MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGA CLNICA

INTRODUCCIN 1.- PREPARACIN DE LAS MUESTRAS CLNICAS 1. 2. 3. 4. Criterios para la obtencin, transporte y recepcin de muestras microbiolgicas. Criterios de rechazo de muestras clnicas. Muestras desaprobadas debido a su cuestionable informacin. Prioridad de las muestras

2- CONTROL DE CALIDAD 1. 2. 3. 4. 5. Control de calidad de los medios de cultivo. Control de calidad de reactivos. Control de calidad de tintes. Control de calidad de antisueros. Control de calidad de la prueba de sensibilidad a los antibiticos. a) Control de calidad del medio de cultivo. b) Control de calidad de los discos de sensibilidad a los antibiticos. c) Control de calidad de la lectura e interpretacin. d) Control de calidad de la sensibilidad a los antibiticos en los sistemas computarizados. Control de calidad de equipos y materiales de trabajo. Control de calidad de equipos computarizados. Control de calidad de frmulas lcteas y mamaderas. Control de calidad del agua destilada.

6. 7. 8. 9.

3.- EL CEPARIO 1. 2. 3. 4. Mtodos de conservacin de cepas bacterianas. Mantenimiento del cepario Cepas ATCC Transporte de cepas bacterianas

4.- SUPERVISIN DE PERSONAL 1. 2. 3. 4. 5. Evaluacin del personal Programa de Docencia Evaluacin del informe final Control de calidad externo. Certificacin del Laboratorio de Microbiologa.

5.- PROFORMAS DE REPORTES DEL CONTROL DE CALIDAD 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Libro de reporte de control de calidad de medios en platos. Libro de reportes de control de calidad de medios en tubos. Libro de reporte de control de calidad de antisueros y reactivos. Libro de reporte de control de calidad de frmulas lcteas y mamaderas. Libro de reporte de control de calidad de la sangre de carnero. Libro de reporte de control de calidad de los discos de sensibilidad a los antibiticos. Libro de control del cepario.

6.- GLOSARIO DE TRMINOS ESTADSTICOS

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7.- BIBLIOGRAFA

MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGA CLNICA

INTRODUCCIN El laboratorio clnico de microbiologa moderno, requiere para su correcto funcionamiento de un adecuado y constante control de calidad sobre todas las etapas en el recepcin, manejo y reporte de especimenes (muestras) clnicos. En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar metodologas relativas al cuidado del paciente. En este contexto el control de calidad en Microbiologa Clnica envuelve el monitoreo de los medios de cultivos, reactivos, instrumentos, procedimientos y el personal, para asegurar una adecuada prctica en el aislamiento, identificacin y caracterizacin de agentes etiolgicos y su correspondiente prueba de susceptibilidad como una gua de la terapia. Un programa de control de calidad debe incluir adems un Manual de Procedimientos, validacin de metodologas y equipos, el desarrollo de ciclos de educacin continuada, elementos de bioseguridad y una supervisin sobre los reportes generados. En ste sentido se hace nfasis en la correcta valoracin de las pruebas de laboratorio, los agentes causales de enfermedades, el conocimiento de la flora normal, la taxonoma bacteriana y la interpretacin correcta de las pruebas de susceptibilidad a los antibiticos. El Aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto ms difcil de cuantificar que el control de calidad, ya que su foco es el impacto de las pruebas de laboratorio en el cuidado del paciente. Este control nos indica que tan bueno es nuestro trabajo y establece mecanismos para asegurar la generacin de informacin de utilidad clnica rpida y segura. Este concepto incluye entrenamiento y calificacin del personal, evaluacin de los reportes, rapidez y seguridad diagnstica, certificacin de los laboratorios, controles externos, etc. El Control de Calidad y el Aseguramiento de la Calidad son similares en sus propsitos, aunque su significado y su manera de funcionar sean diferentes; sin embargo, ambos conceptos deben desarrollarse interactivamente durante un programa de control de calidad. El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo, que el producto final del trabajo tenga un grado aceptable de seguridad, de conformidad con los limites establecidos. Debido a que la mayora de los resultados en microbiologa son producto de interpretaciones y evaluacin de reacciones bioqumicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del evaluador tienen un gran valor, los clculos de coeficientes de variacin y desviaciones estndares que son parte de funciones analticas, tienen poca aplicacin en el laboratorio de microbiologa. Es por ello que algunos expertos consideran que el control de calidad en microbiologa es mas un arte que una ciencia. Un programa de control de calidad debe contar con los siguientes elementos mnimos: Las pruebas y los procedimientos. Verificacin y validacin del test. Manual de procedimientos. Mantenimiento de reportes y libros de registros. Evaluacin del personal. Controles externos.

El programa evala y documenta el desempeo de todos los aspectos de un procedimiento. Esto incluye la calidad del espcimen, la eficiencia de los reactivos, medios e instrumentos y verifica los resultados del test por errores.

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El Manual de Procedimientos del laboratorio de microbiologa, debe contener todos los aspectos relevantes en la operacin del laboratorio y la generacin de reportes que tienen que ver con la salud de los pacientes. El factor ms importante en la generacin de reportes microbiolgicos de calidad corresponde al personal. El personal del laboratorio de microbiologa debe ser escogido en base a sus cualidades acadmicas y personales. Debe poseer habilidad para ejecutar pruebas complejas, la mayora de las veces manuales, inters en mantenerse al da en las ejecutorias y taxonoma bacteriana, excelente concepto de proteccin de grupo y de bioseguridad en general. El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad de los materiales, reactivos y equipos empleados, mejora la auto confianza del personal, detecta fallas que pueden reflejarse en el informe de resultados y en general provee un entorno de excelencia en todos los aspectos del trabajo. Conociendo los elementos bsicos que debe poseer un programa de control de calidad moderno, los albores de un nuevo milenio nos obligan a la confeccin de un Manual que pueda ser una gua para el personal dedicado a la microbiologa clnica en el pas, una disciplina de las Ciencias del Laboratorio en constante evolucin que marcha a la par del progreso de la medicina moderna.

1.- PREPARACIN DE LAS MUESTRAS CLNICAS 1.1. CRITERIOS PARA LA OBTENCIN, TRANSPORTE Y RECEPCIN DE MUESTRAS CLNICAS En trminos de la efectividad del laboratorio de microbiologa, nada es ms importante que la apropiada seleccin, recoleccin y transporte de las muestras clnicas. Por ello todo el personal que tiene que ver con estas responsabilidades, debe comprender lo determinante que es el mantenimiento de la calidad de la muestra, en la evaluacin e informe de un espcimen clnico. Es responsabilidad del laboratorio proveer sta informacin en forma clara y que sea fcilmente incorporada en la metodologa de trabajo de todas las salas de atencin y hospitalizacin, el cual debe estar siempre accesible al personal de enfermera y mdicos como una referencia. Independientemente del hecho de que algunos tipos de muestras requieren metodologas de coleccin muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben tenerse en cuenta en la recoleccin de las muestras clnicas: La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso. Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar la contaminacin con microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal puede interferir con la interpretacin del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiolgico de la enfermedad. Seleccione el tipo anatmico correcto donde se obtendr el espcimen, y utilizar la tcnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtencin. En el caso de investigar microorganismos anaerbicos, la biopsia y el aspirado con aguja, son las muestras de eleccin. Los hisopos y sistemas tipo Culturette son los menos deseables para este fin. Nunca refrigerar una muestra pora anaerobios Coleccionar un apropiado volumen de muestra. Insuficiente material puede ser causa de resultados falso-negativos. Identificar cada muestra con: un cdigo propio del laboratorio, el nombre del paciente, nmero de identificacin personal (Nmero de seguro social o Cdula de identidad personal), procedencia, tipo de muestra, fecha de coleccin e iniciales del funcionario que tom la muestra. Colocar la muestra en un receptculo adecuado para su transporte con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y mantener las medidas de bioseguridad apropiadas. Ordenar siempre un frotis por Gram para los especmenes que proceden de cavidades aspticas, y anotar su inters en determinado microorganismo.

GUA PARA LA COLECCIN DE ESPECIMENES CLNICOS a) ABSCESOS, FSTULAS y HERIDAS Limpiar la superficie del absceso o herida con solucin salina estril o alcohol etlico al 70%. Si el absceso es cerrado, preferiblemente aspirar con aguja la muestra de la base o de la pared de la lesin Cultivar pora anaerobios tambin.

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En caso de absceso abierto, fstula o herida, introduzca un hisopo profundamente dentro de la lesin, sin tocar el rea superficial ya que puede introducir en la muestra bacterias que estn colonizando la superficie y no estn envueltas en el proceso infeccioso. No cultivar lesiones secas, a menos que est presente el exudado. De ser necesario, refrigerar la muestra hasta por 1 hora antes de enviar al laboratorio. No enviar solo pus, ya que sta no es representativa de la lesin. La base y bordes activos de la lesin son ms apropiados.

b) HEMOCULTIVOS Desinfectar el tapn de caucho del frasco de hemocultivos con alcohol etlico al 70%. No utilice solucin de yodo para limpiar el caucho. Aspticamente desinfectar el sitio de la venopuncin con alcohol etlico al 70% y luego con una preparacin de yodo en crculos concntricos hacia fuera del sitio elegido. Espere que el yodo seque y realice la puncin sin palpar de nuevo. Coleccionar la muestra de sangre a razn de 0.5 2 ml para nios y 5-10 ml para adultos en cada frasco. El volumen de sangre a cultivar es el factor ms importante en la recuperacin del microorganismo. Cada frasco debe ser servido con una puncin diferente en diferentes tiempos, a menos que utilice a la vez frascos para organismos aerbicos y anaerbicos. Nunca llenar todos los frascos con sangre provenientes de una sola puncin. No tomar sangre del catter, a menos que se est realizando un estudio epidemiolgico.

c) QUEMADURAS Limpiar y desbridar la superficie de la quemadura antes de proceder a coleccionar la muestra. Una pequea cantidad de tejido puede ser apropiada para el cultivo. Si hay supuracin utilizar un Culturette. Solicitar cultivo aerobio solamente.

d) CATTER Limpiar la piel alrededor del catter con alcohol etlico al 70%. Aspticamente remer el catter y cortar 5 cm de la punta distal y colcar en un tubo o envase estril sin medio de cultivo. Transportar inmediatamente al laboratorio para prevenir la desecacin. Catteres i.v aceptables para cultivos semicuantitativos son: Central, CVP, Hickman, Broviac, perifrico, arterial, umbilical, hiperalimentacin, SwanGanz.

e) LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Aspticamente desinfectar con tintura de yodo al 2%. Insertar una aguja con estilete en el inter espacio L3-L4, L4-L5 ( nios ) L5-S1. Medir la presin del lquido. Coleccionar de 1 3 mL de LCR en 3 tubos estriles previamente rotulados. Ordenar en los tubos: Qumica, celularidad, frotis, cultivo, aglutinaciones. Si no logra obtener suficiente lquido, enviar lo colectado al laboratorio de microbiologa primero. Enviar inmediatamente al laboratorio. Nunca refrigerar el lquido cefalorraqudeo. En la requisicin con los datos del paciente indique la edad y si ha habido antibioterapia previa.

f) ULCERA DE DECBITO

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Limpiar la superficie con agua jabonosa y solucin salina estril. Tome una muestra de biopsia de tejido o un aspirado con jeringuilla de la lesin. Un hisopo no es la mejor escogencia para colectar la muestra, sin embargo, cuando no es posible de otra forma, presione vigorosamente el palillo en la base de la lesin para tomar la muestra.

g) OIDO La timpanocentesis est reservada para casos complicados, recurrentes, que no responden a la antibioterapia y otitis media crnica. El espcimen de escogencia es un aspirado del tmpano, ya que ste fluido representa el proceso infeccioso, no as la flora del canal externo del odo. El hisopo no es recomendado para la coleccin de muestra para diagnosticar otitis media, ya que puede contaminarse con la flora externa. Solo en caso de ruptura del tmpano, se puede usar el hisopo para recoger el lquido. En ste caso se debe limpiar previamente con un antisptico el canal del odo externo. Indircar en la orden mdica si se trata de secrecin de odo interno, o externo o lquido de timpanocentesis. No refrigerar la muestra. No solicitar cultivo por anaerobios. Transportar la muestra rpidamente al laboratorio.

h) OJOS Tomar muestra de cada ojo con diferentes hisopos previamente humedecidos con solucin salina estril, rotando el algodn por la superficie de la conjuntiva. Esto es independiente de que solo un ojo est infectado, ya que la muestra del ojo sano puede servir de control de la flora normal del paciente, y compararlo con el reporte del ojo infectado. Indicar en la muestra, en los medios enviados y en la orden mdica, si es ojo derecho o izquierdo en cada caso. Inocular directamente en medios de agar chocolate, agar sangre, sabouraud-dextrosa agar y tioglicolato. Utilizar otro hisopo para colectar muestra para frotis, el cual debe ser inmediatamente colocado en la placa. En el caso de raspado corneal, el mtodo es el mismo, solo que se utiliza una lanceta o aguja estril para realizar el raspado de la lesin y se adiciona una placa para frotis por KOH. No utilizar el trmino ojo o ocular para identificar la muestra. Sea ms especfico al describirla: Secrecin conjuntival, secrecin corneal, secrecin acuosa o vtrea, etc.

i) HECES Colocar la muestra dentro de un envase limpio, con cierre hermtico y no necesariamente estril. No solicitar frotis por Gram. No cultivar si la muestra es dura o bien formada. No se recomienda el uso de Culturette, salvo para infantes y pacientes con diarrea activa. Si lo utiliza, recolectar ms de 2 g de muestra. Para estudios por Rotavirus y Clostridium difficile, enviar solo muestra diarreica, y no utilice hisopo. 1) LQUIDOS CORPORALES: LIQUIDO PERITONEAL, ASCITICO, BILIS, SINOVIAL, PERITONEAL, PERICARDICO, PLEURAL Y TORACICO : Desinfectar el rea con tintura de yodo al 2%. Obtener la muestra va aspiracin con aguja percutanea o ciruga. Transportar inmediatamente al laboratorio.

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Puede enviar la muestra para cultivo inoculndola en una botella para hemocultivos. Antelo en el rtulo. Siempre enviar una apropiada cantidad de lquido, dependiendo de las pruebas que requiera. Nunca enviar la muestra en hisopo.

k) LIQUIDO AMNITICO: Coleccione por aspirado va amniocentesis, cesrea o catter intrauterino. La aspiracin de la secrecin vaginal no es aceptable debido a contaminacin por la flora vaginal normal. Puede enviar en un tubo estril o en un sistema de transporte para anaerobios.

l) SECRECIN DE GLANDULA DE BARTHOLINO : Limpie los genitales externos con agua y jabn y descarte el exceso de secrecin. Pus del absceso de la glndula puede ser colectado por palpacin digital del ducto. Solicite frotis y cultivo por Gonococos. Aspire el lquido del ducto preferiblemente con aguja y jeringuilla. Puede utilizar un sistema de transporte para anaerobios.

m) CERVICAL O ENDOCERVICAL : Visualice el crvix utilizando un especulo sin lubricante. Limpie el excedente de secrecin. Remueva la mucosa y secrecin del canal con un hisopo y descrtelo. Con un nuevo hisopo estril de alginato de calcio, dacrn o algodn no txico, obtenga muestra del canal endocervical. Preferiblemente inocule la muestra en un plato de Thayer-Martin y el resto envelo al laboratorio. Con otro hisopo coleccione muestra para colocarla en una placa para frotis. Un cultivo anal puede ser colectado para acompaar la muestra cervical cuando se sospecha N.gonorrhoeae, ya que el recto podra ser el nico sitio positivo posttratamiento. No refrigere la muestra. Enve pronto al laboratorio de microbiologa.

n) VAGINAL : El cultivo rutinario de secrecin vaginal no es apropiado debido a la presencia de alto nmero de microorganismos saprofitos en el rea que hacen difcil la interpretacin del cultivo. Descarte el exceso de secreciones externas Obtenga la secrecin de la mucosa vaginal con un palillo estril no txico o con una pipeta. Con otro palillo obtenga una muestra y colquela en una placa para frotis directo. Esta placa puede servir tambin para confirmar vaginosis bacteriana, candidiasis vaginal o Tricomoniasis. No solicite cultivo por anaerobios.

o) SECRECIN URETRAL DAMAS : Colecte la muestra al menos 1 hora despus que el paciente a orinado. Remueva el exudado del orificio uretral. Colecte la descarga de material en un hisopo no txico por masaje de la uretra. Si no hay descarga, lave la uretra externa con jabn Betadine y enjuague con agua. Inserte un hisopo 2 a 4 cm dentro de la uretra y rote el palillo. Enve la muestra rpidamente al laboratorio.

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p) SECRECIN PROSTTICA: Colecte la muestra al menos 1 hora despus que el paciente a orinado. Limpie el meato urinario con jabn antisptico y agua. Proceda a masajear la prstata a travs del recto. Coleccione el fluido en un hisopo estril y no txico o en un tubo estril. Tambin es muy til para recuperar gonococos el cultivo de orina despus del masaje prosttico.

q) SECRECIN URETRAL VARONES : Colecte la muestra al menos 1 hora despus que el paciente ha orinado. Inserte un hisopo urogenital 2-4 cm dentro del lumen de la uretra. Rote el hisopo.. Preferiblemente inocule directamente en un medio de Thayer-Martin. Utilice otro hisopo para tomar muestra para el frotis directo. La placa debe ser hecha en el sitio. No refrigere la muestra. Enve rpidamente al laboratorio. Solicite antgenos por Chlamydia y cultivo por Mycoplasma. No solicite cultivo por anaerobios.

r) NASAL : Inserte un hisopo humedecido con solucin salina estril +/- 2 cm dentro de la fosa nasal. Rote el hisopo contra la mucosa nasal. Colquelo en un medio de transporte. Enve al laboratorio El cultivo de la fosa nasal anterior, solo est reservado para la deteccin de portadores de Staphylococcus aureus y/o Estreptococos betahemolticos o en caso de lesin. No refrigere la muestra. El cultivo nasal no predice el agente etiolgico de infecciones en odo medio o el tracto respiratorio inferior. No cultive por anaerobios.

s) NASOFARINGEO: La muestra debe ser tomada evitando la contaminacin con la flora nasal u oral. Lentamente inserte un hisopo de alginato de calcio dentro de la nasofaringe posterior, va fosas nasales. Puede usar un especulo nasal. Rote lentamente el hisopo para absorber secrecin. Inocule en medios de agar sangre y agar chocolate en el sitio o enve al laboratorio. La muestra nasofarngea es muy til para detectar portadores de Meningococos o en caso de sospecha de tos ferina. El cultivo rutinario de la nasofaringe no es recomendado.

t) FARINGE : Utilizando un depresor lingual presione la lengua hacia abajo para observar los pilares de la faringe y el rea tonsilar para localizar el rea de inflamacin y exudado. Utilizando un hisopo de alginato de calcio o de Dacrn, rote el mismo sobre el rea de exudado, las tonsilas y faringe posterior. No toque el resto del rea de la cavidad oral o los dientes. Enve al laboratorio. Si el transporte demora, refrigere el Culturette hasta por 1 hora.

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No solicite frotis directo de faringe. Indique si requiere cultivo o prueba directa de deteccin de antgenos. Indique si hay sospecha de otro patgeno diferente a Estreptococos betahemolticos ( Ejemplo N. Gonorrhoeae ). El cultivo de faringe est contraindicado en pacientes con epiglotis inflamada.

u) ESPUTO POR EXPECTORACION : El esputo podra no ser la muestra apropiada para determinar el agente etiolgico de neumona bacteriana. La sangre, el lavado bronquial o el aspirado transtraqueal son mas seguros. Es recomendable que la muestra sea tomada en la maana al levantarse. Haga que el paciente se enjuague la boca con agua antes de expectorar, para remover la flora superficial oral. Si el paciente tiene dentadura postiza, se la debe quitar. Instruya al paciente para que tosa con fuerza y profundo, tal que obtenga un esputo que provenga del tracto respiratorio inferior. Explquele que es el esputo. Depositarlo directamente en un envase estril. No colecte saliva ni fluido post-nasal. Ordene un frotis por gram para confirmar la validez del esputo. Para pacientes peditricos que no pueden producir la muestra apropiada, un terapista respiratorio puede colectar la muestra por succin. Si la muestra no puede ser llevada al laboratorio, puede refrigerarse. Indique en la orden mdica los microorganismos de inters, ya sea por bacterias, hongos o micobacterias, cada una con un formulario diferente. Para el diagnstico de la tuberculosis colecte 2 muestras en das consecutivos.

v) ESPUTO INDUCIDO : Haga que el paciente se enjuague la boca con agua. Con ayuda de un nebulizador, haga que el paciente inhale aerosoles de una solucin salina estril al 3-10%. Colecte el esputo inducido en un envase estril.

w) ASPIRADO TRAQUEAL : Colecte el espcimen a travs de una traqueotoma o tubo endotraqueal. Con cuidado pase el catter de polyetileno a travs del sitio dentro de la trquea. Aspire el material de la trquea utilizando una jeringuilla o un succionador intermitente. Remueva el catter y descarte la jeringuilla. Enve al laboratorio. No refrigere la muestra.

x) ASPIRADO TRANSTRAQUEAL : Utilice este mtodo cuando su resultado puede influir grandemente en la terapia, cuando los procedimientos no invasivos no han sido productivos, cuando la infeccin no est siendo controlada, cuando se sospeche infeccin por anaerobios o cuando el paciente est comatoso. Anestesie la piel del sitio de la coleccin y prepare aspticamente el rea. Inserte una aguja calibre 14 a travs de la membrana cricotiroidea. Pase un catter de polyetileno calibre 16 a travs de la aguja hacia la trquea inferior. Remueva la aguja. Aspire la secrecin con una jeringuilla de 20 ml o un succionador. Si la secrecin es escasa, inyecte lentamente de 2 a 4 ml de solucin salina estril para inducir la tos, lo que usualmente produce un adecuado espcimen.

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Enve el envase colector con el tubo incrustado al laboratorio prontamente. Evite la entrada de aire al envase colector. No refrigere la muestra.

y) MUESTRA POR BRONCOSCOPIA : Colecte el espcimen va broncoscopio. El cepillado bronquial es preferido al lavado, ya que el lavado es ms diluido. Anestesie el rea con Lidocaina tpica al 2% preferiblemente. Haga que el paciente inhale por la boca y exhale por la nariz. Lubrique ambas fosas nasales con Xylocaina en jalea. El paciente pudiera necesitar Demerol intravenoso para tolerar el broncoscopio. Lubrique el broncoscopio con Xylocaina al 2% en jalea, evitando tocar la punta distal. Introduzca el broncoscopio intranasalmente. PARA LAVADO BRONQUIAL Sujete una trampa de Lukens al broncoscopio. Introduzca 10 ml de solucin salina no bacteriosttica a travs del canal abierto. Succione el material desde afuera. Selle el tubo de la trampa y enve al laboratorio.

PARA CEPILLADO BRONQUIAL Utilice un broncoscopio de doble lumen. Inserte la brocha citolgica dentro del canal abierto del broncoscopio y avance. Empuje la brocha fuera de su protector y realice el cepillado. Jale la brocha hacia dentro de su protector y remueva la unidad de brocha completa. Coloque la brocha dentro del tubo de transporte conteniendo solucin salina o Ringers lactato. Recuerde que la brocha se seca al aire rpidamente, lo cual es negativo para el cultivo Enve al laboratorio inmediatamente. Si desea estudio por micobacterias, puede colocar la brocha dentro de un tubo conteniendo 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9.

PARA LAVADO BRONQUIO-ALVEOLAR ( BAL ) : Sujete una trampa de espcimen de 70 ml al broncoscopio. Introduzca 100 ml de salina no bacteriosttica a travs del canal en pociones de 20 ml. Despus de la tercera o cuarta inyeccin de salina, reemplace la trampa de 70 ml por una de 40 ml.. Enve las trampas al laboratorio 10 ml de lquido de cada una en tubos estriles. COMENTARIO: El mayor problema con el lavado bronquial, es la inhibicin de las bacterias por la solucin anestsica. El cepillado bronquial solamente obtiene 0.001 ml de muestra, por lo que la brocha debe ser rpidamente colocada en el lquido de transporte para evitar la desecacin. La muestra colectada va broncoscopio puede ser fcilmente contaminada con la flora oral. Esto puede reducirse utilizando un broncoscopio de triple lumen. El lavado bronquioalveolar es preferido especialmente cuando el cultivo de esputo no ha sido satisfactorio. El anlisis cuantitativo de la muestra por lavado broncoalveolar, es clnicamente ms relevante que el anlisis de la muestra de esputo. z) ORINA POR VACIADO DIRECTO : Se recomienda recoger la primera orina de la maana al despertar.

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Lave los genitales con jabn y abundante agua. Secar con un pao limpio. Dejar escapar la primera porcin de orina y a continuacin recoger la muestra directamente en un envase estril. Enviar inmediatamente al laboratorio. Si no se puede, refrigerar la orina hasta por 2 horas. No utilizar orina de receptculos. NO utilizar orina de pool de 24 horas . No solicitar cultivo por anaerobios. El frotis directo por Gram de orina de mujeres recolectadas por vaciado directo, no es del todo confiable, ya puede estar contaminado por microorganismos de la flora normal vaginal.

ORINA POR CATETERIZACION : Limpie la porcin del cateter donde se va a tomar la muestra de orina con alcohol etlico al 70 %. Inserte la aguja dentro del cateter y colecte la orina dentro de la jeringuilla. Transfiera la orina a un envase estril. Enviar inmediatamente al laboratorio. En caso contrario refrigerar la orina. La coleccin de la orina por cateterizacin uretral tiene algn riesgo de forzar hacia la vejiga, parte de la flora normal uretral durante la insercin del catter. Nunca recoja orina de la bolsa del catter. No desconecte el catter de su bolsa durante la coleccin de la muestra. Paciente con catter por 48h 72h pueden ser colonizados con mltiples cepas bacterianas. Indique en la orden mdica si la orina ha sido colectada por catter.

ORINA POR ASPIRACION SUPRAPUBICA : Mediante tcnicas aspticas descontamine y anestesie el rea de la puncin. Introduzca la aguja calibre 22 dentro de la vejiga entre el pubis y el ombligo. Aspire alrededor de 20 ml de la vejiga y transfiera la orina aspticamente a un envase estril o tape la aguja y enve la jeringuilla. Enviar inmediatamente al laboratorio, o refrigerar. Esta tcnica evita la contaminacin de la orina por microorganismos de la uretra o perianales. Es til cuando se sospecha infeccin por anaerobios, en pacientes peditricos si hay problema en la coleccin de la orina, pacientes con trauma en la mdula espinal y en general en aquellos en que el mtodo del vaciado directo o cateterizacin no ha sido posible. Indique en la orden mdica cuando la orina ha sido colectada por puncin suprapbica.

TRANSPORTE DE LA MUESTRA 1) La mayora de las especies bacterianas son vulnerables a demoras en su procesamiento, cambios de temperatura, humedad, etc. Durante el transporte las bacterias de rpido crecimiento, pueden crecer sobre los patgenos ms fastidiosos y de crecimiento lento o con requerimientos especiales, por lo que es vital en el xito del cultivo que la muestra sea transportada y procesada con la celeridad necesaria. 2) Todas las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio despus de colectadas. Se debe instruir al personal mdico, de enfermera y mensajeros en la importancia de un transporte expedito de las muestras clnicas. 3) En los casos en que el transporte o el procesamiento pudieran demorar, se establecen a continuacin las condiciones de temperatura para algunos tipos de muestras:

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MANTENIMIENTO A 4 C : Tejido de autopsia, lavado bronquial, catter i.v , Biopsia de pulmn, lquido pericardico, esputo, orina., quemaduras, odo externo. MANTENIMIENTO A TEMPERATURA AMBIENTE: Muestras de LCR, Lquido sinovial,, abdominal y amnitico, bilis, Cul-de-Sac, aspirado de pulmn, lesin, placenta, nasal, aspirado transtraqueal, orina suprapbica, raspado corneal, sangre, humor vtreo, mdula sea, crvix, conjuntiva, genitales, heces, nasofarngeo, tracto respiratorio superior., heridas, cultivos por anaerobios, ocular, genital, odo interno. 4) En general no guarde una muestra por mas de 24h bajo ninguna condicin. Sin embargo, los virus permanecen estables por 2 a 3 das en medios de transporte apropiados. 5) El transporte ptimo de la muestra depende en gran parte del volumen obtenido. Mientras menor sea su volumen, con mayor rapidez debe transportarse. 6) Microorganismos sensitivos a las condiciones ambientales, como N. meningitidis, N. gonorrhoeae y H. influenzae se recomienda sembrar directamente en platos en el sitio de coleccin de la muestra. 7) Si se anticipa que habr demora en el envo de la muestra o si el cultivo ha de ser enviado a otro laboratorio, se recomienda utilizar medios de transporte adecuados como Stuart, Amies o Cary-Blair. No enviar hisopos. 8) Tenga en cuenta que los medios de transporte estn formulados para mantener la viabilidad de los microorganismos, sin embargo, algunos podran no sobrevivir en un medio pobre en elementos nutricionales especficos. 9) Siempre que sea posible, las muestras deben ser enviadas directamente y en forma inmediata al laboratorio de microbiologa, sin utilizar las reas de recibo central u otros departamentos del laboratorio. 1.2 CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS CLNICAS: El personal del laboratorio debe tener siempre presente que los especmenes clnicos que son enviados para su evaluacin, representan elementos de suma importancia en la deteccin, evaluacin y control de enfermedades potencialmente peligrosas que aquejan al paciente y que la rapidez y eficiencia con que se logre obtener informacin de utilidad clnica de las mismas, tendr repercusiones directas en la salud del paciente, el manejo racional y adecuado de los recursos del laboratorio, la seguridad del resto de los pacientes y el personal que all labora, el control de los antibiticos, el tiempo de hospitalizacin, disminucin de costos de operaciones y en general la credibilidad del laboratorio y el hospital en general. Por todo lo anterior las muestras que son recibidas por el laboratorio, deben ser apropiadamente colectadas, transportadas y procesadas. Estas muestras deben representar la causa probable de infeccin, de lo contrario el procesamiento y reporte de muestras no adecuadas puede proveer informacin equivocada, lo cual puede llevar a un mal diagnstico y por consiguiente fallas en el tratamiento que pueden poner en peligro la vida del paciente. Consecuentemente, el laboratorio debe poner en ejecucin una poltica estricta de aceptabilidad y rechazo de muestras clnicas. CAUSALES DE RECHAZO DE MUESTRAS CLNICAS : a) Muestras no rotuladas o sin identificacin.

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b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) o) p) q) r) s) t) Discrepancia en la identificacin del paciente y la muestra. Envase inapropiado o medio de transporte inadecuado. Demora prolongada en enviar la muestra al laboratorio. Duplicacin de muestra del mismo paciente dentro de 24h, excepto sangre. No indicar tipo de muestra o procedencia. No indicar tipo de examen en la orden. Muestra con preservativos. Muestra derramada o rotura del envase. Hisopos secos. Un solo Culturette con mltiples ordenes. Muestra para anaerobios en envase inapropiado. Cultivo por anaerobios de muestras con flora anaerbica normal. Frotis de Gram por N. gonorrhoeae de muestras de crvix, vagina y cripta anal, ya que pueden haber Neisserias saprfitas en el rea. Cultivo por anaerobios de orina colectada por vaciado directo. Orina colectada de la bolsa del catter. Saliva. Frotis directo por Gram de hisopos. Volumen inadecuado. Contaminacin obvia de la muestra.

El rechazo de una muestra debe estar acompaado de la solicitud de un nuevo especmen. Es conveniente notificarlo directamente al mdico solicitante. 1.3 MUESTRAS DESAPROBADAS DEBIDO A SU CUESTIONABLE INFORMACIN CLNICA: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) Hisopo superficial oral. Hisopo de lcera de decbito. Hisopo de lceras varicosas. Hisopo de lesin superficial gangrenosa. Contenido de vejiga. Vmito. Punta de catter Foley. Descarga de colostoma. Loquios. Aspirado gstrico de recin nacido. Frotis farngeo, nasal, orina o heces.

MUESTRAS NO ADECUADAS PARA CULTIVO POR ANAEROBIOS: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) Lavado bronquioalveolar desprotegido. Hisopo cervical. Aspirado endotraqueal. Loquios. Hisopo nasofarngeo / Secrecin farngea. Lquido seminal o prosttico. Esputo por expectoracin o inducido. Heces o muestra rectal. Secrecin uretral / hisopo vaginal o vulvar. Orina por vaciado directo o catter.

1.4. PRIORIDAD DE LAS MUESTRAS: Todas las muestras deben ser procesadas lo ms rpidamente posible al llegar al laboratorio. Sin embargo, su manejo puede ser clasificado de la siguiente manera, independientemente de su orden. 1.4.1 MUESTRAS URGENTES Sangre.

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LCR. ( Su estudio tiene Prioridad sobre cualquier otra muestra o trabajo ). Aspirado Transtraqueal Lquido pericardico. Lquido amnitico. Tracto respiratorio inferior. Muestras quirrgicas de la sala de CIC. Lquido articular ( Artritis sptica ). Biopsia de Pulmn.

Cuando stas muestras se encuentran rotuladas con la advertencia Stat o Urgente, los resultados deben ser informados telefnicamente al mdico solicitante. 1.4.2 MUESTRAS DE RUTINA Boca. Lquido pleural. Quemaduras. Ocular. Orina. Genitales Muestras quirrgicas. Lquido peritoneal.

1.4.3 MUESTRAS ELECTIVAS Lquido asctico. Bilis. Lquido articular ( No artritis ). Lquidos intravenosos. Genitales Nasal. Odo. Nasofarngeo. Rectal. Ulceras, vesculas. Piel. Post Mortem.

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2. CONTROL DE CALIDAD 1.1 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 1) Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos y la absorcin de agua del exterior, as como la formacin de agua dentro de la botella como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de Ph y cambios en el color del medio. Adems la exposicin a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo. 2) Tomando en cuenta los factores antes sealados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura ambiente y protegidos contra la humedad y la luz. La mayora de los suplementos se guardan en refrigeracin. Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en polvo tienen una vida til de al menos 3 aos. El material que ha sufrido cambios substanciales, tales como hidratacin, endurecimiento y cambio de color, deben descartarse 3) Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo deshidratado, con el nombre del producto, nombre y nmero telefnico de la casa proveedora, nmero de control del frasco, fecha de recibo, fecha de expiracin, nmero de lote y fecha en que se abri el frasco. 4) El grado de disolucin de un medio deshidratado, as como la eficacia del mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratacin. Se recomienda utilizar agua recin destilada o completamente desmineralizada y un erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenizacin al momento de servirlos. 5) Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo, presin y temperatura para la obtencin de medios de cultivo ptimos. Una temperatura de 121 C , presin de 15 libras y un tiempo de esterilizacin de 15 minutos, son suficientes para la mayora de los medios.

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Si no se dispone de autoclave, es posible esterilizar en marmita de vapor a 100 C por 30 minutos. En tal caso la esterilizacin debe repetirse durante 3 das consecutivos. 6) El medio esterilizado debe ser enfriado a 45-60C en un bao mara, para evitar la formacin de agua de condensacin. Al ser vertidos en las placas Petri, evitar la formacin de burbujas y cogulos. Durante el proceso de servida, debe tomarse una muestra del medio para realizar el control de calidad por esterilidad y eficiencia. 7) El medio de cultivo reconstituido tiene una vida til limitada. Si no se emplea de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su utilidad durante un periodo de tiempo. El almacenamiento a 4C es el mejor para la mayora de los medios. Sin embargo, aquellos que contienen Tioglicolato, deben guardarse a temperatura ambiente. 8) Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecacin se aconseja que se guarden en bolsas plsticas bien cerradas. Los platos Petri almacenados as, deben mantenerse con el fondo hacia arriba. 9) Dado que los medios almacenados en refrigeracin, cuando pasan a temperatura ambiente tienden a formar agua de condensacin en la superficie, se recomienda poner los platos Petri en la incubadora a 35C por 2 horas, colocndolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca. Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la individualidad de las colonias en el aislamiento o en los casos de pruebas de sensibilidad a los antibiticos en los que el exceso de agua puede afectar la dilucin de las colonias y por ende la lectura del halo de inhibicin. 10) Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculacin de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas. Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domsticas o cepas control comerciales (ATCC). Se debe guardar un libro de registro de los resultados obtenidos. 11) Evite el congelamiento de los medios preparados o la sangre de carnero. 12) Al colocar en la refrigeradora los medios preparados, debe colocar los de ms reciente preparacin al fondo y los mas viejos adelante. 13) Rotular todos los medios preparados, tanto en platos Petri como en tubos, indicando adems, la fecha de preparacin y expiracin. PRUEBAS BSICAS DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS PREPARADOS: (a) (b) (c) (d) pH Esterilidad Capacidad de crecimiento y reaccin Estabilidad

CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS: (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) Rajadura del plato o envase. Rajadura en la superficie del medio. Variaciones en el volumen del medio. Hemlisis. Cristales en el medio. Presencia de burbujas. Presencia de cogulos. Cambio de color normal. Contaminacin. Falla en la inhibicin de microorganismos saprfitos.

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ERRORES Y CAUSAS EN LA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO: Valor de pH incorrecto: Medir el pH por encima de los 25C. Sobrecalentamiento en la esterilizacin, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50C. Solucin incompleta del medio. Mala calidad del agua. Recipiente mal lavado o con residuos qumicos. Mala conservacin del medio deshidratado o vencido.

Turbidez o precipitacin: Mala calidad del agua. Sobrecalentamiento. Ph incorrecto. Solucin incompleta.

Oscurecimiento: Sobrecalentamiento. Solucin incompleta. Alteracin del pH.

Gel blando: Bajo porcentaje de agar en el medio. Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos. Sobrecalentamiento. Mala homogenizacin del medio. Exceso de agua.

Crecimiento bacteriano pobre: Exceso de calentamiento. Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente. Alteracin en el Ph.

EVALUACIN DE LA EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS: MEDIO DE CULTIVO Agar sangre Agar sangre Manitol Sa TSI TSI TSI SIM SIM Citrato de Simmons Citrato de Simmons Caldo de urea Caldo de urea ORGANISMO CONTROL S. Beta hem.Grupo B S. pneumoniae Staphylococcus E. coli Shigella flexnerii Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis K. pneumoniae K.pneumoniae E. coli Proteus mirabilis E. coli REACCIN ESPERADA Crece. Beta hemlisis Crece. Alfahemlisis Colonias amarillas cido/cido alcalino/cido alcalino/alcalino movilidad positiva movilidad negativa color azul. Crece color verde. No crece Rojo-Morado. Positivo color Naranja. Negativo

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McConkey McConkey Agar sangre McConkey McConkey Sorbitol McConkey Sorbitol McConkey Sorbitol EMB EMB Manitol Sal SS agar SS agar Agar alcohol-fenil etlico Agar alcohol-fenil etlico Thayer-Martin Thayer-Martin OF medio OF medio
OF medio

E. coli Proteus sp K.pneumoniae Staphylococcus E.coli 0157:H7 Proteus sp Klebsiella sp E. coli Proteus sp E. coli Salmonella sp E. coli Staphylococcus E. coli N. gonorrhoeae E. coli E. coli Pseudomona sp
Moraxella sp

Crece. Colonias moradas Crece. Colonias claras Crece. No hemoltico No crece Colonias claras. Sorbitol negativo Colonias claras. Sorbitol negativo Colonias rosadas. Sorbitol positivo Brillo metlico colonias Claras No crece Crece. Colonias claras con H2S No crece Crece No crece Crece No crece Amarillo ambos tubos. Fermentador Un tubo amarillo. Oxidativo
Ningn tubo amarillo. Inerte

MEDIO DE CULTIVO Lysina decarboxylasa Lysina decarboxylasa Lysina decarboxylasa Bili-Esculina Bili-Esculina Caldo Malonato Caldo Malonato NaCl 6.5% NaCl 6.5% Sabouraud-Dextrosa agar Sabouraud-Dextrosa agar Sabouraud-Dextrosa agar Mycosel agar Tioglicolato Selenita Caldo Cerebro-Corazn

ORGANISMO CONTROL Citrobacter freundii Proteus vulgaris Salmonella arizonae Streptococcus mitis Enterococcus faecalis Klebsiella pneumoniae E. coli Streptococcus mitis Enterococcus faecalis Levaduras Dermatofitos Estafilococos Levaduras Flora mixta Flora mixta Flora mixta

REACCIN ESPERADA alcalino/cido H2S + Rojo/cido H2S Alcalino/alcalino H2S + Incoloro Negro Azu No cambia el color No crece Crece Crece Crece Crece Crece Crece Crece en menos de 24h Crece

CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUPLEMENTOS: 1. Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo, pudieran confrontar problemas de eficiencia o inhibicin, ya que como todo producto pudiera no haber sido almacenado y/o transportado adecuadamente. Solo el uso rutinario de los medios de cultivo preparados con stos suplementos, pudieran darnos la alarma de problemas en los mismos. 2. Muchos suplementos son lbiles al calor, por ello se aaden al medio despus de la esterilizacin para evitar su deterioro. 3. Los medios preparados con la mezcla inhibidora VCN , deben ser utilizados dentro de los 8 das siguientes a su preparacin ya que la eficacia de la mezcla decrece muy rpidamente. La

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misma advertencia es aplicable a los frascos de VCN rehidratados, por lo que conviene guardarlos congelados si no se va a usar de inmediato. No sobrepasar los 15 das. 4. En el caso de la sangre de carnero para la preparacin del agar sangre, es importante cada vez que se reciba un nuevo lote, anotar su apariencia, observar por presencia de cogulos, hemlisis, nmero de lote, fecha de recibo y expiracin, hacerle una determinacin de hemoglobina, la cual debe medir entre los 13.0 - 15.0 g/dl, y por supuesto se debe tomar con una jeringuilla una pequea muestra del vial para sembrarla en agar sangre y tioglicolato para determinar su esterilidad. Tambin se debe examinar el agar sangre preparado con sangre de carnero, por adecuada formacin de hemlisis, especialmente utilizando Estreptococos hemolticos. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS: Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio, lo constituyen los reactivos, tanto comerciales como de preparacin domstica, que son utilizados en la caracterizacin de microorganismos. Estos reactivos merecen una especial atencin, toda vez que fallas en su funcionamiento pueden generar en identificaciones equivocadas. Por ello, se recomienda correr controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto almacenamiento de los reactivos, metodologa de la prueba y tiempo de lectura. Es recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento. REACTIVO Coagulasa Coagulasa Coagulasa Oxidasa Oxidasa Catalasa Catalasa Betalactamasa Betalactamasa Optoquina ONPG ONPG Ehrlich Ehrlich Cloruro frrico Cloruro frrico Sobres de Anaerobiosis Suero para tubos germinales MICROORGANISMO Staphylococcus aureus Cepa ATCC 25923 Stafilococcus epidermidis Pseudomona aeruginosa E. coli Staphylococcus sp Streptococcus sp S. aureus ATCC 29213 H. influenzae ATCC 10211 S. pneumoniae E. coli Proteus sp E. coli K .pneumoniae Proteus sp E. coli Bacteroides sp Candida albicans REACCIN ESPERADA Cogulo. Coagulasa positiva Cogulo. Coagulasa positiva Inerte. Coagulasa negativa Negro. Oxidasa positiva Inerte. Oxidasa negativa Burbujas. Catalasa positiva Inerte . Catalasa negativa Rojo. Positiva Inerte. Negativa Halo de >/= 12 mm Amarillo. Positivo Incoloro. Negativo Anillo rojo. Indol positivo Incoloro. Indol negativo Verde. Fenilalanina positivo Incoloro. Fenilalanina negativo Crecimiento en Anaerobiosis Tubos germinales positivo

CONTROL DE CALIDAD DE LOS TINCIONES La clasificacin correcta de las bacterias de acuerdo a las reacciones bioqumicas, dependen de la pureza, reactividad y estabilidad de los reactivos. La concentracin de las soluciones por efecto de la evaporacin de los solventes o las variaciones introducidas en los mtodos recomendados, puede afectar los resultados de modo adverso. Este es el caso de las tinciones para diferenciar bacterias por su reaccin al Gram y la morfologa bacteriana, tintes para cpsulas, esporas, etc. El control de calidad de stos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote preparado; luego basta con un control cada semana para mantener un grado de seguridad apropiado en su uso.

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En el caso de la tincin de Gram, sin lugar a dudas una de las herramientas ms importantes del microbilogo, se recomienda tener especial cuidado con la mezcla de alcohol-acetona para decolorar la placa. Es posiblemente ste reactivo el que produce mayores problemas ya sea por decoloracin excesiva o por dbil decoloracin de los microorganismos. Es tambin la etapa de la tincin de Gram en la que el tiempo de exposicin es ms determinante. Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que pudieran ser ms tiles segn la tincin a evaluar. Algunos ejemplos son : TINCION Gram Gram Gram Zielh-Neelsen Zielh-Neelsen Kellung Kellung Verde malaquita Verde malaquita MICROORGANISMO Staphylococcus sp E. coli Mezcla de ambos Mycobacterium sp E. coli S. pneumoniae E. coli Clostridium sp E. coli REACCIN ESPERADA Morado. Gram-Positivo Rosado. Gram-Negativo Mezcla de ambas colores Rosadas. BAAR positivo Azul. BAAR negativas Deteccin de cpsula positiva Deteccin de cpsula negativa Espora de color verde, Resto de la clula rosada Clula completa rosada

ALGUNAS CAUSAS DE ERROR DURANTE LA TINCION :

1. El Violeta Cristal tiende a hacer precipitacin, lo cual puede ser causa de observacin de estructuras ficticias en el frotis. Si se observa precipitacin, proceda a filtrar el tinte .
2. La evaporacin puede ser causa de mal funcionamiento de los tintes. 3. Las placas que no han sido previamente limpiadas o con restos de grasa, pueden ser causa de mala fijacin y tincin de la muestra . 4. Sobrecalentamiento de la placa durante la fijacin. El exceso de calor provoca un dao fsico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retencin de los colorantes. 5. Lavado muy fuerte de la placa durante la tincin. 6. Proporcin no adecuada de los componentes de la tincin. 7. Algunos tintes como Safranina y Fucsina bsica pueden contaminarse. Si se sospecha esto , cultive 1 ml en Tioglicolato, o descarte el tinte. 8. La tincin de Zielh-Neelsen tiene sus limitaciones en cuanto a no ser especfica para micobacterias y su baja sensibilidad, ya que el nivel de deteccin es de 5,000 a 10,000 bacilos por mililitro de esputo. Esto debe ser tenido en cuenta al evaluar una placa. 9. Una Cepa Control positiva, debe ser teida cada vez que un nuevo lote de tintes para ZielhNeelsen es preparado y cuando se reciba un nuevo pedido de tintes y reactivos. Se puede utilizar la cepa de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 como control positivo. CONTROL DE CALIDAD DE ANTISUEROS : El mundo de la microbiologa ha sido inundado cada vez ms por productos comerciales hechos con el objetivo de detectar agentes etiolgicos de enfermedades en el menor tiempo posible, con el mayor grado de especificidad , sensibilidad y algunos de ellos con la intencin de eliminar el cultivo bacteriano como nica forma diagnstica. Estos sistemas actan algunos con solo la

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muestra del paciente y otros requieren de la cepa aislada o detectan sus metabolitos. Estos sistemas se han convertido en un arma imprescindible para el microbilogo y en muchos casos dan confianza en la seguridad del diagnstico y en otras se utilizan en la deteccin de microorganismos difciles de cultivar. Estos productos para la deteccin directa del espcimen o la cepa bacteriana, son considerados exmenes bacterianos y no test serolgicos. En forma general stos kit deben ser probados cada vez que se recibe un nuevo lote y cada vez que se utilicen, se le deben correr sus controles positivo y negativo que vienen con cada kit. CONSIDERACIONES GENERALES EN EL USO DE ANTISUEROS : 1) Los sistemas son para uso exclusivo de diagnstico in vitro. 2) Conservar todos los reactivos en refrigeracin. 3) Anotar la fecha en que se abre el kit. 4) No congelar los reactivos. 5) No utilizar los reactivos si se sospecha deterioro de los mismos, tales como si se observa cambio de color, autoaglutinacin en el envase, no producen la reaccin esperada con los controles respectivos, reactivos contaminados o con signos de evaporacin. 6) El personal de laboratorio calificado, debe utilizar las tcnicas aspticas y las precauciones habituales para protegerse de los agentes infecciosos. 7) Nunca pipetear con la boca las muestras y/o los reactivos. 8) No utilizar reactivos de lotes diferentes. 9) No utilizar los reactivos despus de la fecha de caducidad. 10) Despus de sacar los reactivos de la refrigeradora, dejarlos a temperatura ambiente antes de utilizar. 11) Todos los productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos. 12) No volver a utilizar las tarjetas desechables , despus de haber sido utilizadas. 13) Algunas pruebas deben estar precedidas por su apropiado cultivo, aislamiento y pruebas bioqumicas preliminares, antes de realizar mtodos serolgicos y una identificacin final. 14) Al terminar la prueba, todo el material sucio y productos inoculados deben ser sometidos a esterilizacin por autoclave, incinerados o sumergidos en un desinfectante germicida adecuado, antes de su eliminacin. 15) La interpretacin de los resultados debe ser hecha por personal calificado, que tomar en cuenta el contexto clnico, el origen de la muestra, los aspectos macro y microscpico y su experiencia. 16) Aglutinacin por Antgenos de Estreptococos : Un test positivo est indicado por la aparicin de una aglutinacin ntida de ltex en 2 minutos en un crculo, lo cual permite la identificacin de grupo. No tomar en cuenta las aglutinaciones dbiles que pudieran aparecer en otros crculos.

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Una aglutinacin intensa en varias suspensiones de ltex, representa una mezcla de grupos o una cepa autoaglutinable. Volver a hacer el aislamiento de la colonia y el test de ltex. Una vez a la semana verificar la reactividad de las suspensiones bacterianas. Para ello seguir las indicaciones del fabricante y reemplazar la cepa a analizar , por el control positivo. Debe aparecer una aglutinacin en cada suspensin ltex. Tambin la especificidad del test se puede analizar utilizando cepas control como el Streptococcus pyogenes ATCC 19615 seguir la tcnica sin emulsionar colonias en la enzima de extraccin, o mezclar los reactivos de ltex con una gota de NaCl 0.15 mol/l. No debe aparecer aglutinacin en las suspensiones de ltex. Pueden aparecer resultados falsamente negativos si se estudia una cantidad insuficiente de colonias Cuando se utiliza el mtodo de deteccin directa de antgenos en muestras del tracto respiratorio superior, hay que tener en cuenta la baja sensibilidad del test, por lo que todo resultado negativo debe ser seguido por su correspondiente cultivo para verificar.

17) Deteccin de antgenos asociados a meningitis bacteriana:

El antgeno de N.meningitidis grupo B es ms difcil de detectar, ya que est relacionado estructural e inmunologicamente con el antgeno de E.coli K1. Por ello una reaccin positiva con ste antisuero en LCR de recin nacido o prematuro, indica en la mayora de los casos la presencia de E.coli K1. En un sujeto de ms edad, si puede indicar la presencia de N. meningitidis grupo B. La sensibilidad de ste ltex de aglutinacin tiene un rango entre 65% para S. pneumoniae y 95% para H. influenzae. Como otras pruebas de ltex, un valor positivo depende del nivel de antgenos detectable. Este es un test de descarte, que no reemplaza al cultivo. Cada laboratorio debe evaluar la sensibilidad, especificidad y valor predecible para su poblacin de pacientes.

18) Aglutinacin por Salmonella sp : Sea estricto en el tiempo de la reaccin. Miembros del grupo Salmonella estn antignicamente relacionados a Citrobacter y Arizona. Antgenos de stos microorganismos tienen estructuras compartidas, por lo que puede haber reacciones cruzadas. Por esto es importante que la prueba de aglutinacin por Salmonella solo se realice a aquellas cepas que muestran patrn bioqumico del gnero Salmonella.

CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS MEDIANTE DISCO: Hemos querido resaltar los aspectos de control de calidad de la prueba de sensibilidad a los antibiticos por difusin simple en agar, utilizando discos de sensibilidad, ya que es la prueba de mayor utilidad en nuestro medio. Es importante tener presente que sta prueba a sido designada exclusivamente para examinar microorganismos de rpido crecimiento, utilizando la normativa NCCLS M2-A6 , volumen 13, nmero 24. Este mtodo no es til para organismos fastidiosos, de crecimiento lento o para anaerobios. El mtodo de difusin simple en agar es sin lugar a dudas el sistema de mayor uso para la realizacin de la sensibilidad bacteriana. Hay que tener en cuenta el gran valor de sta prueba en la deteccin temprana de multiresistencia, escogencia y valoracin de un antibitico frente a un microorganismos patgeno, proteccin de infeccin, estudios epidemiolgicos, etc . La prueba de sensibilidad a los antibiticos consta de varios elementos que deben ser tenidos en cuenta: El medio de cultivo, inoculo, incubacin, lectura e interpretacin y el reporte. 1) Control de calidad del medio de cultivo:

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1. Utilizar agar de Mueller-Hinton. 2. La calidad del agua es determinante, ya que la misma debe estar libre de iones metlicos. Las variaciones de cationes divalentes, principalmente calcio y magnesio, afectar los resultados con aminoglicsidos, tetraciclina y colistina, cuando se prueban ante cepas de Ps. Aeruginosa. Un contenido excesivo en catin, reducir la zona de inhibicin, mientras que un escaso contenido en catin, puede dar un inaceptable aumento en el tamao de la zona. 3. Servir en platos Petri grandes de 150 x 15 mm preferiblemente o 100 x 15 mm, con una profundidad de 4 a 5 mm 4. Aproximadamente se utilizan 25 cc para platos de 100 mm y 60 cc para platos de 150 mm. 5. Volmenes mayores de medio provocan disminucin en el tamao del halo de inhibicin, y volmenes menores halos ms pequeos. 6. Se deben seguir las normas generales establecidas para almacenamiento del medio de cultivo. 7. Los platos Petri deben ser colocados en la incubadora para secarlos de restos de agua producto de la condensacin, antes de ser utilizados para no diluir el inoculo bacteriano. 2) Control de calidad de los discos de sensibilidad: Las metas de un programa de control de calidad van destinadas a monitorear: La precisin y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento de los reactivos utilizados en la prueba y la actuacin de las personas que llevan a cabo las pruebas y sus resultados. 1. Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre 20 y +8C. Algunos discos, especialmente los de antibiticos -lactmicos deben guardarse congelados a -20C. Solo los viales en uso deben mantenerse a temperatura de refrigeracin. 2. Al sacarlos de la refrigeradora para su uso, espere a que los viales alcancen la temperatura ambiente por 1 a 2 horas. 3. Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad ms prxima. 4. Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, ste debe guardarse en un desecador que cierre perfectamente. 5. Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deber mantenerse siempre refrigerado. 6. Los discos son colocados en el medio a una distancia de ms de 24 mm del centro de uno al centro del otro. En todo caso no colocar ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 5 discos sobre la placa de 100 mm. 7. Procurar no colocar discos de antibiticos bactericidas ( Ej. Penicilina, Cefalosporinas, Aminoglicsidos, Vancomicina ) al lado de antibiticos bacteriostticos ( Ej. Cloranfenicol, Tetraciclina, Sulfonamidas ) para evitar el antagonismo antibitico. 8. Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos despus de su aplicacin. 9. Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control ATCC, las cuales son seleccionadas por su estabilidad gentica y por su utilidad en el mtodo utilizado. Estas cepas se corren como una muestra ms y se correlaciona el tamao de los halos de inhibicin con las medidas expresadas en los Manuales NCCLS M2-A6. Entre las cepas ATCC ( American Type Culture Collection ) recomendadas estn: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Escherichia coli ATCC 25922 y 35218 (La E coli 35218 como organismo de control para combinaciones con inhibidor de betalactamasa, como aquellos que contienen cido clavulnico, sulbactam o tazobactam ). Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 29213 Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

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Enterococcus faecalis ATCC 29212 (Para ser utilizado con discos de alto contenido de Aminoglicsidos ). EL ESTANDAR McFARLAND: La densidad de la turbidez del Estndar McFarland deber ser verificada utilizando un espectrofotmetro con direccin de luz de 1 cm y cubetas adecuadas para determinar absorbancia. Para realizar el control de un estndar McFarland de 0.5, la absorbancia deber leer entre 0.08 a 0.10 a una longitud de onda de 625 nm. La suspensin de Sulfato de Bario deber transferirse en alcuotas de 4 a 6 ml dentro de tubos con rosca. Estos tubos debern guardarse a temperatura ambiente en un lugar fresco y oscuro. Antes de ser usados, los patrones debern agitarse para una adecuada homogenizacin. Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se debe comprobar su densidad.

Habituales causas de error en la prueba con disco: a) b) c) d) e) f) g) Error administrativo en la transcripcin de los datos del control de calidad. Lectura errnea al medir el dimetro de la zona. Contaminacin u otros cambios en la cepa control. Suspensin del inculo demasiado fuerte o demasiado dbil. Mala agitacin del estndar McFarland o estndar daado. Incorrecta temperatura, tiempo o atmsfera de incubacin. Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su almacenaje en el laboratorio.

3) Control de calidad de la lectura e interpretacin: 1. Cuando se va a determinar la sensibilidad del S. Pneumoniae a la Penicilina, utilizar un disco de Oxacilina de 1 g. Las cepas de S. Pneumoniae con zonas de Oxacilina de >/- a 20 mm son susceptibles a penicilina (CIM </- 0.06 g/ml). 2. Se recomienda utilizar un disco de Oxacilina de 1 g para probar Resistencia a Oxacilina y Meticilina de los Estafilococos. Esto se debe a que la Oxacilina es ms resistente a la degradacin durante el almacenaje y porque es ms probable que detecte a las cepas heteroresistentes de Estafilococo. 3. Las pruebas para detectar Estafilococos Meticilina Resistentes ( MRSA), deben incubarse a 35 C por 24 horas exactas. 4. Los Estafilococos meticilina resistentes debern informarse como resistentes a todos los Cefems y otros betalactmicos, as como Ampicilina/cido clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Ticarcilina/cido clavulnico, Piperacicilina/Tazobactam e Imipenem, independiente de los resultados in vitro con dichos agentes. 5. Los Enterococos pueden ser resistentes a Penicilina y a Ampicilina debido al desarrollo de poca afinidad de las protenas fijadoras de penicilina ( PBPs) o a la produccin de betalactamasa. Las pruebas de difusin en disco pueden detectar con exactitud los aislamientos que poseen alteradas las PBPs ,pero no detectarn con fiabilidad las cepas productoras de betalactamasa. Estas ltimas han de detectarse con pruebas directas de betalactamasa (Ej. Cefinasa ). Las placas han de leerse con luz transmitida para visualizar cualquiera pequea colonia dentro del halo, que hara la cepa resistente. 6. Todo caso de Estafilococo resistente a la Vancomicina, debe ser confirmado, enviado a un laboratorio de referencia e informar a las Autoridades de Salud Pblica. 7. Cuando se trata de Sulfonamidas, los microorganismos deben desarrollarse por varias generaciones antes de que ocurra inhibicin, por lo que se hace caso omiso del crecimiento leve, al igual que de un vestigio de proliferacin dentro del halo de inhibicin.

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8. Si se observan colonias dentro de un halo de inhibicin, deber confirmarse la pureza de la cepa y repetir la prueba. 9. La difusin ( swarming ) de los Proteus sp no es inhibida por todos los antibiticos, por lo que no se toma en cuenta. 10. Ocasionalmente se pueden observar varis colonias esparcidas por una zona de inhibicin. Este fenmeno es constante para la Serratia sp y la Polimixina. Las colonias se considerarn significativas y la cepa resistente 11. Solo es necesario probar una Tetraciclina y sus resultados son equivalentes a la Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina. 12. Los resultados obtenidos con al Polimixina, pueden aplicarse a la Colimicina. Su halo es pequeo debido a su pobre difusin en agar. 13. Se ha informado que algunas cepas de Providencia sp dan resultados de sensibilidad falsos con discos de Cefprozil , las cepas de ste gnero no deben analizarse ni informarse con ste disco. 14. Los Estafilococos resistentes a la Meticilina, Oxacilina o Nafcilina, tambin puede ser informados como resistentes a la Penicilina, Cefalosporinas , carbapenem y combinaciones de inhibidores de betalactamasa, a pesar de su aparente sensibilidad in vitro, lo cual no se refleja in vivo. 15. La Cefalotina puede utilizarse para representar Cefalotina, Cefradina Cefaclor y Cefadroxil 16. Los datos de sensibilidad al cido nalidxico, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Sulfonamidas y Trimethoprim, se aplican solamente a cepas aisladas de infecciones urinarias. 17. El disco de Sulfisoxazol puede ser usado para representar cualquiera de las Sulfonamidas disponibles. 18. En cepas de Salmonella y Shigella, solo Ampicilina, una Quinolona y Trimethoprim/sulfametoxazol deben ser probados e informados de rutina en heces. Adems el Cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generacin deben ser probados e informados en cepas de Salmonella sp extraintestinal. 19. En cepas de Salmonella sp y Shigella sp, los aminoglicsidos y las cefalosporinas de primera y segunda generacin, pueden aparecer como activos in vitro pero no son efectivos clnicamente y no deben ser informados como susceptibles. 20. La prueba de la betalactamasa predice la resistencia a la Penicilina, Ampicilina y Amoxicilina. 21. Las cefalosporinas pueden aparecer activas in vitro contra Listeria sp, pero no son efectivas clnicamente y no deben ser informadas como susceptibles. 22. Los Enterococos sp las cefalosporinas, los aminoglicsido ( Excepto por resistencia de nivel alto ), Trimethoprim/sulfametoxazole y la Clindamycina, pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clnicamente y stas cepas no deben informarse como susceptibles. 23. La susceptibilidad y resistencia a Azitromicina, Claritromicina y Diritromicina puede ser interferida por la prueba de Eritromicina. 24. Solo los resultados de las pruebas de Ampicilina, una cefalosporina de tercera generacin, el Cloranfenicol y Meropenem deben ser informados de rutina en todas las cepas aisladas de H. influenzae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas. 25. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad con Penicilina, Cefotaxime o Ceftriaxone, Meropenem y Vancomicina, deben ser informados de rutina en cepas de S. pneumoniae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas como meningitis y bacteremia. Verificacin de antibiogramas atpicos : a) b) c) Examine primero por errores de trascripcin. Reexamine el plato de sensibilidad. Evalu reportes previos del paciente para observar su patrn de sensibilidad anterior. d) Repita los test de identificacin y sensibilidad a los antibiticos. Condiciones sugeridas que requieren antibiticos : 1. S. aureus resistente a Oxacilina. verificacin del resultado de Sensibilidad a los

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2. S. pneumoniae resistente a Penicilina. 3. Cefalosporinas de amplio espectro ( Cefotaxime, Ceftriaxone ) resistente a S. pneumoniae. 4. Streptococcus viridans penicilina resistente o intermedio, aislados de reas estriles del cuerpo. 5. Estafilococos o Enterococos resitentes a la Penicilina o intermedio. 6. Enterococos con altos niveles de resistencia a la Gentamicina aislados de reas estriles del cuerpo. 7. Klebsiella sp o Ceftazidime). E. coli con potencial espectro de betalactamasa.(Ej. Resistente a

8. Bacilos Gramnegativos no fastidiosos resistentes a Gentamicina-Tobramicina-Amikacina. 9. S. maltophilia resistente a Trimethoprim-Sulfametoxazole. 10. H. influenzae Ampicilina resistente y betalactamasa negativa. 11. Un aislamiento para el cual el antibiograma es atpico para la especie. 12. Ampicilina y/o Cefalotina susceptible para Enterobacter sp, Citrobacter freundii, Serratia marcescen y Ps. Aeruginosa. 13. Klebsiella sp sensible a Ampicilina. 14. Bacilos Gramnegativos Imipenem resistentes o intermedio, excepto S. maltophilia. 15. Bacilos Gramnegativos Ciprofloxacina resistente, excepto S. maltophilia o B. cepacia. Control de calidad de la sensibilidad a los antibiticos en los sistemas computarizados : Los Laboratorios de Microbiologa modernos tienen a su alcance una creciente gama de sistemas computarizados para la identificacin de los microorganismos y su susceptibilidad a los antibiticos. Algunos de estos sistemas traen consigo programas de computadora para ayudar a evaluar el control de calidad de los mismos. En algunos casos, la computadora hace un control peridico de su funcionamiento mediante comandos u ordenes preestablecidas. Debido a que en nuestro medio existe solamente el Sistema Vitek de identificacin microbiana, solo haremos algunas observaciones relativas a ste sistema. El Sistema Vitek utiliza una determinacin turbidimtrica de la rapidez de crecimiento del microorganismo, en presencia de agentes antimicrobianos para obtener un anlisis de regresin lineal y posteriormente determinar un algoritmo derivado de la concentracin inhibitoria mnima ( CIM ). Actualmente el laboratorio cuenta con un grupo limitado de tarjetas Vitek para la sensibilidad a los antibiticos, tal como sigue: Sensibilidad de los Gram negativos: 1. 2. 3. 4. GNS : Para uso en Policlnicas y rea hospitalaria. GNS-PA : Para uso hospitalario Cuidados intensivos. GNS-GD : Uso hospitalario Lquidos corporales GNS-OP : Uso exclusivo para urocultivos.

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Sensibilidad de los Gram positivos: 1. GPS-SA : Para Estafilococos y bacilos Grampositivos. 2. GPS-TA : Para Estreptococos, inclusive Enterococos. Al hacer el control de calidad de las tarjetas de sensibilidad a los antibiticos, se recomienda utilizar cepas ATCC con CIM conocidas. Estas pruebas se pueden realizar una vez al mes durante 10 das seguidos, en los cuales se aceptan no ms de 2 valores de CIM para cada combinacin de Antibitico/Organismo fuera del rango establecido. Si se diera el caso de deben correr controles de calidad con cepas ATCC durante 30 das consecutivos, en los cuales no se aceptan ms de 3 valores fuera de rango. Si los hay, llamar al Departamento de Servicio de Vitek para el chequeo correspondiente. Para realizar los controles se recomiendan las siguientes cepas ATCC para las tarjetas respectivas: TARJETA GNS GNS-PA GNS-GD GNS-OP CEPAS ATCC E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853 E. faecalis ATCC 29212 E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853 ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853 ATCC 35218 / E. faecalis ATCC 29212 ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853 ATCC 35218 / E. faecalis ATCC 29212

GPS-SA GPS-TA

E. faecalis ATCC 29212 / S. aureus ATCC 29213 E. coli ATCC 35218 E. faecalis ATCC 29212 / S. aureus ATCC 29213

Las tarjetas de sensibilidad a los antibiticos del Sistema Vitek, han sido comparado con los estndares de la NCCLS, mediante las tcnicas de microdilucin para obtener la CIM; sin embargo, bioMrieux Vitek recomienda la utilizacin de mtodos alternos para confirmar la susceptibilidad a ciertos microorganismos contra drogas especficas. TARJETA GNS GNS GNS GNS GNS GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-GD GNS-GD GNS-GD GNS-GD GNS-GD ANTIBIOTICO Ampicilina Carbenicilina Cefoxitin Cefalotina Trimeth/Sulfa Ceftazidime Imipenem Mezlocilina Piperacilina Ticarcilina Ampicilina Cefazolina Cefoxitina Imipenem Piperacilina MICROORGANISMO A. lwoffii, Aeromona sp, Citrobacter sp Acinetobacter lwoffii A. lwoffii, Aeromona sp. Aeromona sp A. lwoffii, Aeromona sp A. jejunii, A. lwoffii Aeromona sp Aeromona sp A. jejunii, A. lwoffii Aeromona sp , Ps. aeruginosa A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp, Citrobacter sp Aeromona sp A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp Aeromona sp A. jejunii , A. lwoffii, Aeromona sp, Ps. aeruginosa

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TARJETA GNS-GD GNS-GD GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GPS-SA GPS-SA GPS-SA GPS-TA GPS-TA GPS-TA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

Ticarcilina/Acido clavulnico Aeromona sp, Ps. aeruginosa Trimetho/Sulfametoxazole A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp Acido nalidxico Pseudomona sp ( diferente a Ps. aeruginosa) Ampicilina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp, Citrobacter sp Carbenicilina A. jejunii , A. lwoffii Cefalotina Aeromona sp Ceftriaxone Klebsiella sp Norfloxacina Acinetobacter sp Trimetho/Sulfametoxazole A. jejunii, A.lwoffii, Aeromona sp Eritromicina Enterococcus sp, Estreptococos grupo D Tetraciclina Estafilococos coagulasa negativa, Enterococcus sp, Estreptococos grupo B, Estreptococos grupo D. Vancomicina Enterococcus sp. Cloranfenicol Staphylococcus sp Eritromicina Estafilococos coagulasa negativa, Enterococcus sp, Estreptococos grupo B, Estreptococos grupo D Vancomicina Enterococcus sp

Existe un grupo de microorganismos en que se desconoce la capacidad de las tarjetas de sensibilidad para detectar resistencia a antibiticos especficos, debido a que las cepas resistentes no estaban disponibles en el momento de realizar los test comparativos. Entre ellos tenemos : TARJETA GNS GNS GNS GNS GNS GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-PA GNS-GD GNS-GD GNS-GD GNS-GD GNS-GD GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GNS-OP GPS-SA GPS-TA ANTIBIOTICO Amikacina Cefalotina Gentamicina Tetraciclina Tobramicina Amikacina Aztreonam Ceftazidima Ciprofloxacina Gentamicina Tobramicina Cefazolina Cefotaxime MICROORGANISMO

Aeromona sp A. lwoffii Aeromona sp A. lwoffii Aeromona sp Aeromona sp A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp Aeromona sp Aeromona sp Aeromona sp Aeromona sp A. jejunii, A. lwoffii A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp, Citrobacter sp Ciprofloxacina Aeromona sp Gentamicina Aeromona sp Tobramicina Aeromona sp Acido nalidxico A. jejunii, A. lwoffii Amoxicilina/Acido clavulnico A. jejunii, A. lwoffii Cefalotina A. jejunii, A. lwoffii Ceftriaxone Aeromona sp Ciprofloxacina Aeromona sp Nitrofurantoina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp Norfloxacina Aeromona sp Tetraciclina A. jejunii, A. lwoffii Penicilina y Ampicilina Enterococcus sp : Utilizar Betalactamasa Penicilina y Ampicilina Enterococcus sp : Utilizar Betalactamasa

CONSIDERACIONES GENERALES:

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a) Se debe tener especial cuidado en la preparacin del inculo. Fallas en su preparacin, tienen efecto sobre el funcionamiento de todo el instrumento. b) Siempre tener presente que el sistema no puede examinar todos los grupos relevantes de bacterias. c) El uso de colonias absolutamente aisladas es clave en el aprovechamiento de los sistemas computarizados. d) Algunos de los organismos sugeridos por el fabricante para control de calidad, podran no detectar deterioro en el instrumento o la calidad de los reactivos. e) Es relevante utilizar mtodos alternos de sensibilidad a los antibiticos en aquellos casos en que la literatura que acompaa las tarjetas indique que el sistema falla en detectar resistencia. f) Se han reportado casos de falsa sensibilidad o resistencia, particularmente debido al lector del instrumento o a un corto periodo de incubacin durante la prueba de sensibilidad. Un periodo de 3.5 a 6 horas podra no ser adecuado para expresar todos los mecanismos de resistencia de las bacterias. Tal es el caso de algunos bacilos Gramnegativos que inducen resistencia mediada por lactamasa a algunos antimicrobianos enzimticamente lbiles a la -lactamasa, como ocurre con el Citrobacter freundii, Enterobacter sp, Serratia sp, Morganella morganii, Providencia sp y Ps. aeruginosa. g) Se ha observado una falsa resistencia a Aztreonam, especialmente por Proteus y Morganella sp por problemas de deteccin fotomtrica del crecimiento. h) Se han reportado falsa resistencia a Imipenem para varias especies en periodos largos y cortos de incubacin. Esto no es comn y se debe a la degradacin del antibitico o la concentracin de Zinc en el medio. i) Una baja o moderado nivel de resistencia a la Vancomicina frente a Enterococcus sp se ha detectado, especialmente del tipo VanB, ya que podra no ser detectado en periodos cortos de incubacin. j) Se han observado o problemas en la deteccin de resistencia a altos niveles de Gentamicina o Estreptomicina frente a Enterococcus sp en incubaciones largas y cortas. k) Tener presente colocar las marcas externas en la tarjeta, antes de meterla a la incubadora/lector. l) No deje pasar ms de 15 minutos despus de prepara el inculo, para llenar las tarjetas y colocarla en la incubadora. m) Chequear la solucin salina por esterilidad. Para ello inocule en caldo de cultivo e incube a 35C por 24 horas. n) Con cada lote de preparacin de inculo, estandarizar primero el calormetro. o) Haga que el Departamento de Servicio tcnico de Vitek revise peridicamente el lector del aparato para calibrarlo. p) Lleve un rcord de cualquier discrepancia en la identificacin de cepas estndar de control. Igualmente el tipo de tarjeta, lote, fecha de expiracin, etc. PATRON DE RESISTENCIA ESPERADA PARA ALGUNOS MICROORGANISMOS: MICROORGANISMO Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Morganella, Providencia, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Serratia, Yersinia. Citrobacter freundii, Enterobacter, Morganella, P. Vulgaris, P. penneri, Providencia, Serratia, Yersinia. Klebsiella C. freundii, Enterobacter, Serratia. RESISTENCIA ESPERADA Ampicilina

Cefazolin, Cefalotina

Ticarcilina Cefoxitin, Cefotetan

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C. freundii, Enterobacter, P. vulgaris, Serratia. Citrobacter, Enterobacter, Serratia. Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Ps. aeruginosa, Aeromonas, Stenotrophomonas maltophilia. Acinetobacter baumannii B. cepacia, S. maltophilia, S. maltophilia Ps. Aeruginosa Amoxicilina/cido clavulnico Ampicilina/Sulbactam Ampicilina, Cefazolin Cefalotina, Cefoxitin, Cefotetan, Cefmetazole. Ticarcilina, Mezlocilina, Piperacilina. Gentamicina Imipenem, Meropenem. Trimethoprim-Sulfametoxazole. Cefuroxime

CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO: Objetivo Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio clnico, deben estar amparados por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo, basados en las instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos. Programa de mantenimiento Un programa de mantenimiento preventivo es esencial para asegurar la exactitud y longevidad del instrumento. El chequeo peridico recomendado es importante para minimizar el dao o la necesidad de servicio y reparacin. El Director del laboratorio es responsable por el programa general, recayendo en el jefe de la seccin la responsabilidad primaria en su rea de trabajo. Puede en algunos casos relegar la responsabilidad en el Departamento de Biomdica de la institucin quienes coordinarn con la casa suplidora el programa de mantenimiento. Manual Estndar de Procedimientos Operacionales El Manual Estndar de Procedimientos Operacionales debe ser organizado por grupo de equipos. Un listado de los equipos debe incluir: nombre, marca, modelo, nmero de serie, fecha de recibo y nmero de inventario de la institucin. Los nuevos equipos requieren una inspeccin funcionabilidad y seguridad elctrica. previa de Biomdica para garantizar su

El Manual debe incluir el rcord de mantenimiento preventivo, periodicidad de la inspeccin y fallas del instrumento. El Manual debe estar accesible en todo momento. Validacin de Equipos Los nuevos equipos de mayor impacto en el cuidado del paciente ( Vitek, Bactec, BacT/alert) requieren estudios de validacin para determinar que su funcionamiento es al menos comparables a los equipos existentes o a mtodos de referencia. Estos equipos son aceptados solo si logran

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cumplir las metas mnimas de funcionabilidad y eficiencia al compararse con los existentes. Este rcord de validacin debe mantenerse por toda la vida til del equipo. Manual de Instrucciones del Uso del Instrumento Estos Manuales deben estar incluidos en el Manual de Operaciones del instrumento, redactados en forma clara, en el idioma de los usuarios, inclusive la documentacin del entrenamiento del personal. Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de limpieza y cuidado del instrumento. Los Manuales deben incluir instrucciones bsicas para resolver problemas menores y un rcord de incidencias, que incluye el tipo de problema, los pasos tomados para resolverlo y la accin correctiva para evitarlo en el futuro. Calibracin del Instrumento Los equipos que requieren un exacto nivel de precisin para obtener un resultado seguro, requieren de una calibracin peridica. La fecha de la calibracin, frecuencia y resultado, deben ser mantenidos en un libro rcord dentro del laboratorio. Control de Calidad Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en base a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio. Debe mantenerse un libro rcord de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha, resultado y comentarios. En otro captulo se afianzarn los conceptos sobre ste tema. Referencias y Lectura Suplementaria El Laboratorio guardar en un flder toda literatura extra que se obtenga sobre un equipo, sus accesorios, materiales, estudios forneos sobre su funcionamiento, etc. a) INCUBADORAS a) Controlar diariamente la temperatura de las incubadoras , antes de sacar los platos y anote en una hoja control el resultado. b) Observar el termoregulador por cualquiera alteracin en su posicin preestablecida. c) Colocar las muestras, platos y tubos, en una posicin segura. d) Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es adecuado para mantener la humedad requerida. e) Las incubadoras de CO2 requieren medir el nivel de gas diariamente. f) El jefe de seccin debe ser notificado cuando una incubadora falla en mantener el rango de temperatura aceptable. g) Observar macroscpicamente los platos Petri para observar desecacin. h) En incubadoras de CO2 , se puede colocar un cultivo de N. Gonorrhoeae ATCC 43069 , subcultivandola cada da, para observar su ptimo crecimiento, ya que es un microorganismo que necesariamente requiere CO2 para crecer. i) Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un rcord de mantenimiento preventivo. b) AUTOCLAVES Procedimiento Mensual 1. 2. 3. 4. 5. 6. Examinar rcord de Temperatura y Presin Utilizar Indicadores de Esterilizacin Rcord de uso, fecha, temperaturas, presin Chequeo del nivel de agua Uso de Indicadores biolgicos de Esterilidad Chequeo de la vlvula de seguridad Por corrida Diario Semanal

X X X X X X

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7. Limpieza del Interior y Exterior. 8. Limpieza de la Pantalla de Temperatura 9. Limpieza del drenaje y sellos X X X

c) CAMARAS DE SEGURIDAD a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) Apague la lmpara Ultravioleta antes de comenzar a trabajar. Prenda el blower 15 minutos antes de utilizar. Observe que no se obstruye el flujo de aire. Si hay derrame dentro de la cabina, limpie con un desinfectante apropiado, manteniendo apagada la cabina. Evite el uso de mecheros de flama dentro de la cabina. Lleve un control de la medida del flujo de aire. Lleve un control de la calibracin del flujo de aire. Lleve un control del remplazo de los filtros. Compruebe los sistemas de alarma de funcionamiento. La superficie interior de la mesa de trabajo de la cabina, puede ser cultivada semanalmente para detectar contaminacin. Desinfecte la cabina antes y despus de utilizar. No utilice las cabinas biolgicas para hacer mezclas de sustancias qumicas y viceversa. Cuando trabaje en la cabina, evite la entrada brusca de aire y el uso innecesario de las puertas del rea.

d) INCINERADOR a) b) c) d) e) En condiciones normales el incinerador logra la temperatura ptima de esterilizacin ( 815C ) 10 minutos despus de haber sido encendido. Bastan 5 segundos para lograr la destruccin de bacterias, hongos y micobacterias. No es necesario observar incandescencia en el asa para lograr la esterilizacin. Inspeccione la cermica del incinerador por rajaduras. Aleje el incinerador de elementos que puedan incendiarse por el calor generado.

e) GENERADORES DE AMBIENTE - SISTEMA GasPak a) b) c) d) e) Mantenga los generadores de gas a temperatura ambiente y el sobre sellado. Mantenga los catalizadores en lugar seco, a temperatura ambiente y las bolsas sellados. Mantenga los indicadores de anaerobiosis a temperatura de refrigeracin ( 2-8C ). El tiempo de generacin de la atmsfera dentro de la jarra es de 30 minutos. El indicador de anaerobiosis cambia de color azul a blanco dentro de la jarra en 4 a 5 horas. f) Una evidencia sugestiva de ambiente anaerobio, es el cambio de color a rojo vino del agar sangre. g) Algunos microbilogos utilizan un agar inoculado con Clostridium novyi B ( ATCC 19402 ) como indicador de ambiente anaerobio, ya que el mismo es anaerobio estricto. h) Los catalizadores de Paladio, pueden ser regenerados colocndolos en horno a 160 C por 2 horas. i) Control biolgico de crecimiento: CEPA Cl. perfringes Micrococcus luteus Campylobacter jejuni ATCC 13124 9341 33291 RESULTADO Crece No crece Crece

f)

REFRIGERADORAS

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a) b) c) d) e) f) g) h) Control diario de la temperatura. Coloque los platos Petri en posicin invertida con la tapa hacia abajo. Mantenga la temperatura entre 4 8 C. Utilice refrigeradoras que no hacen escarcha. No coloque medios de cultivo an ligeramente calientes dentro de la refrigeradora. Evite abrir con frecuencia la puerta de la refrigeradora. Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solucin. No guarde alimentos en refrigeradoras para especmenes clnicos.

g) MICROSCOPIOS

Cuidados y mantenimiento 1. 2. 3. 4. Limpieza del aceite de objetivos, condensador, etc Apagar la fuente de luz Colocar cobertor contra el polvo Limpieza de Ocular, condensador, diafragma con lquido de limpieza de lentes 5. Limpieza y ajuste del sistema ptico 6. Limpieza y ajuste del sistema lumnico 7. Limpieza y lubricacin del sistema mecnico

Diario X X X

Mensual

Semestral

X X X X

_________________________________________________________________

h) CENTRFUGAS : _____________________________________________________________________________ Elemento / accin Por corrida Diario Semanal Mensual Anual 1. Verificar tubos por rajaduras X 2. Verificar por restos de vidrio o lquido dentro del portatubo o las copas X 3. Verificar por balance de cada lote X 4. Verificar por la temperatura de funcionamiento ( Refrigeradas ) X 5. Limpieza de cualquier derrame X 6. Limpieza de la olla del rotor 7. Limpieza externa 8. Desinfeccin de la olla del rotor 9. Verificacin de brochas 10. Chequeo del circuito elctrico 11. Certificacin del velocmetro 12. Medicin de la temperatura interna con termmetro calibrado ( Centrfugas refrigeradas ) PROBLEMAS Y LIMITACIONES 1) Vibracin a) Chequear por balance apropiado. b) Chequear tamao de los tubos. c) Mirar si la centrfuga est sobre una superficie plana. 2) Rotura a) Chequear tamao de los tubos. b) Balance correcto.

X X X X X X X

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c) Verificar el interior de los portatubos 3) Desprendimiento de tapas: a) Utilice tapas de rosca. b) Si no es posible, use Parafilm sobre los tapones de caucho. c) Siempre que sea posible utilice tubos de plstico. 4) No centrifugar grandes volmenes de lquidos inflamables, los cuales pueden producir vapores que pueden incendiarse durante la operacin del equipo. 14) La concentracin de materiales infecciosos para cultivo puede realizarse en el rea rutinaria de cultivo, siempre y cuando los tubos estn bien cerrados. 15) No colocar las tazas o los portatubos en el horno o autoclave para descontaminar. 16) Evitar utilizar para la limpieza soluciones que contengan cloro o sal, ya que son altamente corrosivas. CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS COMPUTARIZADOS El laboratorio de microbiologa moderno se auxilia de equipos computarizados para ayudar en la rapidez y precisin del diagnstico etiolgico. En la seccin de Microbiologa del Laboratorio Clnico del C.H.M,Dr. A.A. Madrid contamos hasta la fecha de 4 sistemas computarizados: BacT/Alert y Bactec para los hemocultivos, Vitek System para la identificacin y antibiogramas y mas recientemente el Bactec MGIT 960 para la deteccin de micobacterias. Cada uno de stos equipos, consta de sus propios sistemas para el control de calidad. A continuacin presentamos algunas observaciones relativas al control de calidad de los referidos equipos: BACT/ALERT: El sistema BacT/Alert es utilizado para la deteccin temprana de microorganismos en hemocultivos u otros fluidos corporales. El sistema utiliza un sensor colorimtrico y una luz reflejada para monitorear la presencia y produccin de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Si existen microorganismos en la muestra, se genera CO2 cuando los microorganismos metabolizan los substratos del medio de cultivo. Si el crecimiento de los microorganismos genera CO2, el color del sensor gas-permeable instalado en el fondo de cada frasco de cultivo cambia de verde a amarillo. Cada equipo trae consigo un kit de reflectancia estndar para los procedimientos de control de calidad y de calibracin. Adems, de un software para ayudar en pantalla a realizar el mismo. A parte de esto, cada lote de frascos de cultivo es suministrado con un Certificado de Anlisis de control de calidad de fbrica. El BacT/Alert utiliza 3 determinantes de control de calidad: Control de calidad de las celdas, Calibracin de las celdas y Calibracin de la temperatura del equipo. La opcin Control de Calidad de las Celdas es utilizada para asegurar que las celdas del instrumento estn en su ptima capacidad de deteccin.. Este control debe ser parte del mantenimiento normal del sistema. Un kit estndar de reflectancia es proporcionado con cada instrumento para los procesos de control de calidad y calibracin. Son dos estndares de reflectancia en cada kit, sin embargo, el proceso de control de calidad solo utiliza el estndar de reflectancia B. El anillo al final de los estndares identifica su nmero estndar de reflectancia. Cuando el control de calidad de una celda falla y no es recalibrada, sta automticamente es inactivada. Generalmente el periodo de control de calidad para cada celda est configurado en 30 das en base al men Editar Configuracin del Sistema del captulo Mantenimiento de Funciones del Sistema. Este control solo se puede realizar en celdas vacas. Al final de que todas las celdas han sido evaluadas, puede obtenerse por impresin un Reporte del Estado de las Celdas, luego de lo

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cual el instrumento retorna automticamente al men Funciones de Mantenimiento del Instrumento. La opcin Calibracin de Celdas, es utilizada para recalibrar cualquier celda que haya fallado el control de calidad. El kit viene con dos estndares de reflectancia. El procedimiento utiliza ambos. El instrumento automticamente recalibra la celda una vez se ha introducido el estndar cuando lo indique el instrumento. Si la calibracin de la celda falla, el instrumento automticamente inactiva la celda. Al final se puede obtener un reporte del estado del instrumento y la pantalla retorna automticamente al men de Funciones de Mantenimiento del Instrumento. La opcin Calibracin de la Temperatura , es utilizada para calibrar la temperatura dentro del instrumento. Primero se mide la temperatura interna del instrumento utilizando el proceso descrito en Verificacin de la Temperatura del captulo Mantenimiento Preventivo. Solo utilice sta opcin si hay discrepancia entre la temperatura marcada por el equipo y la temperatura ptima preestablecida. Observaciones y Limitaciones del Sistema: 1) 2) 3) 4) 5) P. En cada frasco se debe anotar su nmero de laboratorio y la casilla asignada. Colocar los frascos hasta el fondo de la celda. No aerear los frascos anaerobios. Todo frasco con frotis negativo, debe ser colocado nuevamente en el aparato. Ciertas variantes de H. influenzae, N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae y anaerobius, pueden ser sensibles al anticoagulante ( SPS ) lo que resulta en una falta de crecimiento o baja produccin de CO2. 6) En el caso de cultivo de otros fluidos corporales, se requiere agregar sangre u otro suplemento al frasco si se intenta recuperar organismos tales como H. influenzae y N. gonorrhoeae. 7) En contadas ocasiones pueden presentarse BacT/Alert positivos, con frotis y subcultivos negativos, debido a una excesiva cantidad de glbulos blancos en la muestra de sangre. 8) Se recomienda quitar del aparato, aquellos frascos considerados positivos por el BacT/Alert, para evitar cultivos no viables debido a autolisis, especialmente en microorganismos fastidiosos como el S. pneumoniae. BACTEC 9240 : El sistema Bactec 9240 es utilizado para la deteccin temprana de microorganismos en hemocultivos por el mtodo de la fluorescencia. Cada frasco contiene un sensor que puede detectar aumentos del CO2 producido por el crecimiento de los microorganismos. Cada 10 minutos el instrumento verifica el aumento de la fluorescencia del sensor, la que se relaciona con la cantidad de CO2 presente. Observaciones y limitaciones del Sistema: 1. No utilice frascos con signos evidentes de deterioro. 2. No utilice frascos de cultivo despus de la fecha de caducidad. 3. Los frascos inoculados deben ponerse en el instrumento tan pronto como sea posible. 4. Si se ha tardado en colocar un frasco inoculado en el instrumento, y se puede ver crecimiento, el frasco no debe analizarse en el instrumento, sino subcultivarse y hacer placa por Gram, considerndolo como un frasco presuntamente positivo. 5. Se recomienda analizar el rendimiento de cada lote de frascos recibidos, utilizando un control positivo y uno negativo. El frasco positivo debe inocularse con 1.0 ml de una suspensin de E. coli o S. aureus con un estndar McFarland de 0.5. El control negativo est constituido por un frasco sin inocular. 6. Dado que la sangre puede neutralizar la accin txica del anticoagulante SPS sobre algunas Neiserias y cocos Grampositivos anaerobios, se recomienda utilizar volmenes de sangre no menores a 1.0 ml para facilitar el crecimiento. 7. Ciertos organismos exigentes como el H. influenzae requieren para su crecimiento de elementos que se encuentran en la sangre como el factor V. Si la muestra de sangre es

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reducida, es posible que se requiera agregar stos suplementos al frasco si se sospecha de stos microorganismos. 8. Puede darse casos de falso positivo en pacientes con un conteo de leucocitos muy elevado. SISTEMA ViteK: El control de calidad, es un subsistema del Vitek, que examina la seguridad de sus tarjetas. El control de calidad opera similarmente a la evaluacin de exmenes clnicos. El test clnico identifica el organismo, el examen de control de calidad valida el test. 1. El programa de control de calidad evala el kit del Vitek y los organismos de control de calidad listados en el paquete. 2. Las tarjetas de control de calidad utilizan 7 dgitos, compuestos de 2 partes: Los primeros 6 dgitos identifican el tipo de tarjeta y un organismo ATCC. El sptimo dgito identifica el nmero de lote. 3. Cada nmero predefinido de referencia en el control de calidad significa un tipo de test y un organismo. Un nmero de referencia de control de calidad es ms que un nmero de identificacin de tarjeta. Cada uno de stos nmeros significa la paridad de un tipo de tarjeta con un organismo. As por ejemplo el nmero de referencia 900101 corresponde al Proteus mirabilis ( ATCC 7002 ) y el 900102 a la Ps. aeruginosa ( ATCC 27853 ). 4. Un campo para control de calidad demogrfico est accesible para la informacin del lote de la tarjeta. 5. El control de calidad provee su propio set especial de reporte. 6. El flujo de operacin del control de calidad es idntico al flujo de una muestra clnica. 7. Los resultados de control de calidad se transfieren de la incubadora/lector a la base de datos, si la opcin de transferir la tarjeta finalizada est activa. 8. Todos los resultados se mueven a travs del manejador de desviaciones del control de calidad, el cual compara los resultados actuales con los conocidos. 9. El programa de control de calidad Vitek permite ver los resultados del control en pantalla, los cuales aparecen en 3 diferentes formatos: Resultado de la identificacin, resultado de la sensibilidad a los antibiticos y Resultado de la Identificacin de Urocultivos. La pantalla nos indica : La identificacin del organismo esperado ( ATCC ). Resultado de la identificacin actual. Lote de la tarjeta. Fecha del test. Fecha de expiracin de la tarjeta. Reacciones bioqumicas esperadas y de la prueba actual. Cada uno de los test bioqumicos son sealados tanto en lo esperado como en el resultado actual, y se genera una lista de los test que se han desviado del resultado esperado. Igual patrn al anterior muestra la tarjeta de sensibilidad a los antibiticos. Todos los resultados de control de calidad pueden ser imprimidos para guardar en un libro rcord.

10. La base de datos de los equipos de identificacin computarizados, deben ser frecuentemente revisados para actualizarlo en lo referente a los cambios taxonmicos que ocurran. Igualmente se debe prestar atencin a la informacin proveniente de la casa manufacturera acerca del producto y las investigaciones e con el equipo aparezcan en la literatura especializada. 11. El sistema Vitek tambin cuenta con un programa que ayuda a evaluar los resultados, minimizando los errores de interpretacin. Se trata del bioMrieux Vitek Expert System, un programa que usa la lgica proposicional, es decir llega a ofrecer ciertas conclusiones basado en la informacin formulada. El programa puede detectar: Identificaciones que son inconsistente con los resultados de sensibilidad. Errores tcnicos. Fenotipos raros o improbables. Expresiones de resistencia incompleta. Resistencia cruzada.

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12. El sistema tambin permite la adicin de reglas ( CAR ) en la que se establecen parmetros que debe cumplir el reporte antes de su impresin. SISTEMA BACTEC MGIT 960 : El sistema Bactec MGIT 960 es utilizado para la deteccin temprana de micobacterias en especmenes clnicos. El control de calidad del instrumento es automtico y est activo continuamente para asegurar la operacin confiable del sistema. El reporte de control de calidad suministra una lista del estado de todos los detectores del instrumento con la fecha y hora de la ltima verificacin, e incluso la lista de las celdas bloqueadas, temperatura de cada incubadora, estado de los sensores, etc. Control Diario del Equipo: a) Verificar la operacin de las gavetas/incubadoras y las lmparas indicadoras de estacin. b) Realizar test de las luces LED indicadoras ( Verde y Roja ). c) Chequear el termmetro apretando el botn de test. Cada vez que se recibe un lote nuevo de tubos MGIT , se sugiere control de calidad de cepas ATCC en caldo Middlebrook 7H9.

_______________________________________________________________
Especie Dilucin 0.5 McFarland Das para ser detectado (Suspencin en salina) Positivo ______________________________________________________________________ M. tuberculosis 27294 1:500 6 10 M. kansasii 12478 1:50000 7 11 M. fortuitum 6841 1:5000 1-3 ______________________________________________________________________ Control de Calidad Negativo: a) Utilice un frasco MGIT con solucin descontaminante MycoPrep kit y PANTA ( Mezcla antimicrobiana ). colquelo en la incubadora/detector. b) Colocar un frasco de MGIT sin muestra y sin descontaminante y colquelo en la incubadora/detector. c) Inocule una suspensin de E. coli dentro de un tubo MGIT y colquelo dentro de la incubadora/detector. Control de Calidad Positivo: a) Inocule un frasco de MGIT con una cepa control domstica de Mycobacterium tuberculosis o una cepa control de M. Tuberculosis ATCC 25177 o M. Intracellulare ATCC 13950 y colquelo en la incubadora. b) Es importante comprobar que el agua, reactivos de tincin, suplementos, etc, estn libres de contaminacin por micobacterias ambientales especialmente M. Gordonae y M. Terrae. CONTROL DE CALIDAD DE FORMULAS LACTEAS y MAMADERAS PARA EL SERVICIO DE NEONATOLOGA El control de calidad de las frmulas lcteas y sus mamones se realiza como un servicio al Departamento de Neonatologa del hospital. Bsicamente ste control consiste en un recuento bacteriano de bacterias mesfilas y recuento de bacilos coliformes. Consideraciones referentes al control de calidad de formulas y mamaderas: a) Mantener control sobre la esterilidad de los platos Petri y las pipetas. b) Si al calentar los tubos para diluir el agar base o el Red Bile presentaran turbidz, descartar ya que es signo de contaminacin del medio. ATCC

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c) Es preferible no mezclar por inversin la leche para homogenizar, ya que se puede salpicar la parte interna de los mamones y si hubiera contaminacin de la leche, sta se puede extender al mamn afectando la calidad de los mismos. d) Evitar servir muy calientes el agar base o el Red Bile al plato Petri conteniendo la muestra a evaluar, ya que se pueden matar los posibles grmenes. Una temperatura de aproximadamente 30-40 C es apropiada, sin dejar coagular el agar. e) Mezclar homogneamente el agar y la muestra rotando el plato y sin permitir la formacin de cogulos. f) Las frmulas lcteas solo pueden guardarse en refrigeracin por un mximo de 48 horas antes de ser procesadas. g) En condiciones normales la leche y los mamones deben ser estriles, especialmente no deben contener bacterias coliformes. h) Si repetitivamente se observa contaminacin de la leche, solicitar a las nutricionistas encargadas de la supervisin de la preparacin de las frmulas, una muestra de leche en polvo para un cultivo directo y una muestra de agua, si fuera necesario. Grado A : El recuento bacteriano no debe exceder de 30,000 col/ ml. Recuento de coliformes no mayor de 10 col/ml. Grado B: El recuento bacteriano no debe exceder de 50,000 col/ml. Recuento de coliformes no mayor de 10 col/ml. CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA : El agua destilada utilizada en la preparacin de medios de cultivos y para reconstituir reactivos, debe tener un control de calidad bsico que incluye los parmetros qumicos y bacterianos.

Control de Calidad Qumico Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de parmetros a evaluar, tales como: pH Conductividad Olor Color aparente Turbidz Alcalinidad Dixido de carbono Dureza Iones Cationes Metales pesados

Sin embargo, dadas las limitaciones para realizar un estudio profundo, recomendamos el siguiente mtodo sencillo y apropiado para determinar la calidad del agua, aparte de la determinacin de su pH (5.0 5.5). Reactivos: a) Solucin Acuosa de Nitrato de plata ( NO3Ag ) NO3Ag ......... 5.1 g Agua destilada ............ 300 ml b) Acido Ntrico Mtodo: Colocar en un vaso qumico limpio :

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10 ml de agua destilada a examinar 2 gotas de cido ntrico 1 ml de Solucin de NO3Ag Evaluacin: El agua deber continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidz blanquecina, indicar que la calidad es deficiente. Control de Calidad Microbiolgico del Agua destilada: 1) Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato. 2) Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre. 3) Incubar a 35.5 C por 4 das. 4) Llevar un libro rcord del control de calidad del agua.

3. EL CEPARIO : Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para asegurar que los parmetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domsticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa Clnica, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus caractersticas morfolgicas , fisiolgicas y que sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validacin. Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son: ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japn CCTM : Coleccin Nacional Lille, Francia RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia. NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania. As, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210. Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domsticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de aislamiento, reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los antibiticos, forma de almacenaje, fecha de ltimo transplante, etc

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En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos especficos: Caractersticas tpicas. Caractersticas estables. Reproducibilidad

1. Mtodos de Conservacin de Cepas Bacterianas: Los mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y que puedan ser reproducidas despus. El medio utilizado para su conservacin debe mantener un mnimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo crecimiento del microorganismo y aportando ptimas condiciones ambientales para su sobrevivencia, con el menor nmero de subcultivos Para una mejor clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos en tres categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario. A) CULTIVOS STOCK: Estos representan el verdadero Banco de Cultivos . Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para evitar su potencial mutacin. Los dos ms importantes mtodos para conservacin en Stock, son la Liofilizacin y el Ultracongelamiento.

LIOFILIZACIN Se hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en leche estril o similar, y se coloca en tubos con rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vaco, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formacin de aerosoles Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas. ULTRACONGELAMIETO Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en pociones de 0.5 ml en pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45C Tambin se puede utilizar la modificacin de Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato especficamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido. Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo. B) CULTIVOS SEMISTOCK: Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios.

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1) Congelamiento en congelador convencional Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a 25C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelacin y son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al menos de 6 a 12 meses. 2) Cultivo en CTA: Se preparan tubos con rosca conteniendo Cistena- Tripticasa y Soya agar. Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses. 3) Secado en discos con gelatina: Este mtodo es conocido tambin como mtodo Stamp en honor de su creador. Corte pequeos crculos de papel encerado y colquelo en un plato Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presin. Prepare una suspensin de caldo nutriente con 10% de gelatina en polvo (Peso por Volumen) y 0.25% de cido ascrbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice en autoclave. Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven y coloque una gota del mismo con una pipeta estril sobre uno de los discos de papel acerado estril en un plato Petri. Con una pinza estril, transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo Pentaxido de fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco est seco, aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador. Para hacer un subcultivo del disco, aspticamente retire un crculo de papel con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 4 horas a 35C y luego hacer transplante a agar sangre e incubar nuevamente . 4) Conservacin en medio de cultivo inclinado con aceite mineral Es un mtodo especialmente utilizado para hongos, pero es til tambin para algunas bacterias. En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien esporulado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presin por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta. Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porcin visible de crecimiento con una asa estril larga o una aguja. Este mtodo permite la sobrevivencia por muchos aos. Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazn o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con rosca. Se esterilizan y luego se les hace coagular en forma inclinada.

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Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxgeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 aos a temperatura ambiente. 5) Mantenimiento en tierra estril Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas. Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presin por 1 hora. Haga una suspencin fuerte del microorganismo joven y esporulado y colquelo en el tubo con tierra estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador. c) CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO: Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son transplantados diariamente. Bacterias resistentes: Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacteriaceas. Se transfiere una colonia joven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock.

Bacterias delicadas Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeracin. Despus de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.

Bacterias anaerbicas Los cultivos para trabajo diario de la mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado despus de esterilizar por autoclave. Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

Hongos: Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto.. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulacin, para luego ser colocados en refrigeracin. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses . Pasado ste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.

Cultivos de trabajo comerciales

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Son preparados por casa comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC.. Estas son estables en refrigeracin por un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras. Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo de Tripticasa y Soya e incubados por 24 horas a 35C. Luego se hace un transplante a un medio de enriquecimiento o a agar sangre. MANTENIMIENTO DEL CEPARIO: Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validacin de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metdico de transplantes de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los antibiticos, origen de la cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo transplante, etc CEPAS ATCC: En nuestro medio por situaciones muy especiales y altamente beneficiosas, podemos tener acceso a las cepas control del American Type Culture Collection ( ATCC ) , la coleccin ms grande e importante del mundo. Estas cepas bacterianas pueden ser utilizadas como control en una gran variedad de utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los productos comerciales o elaborados en el laboratorio. A continuacin algunas referencias de las cepas ATCC: MICROORGANISMO E. coli S. typhimurium P. mirabilis E. faecalis St. pyogenes St. pneumoniae S. epidermidis Candida albicans Candida albicans Candida tropicalis S. aureus S. epidermidis P. mirabilis M. tuberculosis (TBC) M. kansassi ( I ) M. scrofulaceum (II ) M. intracellulare ( III ) M. fortuitum ( IV ) E. coli ATCC 25922 14020 12453 29212 19615 6305 12228 60193 60193 66029 25922 12228 12453 2577 12478 19981 13950 6841 25922 MEDIO McConkey McConkey McConkey McConkey Agar sangre Agar sangre Agar sangre Agar sangre CARACTERSTICA Colonia rosada Colonia incolora Colonia incolora No crece -hemlisis alfa-hemlisis no hemoltico no hemoltica

Tubos germinales Positivo Tubos germinales Negativo Manitol sal Manitol sal Manitol sal Low-Jensen Low-Jensen Low-Jensen Low-Jensen Low- Jensen Low-Jensen Colonia amarilla Colonia incolora No crece Crece. Incoloro Crece. Amarillo + luz Crece. Amarillo luz Crece. Incoloro Crece. < 7 das. No crece

LISTADO DE CEPAS ATCC SUGERIDAS PARA CONTROL DE CALIDAD MICROORGANISMO ATCC

Campylobacter jejuni .............................................. 33290 Enterococcus faecalis ............................................... 29212 Escherichia coli......................................................... 25922

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Escherichia coli ........................................................ 35218 Proteus vulgaris ....................................................... 8482 Pseudomona aeruginosa .......................................... 27853 Salmonella typhimurium ........................................ 14028 Shigella sonnei ........................................................ 9290 Shigella sonnei ........................................................ 25911 Shigella flexnerii ..................................................... 12022 Enterobacter aerogenes ........................................... 13048 Staphylococcus aureus ............................................ 25923 Staphylococcus aureus ............................................ 29213 Staphylococcus epidermidis .................................... 12228 Steptococcus pyogenes ............................................ 19615 Streptococcus pneumoniae ....................................... 6305 Streptococcus pneumoniae ....................................... 49619 Streptococcus faecalis ............................................... 19433 Haemophilus influenzae ............................................ 49247 Haemophilus influenzae ............................................ 49766 Neisseria gonorrhoeae ............................................... 49226 Escherichia coli 0157:H7 .......................................... 43894 Bacteroides fragilis .................................................... 23745 Clostridium perfringes ............................................... 3624 Clostridium sporogenes ........................................... 19404 Clostridium tertium ................................................... 19405 Clostridium novyi A ................................................. 19402 Fusobacterium necrophorum .......................................25286 Fusobacterium nucleatum ............................................25586 TRANSPORTE DE CEPAS BACTERIANAS: La mayora de las naciones han implementado regulaciones internacionales para el empaque y transporte de materiales biolgicos potencialmente nocivos para el hombre o los animales. Estas reglas intentan proteger al pblico de accidentes al tener contacto directo o indirecto con dichos productos. El personal que prepara ste envo debe ser apropiadamente entrenado en las formas de empaque y en las regulaciones internacionales que lo rigen. Solo como una gua enumeraremos algunas regulaciones forneas: U.S Public Health Service, 42 CFR part 72, Interstate shipments of Etiologic Agents. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations. Unites Nations Recommendations of the Committee of Experts on the Transportation of Dangerous Goods. U.S Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration, 29 CFR Part 1910.1030, Bloodborne Pathogens.

Generalmente el transporte de agentes etiolgicos requiere un doble o triple empaque, dependiendo de las regulaciones del pas de destino. Si la cepa est contenida en un tubo de vidrio, se recomienda que sea pequeo y de vidrio grueso. Este a su vez debe estar inmerso en un envase de metal con material aislante como el aserrn o foam desmenuzado. A ste envase se le puede adicionar otro que contenga igualmente aserrn o foam , dependiendo de las regulaciones y por ltimo la caja externa no porosa, con recubrimiento de cera en su interior y a prueba de derrame. En sta caja irn las etiquetas , gua area, etiquetas de advertencia, nmeros telefnicos para contactar en caso de emergencia, tanto en el pas de origen como en el de destino. Igualmente se etiquetar con un smbolo de material peligroso de color rojo.

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4. SUPERVISON DEL PERSONAL: El personal es el factor ms importante en la calidad del trabajo en el laboratorio de microbiologa. Este personal debe tener una dedicacin y actitud positiva hacia el trabajo, capacidad acadmica, actualizacin constante y contar con los elementos indispensables para su labor. 1. Evaluacin del personal: La competencia del personal de microbiologa, debe ser certificada por la revisin de su hoja de trabajo, la interpretacin de muestras desconocidas , su habilidad tcnica y exmenes escritos anuales. Se debe llevar un registro profesional acerca de su evaluacin acadmica, reporte sobre su capacidad de trabajo, asistencia a programas de educacin continuada, responsabilidad, asistencia, trabajos de investigacin, charlas, conferencias y su evaluacin profesional anual. Todo nuevo empleado que se adicione a la plantilla de la seccin, debe ser documentado, evaluado y certificado, incluyendo las fases pre-analticas, analticas y post-analticas de funcionamiento del laboratorio. 2. Programa de docencia: Un elemento fundamental en el mantenimiento apropiado de la competencia del personal es el programa de educacin continuada. Este programa mantiene al personal informado en los avances en la deteccin e identificacin de agentes etiolgicos, nuevos test, equipos, cambios en la taxonoma bacteriana y la evaluacin correcta de las pruebas de sensibilidad a los antibiticos. Este programa puede incluir charlas, mesas redondas, lecturas de artculos de inters, discusin de casos clnicos, evaluacin de nuevos test o equipos, revisin de la literatura sobre temas

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especficos, trabajos de investigacin, etc. Se debe llevar un control sobre la participacin individual del personal en el programa, su asistencia y actividad, lo cual formar parte de su evaluacin anual. 3. Evaluacin del informe final: El resultado final de la evaluacin de un espcimen clnico luego de cumplir con todas las etapas de investigacin, es el informe final que implica una identificacin etiolgica, si la hubiera, y su correspondiente sensibilidad a los antibiticos. Para llegar a ste resultado, el laboratorio de microbiologa debe haber agotado todos los elementos diagnsticos de que dispone y hacer un juicio respecto a la posibilidad de que dicho informe represente el potencial agente infeccioso, tomando en cuenta los factores que estn involucrados tales como el tipo de muestra, microorganismo aislado, edad del paciente, procedencia, informes previos, frotis directo y el patrn de comportamiento frente a los antibiticos, entre otros. En todo informe final debe prevalecer el concepto de rapidez y seguridad diagnstica. Es recomendable y as est establecido en Manuales forneos, que los resultados sean evaluados antes de su envo por un el jefe del laboratorio de microbiologa o en su defecto por un Supervisor con experiencia y capacidad demostrada, con el fin de minimizar potenciales errores, omisiones o interpretaciones del informe final, tomando en cuenta el valor que ste reporte tendr en la evaluacin, tratamiento y la salud del paciente. Es importante en sta etapa establecer los Valores de Alerta en microbiologa, los cuales son aquellos resultados de mayor preponderancia, ya sea por el tipo de microorganismo involucrado o por su significado en el control de enfermedades de notificacin obligatoria. VALORES DE ALERTA EN MICROBIOLOGA Organismos vistos en LCR Tinta china positiva Deteccin de antgenos de Cryptococcus Deteccin de antgenos de LCR Frotis BAAR positivos Hemocultivos positivos Cultivo de LCR positivo Aislamiento de M. Tuberculosis Aislamiento de Shigella sp Aislamiento de Salmonella typhi Aislamiento de E. coli 0157:H7 Aislamiento de Neiserias patgenas. Aislamiento de Estafilococos resistentes a la Vancomicina. Aislamiento de agentes etiolgicos de notificacin obligatoria. Cuando se observen Valores de Alerta , se debe notificar al jefe de la seccin. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO: Es recomendable que los laboratorios de microbiologa puedan participar en programas de evaluacin externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar un desconocido y llegar a un resultado seguro. Los mismos consisten en la identificacin de muestras o microorganismos desconocidos en los cuales se debe informar del resultado de la identificacin, pruebas utilizadas para el diagnstico etiolgico y sensibilidad a los antibiticos. El Director del laboratorio debe escoger el programa que sea consistente con el nivel de calidad de su laboratorio. Generalmente estos desconocidos vienen con un abstracto clnico y son recibidos al menos 2 veces al ao. Los laboratorios que ofrecen stos programas invalidan aquellos laboratorios que fallan en responder el cuestionario, por lo que es necesario mantener un contacto muy especial para no perder ste beneficio. Los resultados de la evaluacin de los desconocidos

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deben ser discutidos por todo el personal antes de su informe al programa. laboratorio generador del

Algunos laboratorios que ofrecen programas externos de evaluacin de la calidad son: 1) Accutest: POBox 999 Westford, MA 01886-0031 2) American Association of Bioanalysts Proficiency Testing Service 205 West Levee Street Brownsville, TX 78520-5596 3) American Proficiency Institute 1159 Business Park Drive Traverse City, MI 49686 4) The College of America Pathologists- Survey College of American Pathologists 325 Waukegan Road Northfield, Il 60093-2750 5) Idaho Bureau of Laboratories Proficiency Testing Program 2220 Old Penitenciary Rd. Boise, ID 83712 6) Medical Laboratory Evaluation (MLE ). 2011 Pensnsylvania Av, NW, Suite 800 Washington, DC 20008-1808 7) New Jersey Department of Health Proficiency Testing Program, CN 360 Trenton, NJ 08625-0360 USA 8) Pacific Biometrics 110 Eastlake Avenue East Seatle, WA 98109 9) Puerto Rico Department of Health Laboratory Service Program Department of Health of Puerto Rico, Bulding A Call Box 70184 San Juan, Puerto Rico 00936 ( Tel. (800)-769-7774 ) 10) Universitair Ziekenhuis St. Rafael B-300 Bacteriologie Leuven Belgium Att: Prof. Dr. J. Vandepitte Prof. J. Verhaegen Tel. 0032-16-332150 Fax. 0032-16-336321 CERTIFICACIN DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: Un nuevo concepto en la organizacin de los laboratorios es la acreditacin a Asociaciones especializadas que promueven la excelencia en la calidad de los servicios de sus miembros. Esta calidad est enfocada no solo en los aspectos tcnicos, sino tambin en los administrativos, racionalizacin de recursos, planificacin gerencial, costos de operaciones, calidad de servicio al cliente, es decir, un enfoque de Calidad Total. En los Estados Unidos stas acreditaciones estn

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validadas por asociaciones como la American Society for Microbiology, College of American Pathologists, American Association of Bioanalysts, etc. En Latinoamrica algunas asociaciones de laboratorios han creado comits de acreditacin para laboratorios pblicos y privados. El enfoque moderno en un mundo en que las distancias se han acortado y los conceptos de globalizacin son una realidad, la acreditacin proporciona a los miembros la posibilidad de comunicarse mejor con otros laboratorios del mundo, lo cual permite un intercambio de experiencias en metodologas, compra de equipos, entrenamiento de personal, etc Los problemas legales y altos costos de operaciones, han obligado a los grandes laboratorios a encontrar un modelo an ms complejo de aseguramiento de la calidad, con el fin entre otros, de bajar costos. La Organizacin Internacional de Estndares ha desarrollado una gua llamada ISO 9000 que establece un flujograma de trabajo en los programas de aseguramiento de la calidad y unifica los diferentes actividades del control de calidad. La categora apropiada para los laboratorios clnicos en general es el ISO 9002 el cual comprende 18 elementos de control. Para que un laboratorio pueda ser certificado bajo la norma ISO, debe cumplir con todos los elementos del estndar. En stos casos un equipo de Aseguramiento de la Calidad implementa las medidas en cada una de las rea con el fin de que cuando se est listo, pueda pasar las pruebas a que es sometido todo el sistema por parte de auditores certificados. La obtencin de sta certificacin ISO 9002 es el mximo galardn a la excelencia en control de calidad en los laboratorios clnicos.

5. PROFORMAS DE REPORTE DEL CONTROL DE CALIDAD: Se adjuntan a continuacin las hojas proformas utilizadas para llevar el registro del control de calidad en microbiologa: 1) Libro de reporte de control de calidad de medios en platos. 2) Libro de reportes de control de calidad de medios en tubos. 3) Libro de reporte de control de calidad de antisueros y reactivos. 4) Libro de reporte de control de calidad de frmulas lcteas y mamaderas. 5) Libro de reporte de control de calidad de la sangre de carnero. 6) Libro de reporte de control de calidad de los discos de sensibilidad a los antibiticos. 7) Libro de control del cepario.

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6. GLOSARIO DE TERMINOS ESTADISTICOS: Azar: Condicin de desorden sin prediccin de los resultados individuales. Coeficiente de Confianza: Oportunidad que tiene un intervalo de confianza de ser incluido en el valor universal. Curtosis: Grado de agudeza de la curva. Desviacin Promedio: Es la desviacin dividida por el nmero de determinaciones. Es un mtodo que permite determinar la magnitud de la desviacin estndar cuando se corren muchas pruebas. Desviacin Estndar: Raz cuadrada del promedio de las desviaciones al cuadrado, de una media aritmtica. Distribucin de Frecuencia: Agrupa los valores de una variable en orden de tamao. Distribucin Normal: Distribucin de datos en una frecuencia de tabulacin que semeja una curva de campana. Duplicados: Unidad o espcimen que se ha producido bajo las mismas condiciones. Exactitud: Desviacin de un valor estimado, del valor real. Error Experimental: Desviacin del valor esperado, debido a las limitaciones de la metodologa o de la produccin.

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Error Relativo: Error medio en una serie de pruebas, que representan un porcentaje del valor verdadero. Error Estndar: Error alrededor de la media de una serie de pruebas. Error medio: Diferencia entre el resultado verdadero y la media obtenida. Factor de Correccin: Es una constante aplicada a valores observados en muestreos pequeos, con el fin de obtener un mejor ajuste de datos a la distribucin terica chi cuadrado ( x ). Factores Fijos: Factores, variables o efectos que son constantes o iguales para todas las muestras. Grado de Libertad: Es el nmero de diferencias independientes o variaciones posibles en las observaciones individuales. Si solo hay una observacin, entonces hay un grado 0 de libertad, ya que no hay otra observacin para comparar. Histograma: Diagrama de barras que representan la frecuencia de distribucin. Homocentesis: Distribucin uniforme a ambos lados de la media. Interaccin: Tendencia a la combinacin de dos variables de manera que el resultado difiere de la suma de sus actividades independientes. Lmite de Confianza: Lmite alto y bajo de un intervalo de confianza. Muestra: Grupo de datos o elementos utilizados en el estudio. Mediana: Lnea de igualdad que divide la distribucin en igual nmero de casos por encima o por debajo de la lnea. Media Aritmtica: Suma de una serie de pruebas dividido por el nmero total. Modo: Tipo de dato que tiene la mayor frecuencia, lo que indica el punto central de la tendencia. Parmetro: Constante de un universo que describe una caracterstica individual. Probabilidad: Frecuencia relativa al azar. Vara del cero al uno. Precisin: Exactitud en las determinaciones repetidas de una prueba. A menor desviacin estndar, mayor precisin. Punto Fuera ( Outlier ): Valor ubicado en una posicin extrema, fuera de los lmites aceptables. Reproducibilidad: habilidad para repetir el mismo resultado en diferentes ocasiones. Rango: Es la medida ms sencilla de la variabilidad general que describe la diferencia entre el valor mximo y el mnimo. Significativo: Resultados de la prueba que se salen de los lmites de confianza. Universo: La totalidad de los elementos del cual se toman las muestras para su tabulacin. Variabilidad: Es el cuadrado de la desviacin estndar.

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7. BIBLIOGRAFA DE REFERENCIA: Current Concepts and Approaches to Antimicrobial Agent Susceptibility Testing. Cumitech # 25 Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology. John McGowan Coordinating Editor A.S.M Press, American Society for Microbiology, Washington DC New Developments in Antimicrobial Agent Susceptibility Testing: A Practical Guide. Cumitech # 6. Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology. John McGowen Coordinating Editor A.S.M Press, American Society for Microbiology, Washington DC. Verification an d Validation of Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory. Cumitach # 31. Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology. Brenda McCurdy Coordinating Editor A.S.M Press, American Society for Clinical Microbiology, Washington DC. Quality and Quality Assurance Practices in Clinical Microbiology . Cumitech # 3 A. Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology, Alice Weisfeld Coordinating Editor. A.S.M Press, American Society for Microbiology, Washington DC. A Guide to Specimen Management in Clinical Microbiology. J. Michael Miller. A.S.M Press, 1998, American Society for Microbiology. Wsahington DC Essential Procedures for Clinical Microbiology. Henry Isenberg - Editor in Chief. A.S.M Press, 1998, American Society for Microbiology, Washington DC

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Manual of Clinical Microbiology. Edition, 1999, Patrick Murray Editor in Chief. A.S.M Press, American Society for Clinical Microbiology, Washington DC. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology . Demian and N. Solomon. A.S.M Press, 1997, American Society for Microbiology, Washington, DC Food Microbiology: Fundamentals anf Frontiers. M. Doyle, L. Beuchat and T. Montuille. A.S.M Press, 1998, American Society for Microbiology. Washington, DC Quality Assurance in the Clinical Microbiology: Applying ISO 9000 Quality Standars . Seidenfeld, C. Glidden and D. Henrickson Clinical Laboratory News, 1997 ; 23 (8), 11-15. The American Association for Clinical Chemistry, Washington DC. Normativa para la Puesta en Prctica de Estudios de la Sensibilidad Antimicrobiana Mediante Discos. Sexta Edicin, Approved Standard NCCLS - Comit Nacional para Normas de Laboratorio Clnico. M2 A6 . Vol. 13, N24. The National Committee for Clinical Laboratory Standard Press, Pennsilvania, USA Bacteriologa Diagnstica: Tinciones, Medios de Cultivos y Pruebas Diagnsticas. F. Guerrero, M. Gamboa, J. Mora y E. Rodrguez. Oficina de Publicaciones, Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica. Normativa para la Puesta en Prctica del Estudio de Susceptibilidad Antimicrobiana. Octavo Suplemento Informativo. NCCLS , M100 S8 , Vol. 17, N 2 Pennsilvania, USA. Manuales Tcnicos: Merck, Menarini, Oxoid, Difco, BBL, Vitek, Biomerieux, Gibco y Sigma.