UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA

Identificacin y cuantificacin de los componentes principales del aceite esencial del flavedo (cscara) de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por medio de Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas.

JORGE ARTURO MAZARIEGOS MONTERROSO

QUMICO

Guatemala, Octubre 2008

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA

Identificacin y cuantificacin de los componentes principales del aceite esencial del flavedo (cscara) de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por medio de Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas.

INFORME FINAL DE TESIS

Presentado por: JORGE ARTURO MAZARIEGOS MONTERROSO

Para optar al ttulo de: QUMICO

Guatemala, Octubre 2008

JUNTA DIRECTIVA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA

Oscar Cbar Pinto, Ph.D. Lic. Pablo Ernesto Oliva Soto Licda. Lillian Raquel Irving Antilln, M.A. Licda. Liliana Vides de Urzar Licda. Beatriz Eugenia Batres de Jimnez Br. Andrea Alejandra Alvarado lvarez Br. Anbal Rodrigo Sevillanos Cambronero

Decano Secretario Vocal I Vocal II Vocal III Vocal IV Vocal V

DEDICATORIA
A Dios. Por derramar tantas bendiciones sobre m. A mis Padres. Jorge Rubn Mazariegos Lizama y Miriam Marissa Monterroso Orozco, por creer en m, por su inmenso amor, por su incondicional apoyo y gua durante mi vida. A mi Abuelita. Eddy Aurora Pardo, por brindarme su incondicional apoyo y amor. A mi Hermana y Cuado. Cristina y Guillermo, por su amor e incondicional apoyo durante los aos de mi carrera. A mis queridos amigos. Carmen Garnica, Esmeralda Orantes, Ellen Aguilar, Rodrigo Sacahu, Pedro Ordez, Claudia Arreaga y Jorge Torres por su incondicional apoyo durante los aos de la carrera. A mi amada Martita. Por su incondicional apoyo en la culminacin de este trabajo de investigacin.

AGRADECIMIENTOS
A la Licda. Diana Pinagel y M. Sc. Silvia Echeverra por su asesora durante la elaboracin de este trabajo de investigacin. Por obsequiarme su amistad, su confianza, sus conocimientos y experiencia invaluable durante mi formacin profesional.

A la Licda. Mara del Carmen Arroyo y Licda. Fabiola de Micheo por brindarme su amistad, confianza y apoyo durante la elaboracin de este trabajo de investigacin.

A el M. Sc. Ricardo Velz por sus consejos y colaboracin durante la elaboracin de este trabajo de investigacin.

Al Laboratorio de Toxicologa de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala por su colaboracin durante la elaboracin de este trabajo de investigacin.

Al Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia por su apoyo durante la elaboracin de este trabajo de investigacin.

A la Unidad de Anlisis Instrumental y al Departamento de Qumica Orgnica por su apoyo y colaboracin durante la elaboracin de este trabajo de investigacin.

INDICE I. Resumen. II. Introduccin. III. Antecedentes. A. Investigaciones previas de la composicin del aceite esencial de mandarina. B. Mandarinas o Tangerinas. 1. Nombre cientfico. 2. Familia. 3. Nombre comn. 4. Descripcin botnica. 5. Hbitat. 6. Agricultura. a. Requerimientos climticos y edficos. C. Uso de extractos y de aceites esenciales de la mandarina. 1. Usos medicinales. 2. Farmacologa. 3. Composicin qumica. 4 Farmacognosia. 5. Toxicologa. D. Aceites Esenciales. 1. Definicin. 2. Clasificacin de los aceites esenciales. 3. Distribucin y estado natural. 4. Componentes principales del aceite esencial de ctricos. a. Generalidades. E. Mtodos para la extraccin de aceites esenciales. 1. Prensado (Expresin). 2. Destilacin por arrastre con vapor de agua. 3. Extraccin con disolventes. 5. Enflorado. 6. Extraccin con fluidos supercrticos. F. Cromatografa de Gases. 1. Fundamentos y principios bsicos. a. Cromatografa gas-slido (GSC). b. Cromatografa gas-lquido (GLC). 2. Instrumentacin. a. Gas portador. b. Sistema de inyeccin de muestra. c. Columnas y sistemas de control de temperatura. d. Detectores. 11 12 14 14 24 25 25 26 26 26 26 26 27 27 28 28 29 29 29 29 30 31 32 32 34 34 34 35 35 35 36 36 36 36 37 37 37 37 38

7 i) Detector de ionizacin de llama . ii) Detector de conductividad trmica. iii) Detector termoinico. iv) Detector de captura de electrones. v) Detector de emisin atmica. e. Columnas. i) Columnas de relleno. ii) Columnas capilares. f. Fase estacionaria. G. La Espectrometra de Masas (EM) como complemento de la Cromatografa de Gases (CG). H. Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas y su papel en el estudio de aceites esenciales. IV. Justificacin. V. Objetivos. VI. Hiptesis. VII. Materiales y Mtodos. VIII. Resultados. IX. Discusin de Resultados. X. Conclusiones. XI. Recomendacin. XII. Referencias. XIII. Anexos. 38 38 38 39 39 39 39 39 40 40 40 42 44 45 46 54 64 68 70 71 74

INDICE DE TABLAS Tabla No. 1 Contenido Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina italiana determinadas por Gildemeister y Hoffman. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina italiana determinadas por los laboratorios Fritzsche Brothers, Inc. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina brasilea determinadas por los laboratorios Fritzsche Brothers, Inc. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de dos variedades de mandarina cultivas en Florida, Estados Unidos. Propiedades fsicas del aceite esencial de Limn (Citrus aurantifolia), Mandarina (Citrus reticulata Blanco) y Naranja Amarga (Citrus aurantium L.) Propiedades qumicas del aceite esencial de Limn (Citrus aurantifolia), Mandarina (Citrus reticulata Blanco) y Naranja Amarga (Citrus aurantium L.). Rendimiento de extraccin promedio del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Componentes principales cuantificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra). Componentes principales cuantificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata (Mandarina Comn). Componentes principales cuantificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Componentes principales cuantificados en Sabor de Mandarina No. 100. Pgina

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Tabla No.

Contenido

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Componentes traza identificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco Citrus tangerina (Mandarina Dancy). 63 Algunas fases estacionarias comunes en cromatografa de gases. 76 Listado de nombres y estructuras qumicas de los componentes voltiles de los aceites esenciales presentes en la mandarina. 77 Tiempos de retencin y algunas propiedades fsicas de los principales componentes del aceite esencial de mandarina. 90 Rendimiento de extraccin del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco Citrus tangerina (Mandarina Dancy). 117

10

INDICE DE FIGURAS Figura No. 1 Contenido Cromatograma del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra). Cromatograma del aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata (Mandarina Comn). Cromatograma del aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata. Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Cromatograma de la muestra del Sabor de Mandarina No. 100. Aparato para destilacin por Arrastre con vapor de agua Clevenger (hidrodestilacin). Columna para la obtencin de aceites esenciales tipo clevenger. Citrus reshni (Mandarina Cleopatra). Citrus reticulata (Mandarina Comn). Citrus Reticulata Blanco Citrus Tangerina (Mandarina Dancy). Pgina

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60 62 74 75 91 91 92

4 5 6 7 8 9

11 I. RESUMEN En Guatemala es limitada la informacin que existe acerca de investigaciones sobre la composicin qumica de los aceites esenciales de ctricos, con esta investigacin se caracteriz la composicin qumica del aceite esencial extrado de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy), variedades de mandarina que se producen en Guatemala. Para realizar la separacin, identificacin y cuantificacin de los principales componentes de los aceites esenciales se realizaron anlisis mediante cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas, esta tcnica instrumental permiti establecer que los aceites esenciales posean al menos 28 componentes, 7 de los cuales se encontraban presentes en las tres variedades de mandarina investigadas. Las tres variedades de mandarina presentan altas concentraciones relativas del hidrocarburo monoterpnico limoneno seguido del -terpinoleno y en menor concentracin relativa, el -terpineol y -pineno. La cromatografa de gases acoplada a la espectrometra de masas permiti establecer tambin los tiempos de retencin, as como la concentracin relativa para cada uno de los componentes y ms importante an, esta tcnica instrumental permiti identificar a cada uno de los componentes principales presentes en cada variedad, incluso los que se encontraban a niveles traza, tal es el caso del acetato 9-decenlico, el sabineno, el -terpineno, el 1-octanol, el La identificacin de cada componente se realiz

Z-citral y el (+)-2-careno.

mediante la comparacin del espectro de masas obtenido experimentalmente para cada componente contra el espectro de masas de referencia de la base de datos espectral Wiley275 (ver anexos 5 al 16 y 20 al 41), establecindose de esa manera la identidad y concentracin relativa de los componentes presentes en las variedades de mandarina investigadas.

12 II. INTRODUCCIN Los diferentes microclimas y suelos de Guatemala hacen posible una extraordinaria biodiversidad de productos de origen vegetal de los cuales pocos son explotados y una gran cantidad no ha sido descubierta. Un grupo particular de productos o metabolitos son los aceites esenciales, producidos por algunas plantas, entre stas, la familia de las rutceas se caracteriza por llevar a cabo la produccin biosinttica de estos metabolitos que son substancias olorosas que, por regla general, se consideran como productos biosintetizados por la ruta de la acetilcoenzima a travs de un intermediario denominado cido mevalnico. La familia de las rutceas lleva a cabo la produccin de aceites esenciales tanto en frutos, hojas, flores, corteza y races, pero la concentracin de los componentes del aceite esencial puede variar dependiendo de la parte de la planta (1). Los aceites esenciales se extraen de los tejidos en los que se

desarrollan y la biosntesis de estas sustancias se encuentra relacionada estrechamente con el metabolismo, la fertilizacin y proteccin contra enemigos naturales, siendo tambin utilizados por el hombre en mltiples formas. Por ejemplo, los aceites esenciales de las flores de jazmn, clavel y rosas confieren olores agradables a perfumes, jabones, desodorantes, cosmticos e incienso y el aceite esencial de citronela es un ingrediente corriente en jabones y perfumes (1). En Guatemala se cultivan algunas variedades de mandarina, esto representa una gran oportunidad para nuestro pas en el mercado de los productos forestales no maderables como: aceites esenciales y oleorresinas, gomas y resinas, colorantes, pigmentos y tintas naturales, hierbas y especias, plantas medicinales y fitofarmacuticos; no obstante, estas variedades de mandarina no son aprovechadas industrialmente. Dentro de stas se encuentran las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy), las cuales se adaptan a las condiciones agroecolgicas del departamento

13 de Suchitepquez. Recientemente del flavedo de la mandarina Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) se ha extrado el aceite esencial para efectuar pruebas fitofarmacuticas, comprobando que este aceite esencial presentaba capacidad inhibitoria hacia el crecimiento de bacterias tales como: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Helycobacter pilori y Salmonella que resultan ser patgenas para el hombre (13,21). Los aceites esenciales ctricos han sido estudiados (naranja, pomelo, limn, mandarina, etc.) y se ha determinado su composicin qumica, lo cual ha permitido establecer usos y valor comercial de los mismos, convirtiendo a los aceites esenciales ctricos en el sector ms grande de la produccin mundial de aceites esenciales. La alta concentracin de compuestos como d-limoneno,

citronelal, linalool y citral hacen que estos aceites sean muy atractivos para la industria del aroma y sabor. La mandarina Cleopatra, Comn y Dancy dentro de su clasificacin taxonmica son ctricos, sin embargo, es limitada la informacin que se ha publicado acerca de las mismas, tales como aspectos agronmicos, composicin qumica, usos industriales, etc. A diferencia de Guatemala, en otros pases la industria de los aceites esenciales est muy desarrollada y encuentra gran aplicacin en la medicina, la industria cosmtica, de alimentos y de variados productos obtenidos mediante la industria qumica (19). Sin embargo, Guatemala a pesar de su potencial en biodiversidad es un gran importador de este tipo de ctricos. Este trabajo de investigacin permiti determinar cuales son los principales componentes del aceite esencial del flavedo de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (CG-EM), lo cual permiti posteriormente mediante estudios

complementarios determinar la calidad de los mismos, el valor comercial y sus posibles usos industriales.

14 III. ANTECEDENTES A. INVESTIGACIONES PREVIAS REFERENTES A LA COMPOSICIN El primer trabajo del que se tiene conocimiento fue realizado por Gildemeister y Stephan en 1897, el estudio consisti en determinar e identificar el componente principal del aceite esencial de mandarina italiana, su investigacin concluyo que efectivamente el d-limoneno era el componente principal. La

QUMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA MANDARINA.

identificacin consisti en la preparacin de un derivado bromado que posea un punto de fusin con los valores siguientes, 104-105 oC, de acuerdo al intervalo de fusin se pudo sustentar la pureza de la sustancia derivada del d-limoneno y as corroborar su identidad indirectamente (3). Walbaum descubre que el N-Metilantranilato de metilo es el constituyente ms importante del aceite esencial de la mandarina italiana, estableciendo que menos del 1 % del ster esta presente en el aceite esencial y que es el responsable de proporcionarle su peculiar aroma al aceite esencial de mandarina italiana (4). Durante las primeras tres dcadas del siglo 20 se establece una metodologa completa para la clasificacin de las variedades de mandarina que existan, esta metodologa estableci cuales eran los distintos patrones que se cultivaban a nivel mundial, dando esto lugar a la caracterizacin de las variedades de mandarina y a sus aceites esenciales a nivel mundial (5,6,7). As mismo en el ao de 1934, Nelson realiz un estudio de la composicin qumica del aceite esencial de distintas variedades de mandarina que se cultivaban en Florida, Estados Unidos. Nelson extrae los aceites esenciales al comprimir el flavedo (cscara), su estudio determina que variedades similares de mandarina posean aceites esenciales con diferencias en su composicin qumica. Concluy tambin que la razn principal de las diferencias en cuanto a composicin qumica se deba a la calidad del suelo donde se cultivaban las

15 variedades de mandarina as como tambin a las diferencias climticas presentes en la localidad de cultivo (8). Gildemeister y Hoffman en 1940 realizaron un estudio de las propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina italiana determinando las siguientes propiedades:

Tabla No. 1. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina italiana determinadas por Gildemeister y Hoffman. Parmetro Gravedad especfica a 15/15 Rotacin ptica Indice de refraccin a 20 C pH ndice de Esterificacin Residuo de evaporacin Solubilidad Valor calculado 0.854 a 0.859 65 0 a +75 0, usualmente no menor a +70 0 1.475 a 1.478 2.7 5.0 a 11.0; en algunos casos mayor a 18.7. 2.4 a 3.5 %. Soluble en alcohol al 90 %, presentando turbiedad.

Fuente: Die Atherischen Ole. 3d. Ed. Vol. III

Anlogo a este estudio los laboratorios Fritzsche Brothers, Inc. de New York establecen tambin las propiedades fisicoqumicas del aceite esencial extrado de mandarina italiana, siendo los siguientes.

Tabla No. 2. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina italiana determinadas por los laboratorios Fritzsche Brothers, Inc. Parmetro Gravedad especfica a 15/15 Rotacin ptica a temperatura ambiente ndice de refraccin a 20 C ndice de Esterificacin Residuo de evaporacin Solubilidad Color Valor calculado 0.855 a 0.857 69 36 a +73 15 1.4750 a 1.4759 7.5 a 8.8 2.4 a 3.2 %. Completamente insoluble en alcohol al 90%. Amarillento

Fuente: Die Atherischen Ole. 3d. Ed. Vol. III

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Durante los aos de la Segunda Guerra Mundial el aceite esencial de mandarina proveniente de Italia no estaba disponible, Brazil entonces comienza a exportar de manera limitada su produccin de aceite esencial de mandarina a los Estados Unidos, siendo analizados los embarques de aceite esencial de mandarina brasilea por los laboratorios Fritzsche Brothers Inc. de New York, establecen los siguientes parmetros de calidad para el aceite esencial de mandarina brasilea.

Tabla No. 3. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de mandarina brasilea determinadas por los laboratorios Fritzsche Brothers, Inc. Parmetro Gravedad especfica a 15/15 Rotacin ptica a temperatura ambiente ndice de refraccin a 20 C Contenido de steres, calculado como Acetato de Linallo. Contenido de Aldehdo, calculado como aldehdo declico (Mtodo de Clorhidrato de hidroxilamina). Residuo de evaporacin Solubilidad Color Valor calculado 0.854 a 0.858 63 55 a +74 42 1.4745 a 1.4763 1.5 a 3.5 % 0.4 a 1.5 %

3.4 a 4.7 %. Completamente insoluble en alcohol al 90%. Verde

Fuente: Die Atherischen Ole. 3d. Ed. Vol. III

Los laboratorios Fritzsche Brothers realizan tambin una comparacin entre el aceite esencial extrado de mandarina italiana y brasilea, descubriendo que el aceite esencial extrado de la mandarina italiana posea un color, olor y sabor de mejor calidad que el aceite esencial extrado de la mandarina brasilea, debindose esto a la presencia del N-metilantranilato de metilo. Nelson realiza un segundo estudio en 1934, en su investigacin compara la mandarina italiana con mandarina cultivada en Florida, Estados Unidos, y determina que las

17 diferencias se deben a la presencia del cido metilantranlico en la mandarina italiana, siendo este componente el responsable de impartirle una mayor fluorescencia y olor al aceite esencial de la mandarina cultivada en Sicilia, Italia. Nelson confirma la existencia de d-limoneno en el aceite esencial de mandarina italiana como lo haban descubierto Gildemeister y Stephan en 1897, la diferencia radicaba en que Nelson asla al d-limoneno y establece de manera experimental un punto de ebullicin para este compuesto, 175 C - 177 C (8). En 1948, Kesterson y McDuff investigan dos tipos de aceites esenciales extrados de dos variedades distintas de mandarina, las mandarinas eran cultivadas en Florida, Estados Unidos. Kesterson y McDuff realizan la

extraccin de los aceites esenciales variando el mtodo de obtencin, para ello al flavedo de una variedad de mandarina le realizan compresin en fro y para la otra realizan una destilacin por arrastre con vapor de agua, de su estudio derivan los siguientes resultados:

Tabla No.4. Propiedades fisicoqumicas del aceite esencial de dos variedades de mandarina cultivas en Florida, Estados Unidos. Parmetro Valor calculado para el aceite esencial obtenido por compresin del flavedo en fro 0.856 +91.18 +92.68 +92.68 1.4734 +92.68 1.4734 0.34 % Valor calculado para el aceite esencial obtenido mediante destilacin por arrastre con vapor de agua. 0.8407 +93.67 No determinado No determinado 1.4720 No determinado 1.4720 0.25 %

Gravedad especfica a 25/25 Rotacin ptica a 25 C Rotacin ptica del 10% del producto destilado. Rotacin ptica del 10% del producto destilado. ndice de Refraccin a 20 C Rotacin ptica del 10% del producto destilado. ndice de Refraccin a 20 C Contenido de steres

18 Parmetro Valor calculado para el aceite esencial obtenido por compresin del flavedo en fro 1.4711 1.08 % Valor calculado para el aceite esencial obtenido mediante destilacin por arrastre con vapor de agua. No determinado 1.24 %

ndice de refraccin a 20 C del 10% destilado. Contenido de aldehdos, calculado como aldehdo declico. Residuo de Evaporacin

4.53 %

0.20 %

Fuente: Method and Seeker and Kirby. 1932. U.S. Dept. Agr. Tech. Bull. No. 241. Pp. 30.

As mismo Nelson investigador de American Perfumer en 1934, estudia la qumica de la mandarina Dancy que se cultivaba en Florida, identifica los siguientes compuestos como constituyentes principales del aceite esencial de esta variedad: d-limoneno, constituyente principal del aceite esencial con un porcentaje cercano al 95.75 %, estableciendo tambin la rotacin ptica del d-limoneno puro en un valor igual a +94 30. Aldehdo octlico, el cual separa como compuesto de bisulfito e identifica como oximas lo que resulta en un punto de fusin experimental entre 57-58 C. Establece la presencia del aldehdo octlico realizando una oxidacin del aldehdo a cido octlico con plata y analizando las sales formadas. Aldehdo declico, el cual asla como compuestos de bisulfito, identificado como una oxima con un intervalo de fusin entre 66-67 C. Establece la y

presencia de aldehdo declico oxidndolo a cido declico con plata analizando las sales formadas (8).

Nelson y Mottern establecen que el aceite esencial de mandarina Dancy posee menor concentracin de aldehdo octlico y declico que el aceite esencial de toronja que se obtiene de las variedades cultivadas en Florida (9). Linalool y citronelol, identificados como feniluretanos, para el

feniluretano derivado del linalool se obtuvo un intervalo de fusin igual a

19 61 - 62C. El linalol puro se trato con cido sulfrico al 5%, resultando esto en la formacin de un hidrato terpenico con intervalo de fusin igual a 116 - 117 C. Goldsworthy y Robinson investigan la identidad de una sustancia de color amarillo que se formaba en los aceites esenciales almacenados durante algn tiempo a una temperatura de 4 C, estos cristales de color amarillo se haban separado principalmente del aceite esencial extrado de las variedades de mandarina cultivadas en Florida, Nelson la llamo tangeritina, pero luego de las investigaciones de Goldsworthy y Robinson se determino que la identidad de la sustancia era la 3,5,6,7,4-pentametoxiflavona con un punto de fusin experimental de 154 C (10). En 1982, Leonor R. de Vottero realiza un estudio de los componentes del aceite esencial de Limn (Citrus aurantifolia), Mandarina (Citrus reticulata Blanco) y Naranja Amarga (Citrus aurantium L.). Su investigacin determino las

siguientes propiedades qumicas de los aceites esenciales extrados: a) contenido de aldehdos expresados como citral (aceite esencial de Limn) y como decanal (aceites esenciales de ctricos restantes); b) contenido de steres; c) ndice de cido; d) contenido de alcoholes.

20 Tabla No. 5 Propiedades fsicas del aceite esencial de Limn (Citrus aurantifolia), Mandarina (Citrus reticulata Blanco) y Naranja Amarga (Citrus aurantium L.) Tipo de Ctrico Propiedades fsicas Peso especfico 20 oC Rotacin ptica 20 oC Ind. Refraccin 20 oC Residuo evap. % Sol. En alcohol al 95 % Densidad del 10% destilado 20 oC Rot. ptica del 10 % del destilado Limn 0.8589 +62.3 1.4742 3.15 % Soluble 1.4718 +67.3 Mandarina 0.8560 +73.6 1.4765 4.95 % Soluble 1.4740 +74.7 Naranja 0.8460 +96.0 1.4738 2.35 % Soluble 1.4718 +96.8

Giacomo, A. Di. Retamar J.A. 1982. Aceites esenciales de Especies Vegetales, Diversidad de sus Productos Qumicos. Vol. I. IPNAYS Co. Argentina. Pp. 154.

Tabla No. 6 Propiedades qumicas del aceite esencial de Limn (Citrus aurantifolia), Mandarina (Citrus reticulata Blanco) y Naranja Amarga (Citrus aurantium L.) Tipo de Ctrico Propiedades qumicas
Aldehdos, como citral (aceite esencial de limn) como decanal (aceite esencial de mandarina y naranja amarga).

Limn 2.63

Mandarina 1.21

Naranja 1.50

Indice de acidez Indice de steres

1.81 No determinado

1.68 5.60

1.42 2.07

Porcentaje de steres Porcentaje de Alcoholes

3.20 1.20

1.96 11.86

0.73 11.68

Giacomo, A. Di. Retamar J.A. 1982. Aceites esenciales de Especies Vegetales, Diversidad de sus Productos Qumicos. Vol. I. IPNAYS Co. Argentina. Pp. 154.

21 Para determinar la fraccin de hidrocarburos monoterpenicos Retamar y Vottero realizan un tratamiento con sodio metlico y redestilando a presin reducida el aceite esencial de limn, determinaron luego su composicin porcentual por cromatografa gaseosa, obtienen los siguientes resultados porcentuales: -pineno 2.7%, -pineno 10.1%, sabineno 1.2%, mirceno 1.8%, limoneno 73.7%, -terpineno 9.7%, p-cimeno (11). Luego de haber realizado el anlisis del aceite esencial extrado del flavedo de limn, mandarina y naranja amarga Retamar y Vottero realizan la identificacin de los componentes principales de petitgrains de las hojas de Limn, Mandarina y Naranja amarga mediante cromatografa de gases, los resultados que obtuvieron son los siguientes:

a) Limn. Citrus Aurantifolia. Componentes identificados: -pineno, -pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, citronelal, linalol, neral, -terpineol, geranial, acetato de geranilo, citronelol, geraniol.

b) Mandarina. Citrus Aurantifolia Citrus reticulata Blanco. Componentes identificados: -pineno, -pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, -terpineno, linalol, acetato de linalilo, -terpineol, citronelol, acetato de geranilo, N-metilantranilato de metilo.

c) Naranja amarga. Citrus aurantium L. Componentes identificados: -pineno, -pineno, mirceno, limoneno, aldehdo octlico, p-cimeno, -terpineno, linalol, acetato de linalilo, -terpineol, acetato de citronelilo, acetato de terpinilo, acetato de geranilo, nerol, geraniol (12).

22 Un estudio mas reciente sobre la investigacin de la composicin de los aceites esenciales de ctricos y aplicaciones lo plantea Bergonzelli et. al. en 2003. En su estudio sobre la caracterizacin de los componentes del aceite esencial de ctricos establece que el componente mayoritario de algunos ctricos como la Lima, el Limn y la Toronja es el d-limoneno, tambin encuentra pequeos porcentajes de monoterpenos como el -pineno, entre otros. La

identificacin del componente principal de estos ctricos lo llevo a cabo mediante cromatografa de gases, su estudio determino que el d-limoneno presentaba una gran capacidad inhibitoria de crecimiento bacteriano en los alimentos, principalmente sobre las bacterias gram (+), tambin establece el -pineno puede inhibir el crecimiento de Helicobacter pylori que es asociado con gastritis severas; adems de incrementar la capacidad de conservacin del benzoato de sodio en los alimentos (13). Los aceites esenciales de ctricos son de inters universal, y en particular en Argentina, primer productor mundial de aceite esencial de Limn (Citrus limonum), por sus numerosas aplicaciones en productos alimenticios. Viturro de Galli, en 2004 realiza la evaluacin de la calidad del aceite esencial obtenido mediante prensado en fro del flavedo de Citrus Limonum (Limn), Citrus reticulata blanco (Mandarina), Citrus sinensis (Naranja) y Citrus paradisi (Pomelo blanco y rosado). Estudia la composicin de cada aceite esencial mediante

cromatografa gaseosa capilar acoplada a espectrometra de masas, identificando el 97% de los compuestos constituyentes. El aceite esencial extrado del flavedo de la mandarina presento altos contenidos de citral, decanal y undecanal as como un bajo porcentaje de -terpineno. Determina adems de los componentes comunes, el -tuyeno (0.56%), generalmente no informado, as como sesquiterpenos tales como el germacreno D, -bisaboleno, (E)--farnesano y perilaldehdo. El aceite esencial extrado del flavedo de Citrus paradisi (Pomelo blanco y rosado) sin desecar presentaron porcentajes levemente superiores de aldehdos y menores de limoneno que el descerado. Viturro de Galli concluye

23 que en general la mayora de los aceites esenciales extrados mediante prensado en fro del flavedo presentan bajos niveles de -pineno, -pineno, sabineno y terpinoleno (14). Es importante reconocer que la informacin publicada acerca de la composicin qumica del aceite esencial extrado del flavedo de la mandarina es limitada a nivel internacional y nacional, con base en este hecho se puede mencionar cuales son los componentes de Citrus sinensis (Naranja) y Citrus Swinglea glutinosa (Limn) as como los porcentajes encontrados para cada uno de esos componentes, esto con el fin de establecer parmetros de comparacin entre los aceites esenciales ya estudiados y los de esta investigacin. Yanez, en 2007 estudia el aceite esencial extrado del flavedo de Citrus sinensis (Naranja, variedad Valenciana) mediante hidrodestilacin, establece mediante

cromatografa de gases de alta resolucin que el componente voltil de mayor porcentaje era el monoterpeno oxigenado limoneno con un 90.93%. Determina tambin la presencia de monoterpenos oxigenados tales como el

trans-dihidrocarvona (1.78%), de frmula molecular C10H14O2, as como tambin porcentajes menores de trans-p-mentano (1.66%), canfeno (1.62%), p-menta-1,8dieno (0.69%), dihidromircenol (0.45%), y el isocitroneleno (0.43%) (15). Arrazola, en 2007 realiza la caracterizacin del aceite esencial de la corteza del Citrus Swinglea glutinosa (Limn) por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas. El anlisis de los componentes voltiles permiti la identificacin de 14 componentes dentro de los cuales se destacaron por su abundancia los siguientes: -cubebeno (26.48-28.74%), -pineno (4.44-6.67%), elixeno (10.13-11.03%), -cariofileno (6.30-9.55%), -felandreno (5.99-7.86%), -pineno (4.44-6.67%), d-limoneno (4.45-5.38%) y anozol (1.45-4.38%) (16).

24 B. MANDARINAS O TANGERINAS. Las mandarinas o tangerinas se conocen en ingls como mandarins o tangerins, japons como mikanen, en la India como suntura o sangtra, en italiano como mandarino, en Tailandia como som khiep wan, y en francs como mandarine (17). Las mandarinas son claramente el principal ctrico en Asia y son tambin importantes en otras partes del mundo. Las caractersticas de las mandarinas son muy variables y muchas variedades se consideran frutos exticos. Las

mandarinas se caracterizan por tener una corteza suelta y fcil de pelar, un ncleo abierto y un color naranja ms intenso que el de la mayora de los otros ctricos. El sabor de las mandarinas es tambin caracterstico y ms intenso que el de la mayora de las variedades de ctricos. A nivel mundial, las mandarinas son el ctrico ms importante despus de las naranjas y son ms resistentes al fro que otros ctricos, pero se pueden producir severos daos al fruto por congelacin debido a la caracterstica holgura de la cscara. La mandarina

Satsuma sufre daos por congelacin alrededor de los 8 oC bajo cero, mientras que otras variedades de mandarinas nicamente soportan temperaturas de alrededor de 5 a 6 oC bajo cero, que son, en todo caso, temperaturas mas bajas que las que soportan otros ctricos. Las altas temperaturas durante la ltima parte de la temporada dan lugar a un zumo suave, con una acidez ms baja (17). En Japn, se procesa alrededor del 15% de la cosecha de mandarinas, pero en otros pases el zumo de mandarina tiene menor importancia y se utiliza principalmente para mejorar el color en zumos de naranja cuyo color no es suficientemente intenso. Un ejemplo de esto es que en los Estados Unidos se aade hasta un 10% de zumo de mandarina al zumo de naranja para mejorar sus condiciones organolpticas (18). En Guatemala la mandarina se ha convertido en una de las frutas que goza de la preferencia de los guatemaltecos por su sabor y color. Segn un estudio de la empresa Sistemas de Informacin de Mercados dedicada al anlisis

25 estadstico, los habitantes de la regin metropolitana son los que ms consumen el fruto con un 33.20%, mientras que en la regin norte el consumo es de 25.10% y en Petn, territorio con condiciones ideales para el cultivo de esta fruta, se consume el 1.4% (19). La empresa Sistemas de Informacin de Mercados bas el resultado en una muestra de 303 mil 307 hogares a lo largo y ancho del pas. Las cifras indican que de este total, el 47% de la muestra prefiere comprar las mandarinas en los mercados o plazas, el 30% la obtiene directamente de sus cultivos, mientras que 12% las adquiere en casas particulares (personas que tienen algn puesto de venta), otro 10.7% la compra en tiendas de barrio y 1.3% la adquiere en supermercados. Datos del Proyecto de Desarrollo de la Fruticultura y

Agroindustria (PROFRUTA) del Ministerio de Agricultura (MAGA), argumentan que actualmente se siembra en 450 hectreas en diferentes zonas del pas. Segn el Proyecto de Desarrollo de la Fruticultura y Agroindustria (PROFRUTA), existe un mercado creciente tanto a nivel nacional como centroamericano, y sin importar que Guatemala tambin importa el fruto, se considera una buena opcin para la diversificacin agrcola. De acuerdo con informacin del Banco de Guatemala las importaciones a noviembre de 2004 sumaron 211 mil 991 kilogramos provenientes de Estados Unidos, Chile, Per, El Salvador y Espaa, mientras tanto se export un total de 32 mil 136 kilogramos hacia Honduras y El Salvador ese mismo ao (19). A continuacin se describen las variedades de mandarina que se cultivan en el pas y que se seleccionaron para realizar el estudio de sus respectivos aceites esenciales: 1. Nombre cientfico: Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (20).

2. Familia: Rutceas.

26 3. Nombre comn: Mandarina Cleopatra, Mandarina comn y Mandarina Dancy.

4. Descripcin botnica. Son rboles pequeos, hojas unifoliadas, pecolos con pequeas alas y articulados con la vaina de la hoja; las flores son de color blanca, simples y ubicadas en las axilas de las hojas, ovario generalmente de 10 a 14 partes; el fruto es un tipo especial de baya (hesperidio), las semillas pueden ser

monoembrinicas y poliembrinicas; la raz pivotante con muchas races secundarias (21).

5. Hbitat. Nativos del sudeste asitico; ampliamente cultivado en forma comercial en los trpicos y subtrpicos de ambos hemisferios. En Guatemala se cultiva de forma comercial en Escuintla y Suchitepquez (21). 6. Agricultura. a) Requerimientos climticos y edficos. En el cultivo de Mandarina, la temperatura es el factor climtico limitante que afecta el perodo comprendido entre la floracin y la cosecha, la calidad del fruto y la adaptacin de cada una de las variedades. Los ctricos necesitan de unos 1,200 milmetros de lluvia por ao, sin embargo precipitaciones mayores no son problema siempre que haya un buen drenaje del suelo. Precipitaciones bajas afectan el cultivo, en esos casos el riego es fundamental como complemento de las necesidades hdricas del cultivo. La humedad relativa influye sobre la

calidad de la fruta de modo que la mandarina en regiones donde la humedad relativa es alta tiende a tener cscara delgada y suave, mayor cantidad de jugo y

27 de mejor calidad pero la baja humedad favorece una mejor coloracin de la fruta (21). El rango adecuado de humedad relativa puede considerarse entre 60 y 70%. Fuertes vientos provocan cada de frutos, deshidratacin, roturas de ramas, cada de flores, lo cual hace necesario seleccionar bien el terreno de siembra, localizndolo en reas con proteccin natural o el establecimiento de barreras rompevientos desde la siembra del cultivo. Las altitudes aptas para el cultivo de mandarina oscilan entre los 400 a l300msnm. En este amplio rango hay que seleccionar la variedad ms adecuada para cada zona. Los ctricos se adaptan a una gran diversidad de suelos, la profundidad es muy importante, ya que la parte activa del sistema radicular puede llegar hasta una profundidad de 1.5 metros, adems el buen drenaje es muy importante para la productividad del cultivo prefirindose suelos con pH entre 5.5 a 7.0 (22).

C.

USOS DE EXTRACTOS Y DE ACEITES ESENCIALES DE LA

MANDARINA. 1. Usos medicinales. Las infusiones de las hojas se pueden usar para tratar infecciones digestivas (clico, dispepsia, gastralgia, indigestin, hipo, nausea), respiratorias (asma, bronquitis, gripe, resfro, tos, tosferina), nerviosas (cefalea,

desvanecimientos, epilepsia, excitacin nerviosa, insomnio, palpitaciones), cardiacas y urinarias, hipertensin y fiebre. Las flores en jarabe o infusin se usan para tratar afecciones nerviosas (excitacin, insomnio). La tintura del epicardio se usa para afecciones nerviosas. El jugo de la mandarina tambin puede

utilizarse para tratar afecciones digestivas (diarrea, flatulencia, gastritis, tifoidea) y respiratorias (catarro, inflamacin de la garganta, fiebre, resfri, tos) y reumatismo. La decoccin de cscaras se usa para aliviar la flatulencia. El aceite

28 se usa en el tratamiento de bronquitis crnica, ya que no irrita los riones y tiene buen sabor (21). El jugo de la mandarina tambin puede utilizarse como tratamiento tpico de heridas, magulladuras, raspones, lceras, tumores; en fricciones se usa para tratar reumatismo; la cscara o corteza machacadas se aplican en cataplasma para tratar raspones y magulladuras, hemorroides y erisipela; con las flores se prepara un ungento para afecciones de la piel (21). 2. Farmacologa. Estudios antibacterianos demuestran que el aceite esencial de mandarina es activo contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pilori y Salmonella. El aceite esencial de hojas tiene

actividad fungicida contra Colletotrichum acutatum causante de la cada prematura del fruto. Estudios farmacolgicos demuestran que la decoccin del fruto tiene actividad antihemorragica sobre el sistema gastrointestinal, muestra efecto de relajacin sobre el tero de rata y efecto espasmoltico de ileon de cobayo (21). Las flores tienen actividad espasmoltica, el epicardio del fruto es un tnico amargo; ambos aumentan la contractibilidad cardiaca, mejoran la circulacin coronaria y el flujo de sangre cerebral e inhiben las contracciones del msculo liso intestinal. 3. Composicin qumica. Toda la planta contiene aceite esencial y principios amargos (flavonoides), las hojas maduras pueden contener alcaloides, taninos y monoterpenos. Las flores contienen adems glucsidos y cumarinas. La el flavedo (cscara) del fruto contiene -pineno, -pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, -terpineno, linanol, acetato de linalilo, -terpineol, citronelol, acetato de geranilo, N-metil antranilato de metilo, entre otros componentes (21).

29

4. Farmacognosia. El aceite del epicarpio (aceite de Citrus) es un lquido amarillo plido, transparente o amarillo-verdoso, olor agradable a fruta, soluble en etanol al 90% (1:2), reaccin neutra (pH 7), densidad 0.850-0.859, ndice de refraccin 1.473-1.477, el residuo al evaporarse es 2-5%, contiene compuestos carbonlicos en un rango de 0.4-1.8% (21).

5. Toxicologa. El contacto con el zumo y posterior exposicin al sol puede desencadenar fenmenos de fotosensibilidad. Los extractos acuoso y etanolico de hojas,

corteza y raz (500 mg/kg) no son txicos a peces del genero Mollinesia (21). D. ACEITES ESENCIALES. 1. Definicin. Los componentes voltiles provenientes de plantas han atrado la atencin del hombre desde la antigedad como principios aromticos o especies de gran complejidad en su composicin. El estudio de los aceites esenciales como materias primas bsicas para la industria de fragancias y sabores se ha transformado en una de las reas de investigacin y desarrollo ms importantes para muchos pases. Inicialmente considerados como material de deshecho del metabolismo de las plantas, la importancia biolgica de los aceites esenciales ha sido reconocida slo recientemente (23). Los aceites esenciales son las fracciones lquidas voltiles, generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria de alimentos (condimentos y saborizantes), cosmtica (perfumes y aromatizantes) y

30 farmacutica. Los aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta ms de 100 componentes que pueden tener la siguiente naturaleza qumica:

a) Compuestos alifticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehdos, cetonas, steres y cidos), b) Monoterpenos, c) Sesquiterpenos, y d) Fenilpropanos (23).

En su gran mayora son de olor agradable, aunque existen algunos de olor relativamente desagradable como por ejemplo los componentes que forman parte de la fraccin aromtica del ajo y la cebolla, los cuales contienen compuestos azufrados. Los aceites pueden estar asociados formando mezclas con otros productos naturales como es el caso de las resinas y productos relacionados (23). 2. Clasificacin de los aceites esenciales. Los aceites esenciales se clasifican con base en diferentes criterios: consistencia, origen y naturaleza qumica de los componentes mayoritarios. De acuerdo con su consistencia los aceites esenciales se clasifican en esencias fluidas, blsamos y oleorresinas. Las esencias fluidas son lquidos voltiles a temperatura ambiente. Los blsamos son de consistencia ms espesa, son poco voltiles y propensos a sufrir reacciones de polimerizacin, son ejemplos el blsamo de copaiba, el blsamo del Per, Benju, blsamo de Tol, Estoraque, etc. Las oleorresinas tienen el aroma de las plantas en forma concentrada y son tpicamente lquidos muy viscosos o sustancias semislidas (caucho, gutapercha, chicle, oleorresina de paprika, de pimienta negra, de clavero, etc.) (23).

31 De acuerdo a su origen los aceites esenciales se clasifican como naturales, artificiales y sintticos. Los naturales se obtienen directamente de la planta y no sufren modificaciones fsicas ni qumicas posteriores, y debido a su rendimiento tan bajo son muy costosos. Los artificiales se obtienen a travs de procesos de enriquecimiento de la misma esencia con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de esencias de rosa, geranio y jazmn enriquecidas con linalool, o la esencia de ans enriquecida con anetol. Los aceites esenciales sintticos como su nombre lo indica son los producidos por la combinacin de sus componentes, los cuales son la mayora de las veces producidos por procesos de sntesis qumica. Estos son ms econmicos y por lo tanto son mucho ms utilizados como aromatizantes y saborizantes (esencias de vainilla, limn, frutilla, etc.) (23). Desde el punto de vista qumico y a pesar de su composicin compleja los aceites esenciales se pueden clasificar de acuerdo con los componentes mayoritarios. Segn esto los aceites esenciales ricos en monoterpenos se denominan aceites esenciales monoterpnicos (por ej. hierbabuena, albahaca, salvia, etc.). Los ricos en sesquiterpenos son los aceites esenciales

sesquiterpnicos (por ej. copaiba, pino, junpero, etc.). Los ricos en fenilpropanos son los aceites esenciales fenilpropanoides (por ej. clavo, canela, ans, etc.) (23). Aunque esta clasificacin es muy general resulta til para estudiar algunos aspectos fitoqumicos de los monoterpenos, los sesquiterpenos y los fenilpropanos. Sin embargo, existen clasificaciones ms complejas que tienen en cuenta otros aspectos qumicos (23). 3. Distribucin y estado natural. Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en plantas que incluyen las Compuestas, Labiadas, Laurceas, Mirtceas, Pinceas, Rosceas, Rutceas, Umbelferas, etc. Se les puede encontrar en diferentes partes de la planta: en las hojas (ajenjo, albahaca, eucalipto, hierbabuena, mejorana,

32 menta, pachul, romero, salvia, etc.), en las races (anglica, crcuma, jengibre, sndalo, sasafrs, valeriana, vetiver, etc.), en el pericarpio del fruto (ctricos como limn, mandarina, naranja, etc.), en las semillas (ans, cardamomo, hinojo, comino, etc.), en el tallo (canela, etc.), en las flores (lavanda, manzanilla, piretro, tomillo, rosa, etc.) y en los frutos (nuez moscada, perejil, pimienta, etc.). Aunque en los aceites esenciales tanto los monoterpenos, los sesquiterpenos y los fenilpropanos se les encuentran en forma libre, ms recientemente se han investigado los que estn ligados a carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos del aceite esencial como tal (23). 4. Componentes principales del aceite esencial de ctricos. a) Generalidades. Existen marcadas diferencias en la composicin de los aceites esenciales ctricos provenientes de las distintas partes de la planta; as, del naranjo amargo se obtiene el petitgrain de las hojas, constituido casi totalmente de compuestos oxigenados y en donde predomina el acetato de linalilo; el aceite esencial de las flores, cuyos componentes oxigenados de mayor proporcin son los alcoholes monoterpnicos, y el aceite esencial de la cscara de los ctricos, donde los hidrocarburos terpnicos sobrepasan el 90% y el valor olfativo esta ligado a la pequea fraccin en la que participan aldehdos y steres. Del mandarino la industria extrae dos aceites esencial diferentes: el petitgrain de las hojas, caracterizado por el alto contenido de N-metilantranilato de metilo, y el aceite esencial de la cscara con elevado contenido de hidrocarburos terpnicos y su grupo odorante formado por la asociacin de aldehdos, alcoholes y steres, incluyendo una pequea cantidad de N-metilantranilato de metilo (24). La calidad de estos aceites esenciales ctricos es particularmente apreciada por su contenido en componentes oxigenados dado que ellos confieren el sabor y cualidad olfativa caracterstica, estimndose precisamente su valor comercial por la riqueza de estos constituyentes (aldehdos, alcoholes y steres monoterpnicos,

33 principalmente), que han repercutido en la perfumera y cosmtica, donde la nota especfica no solo esta dominada por los compuestos ms abundantes sino tambin por los constituyentes menores que participan en la armona olfativa del conjunto (25). Los aceites de ctricos se encuentran principalmente en sacos ovalados presentes en el flavedo o parte coloreada de la cscara y actan como barrera txica natural para muchos microorganismos e insectos. Ms del 90% del aceite esencial de ctricos lo compone el d-limoneno, un sesquiterpeno, y se encuentran cantidades traza de otros monoterpenos y sesquiterpenos como el mirceno. En los aceites esenciales de naranja se han encontrado 111 constituyentes voltiles, incluidos 5 cidos, 26 alcoholes, 25 aldehdos, 16 steres, 6 cetonas y 31 hidrocarburos. Los componentes no voltiles representan alrededor del 1.5% de los aceites de naranja, entre los que se encuentran las ceras, cumarinas, flavonoides, carotenoides, tocoferoles, cidos grasos y esteroles. El aceite de pomelo se caracteriza por la presencia de nootkatona, que proporciona al pomelo su sabor y aroma caracterstico. Este aceite esencial esta constituido por

20 alcoholes, 14 aldehdos, 13 steres, 3 cetonas, 14 monoterpenos y sesquiterpenos. La concentracin de nootkatona aumenta conforme madura la fruta. La fraccin no voltil del aceite esencial de pomelo representa alrededor del 7% del mismo e incluye cumarinas, flavonoides, tocoferoles y ceras. Se cree que los aceites de limn contienen alrededor de un 2% de compuestos no voltiles, principalmente en forma de cumarinas, as como 18 alcoholes, 16 aldehdos, 11 steres, 3 cetonas, 4 cidos y 23 hidrocarburos. En los aceites de lima se han encontrado 12 alcoholes, 7 aldehdos, 4 steres, 1 cetona y 22 hidrocarburos, as como un 7% de compuestos no voltiles, principalmente cumarinas (26). Los aceites esenciales de mandarinas contienen cantidades significativas (4%) de un compuesto no voltil distintivo llamado tangeritina, as como 24 alcoholes, 11 aldehdos, 4 steres, 2 cetonas, 7 cidos, 24 hidrocarburos y 2 teres.

34 Estudios mas detallados utilizando cromatografa de gases han demostrado que el aceite esencial de mandarina posee los siguientes compuestos como componentes mayoritarios: -pineno, -pineno, mirceno, limoneno,

p-cimeno, -terpineno, linalol, acetato de linalilo, -terpineol, citronelol, acetato de geranilo, N-metil antranilato de metilo (26).

E. MTODOS PARA LA EXTRACCIN DE ACEITES ESENCIALES. Los aceites esenciales se pueden extraer de las muestras vegetales mediante diferentes mtodos como: prensado (expresin), destilacin por arrastre con vapor de agua, extraccin con disolventes voltiles, enflorado y con fluidos supercrticos.

1. Prensado (Expresin). En la aplicacin de este mtodo el material vegetal es exprimido mecnicamente para liberar el aceite, recolectndose y filtrndolo para su purificacin. Este mtodo es utilizado comnmente para la extraccin de aceites esenciales de ctricos (23).

2. Destilacin por arrastre con vapor de agua. En la aplicacin de este mtodo la muestra vegetal generalmente fresca y cortada en trozos pequeos, se coloca en un recipiente cerrado y sometida a una corriente de vapor de agua sobrecalentado, el aceite esencial as es arrastrado y posteriormente condensado, recolectado y separado de la fraccin acuosa. Esta tcnica es muy utilizada especialmente para aceites esenciales fluidos tales como los de ctricos, siendo este el mtodo preferido para obtener materia prima para la industria de perfumera, alimentos, pesticidas, etc. Su seleccin se hace en base a que es un

35 mtodo econmico que permite la obtencin de un aceite esencial con alta pureza y muy importante porque no requiere tecnologa sofisticada (27).

3.

Extraccin con disolventes voltiles.

En el mtodo de extraccin con

disolventes voltiles, la muestra seca y molida se coloca en contacto con disolventes tales como etanol absoluto, cloroformo, ter etlico, etc. Estos disolventes solubilizan el aceite esencial pero tambin solubilizan y extraen otras sustancias tales como grasas y ceras, obtenindose al final un aceite esencial impuro. Se utiliza a escala de laboratorio pues a nivel industrial resulta costoso por el valor comercial de los disolventes y porque se obtienen aceites esenciales impuros, como ya se menciono, adems del riesgo de explosin e incendio de los disolventes orgnicos voltiles cuando se usan en grandes volmenes (28).

4. Enflorado. En este mtodo el material vegetal (generalmente flores) es puesto en contacto con una grasa. El aceite esencial se solubiliza en la grasa que acta como vehculo extractor, obtenindose inicialmente una mezcla (concreto) de aceite esencial y grasa la cual es separada posteriormente por otros medios fisicoqumicos. En general se recurre a agregar etanol absoluto caliente a la mezcla y su posterior enfriamiento para separar la grasa (insoluble) y el extracto aromtico puro (absoluto). Esta tcnica es empleada para la obtencin de esencias florales (rosa, jazmn, azahar, etc.), pero su bajo rendimiento y la difcil separacin del aceite extractor la hacen costosa, siendo esta la principal desventaja para su utilizacin (23).

5. Extraccin con fluidos supercrticos. En la aplicacin de este mtodo el material vegetal cortado en trozos pequeos, licuado o molido, se empaca en una cmara de acero inoxidable y se hace circular a travs de la muestra un fluido en estado supercrtico (por ejemplo CO2), los aceites esenciales as solubilizados son arrastrados por el fluido supercrtico que acta como disolvente extractor, la

36 presin del sistema se elimina por descompresin progresiva hasta alcanzar la presin y temperatura ambiente, obtenindose un aceite esencial cuyo grado de pureza depende de las condiciones de extraccin. Aunque presenta varias ventajas tales como un rendimiento alto de extraccin, es inocuo para el medio ambiente, el disolvente se elimina fcilmente e inclusive se puede reciclar as como las bajas temperaturas utilizadas para la extraccin no cambian qumicamente los componentes del aceite esencial, el equipo requerido es relativamente costoso ya que se requieren bombas de alta presin y sistemas de extraccin tambin resistentes a las altas presiones (29).

F. CROMATOGRAFA DE GASES. 1. Fundamentos y principios bsicos. La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y su posterior inyeccin en la cabeza de una columna cromatogrfica. Para la elucin de la muestra se usa un gas inerte como fase mvil, de esta manera la fase mvil no interacciona con las molculas del analito, simplemente transporta el analito a travs de la columna (30). Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): a. Cromatografa gas-slido (GSC): la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos se produce mediante adsorcin. En la cromatografa gas-slido la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga

aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular (30).

37 b. Cromatografa gas-lquido (GLC): la fase estacionaria son molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa ms ampliamente. La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyeccin de muestra, columna (generalmente dentro de un horno), y detector (30). 2. Instrumentacin. a. Gas portador: debe ser un gas inerte para evitar que reaccione con el analito o con la columna. Los gases de uso mas comn son helio, nitrgeno, hidrogeno o argn. Se controla su entrada en el sistema mediante manmetros para garantizar un flujo constante y estable. Las presiones de entrada son desde 10 a 25 psi.

b. Sistema de inyeccin de muestra: el analito se inyecta usando una microjeringa o un automuestrador en una cmara de vaporizacin instantnea sellada por una junta de silicona (Septum). El analito debe ser introducido en pequeas cantidades para asegurar el mejor anlisis, si la columna es ordinaria el volumen es de unos 20 microlitros; si la columna es capilar el volumen es menor de 10-3 microlitros. Se usan divisores de flujo a la entrada de la columna para desechar analito hasta alcanzar estos volmenes. Las muestra slidas deben introducirse en forma de disolucin, el disolvente se pierde en la cmara de vaporizacin y as no interfiere en la elucin (30).

c. Columnas y sistemas de control de temperatura: la longitud de las columnas es de 2 a 50 metros, de acero inoxidable, vidrio, slice o tefln. Las columnas se enrollan de forma helicoidal para encajar en el horno. La temperatura influye directamente sobre la separacin de los analitos, se necesita una precisin de dcimas de grado. La temperatura depende del punto de ebullicin del analito,

38 as pues se ajusta la temperatura un poco por encima del punto de ebullicin. Si son varios analitos se debe ajustar la rampa de temperatura, que consiste en aumentar la temperatura de forma gradual o por etapas hasta separar los analitos. El problema de subir demasiado la temperatura es que aumenta la velocidad de elucin y tambin aumenta el riesgo de descomposicin del analito.

Existen dos tipos de columnas: - Empaquetadas o de relleno. - Tubulares abiertas o capilares (mas eficaces y rpidas) (30). d. Detectores: i) Detector de ionizacin de llama: es un quemador de

hidrgeno/oxgeno donde se mezcla el eluyente con hidrgeno. En esta cmara se produce una chispa para causar ignicin, los compuestos orgnicos al quemarse se pirolizan y producen iones y electrones, aprovechando que se convierte en conductor se induce una corriente elctrica, para detectar iones desprendidos. Es un detector de masa, puesto que aproximadamente el numero de iones desprendidos es igual al numero de carbonos transformados (30). ii) Detector de conductividad trmica: se basa en el calentamiento de

una resistencia mediante el uso de una corriente elctrica. Esta resistencia tiene una temperatura que depende del gas circundante. La resistencia es un hilo que puede ser de tungsteno, platino u oro (30). iii) Detector termoinico: Se usa para compuestos fosforados y nitrogenados, su funcionamiento es parecido al detector de ionizacin de llama, el eluyente se mezcla con hidrgeno y se quema. El gas se pasa alrededor de una esfera de rubidio calentado a 600 C y sometida a 180 V, creando un plasma en el

39 cual se forman gran cantidad de iones que producen una corriente medible, la intensidad es proporcional al nmero de iones formados y as se determina la concentracin o porcentaje del analito (30). iv) Detector de captura de electrones: se basa en la emisin de una partcula por parte de tomos como el 63Ni o tritio, el electrn emitido ioniza el gas portador y emite una rfaga de electrones, esta rfaga es sensible a una corriente elctrica que se puede medir. En el caso de especies orgnicas los electrones son absorbidos, disminuyendo la intensidad de la corriente (30). v) Detector de emisin atmica: el gas se introduce en un plasma de helio inducido por microondas, la alta temperatura ioniza toda la muestra y se miden los espectros de emisin mediante un espectrofotmetro acoplado al sistema (30). e. Columnas: i) Columnas de relleno: Son tubos de vidrio, metal inerte o tefln de 2 o 3 metros de longitud y 2 a 4 milimetros de dimetro interno el material de relleno del interior consiste en partculas esfricas para interaccionar con el analito. Normalmente se usan diatomeas puesto que es un material ideal para la adsorcin. ii) Columnas capilares: WCOT: Pared recubierta: son tubos capilares donde la pared interna esta recubierta con una fina capa de fase estacionaria.

40 SCOT (soporte recubierto): tienen una capa en su lado interno de superficie adsorbente donde se acopla la fase estacionaria. Tienen mayor capacidad de carga (30). f. Fase estacionaria: Una fase estacionaria liquida inmovilizada requiere: - Caractersticas de reparto, - Baja volatilidad, - Baja reactividad, y - Estabilidad trmica (30).

G. LA ESPECTROMETRA DE MASAS (EM) COMO COMPLEMENTO DE LA CROMATOGRAFA DE GASES (CG). La cromatografa de gases en si, es esencialmente una tcnica de separacin. Sin embargo, puede convertirse en un instrumento analtico con el auxilio de la espectrometra de masas. El punto de acoplamiento de ambas tcnicas esta en utilizar el espectrmetro de masas como un tipo de detector muy selectivo en el cromatgrafo de gases. De tal manera que no solamente se

obtiene una separacin de los componentes de la mezcla sino adems, para cada una de ellas, se tiene informacin referente a su peso molecular y un patrn de fragmentacin estructural caracterstico de cada componente (31). H. CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRA DE MASAS Y SU PAPEL EN EL ESTUDIO DE ACEITES ESENCIALES. En relacin con el estudio de aceites esenciales, el acoplamiento de la Cromatografa de Gases a la Espectrometra de Masa (CG-MS) es el que ha recibido mayor atencin desde su introduccin ya que permite obtener el espectro de masas de cada componente eludo. Se obtiene el dato de su peso molecular e informacin estructural. Existen bases de datos con los espectros de masas de muchos componentes, por lo cual el ndice de Kovats (determinado en

41 dos columnas de diferente polaridad) y el espectro de masas son criterios para la identificacin qumica de muchos de los componentes de un aceite esencial, sean monoterpenos u otros tipos de sustancias caractersticas de dichos aceites. En el acoplamiento de la cromatografa de gases a la espectrometra de masas, la tcnica de ionizacin ms utilizada es la de impacto electrnico (EI). Sin embargo, la tcnica de ionizacin qumica (CI) tiene cada vez ms aplicaciones, por la mayor informacin que permite obtener. Un ejemplo de esto lo presenta la identificacin de fenilpropanos ya que por la presencia de su anillo aromtico presentan espectros de masa con iones moleculares intensos, lo que facilita la determinacin de su peso molecular. En el caso de compuestos con grupos carboxilo e hidroxilo es conveniente derivatizarlos para obtener sustancias ms volatilizables y trmicamente ms estables, ya que esto facilita por ejemplo su anlisis en mezclas mediante cromatografa de gases o cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (32).

42

IV. JUSTIFICACIN La industria de los ctricos en Guatemala se encuentra en constante crecimiento debido principalmente a la demanda de limn, naranja, toronja y recientemente de mandarina. En Guatemala se cultivan algunas variedades de mandarina, entre las cuales destacan las variedades Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Teniendo en cuenta que en general el flavedo de la mandarina se desecha, existe la posibilidad de viabilizar de manera comercial la extraccin del aceite esencial del mismo mediante arrastre con vapor de agua. La importancia de llevar a cabo la extraccin del aceite esencial del flavedo de las variedades de mandarina mencionadas, radica en la amplia gama de aplicaciones que estos aceites pueden tener en la industria de Guatemala. Entre las

aplicaciones ms importantes se pueden mencionar: la industria alimenticia, la industria mdica, adems de contar con aplicabilidad en la industria de perfumera y cosmticos. En la industria alimenticia los aceites esenciales extrados del flavedo de las variedades de la mandarina son importantes, ya que pueden ser utilizados como agentes antimicrobianos, actuando al mismo tiempo como saborizantes y preservantes contra la descomposicin bacteriana. As mismo tambin puede utilizrseles en el sector de la salud, ya que pueden ser desarrolladas formulaciones que permitan la fabricacin de medicamentos genricos de bajo costo con eficientes actividades contra microorganismos patgenos para el ser humano, siendo esto un beneficio para la poblacin guatemalteca. Un ejemplo de esto es que el aceite esencial extrado del flavedo de la mandarina puede ser utilizado como agente antibacteriano contra algunas cepas patgenas para el ser

43 humano, entre las cepas bacterianas que pueden mencionarse estn las siguientes: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Helycobacter pilori y Salmonella (13,21). Existe tambin la posibilidad de fraccionar los componentes del aceite esencial extrado del flavedo de la mandarina para utilizarlos como materia prima para la obtencin de otras sustancias importantes, tal es el caso de la utilizacin del d-limoneno y p-cimeno para la sntesis de pesticidas que pueden controlan el crecimiento de larvas de insectos dainos para cultivos del pas, teniendo estos pesticidas la ventaja de ser de origen natural y por lo tanto totalmente biodegradables. Tambin es importante reconocer que el desarrollo industrial de la extraccin del aceite esencial del flavedo de la mandarina cultivada en Guatemala, podra establecer fuentes de trabajo e ingresos econmicos para un sector de la poblacin.

44 V. OBJETIVOS A. General. Identificar y cuantificar de forma relativa los componentes principales del aceite esencial del flavedo (cscara) de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por medio de Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas.

B. Especficos. 1. Obtener muestras frescas de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).

2. Obtener muestras frescas del flavedo de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus

reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).

3. Obtener el aceite esencial del flavedo de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus

reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por medio de destilacin por arrastre con vapor de agua (hidrodestilacin).

4. Separacin, identificacin y cuantificacin relativa de los componentes del aceite esencial del flavedo de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por medio de Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas.

45 VI. HIPTESIS No se platea hiptesis debido a que es un estudio exploratorio de la cantidad de aceite esencial que posee el flavedo de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y

Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) as como la identidad y concentracin relativa de los principales componentes del aceite esencial de cada una de las variedades de mandarina seleccionadas para el estudio.

46

VII. MATERIALES Y MTODOS A. Universo de trabajo. 1. Poblacin. Variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina

(Mandarina Dancy) cultivadas en la Finca La Providencia ubicada en el municipio de Ro Bravo, del Departamento de Suchitepquez a una altitud de 460 metros sobre el nivel del mar. 2. Muestra. 125g de flavedo fresco de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) cultivadas en la Finca La Providencia ubicada en el municipio de Ro Bravo, del Departamento de Suchitepquez a una altitud de 460 metros sobre el nivel del mar. B. Recursos. 1. Materiales. a) Reactivos. Reactivo Etanol Acetona Pentano 2-bromoclobenceno Cantidad 1L 1L 1L 1.0 g Calidad A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. Concentracin 99.9 % 95.0 % 99.0 % 99.0 %

47

b) Estndares primarios. Estndar -pineno -pineno Mirceno Limoneno p-cimeno -terpineno Linalol acetato de linalilo -terpineol Citronelol acetato de geranilo N-metilantranilato de metilo Cantidad 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L 0.001 L Calidad A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. A.C.S. Concentracin > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 % > 99.0 %

c) Cristalera. 1 baln corning de 500 ml y condensador 24/40 esmerilado. 1 agitador de Vidrio. 21 viales de 1mL color mbar. 3 beacker de 25mL. 1 columna para extraccin de aceites esenciales (ver anexo No. 2). d) Equipo. 1 rotavapor. 1 balanza electrnica (0.0001 g) Marca Perkin Elmer 9200. 1 manta de calentamiento. e) Equipo instrumental. Cromatgrafo de gases marca Hewlett-Packard F & M, modelo 770. Columna, dimetro interior 4mm, longitud 1.20m. Soporte, cromosorb C silanizado, malla 100/120.

48 Fase estacionaria FFAP, 5%. Gas acarreador, nitrgeno. Flujo, 5 ml/min. Temperaturas, horno 90 oC, bloque de inyeccin 170 oC, detector 200 oC. Espectrmetro de masas Hewlett-Packard JL234. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280 oC. Temperatura de fuente: 200 oC. Calibrante: Perfluorotributilamina PTBFDA (FC-43) m/z: 69 (100%), 219 (50%) y 502 (2.5%).

2. Humanos. a) Estudiante: Jorge Arturo Mazariegos Monterroso. b) Asesores de Tesis: Licda. Diana Pinagel Cifuentes. M. Sc. Silvia Echeverra. C. Mtodo. 1. Diseo de investigacin. Se realiz un muestreo probabilstico de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y

Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy), cultivadas en la Finca La Providencia ubicada en el municipio de Ro Bravo, del Departamento de Suchitepquez a una altitud de 460 metros sobre el nivel del mar. El muestreo consisti en la recoleccin de frutos en completo estado de madurez de cada una de las variedades de mandarina bajo estudio, luego se extrajo mediante hidrodestilacin el aceite esencial del flavedo fresco de cada una de ellas, cuantificando el porcentaje de aceite esencial obtenido. El aceite esencial

extrado de cada variedad de mandarina se analiz en duplicado por medio de

49 cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas lo que permiti, separar, identificar y cuantificar los componentes principales de los mismos.

a) Muestra (materia prima). Para realizar el estudio de composicin qumica del aceite esencial de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y

Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) se seleccion como muestra el flavedo fresco de cada una de las variedades de mandarina cultivadas en la Finca La Providencia ubicada en el municipio de Ro Bravo, del Departamento de Suchitepquez a una altitud de 460 metros sobre el nivel del mar.

b) Variables de inters. Componentes principales del aceite esencial del flavedo fresco de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus

reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Las condiciones de separacin y cuantificacin de los componentes principales estn sujetas a ser modificadas en caso la metodologa terica no sea la ptima para separar, identificar y cuantificar los principales componentes presentes en cada uno de los aceites esenciales extrados de las variedades de mandarina bajo estudio. c) Anlisis de resultados. i) Identificacin de los componentes principales del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Los componentes del aceite esencial de cada una de las variedades de mandarina fueron identificados por medio de cromatografa de gases acoplada a

50 espectrometra de masas, estableciendo as los tiempos de retencin y espectros de masas de los principales componentes presentes en cada variedad de mandarina y comparndolos con los tiempos de retencin y los espectros de masas de cada uno de los estndares o patrones utilizados, tambin se realiz la respectiva comparacin del espectro de masas de cada componente identificado con el de referencia de la base datos Wiley275. Para el estudio se utilizarn los siguientes estndares: -pineno, -pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, -terpineno, linalol, acetato de linalilo, -terpineol, citronelol, acetato de geranilo y N-metil antranilato de metilo con un mnimo de pureza del 99%.

ii)

Cuantificacin del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina comn) y Citrus

(Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata

reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Cuantificacin del contenido de aceite esencial de cada una de las variedades de mandarina. Esto se realiz utilizando la siguiente expresin:

C = (PA / PP) 100% Donde: C: contenido de aceite esencial (% p/p ). PA: Masa de aceite esencial extrado (g). PP: Masa del flavedo fresco de mandarina (g).

(Ecuacin 1)

D. Procedimiento. 1. Recoleccin de las variedades de mandarina cultivadas en la Finca La Providencia ubicada en el municipio de Ro Bravo, del Departamento de Suchitepquez a una altitud de 460 metros sobre el nivel del mar por el Proyecto

51 de Desarrollo de la Fruticultura y Agroindustria (PROFRUTA) del Ministerio de Agricultura (MAGA).

2. Molienda del flavedo fresco de cada una de las variedades de mandarina: utilizando una cuchilla esterilizada para pelar cada una de las mandarinas y disponer del mismo en trozos pequeos, luego en un molino de aspas disminuir el tamao del flavedo hasta aproximadamente 1mm. a) Extraccin del aceite esencial. 1. Se pesan 125g de flavedo fresco de mandarina. 2. Se colocan los 125g de flavedo fresco de mandarina previamente molido en un baln de 1000mL y se adicionan aproximadamente destilada con algunos ncleos de ebullicin. 3. Armar el aparato para hidrodestilacin como se muestra en el Anexo No. 1. 4. Se calienta la mezcla hasta ebullicin y se mantiene de esa manera durante 4 horas. 5. El aceite esencial extrado de cada una de las variedades de mandarina se cuantifica mediante la ecuacin 1 y se procede a almacenarlo en la refrigeradora a 4 oC en viales de vidrio color mbar con tapn de rosca. El aceite esencial puede ser almacenado durante 6 meses (12) siempre y cuando el viale se encuentre bien cerrado y a 4 oC (33). 600mL de agua

b) Determinacin de los componentes del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) por medio de Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas.

52 1. Elaborar disoluciones patrn de cada uno de los estndares de inters, pesando 0.0250g de cada patrn con un mnimo de pureza del 99% en un baln de 25mL y luego aforando con etanol absoluto. Agite vigorosamente cada disolucin patrn para homogeneizarla. Almacene a 4 oC. 2. Vierta 5mL de cada disolucin patrn elaborada en el inciso anterior y agregue a la misma 0.0250g de 2-bromoclorobenceno (BCB) como patrn interno en un baln de 100mL, afore la mezcla de estndares con etanol absoluto, esta mezcla servir para establecer el perfil cromatogrfico de referencia con el cual ser comparado el aceite esencial extrado de cada una de las variedades de mandarina. La mezcla elaborada debe poseer los 12 estndares de inters. 3. Realizar la calibracin del sistema de deteccin llevando a cabo la determinacin del intervalo de linealidad para los patrones de los compuestos bajo estudio. 4. Inyectar por duplicado cada una de las disoluciones patrn elaboradas a partir de cada uno de los estndares puros, con esto se establecern los tiempos de retencin y espectros de masa de referencia para cada uno de los estndares o patrones. 4. Inyectar por duplicado cada uno de los aceites esenciales extrados del flavedo las variedades de mandarina y establezca los tiempos de retencin para cada uno de los componentes mayoritarios. 5. Establezca los espectros de masas para cada uno de los componentes mayoritarios en cada uno de los aceites esenciales extrados mediante un barrido completo en un intervalo de masas entre 40 y 250 u.m.a. a una velocidad de 1,2 scaneos/s. 6. Para realizar la separacin, identificacin y cuantificacin relativa de los componentes de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina se miden 0.2L de aceite esencial y se diluyen en 1mL de diclorometano, de esta dilucin se inyecta 0.6L al cromatgrafo (HP 5890) acoplado a un espectrmetro de masas (HP 5890 II) con las siguientes

53 condiciones de operacin: Columna (HP 1, capilaridad 30m x 0.25mm dimetro interno x 0.25 m espesor, se utiliz Helio como gas portador, a flujo constante de 1mL/min, presin de 14 libras por pulgada cuadrada, y una velocidad lineal de 19cm/s. La temperatura inicial fue de 50oC durante 3 minutos, con una rampa de 20oC/min. hasta 280oC y 15 min. a 280oC, temperatura del inyector 250oC, temperatura de interfase del inyector 280oC. Tiempo de corrida 60 minutos.

54

VIII. RESULTADOS Tabla No. 7. Rendimiento de extraccin promedio del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).

Muestra

Tiempo (min)

Peso muestra flavedo fresco (g)* 127.53.54

Peso de aceite esencial (g)* 1.04010.036

Rendimiento de extraccin (%)* 0.820.0059

Citrus Reshni (Mandarina Cleopatra) Citrus reticulata (Mandarina Comn) Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy)

180

180

133.252.47

0.94300.0076

0.710.0074

180

123.00

0.89410.077

0.660.021

Fuente: Resultados experimentales obtenidos del arrastre con vapor de agua (hidrodestilacin Neoclevenger) del flavedo fresco de las variedades de mandarina bajo estudio. LIPRONAT-

* Los valores de peso muestra flavedo fresco (g), peso de aceite esencial (g) y el rendimiento de extraccin (%) incluyen el valor de la media la desviacin estndar

55 Tabla No. 8. Componentes principales cuantificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra). Nmero de Pico
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -

Componente

Tiempo de retencin (Rt) Minutos 0.05

9.80 11.53 11.99 12.55 13.60 13.76 14.79 15.52 16.45 19.65 20.21 20.45 21.36 23.33 23.93 No detectado No detectado No detectado No detectado

Concentracin relativa (%)

0.20 0.15 2.23 1.70 36.03 38.07 8.46 0.70 7.20 0.61 1.80 0.42 0.35 0.46 1.30 No detectado No detectado No detectado No detectado

-pineno -pineno -mirceno n-octanal Limoneno l-limoneno -terpineno -terpinoleno linalool 4-terpineol -terpineol n-decanal citronelol perilaldehdo carvacrol p-cimeno acetato de Linalilo acetato de geranilo N-metilantranilato de metilo

Fuente: Base de datos Wiley275.

56

Abundancia 6

1.1e+07 1e+07 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000

9 5

3000000 2000000 1000000

Tempo de retencin 1 234

7 11 8 10

15 12 14 13

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

Figura No. 1. Cromatograma del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra).

57 Tabla No. 9. Componentes principales cuantificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata (Mandarina Comn). Nmero de Pico
1 2 3 4 5 6 7 8 -

Componente

Tiempo de retencin (Rt) Minutos 0.05

9.79 11.53 11.99 13.60 14.78 19.65 20.21 20.45 No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado

Concentracin relativa (%)

0.30 0.25 1.43 79.07 16.03 0.52 1.45 0.31 No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado

-pineno -pineno -mirceno limoneno -terpineno 4-terpineol -terpineol n-decanal l-limoneno citronelol perilaldehdo carvacrol n-octanal p-cimeno acetato de Linalilo linalool acetato de geranilo N-metilantranilato de metilo

Fuente: Base de datos Wiley275.

58

Abundancia 4

600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0
Tiempo de retencin 1 23 6 78 5

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

Figura No. 2. Cromatograma del aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata (Mandarina Comn).

59 Tabla No. 10. Componentes principales cuantificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Nmero de Pico
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -

Componente

Tiempo de retencin (Rt) Minutos 0.05

9.82 11.53 11.96 12.55 13.62 13.79 14.79 15.32 16.50 19.65 20.21 20.45 21.36 23.33 23.93 No detectado No detectado No detectado No detectado

Concentracin relativa (%)

0.20 0.15 2.20 0.60 30.63 40.62 5.69 0.20 14.43 0.50 1.85 0.42 0.62 0.35 0.96 No detectado No detectado No detectado No detectado

-pineno -pineno -mirceno n-octanal limoneno l-limoneno -terpineno -terpinoleno linalool 4-terpineol -terpineol n-decanal citronelol perilaldehdo carvacrol p-cimeno acetato de Linalilo acetato de geranilo N-metilantranilato de metilo

Fuente: Base de datos Wiley275.

Abundancia
6

60

1.3e+07 1.2e+07 1.1e+07 1e+07 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 Tiempo de retencin Figura No. 3. Cromatograma del aceite esencial del flavedo de Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
1 3 4 7 11 12 14 15 13 10 5 9

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

61 Tabla No. 11. Componentes principales cuantificados en muestra de Sabor de Mandarina No. 100. Nmero de Pico
1 2 3 4 5 6 7 8 -

Componente

Tiempo de retencin (Rt) Minutos 0.05

9.80 11.53 11.63 13.06 13.24 14.40 15.53 27.60 No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado

Concentracin relativa (%)

1.76 1.65 1.16 2.66 74.38 16.82 0.72 0.82 No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado No detectado

-pineno -pineno -mirceno p-cimeno limoneno -terpineno -terpinoleno N-metilantranilato de metilo l-limoneno 4-terpineol -terpineol n-octenal n-decanal citronelol perilaldehdo carvacrol p-cimeno acetato de Linalilo acetato de geranilo linalool

Fuente: Base de datos Wiley275.

62

Abundancia

7000000 6000000 5000000 4000000 3000000

6

2000000 1000000 0
Tiempo de retencin
1 234 7 8

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

Figura No. 4. Cromatograma del aceite esencial del Sabor de Mandarina No. 100.

63 Tabla No. 12. Componentes traza identificados en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Componente Tiempo de retencin (Rt) Minutos 0.05 Citrus reshni acetato 9-decenilico Sabineno -terpineno 1-octanol (+)-2-careno l-linalool 6-octenal [Citronela] 6-octen-1-ol 2,6-octadienal [Z-Citral] 2-ciclohexen-1-ona 2,6-octadien-1-ol [trans-Geraniol] -citral [Geranial] -elemeno 25.37 0.10 0.06 0.10 22.96 0.09 0.07 0.08 22.13 22.32 0.05 0.03 0.07 0.02 0.04 0.04 21.37 21.86 0.10 0.09 0.11 0.07 0.05 0.10 11.10 11.50 13.11 15.28 15.93 16.59 18.49 0.08 0.02 0.05 0.03 0.22 0.06 0.02 Concentracin relativa (%) Citrus reticulata 0.06 0.04 0.07 0.07 0.28 0.08 0.03 Citrus Tangerina 0.09 0.05 0.03 0.04 0.23 0.05 0.12

Fuente: Base de datos Wiley275.

64 IX. DISCUSIN DE RESULTADOS La extraccin del aceite esencial del flavedo fresco de las variedades de mandarina Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina se realiz en duplicado por medio de destilacin por arrastre con vapor de agua (hidrodestilacin) durante 3 horas. Los aceites esenciales fueron

recibidos durante la destilacin en pentano, la seleccin de este disolvente respondi a la facilidad con la que es separado del aceite esencial mediante rotavapor a 30oC. Al obtener el aceite esencial de cada variedad de mandarina se pudo observar un aceite esencial incoloro y de aroma caracterstico. Despus de esto, los aceites esenciales extrados fueron almacenados en viales mbar y refrigerados a 4oC para garantizar de ese modo su estabilidad qumica hasta realizar el anlisis mediante cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas. Los rendimientos de extraccin del aceite esencial del flavedo fresco de las variedades de mandarina bajo estudio presentaron valores por encima de los valores reportados en estudios anteriores a aceites esenciales de ctricos, siendo los valores promedio de extraccin los siguientes; para Citrus reshni 0.820.0059% p/p, para Citrus reticulata 0.710.0074% p/p y 0.660.021% p/p para Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina. En estudios de ctricos efectuados con anterioridad se obtuvieron rendimientos de extraccin para el aceite esencial de Limn (Citrus Aurantifolia), mandarina comn (Citrus reticulata) y naranja amarga (Citrus aurantium L.) con un porcentaje entre de 0.2 y 0.5% p/p (12). Los altos porcentajes de extraccin se deben a que las mandarinas de cada variedad seleccionadas para el estudio se encontraban en completo estado de madurez y a que el mtodo de extraccin del aceite esencial de mandarina fue fundamentalmente diferente, ya que para esta investigacin el mtodo de extraccin consisti en una destilacin por arrastre con vapor de agua (hidrodestilacin) y en los estudios anteriores el mtodo aplicado fue el

65 prensado en fro. Los altos rendimientos de extraccin tambin pueden deberse al completo estado de madurez, este hecho encuentra justificacin en un estudio efectuado al limn (Citrus Swinglea) en el 2005, en este estudio se pudo establecer mediante anlisis cromatogrficos de alta resolucin que las diferentes etapas de maduracin influyen en la cantidad y calidad del aceite esencial que se puede extraer de ctricos (37). Los resultados de los anlisis cromatogrficos de los aceites esenciales extrados del flavedo fresco de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina se muestran en las tablas 8, 9 y 10, respectivamente, as como los cromatogramas en las figuras 1, 2 y 3. Se observaron algunas

variaciones en la composicin de voltiles de los aceites esenciales extrados, estos resultados muestran la presencia de 28 componentes, 7 de los cuales se encuentran en todas la variedades de mandarina, siendo estos los siguientes; (pineno, -pineno, limoneno, -terpineno, 4-terpineol, -terpineol y n-decanal), los cuales se pueden considerar como mayoritarios. Entre estos componentes destacan los siguientes hidrocarburos

monoterpnicos por su abundancia, el limoneno con 79.07% en Citrus reticulata, 36.16% en Citrus reshni y 30.63% en Citrus reticulata Blanco, tambin el -terpineno con 16.03% en Citrus reticulata, 8.46% en Citrus reshni y 5.69% en Citrus reticulata Blanco, por ltimo el derivado oxigenado (alcohol) -terpineol con 1.85% en Citrus reticulata Blanco, 1.80% en Citrus reshni y 1.45% en Citrus Se debe mencionar tambin que para la cuantificacin de los componentes principales de los aceites esenciales de las variedades de mandarina investigadas no fue necesaria la elaboracin de curvas de calibracin con estndares de alta pureza, ya que la cromatografa de gases acoplada a la espectrometra de masas permiti establecer los tiempos de retencin, as como la concentracin relativa para cada uno de los componentes y ms importante an, esta tcnica instrumental permiti establecer la identidad de cada uno de los componentes reticulata.

66 principales, incluso los que se encontraban a niveles traza, esto mediante la comparacin del espectro de masas obtenido experimentalmente para cada componente versus el espectro de masas de referencia de la base de datos Wiley275 (ver anexos 5 al 16 y 20 al 43), establecindose de esa manera la identidad y concentracin relativa de cada uno de los componentes presentes en las variedades de mandarina investigadas. El anlisis cromatogrfico permiti establecer una comparacin entre la composicin de las diferentes variedades de mandarina analizadas, se estableci que algunos componentes se encuentran ausentes en Citrus reticulata, tal es el caso del n-octanol, l-limoneno, -terpinoleno, linalool, citronelol, perilaldehdo y carvacrol, tambin se encontr que en las tres variedades de mandarina estudiadas las concentraciones relativas de -pineno y -pineno (0.20%-0.30% y 0.15%-0.25% respectivamente) son menores que las reportadas en otras variedades de ctricos, tal es el caso del estudio realizado por Daz et. al. donde se caracteriz el aceite esencial de Citrus Swinglea, reportando el estudio concentraciones relativas mayores al 24% para el -pineno y -pineno, este hecho es de importancia ya que estos componentes son de inters comercial (37). Tambin se llevo a cabo el anlisis de una muestra del Sabor de Mandarina No. 100, se encontraron algunas diferencias en cuanto a composicin ya que al comparar la identidad de los componentes presentes en la muestra del Sabor de Mandarina No. 100 con respecto a la composicin de los aceites esenciales de las variedades Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina, los resultados indican diferencias en la concentracin relativa del -pineno y -pineno ya que el Sabor de Mandarina No. 100 present concentraciones relativas mas elevadas de estos componentes que el aceite esencial de las variedades de mandarina. En el Sabor de Mandarina No. 100 tambin se encontr una concentracin relativa de N-metilantranilato de metilo igual a 0.82%, este componente voltil no se encontr en ninguna de las variedades de mandarina caracterizadas, esto es relevante ya que este

67 componente voltil es considerado como un parmetro de calidad de los aceites esenciales provenientes de variedades de ctricos. En las variedades de mandarina Citrus reshni, Citrus reticulata, Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina y muestra de Sabor de Mandarina No. 100 existen algunos componentes que no fue posible detectar, tal es caso del acetato de linalilo y acetato de geranilo, pero se detect la presencia de algunos componentes a niveles tan bajos que puede catalogrseles como trazas, siendo stos los siguientes; acetato 9-decenlico, sabineno, -terpineno, 1-octanol, (+)-2-careno, l-linalool, 6-octenal (Citronela), 6-octen-1-ol,

2,6-octadienal (Z-Citral), 2-ciclohexen-1-ona, 2,6-octadien-1-ol, (trans-geraniol), -citral (Geranial) y -elemeno. cetonas, steres Estos compuestos oxigenados (aldehdos,

y alcoholes) y sus bajas concentraciones relativas pueden

ocasionar las diferencias sutiles en el aroma del aceite esencial de cada variedad de mandarina estudiada, ya que cada uno de los aceites esenciales extrados presentaba un aroma ligeramente diferente. Al haber identificado y cuantificado los componentes mayoritarios y minoritarios del aceite esencial de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina se puede argumentar que stos representan un recurso natural renovable y que aun no se explota en Guatemala, siendo tambin una gran oportunidad para el pas en el mercado de los productos forestales no maderables, ya que al fraccionar los aceites esenciales se puede obtener limoneno, linalool, -terpineol y citronelol que pueden ser usados como aromatizantes en la industria alimenticia, farmacutica y cosmtica del pas; en la agronoma como pesticidas; en la industria de agentes de limpieza como desinfectantes y en la industria farmacutica como principios activos y como saborizantes en la industria alimenticia, entonces al explotar este recurso natural del pas se pueden establecer fuentes de investigacin y desarrollo.

68 X. CONCLUSIONES 1. Se obtuvieron altos rendimientos de extraccin para los aceites esenciales de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina, ya que normalmente los rendimientos de extraccin se encuentran entre 0.2 y 0.5% p/p y los valores de extraccin experimentales son de 0.820.0059% p/p, 0.710.0074% p/p y 0.660.021% p/p

respectivamente. 2. Los altos porcentajes de extraccin en los aceites esenciales se debieron a que las mandarinas seleccionadas se encontraban en completo estado de madurez y a que se utiliz el flavedo fresco. 3. Los aceites esenciales extrados del flavedo fresco de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina tienen en comn la presencia de 7 componentes; -pineno, -pineno, limoneno, -terpineno, 4-terpineol, -terpineol y n-decanal, los cuales debido a su abundancia se pueden considerar como mayoritarios. 4. Los hidrocarburos monoterpnicos con concentraciones relativas

mayoritarias son el Limoneno con 79.07% en Citrus reticulata, 36.16% en Citrus reshni y 30.63% en Citrus reticulata Blanco, as como el -terpineno con 16.03% en Citrus reticulata, 8.46% en Citrus reshni y 5.69% en Citrus reticulata Blanco, y el derivado oxigenado -terpineol con 1.85% en Citrus reticulata Blanco, 1.80% en Citrus reshni y 1.45% en Citrus reticulata. 5. En la variedad de mandarina Citrus reticulata no se detect concentracin relativa de n-octanol, l-limoneno, -terpinoleno, linalool, citronelol, perilaldehdo y carvacrol. 6. Se comprob que los aceites esenciales de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina son ricos en algunos componentes tales como el limoneno, -terpineno y -terpineol entre otros, esto permite considerar a los aceites esenciales extrados como un ingrediente bsico

69 para la industria de alimentos como saborizantes, en farmacutica como principios activos y en productos limpieza como desinfectantes. 7. En los aceites esenciales de las variedades de mandarina investigadas se detecto e identific la presencia de algunos componentes a niveles tan bajos que puede catalogrseles como trazas, siendo stos los siguientes; acetato 9-decenilico, sabineno, -terpineno, 1-octanol, (+)-2-careno, l-linalool, 6-octenal (Citronela), 6-octen-1-ol, 2,6-octadienal (Z-Citral), 2-ciclohexen-1-ona, 2,6-octadien-1-ol, (trans-Geraniol), -Citral (Geranial) y -elemeno, estos componentes voltiles presentaron una pequea variacin en cuanto a concentracin relativa para cada una de las variedades de mandarina lo que puede contribuir directamente al aroma caracterstico de cada aceite esencial.

70

XI. RECOMENDACIN

1. Bergonzelli et. al. en 2003 caracteriza los aceites esenciales de ctricos tales como la lima, el limn y la toronja en estos aceites esenciales encuentra que el componente mayoritario era el d-limoneno, tambin cuantifica pequeos porcentajes de monoterpenos como el -pineno que presentaba actividad inhibitoria contra las cepa bacteria Helycobacter pilori, ya que esta cepa es patgenas para el ser humano se plantea utilizar los aceites esenciales extrados de Citrus reshni, Citrus reticulata y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina para realizar pruebas antibacterianas contra las cepas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginos y Salmonella para establecer su actividad antimicrobiana.

71 XII. REFERENCIAS 1. K. P., Adam, Zapp J. 1998. Phytochemistry. 48 (6). Pp 953. 2. Fuller, J. Harry. 1974. Botnica. Quinta Interamericana S. A. de C. V. Mxico. Pp 470. 3. Arch. Pharmaceutical. 1897. Vol 235. Pp. 583. 4. J. Prakt. Chemical. (1900). 62. Pp. 135. 5. Citrus and Related Genera. 1914-1917. Bailey Standard Cyclopedia of Horticultura. The Macmillan Co. New York. 6. Tanaka, Cf. Principal Citrus Fruit of the World. 1924. Vol 1. Kyushu Imp. Univ. Dep. Arg. Bull. Pp 20. 7. Webber and Barchelor. 1943. Citrus Industry. Vol. 1 Univ. Calif. Press. Pp 999. 8. American Perfumer. 1934. Vol. 29. Pp. 347. 9. Method and Seeker and Kirby. 1932. United States Dept. Agr. Tech. Bull. No. 241. Pp.1-30. 10. Ind. Eng. Chem. 1934. Vol 26. Pp 636. 11. Guenther, Ernest. 1949. The Essential Oils, Individual Essential Oils of the Plants Families Rutaceae and Labiatae. D. Van Nostrand Company, Inc. Vol. III New York. Pp. 333-344. 12. Giacomo, A. Di. Retamar J.A. 1982. Aceites esenciales de Especies Vegetales, Diversidad de sus Productos Qumicos. Vol. I. IPNAYS Co. Argentina. Pp. 149162. 13. Bergonzelli G.E, Donnicola D., Porta N y Corthsy-Theulaz., 2003, Essential oils as components of diet-based approach to management of Helicobacter Infection. AAC. Vol. 47, Pp 3240-3246. 14. http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UV/AVAILABLE/0301107-141814 15. http://www.portales.unipamplona.edu.co/unipamplona/hermesoft/ 16. http://www.unicordoba.edu.co/revistas/rta/documentos/ Edicin. Nueva Editorial

72 17. Herman, Jos. 1982. Farmacotecnia Terica y Prctica. 1ra. Edicin. Tomo V. Compaa Editorial Continental, S.A. de C.V. Mxico. Pp 1474-1475. 18. Austn. T., George. 1988. Manual de Procesos Qumicos en la Industria. Quinta Edicin, Primera edicin en espaol. Tomo II. McGraw

Hill/Interamericana de Mxico, S.A. de C.V. Pp 573-578. 19. http://www.profruta.gob.gt/ 20. http://variedadesdemandarina/CITRUS_RETICULATA.htm 21. Cceres, Armando. 1996. Plantas de Uso Medicinal en Guatemala. Primera Edicin. Editorial Universitario. Universidad de San Carlos de Guatemala. Pp 150-155, 228-230, 283-286. 22. Centro de Comercio Internacional UNCTAD/GATT. 1988. Aceites esenciales y oleorresinas: estudio de distintos productores y de mercados importantes. Ginebra. Pp 23-25. 23. Martnez M. Alejandro. 2001. Aceites Esenciales. Facultad de Qumica Farmacutica. Medelln. Universidad de Antioquia. Pp. 1-12. 24. F. La Face. 1968. Ess. Deriv. Agrum. 38. Pp 191-192 25. Vottero, Leonor. 1978. Essential Deriv. Agrum. 48. Pp. 150-156. 26. Kimball, Dan A. 2002. Procesado de Ctricos. 1ra. Edicin. Editorial Acribia S.A. Espaa. Pp 234. 27. J. Chem. Educ. 1980. 57. Pp. 138. 28. J. Chem. Educ. 1991. 68. Pp. 946. 29. Yonei, Y and col. Journal of Supercritic Fluids. 1995. 8. Pp. 156-156. 30. Skoog, Douglas A. 2001. Anlisis Instrumental. Quinta Edicin, McGraw Hill/Interamericana de Espaa S.A. Pginas consultadas 759-782. 31. Gasco, Luis. 1969. Teora y Prctica de la Cromatografa en Fase Gaseosa. Ediciones J.E.N. Espaa. Pp 234. 32. Crippen, Raymond C. 1973. Identification of Organic Compounds with Aid of Gas Chromatography. Mc Graw-Hill. USA. Pp 123.

73 33. Freeman, R.R. 1979. Teora y Prctica de la Cromatografa en Fase Gaseosa. Ediciones J.E.N. Espaa. Pp. 234 34. http://webbook.nist.gov/chemistry 35. http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi 36. http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UV/226107-100108 37. Daz, Carlos, et. al. 2005. Caracterizacin del aceite esencial de la corteza del Limn Swinglea por medio de CG-EM. Temas Agrarios Vol. 10:(1). Pp 22-28.

74 XIII. ANEXOS ANEXO No. 1

Figura No. 5 APARATO PARA DESTILACIN POR ARRASTRE CON VAPOR DE AGUA CLEVENGER. Fuente: Laboratorio de Investigacin de Productos Naturales LIPRONAT-. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia Universidad de San Carlos de Guatemala.

75 ANEXO No. 2

Figura No. 6 COLUMNA PARA LA OBTENCIN DE ACEITES ESENCIALES TIPO CLEVENGER.

76

ANEXO No. 3 Tabla No. 13 ALGUNAS FASES ESTACIONARIAS COMUNES EN CROMATOGRAFA DE GASES NOMBRE FASE TEMPERATURA APLICACIONES COMERCIAL ESTACIONARIA MAXIMA oC Polidimetilsiloxano OV-1, 350 Hidrocarburos; aromticos SE-30 polinucleares, esteroides. Poli(fenilmetildifenil)si OV-3, 350 Esteres metlicos de cidos loxano SE-52 grasos, alcaloides; drogas, compuestos halogenados. Poli(fenilmetil)siloxano OV-17 250 Drogas; esteroides, pesticidas, glicoles. Poli(trifluoropropildim OV-210 200 Aromticos clorados; etil)siloxano nitrocompuestos aromticos, alquilsustituidos. Polietilenglicol Carbowax 250 Acidos libres; alcoholes, esteres, aceites esenciales, glicoles. Poli(dicianoalildimetil) OV-275 240 Acidos grasos. siloxano Fuente: Skoog, Douglas A. 2001. Anlisis Instrumental. Cuarta edicin, McGraw Hill/Interamericana de Espaa S.A. Pgina consultada 774.

77

ANEXO No. 4 Tabla No. 14 LISTADO DE NOMBRES Y ESTRUCTURAS QUMICAS DE LOS COMPONENTES VOLATILES DE LOS ACEITES ESENCIALES PRESENTES EN LA MANDARINA CAS No. No. Nombre Comn 1 -pineno 80568 2 -pineno 127913 3 Mirceno 123-35-3 4 (+)-Limoneno 5989-27-5 5 p-cimeno 99-87-6 6 -terpineno 99854 7 Linalol 78-70-6 8 acetato de linalilo 115-95-7 9 8006391 -terpineol 10 Citronelol 106-22-9 11 aetato de geranilo 105-87-3 12 N-metilantranilato de metilo. 85-91-6
CH2 H2C CH2 H3C CH3 CH3 CH3 H3C

H3C

CH3

1.
CH3 H3C

2.
OH

H3C

3.

CH3

H3C

4.
CH3

CH2

H3C

5.

CH3

CH3

H3C

OCOCH3

CH2

CH2

CH2OH

H3C

CH3

H3C

CH3

H3C

CH3

H3C

OH

CH3

H3C

CH3

6.

7.

8.
O

9.

10.

CH3

CH3

O CH3

CH3 O O

H3C

11. 12.

NH CH3

78

ANEXO No. 5 Espectro No.1 Espectro de masas de -pineno

Fuente: http://webbook.nist.gov/chemistry (34) Fecha de consulta: 8/Mayo/2007. Hora de consulta: 17:25:00. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280oC. Temperatura de fuente: 200oC.

79

ANEXO No. 6 Espectro No.2 Espectro de masas del -pineno

Fuente: http://webbook.nist.gov/chemistry (34) Fecha de consulta: 8/Mayo/2007. Hora de consulta: 17:25:00. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280oC. Temperatura de fuente: 200oC.

80

ANEXO No.7 Espectro No. 3. Espectro de masas del mirceno.

Fuente: http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi (35) Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 19:50:00 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 75 eV. Temperatura de la muestra: 140oC. Temperatura de fuente: 260oC.

81

ANEXO No. 8 Espectro No. 4 Espectro de masas del d-limoneno.

Fuente: http://webbook.nist.gov/chemistry (34) Fecha de consulta: 8/Mayo/2007. Hora de consulta: 17:25:00. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280oC. Temperatura de fuente: 200oC.

82

ANEXO No. 9 Espectro No.5 Espectro de masas del p-cimeno.

Fuente: http://webbook.nist.gov/chemistry (34) Fecha de consulta: 8/Mayo/2007. Hora de consulta: 17:25:00. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280oC. Temperatura de fuente: 200oC.

83

ANEXO No. 10 Espectro No. 6 Espectro de masas del -terpineno.

Fuente: http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi (35) Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 19:50:00 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 75 eV. Temperatura de interfase: 150oC. Temperatura de fuente: 260oC.

84

ANEXO No. 11 Espectro No. 7 Espectro de masas del linalool.

Fuente: http://webbook.nist.gov/chemistry (34) Fecha de consulta: 8/Mayo/2007. Hora de consulta: 17:25:00. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280oC. Temperatura de fuente: 200oC.

85

ANEXO No. 12 Espectro No.8 Espectro de masas del -terpineol

Fuente: http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi (35) Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 19:50:00 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 75 eV. Temperatura de la muestra: 75oC. Temperatura de fuente: 280oC.

86

ANEXO No. 13 Espectro No. 9 Espectro de masas del acetato de linalilo.

Fuente: http://webbook.nist.gov/chemistry (34) Fecha de consulta: 8/Mayo/2007. Hora de consulta: 17:25:00. Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 70 eV. Temperatura de interfase: 280oC. Temperatura de fuente: 200oC.

87

ANEXO No. 14. Espectro No. 10. Espectro de masas del citronelol.

Fuente: http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi (35) Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 19:50:00 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 75 eV. Temperatura de la muestra: 150oC. Temperatura de fuente: 200oC.

88

ANEXO No. 15 Espectro No. 11. Espectro de masas del acetato de geranilo.

Fuente: http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi (35) Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 19:50:00 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 75 eV. Temperatura de muestra: 160oC. Temperatura de fuente: 220oC.

89

ANEXO No. 16 Espectro No. 12. Espectro de masas del N-metil antranilato de metilo

Fuente: http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi (35) Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 19:50:00 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 75 eV. Temperatura de la muestra 180oC. Temperatura de fuente: 240oC.

90

ANEXO No. 17 Tabla No. 15 TIEMPOS DE RETENCIN Y ALGUNAS PROPIEDADES FSICAS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE MANDARINA.

Punto ebullicin (oC) Componente -pineno -pineno mirceno (+)-limoneno p-cimeno -terpineno linalol -terpineol citronelol acetato de linalilo acetato de geranilo N-metilantranilato de metilo Rt 13.52 15.79 16.48 18.74 19.62 20.27 22.50 27.49 29.36 30.82 37.13 N.D. 700 mm Hg 156.2 164.6 171.5 178 N.D. 183 198 220.8 244.4 220 243.3 N.D. 400 mm Hg 132.3 136.1 148.3 151.4 N.D. N.D. 175.6 194.3 201 196.2 219.8 N.D. 40 mm Hg 66.8 71.5 82.6 84.3 N.D. N.D. 109.9 126 137.2 127.7 150 N.D.

Solubilidad H2O N.D. Hexano +

+ N.D

N.D.

N.D.

+ = soluble; - = insoluble, = Parcialmente soluble. N.D. = no disponible. Fuente: http://www.tesisenxarva.net/TESIS_UM/AVAILABLE/TDR-0226107100108/ (36) Fecha de consulta: 15/Mayo/2007. Hora: 20:25:00

91

ANEXO No. 18 Identificacin de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina Comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy)

Figura No. 7. Citrus reshni (Mandarina Cleopatra) Fuente: Proyecto de Desarrollo de la Fruticultura y Agroindustria PROFRUTA-.

Figura No. 8. Citrus reticulata (Mandarina Comn)

92 Fuente: Proyecto de Desarrollo de la Fruticultura y Agroindustria PROFRUTA-. ANEXO No.19

Figura No. 9. Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy) Fuente: Proyecto de Desarrollo de la Fruticultura y Agroindustria PROFRUTA-.

93

ANEXO No. 20 Espectro de masas del -pineno identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 433 (9.773 min): 3214.D 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #25392: .alpha.-PINENE 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 150 200 250 300 350 400 450 39 67 121 53 74 100 121 166 191 150 200 262 250 300 363 350 417 447 400 450

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

94

ANEXO No. 21 Espectro de masas del -mirceno identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 634 (11.975 min): 3214.D 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 50 0 50 m/z--> Abundance #25355: MYRCENE 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 150 200 250 300 350 400 450 500 121 69 136 115 100 150 176 207 200 245 250 281 335 316 350 377 400 438 450 500 500 69

300

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

95 ANEXO No. 22 Espectro de masas del n-octanal identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 686 (12.545 min): 3214.D 56 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #19693: OCTYL ALDEHYDE 56 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 150 200 250 300 350 400 450 500 110 84 110136 157 100 150 216 200 250 300 354 350 407 400 450 496 529 500 84

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

96 ANEXO No. 23 Espectro de masas del limoneno identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 784 (13.619 min): 3214.D 68 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> Abundance #25367: LIMONENE 68 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> 119 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420 39 136 93 51 119 196 243 416 136 93

40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

97 ANEXO No. 24 Espectro de masas del l-limoneno identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 847 (14.309 min): 3214.D 67 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420 m/z--> Abundance #25371: l-LIMONENE 68 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> 138 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420 39 121 93 50 207 242 291 433 121 93

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

98 ANEXO No. 25 Espectro de masas del -terpineno identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 891 (14.791 min): 3214.D 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #25031: .gamma.-Terpinene $$ 1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 150 200 250 300 350 400 450 500 65 43 136 100 65 162 150 209 238 200 250 294 300 334 350 411 400 450 513540 500 136

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250 oC. Temperatura de fuente: 280 oC.

99 ANEXO No. 26 Espectro de masas del 4-terpineol identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 381 (9.370 min): MANDA3.D 71 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> Abundance #40552: TERPINEN-4-OL 71 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 53 1000 0 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420440 m/z--> 154 136 93 111 53 154 136 185 207 281 304 327 354 442 93

111

40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420440

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

100 ANEXO No. 27 Espectro de masas del -terpinoleno identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 992 (15.897 min): 3214.D 121 136 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 40 m/z--> Abundance #25090: .alpha.-terpinolene $$ Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-m 93 121 9000 8000 136 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 40 m/z--> 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 77 41 60 240 281 312 334 363 380 53 77 93

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

101 ANEXO No. 28 Espectro de masas del -terpineol identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1386 (20.214 min): 3214.D 59 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> Abundance #40197: l-.alpha.-Terpineol $$ 3-Cyclohexene-1-methanol, .a 59 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 139 0 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420440 m/z--> 41 121 93 139 162 181 209 243 439 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420440 93 121

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

102 ANEXO No. 29 Espectro de masas del linalool identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1047 (16.500 min): 3214.D 71 8000 93 6000 55 4000 2000 0 20 m/z--> Abundance #40045: Linalool $$ 1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl- (CAS) 71 8000 6000 4000 27 2000 0 20 m/z--> 40 60 121 107 136 41 55 93 40 60 121 107 136

154

181

207 232 253 267

338

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

154

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

103 ANEXO No. 30 Espectro de masas del n-decanal identificado y cuantificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1416 (20.542 min): 3214.D 57 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #42667: DECYL ALDEHYDE 57 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 138 150 200 250 300 350 400 450 500 550 112 82 100 150 136 191 215 200 267 296 250 300 350 416 400 450 520545 500 550 112 82

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

104 ANEXO No. 31 Espectro de masas del acetato 9-decenilico identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 539 (11.101 min): MANDA3.D 57 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #83128: 9-decenyl acetate 43 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 150 200 250 300 350 400 450 138 96 68 100 150 200 250 300 350 400 450 110 135 189 208 161 81

277

354

472

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

105

ANEXO No. 32 Espectro de masas del sabineno identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 591 (11.504 min): 3214.D 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #25186: Sabinene $$ Bicyclo[3.1.0]hexane, 4-methylene-1-(193 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 41 69 136 115 100 150 200 250 300 350 400 450 500 100 150 136 178 207 250 300 350 400 281 429 450 517 500 69

200

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

106 ANEXO No. 33 Espectro de masas del -terpineno identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 738 (13.115 min): 3214.D 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z--> Abundance #25321: .Alpha.-Terpinene 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 41 2000 1000 0 m/z--> 65 23 139 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 121 55 151 173 207 241 430 121

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

107 ANEXO No. 34 Espectro de masas del 1-octanol identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 936 (15.284 min): 3214.D 56 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #21053: 1-Octanol (CAS) $$ Octilin $$ Alfol 8 $$ Sipol L8 $ 56 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 112 100 150 200 250 300 350 400 450 28 84 100 150 108 136 189 209 200 262 250 300 350 387 414 400 471 450 83

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

108 ANEXO No. 35 Espectro de masas del (+)-2-careno identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 995 (15.930 min): 3214.D 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 68 2000 1000 151 0 m/z--> Abundance #25433: (+)-2-Carene 93 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> 41 67 138 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420 121 51 207 189 236 288 402 434 121

40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

109 ANEXO No. 36 Espectro de masas del l-linalool identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1056 (16.598 min): 3214.D 55 9000 8000 7000 6000 5000 93 4000 3000 2000 1000 74 0 m/z--> Abundance #40608: L-LINALOOL 71 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> 139 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 53 121 93 165 184 265 287 335 399 468 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 121

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

110

ANEXO No. 37 Espectro de masas del 6-octenal identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1229 (18.494 min): 3214.D 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> Abundance #39940: CITRONELLA $$ 6-Octenal, 3,7-dimethyl- (CAS) $$ Cit 69 9000 8000 7000 95 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m/z--> 81 29 121 111 136 154 55 41 111 79 121 136 154 181 213 55 95

20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210

145 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

111

ANEXO No. 38 Espectro de masas del 6-octen-1-ol identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1492 (21.375 min): 3214.D 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 m/z--> Abundance #42735: 6-Octen-1-ol, 3,7-dimethyl-, (R)- $$ (R)-(+)-.beta. 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 m/z--> 15 50 100 123 156 150 200 250 300 350 400 450 500 95 41 50 100 150 95 123 156 207233 200 250 291 300 352 350 411 400 470 450 500 531

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

112 ANEXO No. 39 Espectro de masas del 2,6-octadienal identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1537 (21.868 min): 3214.D 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #37679: Z-Citral $$ 2,6-Octadienal, 3,7-dimethyl-, (Z)- (CA 41 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 94 119 152 150 200 250 300 350 400 450 500 69 100 150 200 250 300 350 400 450 500 119 150 177 207 230 409 535 94

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

113 ANEXO No. 40 Espectro de masas del 2-ciclohexen-1-ona identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1561 (22.131 min): 3214.D 82 8000 6000 4000 2000 0 40 m/z--> Abundance #35865: 2-Cyclohexen-1-one, 2-methyl-5-(1-methylethenyl)- ( 82 8000 6000 54 4000 2000 0 40 m/z--> 60 108 39 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 54 108 67 133 150 186 223 327 258272

67

95

135150 122

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

114 ANEXO No. 41 Espectro de masas del 2,6-octadien-1-ol identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1579 (22.328 min): 3214.D 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 m/z--> Abundance #40027: trans-Geraniol $$ 2,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-, 41 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 m/z--> 15 50 100 93 123 154 150 200 250 300 350 400 450 500 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 93 164 137 205 316 384 437 540

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

115 ANEXO No. 42 Espectro de masas del -citral identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1637 (22.963 min): 3214.D 69 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #37863: .alpha.-citral $$ geranial 41 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> 100 150 200 250 300 350 400 450 94 123 152 69 50 94 137 160 185 115 100 150 200 243 250 285 300 350 400 446 450 481

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

116 ANEXO No. 43 Espectro de masas del -elemeno identificado en el aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy).
Abundance Scan 1857 (25.373 min): 3214.D 121 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 m/z--> Abundance #89173: .delta.-Elemene $$ Cyclohexene, 4-ethenyl-4-methyl121 93 100 150 204 183 200 250 300 333 350 380 408 400 466 450 504 500 53 161 93

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 41

161

67 50 100 150

204 200 250 300 350 400 450 500

m/z-->

Fuente: Base de datos Wiley275. Fecha de consulta: 8/mayo/2007. Hora: 11:07:47 Ionizacin: Ionizacin electrnica. Energa de ionizacin 19.41 eV. Temperatura de la muestra: 250oC. Temperatura de fuente: 280oC.

117 ANEXO No. 44 Tabla No. 16. Rendimiento de extraccin del aceite esencial del flavedo de Citrus reshni (Mandarina Cleopatra), Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina Dancy). Muestra Peso muestra flavedo fresco (g) 125.0 Peso de aceite esencial (g) Rendimiento de extraccin (%)

Citrus Reshni 1.0143 0.8114 (Mandarina Cleopatra) Citrus Reshni 130.0 1.0658 0.8198 (Mandarina Cleopatra) Citrus reticulata 135.0 0.9484 0.7025 (Mandarina Comn) Citrus reticulata 131.5 0.9376 0.7130 (Mandarina Comn) Citrus reticulata Blanco o 123.0 0.9484 0.6415 Citrus tangerina (Mandarina Dancy) Citrus reticulata Blanco o 123.0 0.8398 0.6718 Citrus tangerina (Mandarina Dancy) Fuente: Resultados experimentales obtenidos del arrastre con vapor de agua (hidrodestilacin Neoclevenger) del flavedo fresco de las variedades de mandarina bajo estudio. LIPRONAT-