son difciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas clulas. 83

3) La precisin es difcil de lograr 4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teido la muestra. 5) El mtodo no es adecuado para suspensiones de clulas de baja densidad. En el asa de bacterias, en una suspensin de clulas con menos de 106 clulas por mililitro, se podran ver pocas o ninguna bacteria.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Cultivo de E. coli Matraz Cmara del Neubauer Estufa - Cultivo de levadura - Pipetas -Pipeta Pasteur - Microscopio

IV. METODOLOGA
CARGANDO LA CMARA Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea cantidad de suspensin con una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequea en la superficie pulida de la cmara de recuento cerca del extremo del cubre. La suspensin entrar en la cmara por capilaridad. Una cmara adecuadamente llenada contiene clulas solo en el espacio contenido entre el cubre y la cmara de recuento. No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.

V. CUESTIONARIO
1.- Investigue las caractersticas de: Cmara de cuenta de Petroff Hausser, equipos automticos de Contaje celular, Otros mtodos de recuento celular 2.- Indique como diferencia las clulas viables de clulas totales. 3.- Describa los mtodos directos e indirectos de contaje celular.

84

PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN PLACA

I.

OBJETIVOS

Aprender la tcnica de dilucin para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inculo.

II. INTRODUCCIN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin de colonias, la tcnica por vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estriles, se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra. Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la dilucin que corresponda permite estimar el nmero de microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado grupo de microorganismos. Esta tcnica permite la mayora de las veces cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY). Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.

TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION 85

Se dispondr de un batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se adicionar una cantidad de muestra liquida o slida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inculo que se aade en el tubo inicial. Se agitar hasta homogenizar. Con la pipeta estril se tomar una cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la dilucin deseada. Con la dilucin obtenida por ej. l0 -4 y 10-5 inocular en placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente estril. Incubar a temperatura ptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluye hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja solidificar.

III. MATERIAL REACTIVOS

Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tincin de Gram, Cajas Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml, Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodn, gasa, alcohol.

IV. METODOLOGA
SIEMBRA POR DILUCION Preparacin de reactivos y medio de cultivo: Solucin isotnica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo. Envolver cajas de Petri y pipetas.. Bajo condiciones estriles hacer las diluciones en la solucin isotnica estril, de acuerdo a la figura 1. Tomar 0.1 ml de la dilucin 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en cajas de petri bajo condiciones estriles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes Se realizar el conteo en placa por superficie. Incubar las cajas en forma invertida a 30C, de 24 a 48 horas. Considerar las siguientes reglas para la realizacin del reporte de la prctica: Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo. Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el nmero de colonias contadas se multiplica por 2. 501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas se multiplica por 4. >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el nmero de cuadros que ocupa la caja. El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la dilucin y considerar si la tcnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra). 86

Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49

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Fig. 1

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la preparacin y dilucin de muestras. Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45C, mezclar rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de la placa; dejar solidificar. Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas. Efectuar el recuento de microorganismos segn: a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias. b) Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilucin utilizada. Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, segn el caso c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relacin de los dos recuentos

V. RESULTADOS
Reportar el nmero de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir. Presentar descripcin de morfologa de colonias y microscpica. 88

89

VI. CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el aislamiento de microorganismos. 2. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de microorganismos. 3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el nmero de colonias por el inverso de la dilucin? 4. De los datos obtenidos en la prctica cules cree que sean congruentes y cules no y porque? 5. Por qu la incubacin se realiza con las placas en posicin invertida? 6. Qu finalidad tienen las diluciones y donde se requerirn ms diluciones, en muestra fresca o procesada, por qu?

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PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM

I.

OBJETIVO
Obtener ndulos de Rhizobium de races de alfalfa. Observacin microscpica de bacterias de Rhizobium

II.

FUNDAMENTO TERICO
La produccin agrcola basada en leguminosas es fundamental para la alimentacin humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello la interaccin natural de estas plantas con una bacteria del suelo a nivel de la raz, es ecolgicamente importante, como medida para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran el suelo y contaminan el ambiente. La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta a travs de los pelos radicales para que en la matriz de las clulas corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical de la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al ribosoma vegetal para la sntesis de protenas vegetales; simultneamente por la fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirn como fuente de carbono y energa para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta. Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicacin de fertilizantes qumicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de produccin y la contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable.

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GRUPOS DE INOCULACIN CRUZADA Y ASOCIACIONES Grupo de Inoculacin cruzada Grupo de alfalfa DE Rhizobium LEGUMINOSA Especies de Gnero Rhizobium hospedero R. meliloti Medicago Melilotus Trigonella Trifolium Leguminosa incluida Alfalfa Trebol dulce Alholva Trbol

Grupo del trbol

R. leguminosarum biovar trifolii

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Material Biolgico - Races de alfalfa con ndulos Matraces - Placa Petri - Pinzas bistur - Mecheros - Vasos PP 100 ml Reactivos - Agua destilada estril - Hipoclorito de sodio 2.5% - Bicloruro de Mercurio 0.2% - Medio PSA (papa sacarsa agar)

IV. METODOLOGA
1. Preparacin del Medio PSA Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las papas estn cocidas. Filtrar la solucin de coccin y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de sacarosa y 1.2 g agar agar autoclave 120C 15? Y proceder a plaquear 2. Observacin Microscopia de Bacterias de Rhizobium - Obtener los ndulos de Rhizobium de las races de alfalfa. - Caracterizar los ndulos segn posicin en las races, color, forma, tamao. - Lavar con agua destilada los ndulos y realizar diseccin del ndulo sobre un porta objeto y dejar caer el lquido interno para realizar un frotis. - Fijar el frotis de Rhizobium. 92

- Realizar coloracin Gram - Observacin en el microscopio a 100X 3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA Esterilizacin de ndulos - Disponer los ndulos en un matraz de 100 ml - Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar. - Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 8 minutos, decantar - Lavar con agua destilada estril 3 veces - Realizar la diseccin del ndulo con la ayuda de pinzas y bistur sobre papel estril. - Dejar caer el lquido interno del ndulo seccionado apretando con la pinza o pasar sobre la superficie del medio. - Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 27C en estufa, 5 das.

V. CUESTIONARIO
Qu otros medios se utilizaran para el cultivo de Rhizobium. Cul es la ruta metablica que utiliza el Rhizobium. Cul sera la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.

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PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS

I.

FUNDAMENTO TEORICO

La deteccin de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas constituye una prctica habitual en cualquier laboratorio de Bromatologa. Para ello se utilizan medios selectivos, indicadores y generales que nos permiten identificar desde el total de bacterias contaminantes (realmente slo se detecta una cierta parte de la poblacin total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial inters como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de procesos sufridos por el producto durante su manufacturado o almacenamiento.

II. PROCEDIMIENTO
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes: Escherichia coli Samonella typhimurium Proteus morganii Enterobacter aerogenes. El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en solucin fisiolgica, siguiendo el esquema que se representa a continuacin:

0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml 0.9 ml ClNa 0.9%

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MUESTRA

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios: 1) Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10 -5, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar comn, e incubarlas a 37C durante la noche en posicin invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de dilucin correspondientes. 2) Determinacin de bacterias coliformes. Se extiende 0.1 ml de las diluciones 10-5 y 10-4 sobre dos placas de agar MacConkey, incubndolas de la forma descrita. Una vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las rosceas y se multiplican ambos nmeros por los factores de dilucin. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se extiende un inculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a continuacin a 37C durante toda la noche. En este medio, confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias ms rosceas y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes. 3) Determinacin de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37C durante 24-48 horas. Sobre este medio Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo (una buena forma de detectar coliformes). Con estos datos, hay que deducir el nmero de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en caldo de urea y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul. Salmonella da negativo para ambas actividades. En TSI nicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer con precipitados negros (por produccin de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto de los caracteres siguientes: Fondo* S. typhimurium A+G P. morganii A+G (*) A indica produccin de cido y Pendiente Alcalino Alcalino G de gas. Ennegrecimient o S No

III. RESULTADOS

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FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRCTICAS

1.- SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10% PREPARACIN Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada 2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5% PREPARACIN Azul de metileno 5.0 gr Agua destilada 100 ml 3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA FRMULA: Cristal violeta 2.0 gr Etanol al 95% 20 ml Oxalato de amonio 0.8 gr Agua destilada 80 ml PREPARACIN: 1.- Disolver el cristal violeta en el etanol 2.- Disolver el oxalato en el agua 3.- Mezclar las dos soluciones B) SOLUCION DE LUGOL FORMULA Yoduro de potasio 10.0 gr Agua destilada 20.0 ml Yodo metlico 5.0 gr Etanol, aforar a 100.0ml PREPARACIN: 1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua 2.- Agregar el yodo metlico y disolver 3. Aforar a 100 ml con etanol C) SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA FORMULA Acetona 1 volumen Etanol al 95% 2 volmenes D) COLORANTE SAFRANINA FORMULA Safranina 0.5 gr Agua destilada 100.0 ml PREPARACIN Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus aforara a 100 ml con ms agua. 4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN A) COLORANTE FUCSINA FENICADA 96

FORMULA: Fucsina bsica 5.0 gr Fenol 25.0 grs Etanol al 95% 50 ml Agua destilada aforar a 500 ml PREPARACIN 1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a ebullicin 2.- Aadir la fucsina bsica y disolver 3.- Aadir el etanol y mezclar 4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO FORMULA cido clorhdrico 3.0 ml Etanol al 95 100.0 ml PREPARACIN Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando C) COLORANTE AZUL DE METILENO FORMULA Azul de metileno 5.0 gr Agua destilada 100.0 ml 5.- MEZCLA CRMICA Dicromatode potasio cido sulfrico concentrado Aguadestilada 20.0 gr 20.0 ml. 250.0 ml.

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BIBLIOGRAFIA
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General. Canoabo CARPENTER, Philip. 1969. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial Interamericana, S.H. Mxico. PELCZAR. 1990. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial. Mc Graw-Hill. Mxico. WALTER, W.G. 1980. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Continental. Mxico. GRASSINI, Luis. 1967. Microbiologa Agraria. UCV-Facultad de Agronoma. Caracas-Venezuela. BLAIR, J. 1970. Manual Clnico de Microbiologa. Bethesda. AMERAtlas, Ronald M. Ecologa Microbiana y Microbiologa ambiental . Pearson, Espaa, 2006. FARRAS, Ramn Pars J. Bioqumica de los Microorganismos. Ed. Revert, S.A., Espaa, 1997. INGRAHAM, John L. Introduccin a la Microbiologa. Ed. Revert, S.A., Espaa, 2000. JAY, James M. Microbiologa Moderna de los Alimentos, Ed. Acribia, S.A. Espaa, 1992. LEVEAU, J.Y. Microbiologa Industrial: Los microorganismos de inters industrial. Ed. Acribia, S.A. Espaa, 2000. OKAFOR, Nduka. Modern Industrial Microbiology and Biotechnology Science Publishers, United States of America, 2007. PRESCOTT, Lansing M. Microbiologa. McGraw Hill. Interamericana, Espaa 1999. TORTORA Gerard J. Introduccin a la Microbiologa. Ed. Acribia, S.A. Espaa, 2002. WAITES, Michael J. Industrial Microbiology: An Introduction , Blackwell Science Ltd, Oxford, 2001. WARD, Owen P. Biotecnologa de la Fermentacin, Ed. Acribia, S.A. Espaa, 1991.

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