Hibridacin fluorescente in situ

Hibridacin fluorescente in situ

FISH o hibridacin fluorescente in situ es una tcnica citogentica de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y permiten la visualizacin, distincin y estudio de los cromosomas as como de las anomalas que puedan presentar. Esta tcnica permite la rpida determinacin de aneuploidas, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, as como la adjudicacin de un marcador gentico a un cromosoma (cartografa gentica).

FISH metafsico en humanos. En amarillo, el cromosoma 2.

Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los ms propensos a sufrir anomalas. Estn relacionados a enfermedades como el sndrome de Patau (13), el sndrome de Edwards (18), el sndrome de Down (21), el sndrome de Turner (X) y el sndrome del superhombre (Y), entre otros. Sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta tcnica. FISH usa segmentos de una nica hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma especfico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. En un principio se empleaban sondas de carcter radiactivo, pero este tipo de marcaje fue reemplazado por los fluorforos por mayor seguridad, eficacia y facilidad de deteccin. La tcnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase.

Protocolo bsico
El primer paso de la tcnica consiste en la desnaturalizacin del DNA para separar la doble hlice. A la muestra desnaturalizada se le aade entonces la sonda de inters (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a las regiones especficas para las que han sido diseadas. Despus, se tien los ncleos con un color de contraste inespecfico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con molculas fluorescentes denominados fluorforos (mtodo directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (mtodo indirecto). Por ltimo, se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

FISH en metafase
Cuando las clulas estn en metafase, sus cromosomas se encuentran FISH interfsico en ratn. condensados a modo de preparacin para la divisin celular. Para detenerlas en metafase, se emplea colchicina, un agente despolimerizante de los microtbulos encargado de separar las cromtidas hermanas de un cromosoma, impidiendo as el avance de la divisin celular. Este tipo de FISH se utiliza para detectar microdeleciones especficas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son: Los csmidos son secuencias nicas que hibridan con fragmentos pequeos. Se emplean en estudios de microdeleciones. Las sondas satlites estn formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrmeros. En la mayora de los casos son especficas de cada cromosoma. Se usan para determinar

Hibridacin fluorescente in situ aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores. Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma y as marcar el cromosoma completo. Se usan para ver translocaciones. En la imagen que acompaa el texto se muestra un ejemplo de uso de una sonda completa para el cromosoma 4, en el que destacan las dos copias de dicho cromosoma sobre el resto.

FISH en interfase
No siempre es posible tener ncleos fijados en metafase para realizar el FISH, y los resultados obtenidos no sern tan especficos. Sin embargo, el FISH en interfase tiene la ventaja de que no es necesario cultivar previamente las clulas durante diversos das antes de poder analizar sus cromosomas. Adems, cuando las clulas se encuentran en interfase, la cromatina est en torno a 10 000 veces ms descondensada que en metafase, lo cual permite una mayor resolucin a la hora de detectar anomalas pequeas. Se emplea sobre todo para la deteccin de aneuploidias o grandes deleciones, duplicaciones. No es posible distinguir entre un cariotipo normal y un cariotipo que presente una translocacin equilibrada. Adems, puede ser empleado en el anlisis de tumores slidos, que se dividen con muy poca frecuencia. Una forma reciente derivada del FISH inverso son los arrays de CGH (del ingls "Comparative Genomic Hybridization"), que estn desplazando a tcnicas como FISH y el cariotipo.

Otras variantes de FISH

FISH en hebra
Este tipo de FISH (tambin llamado "Fiber FISH" o "Halo FISH") se aplica sobre hebras de ADN desproteinizadas (es decir, desprovistas de las histonas encargadas de su compactacin). Se extiende linealmente y de forma mecnica en un porta el fragmento de cromosoma a estudiar. Se observarn puntos discontinuos por rotura de la hebra de ADN. Esta tcnica permite detectar pequeas reorganizaciones porque admite una mayor resolucin (permite incluso la visualizacin de genes individuales). La tcnica puede ser usada para detectar deleciones en clones y para estimar huecos en los proyectos genoma.

FISH inverso
Por su parte, el FISH inverso es una tcnica que se usa mucho para determinar la procedencia de un cromosoma marcador. Este tipo de FISH tiene la peculiaridad de ser el ADN problema el que se marca. El procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de un porta donde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se encuentran teidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A continuacin, ponemos los cromosomas de un donantes sin anomalas (generalmente procedente de sus linfocitos y de un varn para contemplar todas las opciones, es decir, tener los cromosomas X e Y) en un porta y aadimos la sonda preparada. Esperamos ver que hay hibridacin de la sonda (cromosoma marcador) con alguno de los cromosomas del donante por complementariedad en su secuencia. As, podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida. Una vez identificado, el cromosoma marcador pasara a ser llamado un cromosoma derivativo.

Hibridacin fluorescente in situ

FISH on a chip
Esta nueva variante de la tcnica FISH, ha surgido como una forma de automatizar los estudios de muestras por el mtodo convencional. Esta nueva tcnica conlleva numerosas ventajas, como la necesidad de utilizar menor cantidad de reactivos, el empleo de un menor nmero tiempo de anlisis (ya que en menos de una hora se pueden analizar los ncleos, frente a las 2-3 horas que precisa el procedimiento de FISH convencional), su rapidez para la obtencin de resultados, su alta sensibilidad o su menor coste, con comparacin con la tcnica convencional de FISH. La principal aplicacin de este novedoso sistema es en el campo del diagnstico clnico, sobre todo en el estudio de enfermedades neuronales, como es el caso de la enfermedad del Alzheimer en su estado temprano, aunque no se descarta su uso en otros campos como en la industria alimentaria.
Anlisis de una muestra de sangre por la Se emplea un chip microfludico con estrechos canales, por los que se tcnica FISH on chip: Se introduce la muestra hace pasar la suspensin celular purificada por capilaridad, lavada de sangre en el chip por capilaridad. Se aade la previamente con PBS. Una vez adheridas o fijadas las clulas a los protena K para digerir las clulas y se canales por calor, digerimos las clulas mediante la adicin de desnaturaliza su ADN con calor. A continuacin se introducen las sondas y se dejan hibridar con el proteinasa K y desnaturalizamos su material gentico, nuevamente por ADN diana. un incremento de temperatura. Tras estos pasos, ya pueden ser aadidas las sondas y reactivos necesarios, que difundirn a lo largo de todo el canal, pudiendo observar los ncleos bajo el microscopio en el mismo chip y de manera ordenada.

FISH on chip es una tcnica muy til para detectar anomalas cromosmicas (aneuploidas), entre otros defectos. En el caso del Alzheimer, es habitual utilizar muestras de linfocitos procedentes de sangre perifrica, fibroblastos o muestras de orina.

FISH multicolor
El FISH Multicolor, M-FISH o SKY (Spectral Karyotiping) es una adaptacin del FISH que permite la visualizacin de los 23 pares de cromosomas a la vez, teidos con diferentes sondas fluorescentes. A nivel comercial slo hay 5 colores distintos posibles, por lo que se puede usar la sonda de un color concreto o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. El sistema de deteccin del equipo empleado debe estar adaptado a los 5 colores. Un programa informtico se encarga de analizar las imgenes y formar el cariograma: organiza los cromosomas de acuerdo a la emisin de las sondas que tiene integradas y las combina hasta dar las 23 combinaciones. Se utiliza con frecuencia en el estudio de clulas tumorales. El poder de dicho mtodo reside en su habilidad para: Determinar rpidamente si hay algn cromosoma adicional en el cariotipo y de qu cromosoma se trata, porque su color permitir identificarlo. Determinar si est presente algn cromosoma translocado y qu cromosomas estn implicados en la translocacin por la combinacin de dos colores asociados a cromosomas diferentes en un mismo cromosoma. Rpida identificacin de material cromosmico de un cromosoma que haya sido insertado en otro cromosoma por la variacin del color del fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma. Identificacin de cromosomas pequeos o fragmentados que frecuentemente implican el problema de averiguar su origen, como es el caso de los cromosomas marcadores.

Hibridacin fluorescente in situ Estas aplicaciones del SKY se deben a que cada cromosoma est teido completamente de un nico color (de una nica sonda) y por eso, viendo el color que van a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que anomala presenta el paciente. Sin embargo, aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo tradicional, tiene una serie de desventajas que han frenado su uso, especialmente el uso clnico. Estas son: El elevado precio Menor definicin que el FISH convencional. Slo se pueden ver cromosomas y traslocaciones grandes, sin poder observar bandas.

Aplicaciones
Esta tcnica ha resultado ser muy til en el campo de la medicina reproductiva, con aplicacin en el diagnstico gentico preimplantatorio (DGP). Resulta una forma muy precoz de diagnstico que, apoyndose en las tcnicas de reproduccin asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser transferidos al tero materno y, por consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantacin embrionaria. Para el anlisis de anomalas cromosmicas embrionarias, tanto numricas como estructurales, puede utilizarse la tcnica DGP-FISH. Para este fin se requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una clula del embrin en cultivo "in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el ncleo en interfase y se hibrida con sondas especficas para el estudio cromosmico de la patologa que se sospecha pueda estar presente en el embrin. Entre las anomalas cromosmicas que pueden ser analizadas, caben citarse: Anomalas numricas. Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica que, en muchos casos, slo se den defectos leves en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir asociado, en mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos de sndrome de Klinefelter, trisoma X y monosoma X. Edad materna avanzada, aborto de repeticin de causa desconocida y/o fallo de implantacin: Ms de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos, la seleccin de aquellos embriones normales para los cromosomas citados, aumenta las probabilidades de conseguir una gestacin a trmino. Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar las alteraciones cromosmicas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a la tcnica de microinyeccin intracitoplasmtica del espermatozoide (ICSI). Anomalas estructurales.Surgen espontneamente, en la mayora de los casos, como consecuencia de un fallo de meiosis durante la oognesis o espermatognesis, en los casos en que los padres presentan cariotipos normales. Algunas veces, algn miembro de la pareja puede ser portador de una anomala estructural equilibrada, que podra transmitir a su descendencia. De esta manera, por medio del estudio gentico especfico de embriones de la pareja portadora, podran distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromosmicamente de los equilibrados. Un vez hecha esta seleccin de embriones, podran transferirse con total tranquilidad al tero materno los embriones que no presentan la alteracin gnica. Una aplicacin adicional del FISH en interfase es obtener mayor informacin sobre la organizacin de los cromosomas en el ncleo interfsico (los llamados territorios cromosmicos). Adems de ser til para realizar diagnsticos preimplantatorios, el FISH tiene aplicacin en medicina para detectar enfermedades y determinar el pronstico de las mismas, as como para evaluar la remisin de algunas enfermedades, como el cncer. Con FISH es posible diagnosticar enfermedades incapaces de ser detectadas por otros mtodos

Hibridacin fluorescente in situ tradicionales que implicaban el anlisis de cromosomas en metafase. Adems su utilizacin es mucho ms sencilla que los mtodos citogenticos ms habituales, los cuales requieren clulas en divisin, as como un mayor esfuerzo en tiempo y trabajo para la preparacin manual y anlisis de las muestras. Tambin puede utilizarse para la deteccin directa de patgenos a partir de sangre o restos de tejidos de un paciente. Esto supone una gran ventaja teniendo en cuenta que muchos microorganismos no son cultivables en condiciones de laboratorio. El FISH tambin se usa para comparar genomas de dos especies biolgicas y deducir relaciones evolutivas. Asimismo, se puede usar en el rea de la Ecologa Microbiana para identificar microorganismos dentro de un biofilm, as como para observar su distribucin y localizacin dentro del biofilm o realizar ensayos de colocalizacin utilizando sondas de distinto color para cada microorganismo.

Enlaces externos
Cytogeneticists can now go "FISH-ing" for chromosomal abnormalities, which are deletions and duplications that can cause disease. How exactly does FISH work? [1] Fiber-FISH: Fluorescence In Situ Hybridization on Stretched DNA, Methods in Molecular Biology [2] Fish-on-a-chip: a sensitive detection microfluidic system for alzheimer's disease, Journal of Biomedical Science
[3]

Referencias
[1] http:/ / www. nature. com/ scitable/ topicpage/ fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327 [2] http:/ / link. springer. com/ protocol/ 10. 1385%2F1-59259-793-9%3A395 [3] http:/ / www. ncbi. nlm. nih. gov/ pmc/ articles/ PMC3125339/

Fuentes y contribuyentes del artculo

Fuentes y contribuyentes del artculo

Hibridacin fluorescente in situ Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=65042999 Contribuyentes: Acratta, Belb, DMG0708 idelsai, GermanX, Hortelano, Jorge c2010, Midi.900, Natrix, Nubecosmica, Retama, Roto2esdios, UPO649 1011 abiglrom, UPO649 1011 clmilneb, UPO649 1011 mdlimgar, UPO649 1011 mperalc, UPO649 1011 omjimmar, UPO649 1112 aandgar, UPO649 1112 ebatsan, UPO649 1112 fdlahmar, UPO649 1112 jvingon, UPO649 1112 mrebama, UPO649 1112 prodgom, UPO649 1213 MJCONDUS, UPO649 1213 amunlop1, UPODMG 1213 blarama, UPODMG 1213 jjimlop, UPODMG 1213 mmkon, 9 ediciones annimas

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