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METODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS En muchos aspectos, el pequeo tamao de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentacin. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio. La rpida multiplicacin de estas diminutas criaturas constituve tambin una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo da, Es ms, los conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es usualmente necesario cutivarlos en el laboratorio. Obtencin de un cultivo puro o axnico Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muv raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. En lo que resta de este captulo, estudiaremos los mtodos para obtener y propagar los cultivos axnicos. Estos mtodos se desarrollan para bacterias y hongos, pero con unas pequeas modificaciones, tambin pueden ser aplicados a algas y protozoos. Los mtodos para obtener cultivos axnicos de virus se describirn en el Captulo 13. La obtencin de un cultivo axnico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes. La esterilizacin A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. La eliminacin de todos los microorganismos se denomina esterilizacin. Los fundamentos de la esterilizacin y su aplicacin en medicina clnica y en la industria se estudiarn en el Captulo 9. En este captulo describiremos solamente su relacin con el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Todos los aparatos y todo el material utilizado para obtener un cultivo axnico ha de esterilizarse. Esto incluye el medio, las sustancias lquidas o slidas que se aadan como nutrientes al cultivo, los matraces, tubos de ensayo, las placas, los utensilios necesarios para transferir los cultivos de un recipiente a otro (pipetas, jeringas), etc. Como medios usuales de esterilizacin en el laboratorio se utilizan el calor, la filtracin y los compuestos qumicos. Esterilizacin por calorEl calor es el mtodo de eleccin para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material depende de que se est utilizando calor seco o calor hmedo. El calor hmedo mata los microorganismos ms rpidamente que el calor seco. Cuando se utiliza calor hmedo, una temperatura de 121 oC durante 20 minutos proporciona condiciones fiables para esterilizar la mayor parte del material de laboratorio. El material voluminoso o los grandes volmenes de lquido requieren un tiempo mayor para que la temperatura letal alcance el centro de los mismos. Por ejemplo, se tarda slo 15 minutos en esterilizar 10 ml de lquido en un tubo de ensayo, pero aproximadamente una hora y l0 minutos en esterilizar un matraz de 10 litros de capacidad que est lleno en sus dos terceras partes con lquido. Los objetos no pueden esterilizarse hirvindolos en contenedores ahiertos, porque la esterilizacin requiere una temperatura superior a la de ebullicin del agua (100 oC, al nivel del mar). Por este motivo, la esterilizacin por calor hmedo se realiza en camaras presurizadas. A una presin de 1 atmsfera, se puede calentar el agua a 121oC, sin que llegue a hervir. Cuando la cmara alcanza esta temperatura y presin, su con tenido puede ser esterilizado en 20 minutos, a condicin de que todo el aire de la misma haya sido reemplazado por vapor de agua.

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La cmara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave (Figura 3.18). En muchos aspectos una autoclave se parece a una olla de presin casera. De hecho, en algunos pequeos laboratorios de microbiologa se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presin de vapor. Las autoclaves son grandes cmaras de acero inoxidable que funcionan automticamente. Los objetos deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca, donde la esterilizacin no ser efectiva.

Una autoclave utiliza vapor de agua a presin para esterilizar objetos mediante calor. La mayora de los autoclaves estn diseadas de manera que el mismo vapor hace salir el aire de la cmara. En caso contrario, los objetos que quedaran en las bolsas de aire no se esterilizaran. Tambin estn equipados con indicadores que comprueban que se alcanza la temperatura precisa y se mantiene durante el tiempo necesario para la esterilizacin. Los medios de cultivo y los materiales textiles, tales como toallas y batas de laboratorio, se esterilizan en la autoclave. Tambin otros materiales secos que resisten las temperaturas altas, incluyendo pipetas de vidrio, matraces vacos o tubos de ensayo, especialmente si la autoclave posee secado automtico. Los materiales que se esterilizan en la autoclave quedan hmedos. El cristal y los instrumentos de metal tambin se pueden esterilizar por calor seco. Se colocan en hornos de aire caliente y se calientan a 170 o C durante 90 minutos. Las prendas textiles no pueden esterilizarse mediante esta tcnica debido a que la elevada temperatura las carboniza. La llama de un mechero tambin se utiliza para esterilizar. Cada vez que un matraz o un tubo de ensayo se abre para aadir o sacar material, se pasa la boca del mismo a travs de la llama de un mechero, a fin de destruir cualquier microorganismo que pueda haberse depositado all. Este procedimiento disminuve

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la probabilidad de que las celulas microbianas caigan en el recipiente y contaminen su contenido. Las asas e hilos de siembra, que los microbilogos utilizan para tomar microorganismos de un medio y llevarlos a otro, tambin se esterilizan flamendolos en la llama de un mechero Bunsen hasta la incandescencia. Este metodo de esterilizacin es rpido y cmodo, pero peligroso cuando se trabaja con microorganismos causantes de enfermedad. El calentamiento repentino en una llama puede formar un aerosol (suspensin de pequeas gotas de liquido) que contenga celulas microbianas y que puede ser inhalado por la persona que est trabajando en el laboratorio. La utilizacin de un pequeo horno para esterilizar las asas evita este riesgo. Filtracin Las clulas microbianas pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos termolbiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden esterilizar por filtracin, si previamente se disuelven en unl quido. Tecnicamente, la filtracin no esteriliza porque los virus pueden pasar a travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas estn compuestas de nitrocelulosa, con un poro de dimetro constante. La nitrocelulosa es un derivado qumico de la celulosa, que tambien se utiliza como explosivo. El dimetro de poro es aproximadamente 0,45 m; este tamao es lo suficientemente pequeo como para eliminar todos los microorganismos, con excepcin de los virus y algunas bacterias muy pequeas. Un lquido se filtra hacindolo pasar a travs de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el lquido por el filtro se utiliza una bomba de vaco; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtracin es el mtodo de eleccin para esterilizar soluciones de vitaminas, antibiticos v otros compuestos termolbiles, que son aadidos a los medios. Compuestos qumicos La mayora de los compuestos qumicos no se pueden utilizar para esterilizar medios de cultivo, pues permanecen en ellos y son txicos para los microorganismos que luego se han de cultivar. sin embargo, son de uso comn una vez que el experimento ha finalizado. El hipoclorito sdico (leja domstica) se utiliza para destruir los cultivos de la mayoria de los microorganismos patgenos, para que no contaminen el medio ambiente. Tambin se utiliza para esterilizar la superficie de ciertos materiales biolgicos, como las semillas y los tejidos vegetales. Los compuestos qumicos tambin se usan para desinfectar los laboratorios. Por ejemplo, las sales de amonio cuaternario se utilizan en la desinfeccin de mesas, bancos, etc. En las grandes instituciones se usa el gas txico xido de etileno para esterilizar materiales termolbiles, tales como ropas y contenedores de plstico. Este gas se aplica en cmaras presurizadas especiales, parecidas a la autoclave.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS: CULTIVO BACTERIANO El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio solido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. Una colonia de bacterias de tamao medio contiene, aproximadamente, 109 clulas individuales, casi tantos individuos como personas pueblan la Tierra. Para aislar clulas individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran numero en que normalmente estn presentes. La dilucin se realiza, normalmente, por uno de los siguientes sistemas: siembra por estra en placa, vertido en placa y extensin en placa.
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El mtodo de siembra por estra en placa Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petr (a las placas Petri

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tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. La colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda seguridad, cultivos axenicos. Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras creceran en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. El crecimiento de los cultivos axnicos Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador desear obtener ms clulas para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, lquido o slido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios slidos se hacen generalmente, aadiendo agar a los lquidos (ver cl recuadro "La despensa de Frau Hesse" en el Captulo 1, para recordar las propiedades especiales del agar). Tipos de medios de cultivo El tipo de medio que utiliza un microbilogo depende del microorganismo que est cultivando y el porqu de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mnimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rpida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composicin y uso.

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Medios definidos Un medio definido es aquel del cual conocemos su composicin qumica exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos qumicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio qumicamente definido, de composicin bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgnica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios qumicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. As, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen ms despacio en ellos. Adems, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse. Medios complejos Se desconoce la composicin qumica exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, casena (la protena de la leche), levaduras o soja. Un medio lquido complejo se denomina caldo. La casena u otras protenas que se aaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio cido, para hacerlas ms solubles y, por tanto, ms fciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrlisis parcial rompe las protenas en pptidos. Una hidrlisis total las degrada hasta aminocidos. A las protenas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosapeptona, la triptona y la triptosa. A la casena totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de casena. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. Tambin existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos especficos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que ms se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilizacion de los medios complejos, ya que son fciles de preparar y permiten un crecimiento rpido de los microorganismos. LA IMPORTANCIA DE SER PURO Todos los microbilogos saben que han de trabajar con cultivos axnicos (puros) para que sus experimentos sean significativos. Pero incluso los microbilogos ms experimentados han cometido errores alguna vez. Esto le sucedi a Ralph Wolfe, uno de los microbilogos americanos ms distinguidos. En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. Este microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir metano (gas natural). Wolfe quera conocer de qu manera M. omelianski produca gas metano a partir de etanol y anhdrido carbnico. El procedimiento estaba claro; tena que lisar la bacteria y aislar las enzimas que catalizan la reaccin, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena bastante simple, haba sido intentado previamente por otros investigadores y todos haban fracasado. Wolfe lo intent durante todo un ao y tampoco tuvo xito. De repente lo consigui: una solucin de enzima. sintetizaba metano en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular, hasta que un colega se pregunt si el cultivo era axnico. Wolfe decidi volver a aislar el culfivo, pero en vez de aadir etanol y anhdrido carbnico al mismo, aadi hidrgeno y anhdrido carbnico. En el nuevo medio se desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhdrido carbnico no crecieron. ¿Qu haba sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba sucediendo. Aunque M. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada cepa S, converta el etanol en hidrgeno gas. La otra, designada cepa M, converta el hidrgeno gas y el anhdrido carbnico en metano. Ninguna de las dos poda crecer sola con etanol y anhdrido carbnico. Todos los experimentos de Wolfe se haban realizado con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar qu enzimas pertenecan a la cepa S y cules a la cepa M. Qu leccin puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los problemas tcnicos (tales como obtener un cultivo axnico), aunque son tan bsicos que se explican en los textos introductorios,

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son reales e importunan a los ms prestigiosos investigadores. Segundo, que incluso un buen microbilogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer juntas (para formar un consorcio) y parecer un cultivo axnico cuando realmente no lo son. MEDOS DE CULTIVO Medios selectivos Un medio selectivo favorece el crecmiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto qumico, como la azida sdca, el telurito potsico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicacin alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comun. Medios diferenciales Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado mieroorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina (Captulo 22), se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hemates. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemolisis (muerte y lisis de los hemates). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metablicos cidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Ingredientes de un medio definido para el cultivo de Escherichia coli. Ingrediente Cantidad Comentarios KH2PO4 3,6 g Acta como fuente de fosfato y como tampn (NH4)2S04 2,0 g Fuente de nitrgeno y azufre CaCl2 0,01 g Fuente de calcio, no se requiere cloruro FeSO 7 H2O 0,0005 g Fuente de hierro MgSO4 7 H2O 0,02 g Fuente de magnesio. Como este compuesto es relativamente impuro tambin sirve como fuente de elementos traza Glucosa 1,0 g Fuente de carbono Agua destilada 1000 ml Agar 15 g Se aade si se desea solidificar el medio Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entricas (del intestino) que causan disenteras (Captulo 23). Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio est plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey acta como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificacin. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aqu, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacteras s lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias sern rojas, mientras que las restantes no lo seran.

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Ingredientes del caldo nutritivo, un medio complejo adecuado para el cultivo de muchas especies de bacterias Ingrediente Peptona Extracto de carne NaCl Agua destilada Cantidad 5g 3g 8g 1000 mL Comentarios Casena parcialmente ludrolizada por tripaina Concentrado desecado de un extracto de carne en agua caliente Aliadido como osmorregulador

Condiciones ambientales idneas para el cultivo en el laboratorio Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambin es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, segn el caso, ser aportado o eliminado. Temperatura Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento ptimo (Captulo 8). Pero, en general, los microorganismos crecen mas rpidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se daan las protenas (Capitulo 2). As pues, para favorecer un crecimiento rpido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura ms alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que ms frecuentemente se utiliza en investigacin (Captulo 5), se encuentra en el intestino humano y de otros mamferos. Este microorganismo crece ptimamente a 37 oC, la temperatura del cuerpo humano. Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadoras o en baos de agua, ambos controlados termostticamente. Los incubadoras, o estufas, son cmaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos slidos como lquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petr, tubos de ensayo, o matraces. Los medios lquidos, distribuidos en tubos o matraces, tambin pueden ser incubados en baos de agua caliente. Estos baos resultan cmodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo.

Medio diferencial. Streptococcos pyogenes se diferencia de otras bacterias porque en agar sangre lisa los hemates creando una zona clara alrededor de cada colonia.
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pH El pH ptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH prximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0. Aunque el pH de un

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medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algn componente cido o bsico del medio; o bien, porque algn producto de su metabolismo es un cido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones (Captulo 2). En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actan como tampones dbiles. Los tampones ms eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato clcico. Ambos se aaden normalmente como nutrientes (fuente de fsforo y calcio); pero si se desea que acten como tampones se precisarn cantidades mayores. Oxgeno La concentracin de oxgeno del medio es un determinante crtico para el crecimiento bacteriano (Captulo 8). Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxgeno porque lo necesitan para obtener energa. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxgeno, para ellos es un agente txico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxgeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si disponen de l, pero tambin pueden crecer sin l. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxgeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerfilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxgeno; las altas tensiones, como las que existen en el are son txicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendr que suministrar, restringir o eliminar el oxgeno. Suministrar oxgeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen ms rpidamente en su presencia, representa una dificultad tcnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxgeno de la atmsfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios lquidos es ms dificil, porque no existe demasiado oxgeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rpidamente. Todos los cultivos lquidos con ms de uno o dos centmetros de profunditad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a travs del cultivo o agitndolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiologa existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotacin o a una agitacin de vaivn, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxgeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibiticos, es un desafio para la ingeniera. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a travs de ellos enormes cantidades de aire. La exclusin del oxgeno del ambiente de los anaerobios tambin plantea problemas tcnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxgeno, s el medio contiene un compuesto qumico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxgeno. Los anaerobios tambin pueden cultivarse en placas Petr, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se hava eliminado totalmente el oxgeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrgeno o argn. Tambin se puede llevar a cabo una eliminacin qumica del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrgeno cuando se les aade agua; el hidrgeno reacciona con el oxgeno en presencia de un catalizador; la reaccion consume el oxgeno produciendo agua. Un mtodo muy sencillo para dismnuir la concentracin de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhidrido carbnico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo hermticamente; la vela consumir oxgeno hasta que se extinga. Esta tcnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del cido lctico. Tambin ha sido utilizada para microacrfilos, especialmente cuando el dixido de carbono les favorece. Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposicin al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal hermticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para
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aadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrgeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren tcnicas ms elaboradas. Es frecuente el uso de cmaras libres de oxgeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxgeno, donde los tcnicos trabajan con mscaras de oxgeno.

El oxgeno debe ser suministrado, eliminado o restringido dependiendo de los requerimientos de los microorganismos. Para los microaerfilos (que requieren bajas tensiones de oxgeno) y para los anaerobios aerotolerantes (que pueden crecer en presencia de oxgeno o en su ausencia) se utilizan recipientes cerrados con una vela en su interior. Conservacin de los cultivos axnicos Una vez que se obtiene un cultivo axnico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con l o intercambiarlo con otros cientficos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro tambin puede mantenerse viable durante aos sin hacerlo crecer peridicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de coleccin. Muchos laboratorios poseen una coleccin dc cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un nmero enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbilogos. Existen muchas tcnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecacin (eliminacin del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Los cultivos generalmente se desecan por liofilizacin (congelacin y desecacin). El mtodo consiste en lo siguiente: el cultivo lquido se vierte en un pequeo vial o ampolla de vidrio y se aade leche descremada para proteger las clulas durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vacio para su sublimacin (eliminacin del agua congelada). Durante el proceso de sublimacin las clulas permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras an se mantiene el vaco. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrgeno lquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. Microorganismos que no pueden ser cultivados en el laboratorio Muchas especies bacterianas no se pueden cultivar en un medio artificial. De hecho, se cree que slo una mnima cantidad de las especies que existen en la naturaleza, pueden cultivarse en el laboratorio. Se pueden tomar muestras de suelo y contar el nmero de microorganismos con la ayuda de un microscopio. Si posteriormente se cultivan esas muestras, crecern menos de la mitad de los organismos observados, independientemente de la tcnica que se utilice.

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Algunas de las bacterias que causan enfermedades extremadamente serias no han podido cultivarse en medios de laboratorio pero puede hacerse en animales de experimentacin. Por ejemplo, Treponema pallidum, causante de la sfilis, enfermedad de transmisin sexual, se cultiva en conejos (Captulo 24); Micobacterium leprae, agente causal de la enfermedad de Hansen (lepra), se inocula en armadillos (Capitulo 26). Las riquetsias y clamidias y todos los virus requieren ser cultivados en sus clulas hospedadoras vivas, ya que son parsitos intracelulares obligados. Adems de animales vivos, tambin pueden utilizarse cultivos de tejidos, cultivos de clulas animales. Con muy pocas excepciones, los microorganismos que no han podido cultivarse en el laboratorio, no han sido identificados. No sabemos cuntos de estos misteriosos seres existen o qu importancia puedan tener. Es de esperar, sin embargo, que con los modernos avances de la ingeniera gentica, seamos capaces de identificar e incluso clasificar estos microorganismos en especies simplemente obteniendo pequeos fragmentos de sus genes. Cuando esto suceda, ser posible el estudio de los microorganismos sin necesidad de cultivarlos.

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TCNICAS DE CULTIVO

TCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Y TCNICA DE SIEMBRA POR DIFUSIN EN PLACA.
Con un asa bacteriolgica, se pasa una porcin de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho basado en agar y se siembra en el medio ya sea por estra o por difusin. Para sembrar por difusin en placa, por lo comn se usa una varilla de cristal estril para esparcir la muestra. Esta operacin hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Cuando se raya adecuadamente agar con el asa de siembras, las clulas bacterianas quedan lo suficientemente separadas en algunas reas de la placa lo que permite estar seguro que las colonias que se desarrollan a partir de una clula no se junte con la que se est desarrollndose a partir de otra clula. Cada colonia aislada es la descendencia de una sola clula y, por tanto, un cultivo puro. En las especies donde las clulas se agrupan de forma caracterstica, la colonia se desarrolla a partir de un grupo de clulas del mismo tipo e igualmente representa un cultivo puro. Una porcin de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro. Las tcnicas de siembra en placa por estras o por difusin se puede hacer convencionalmente y con equipo mnimo; stos son procedimientos de rutina que se efectan para aislar bacteria en cultivo puro. Una de sus limitaciones es que slo pequeas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas sobre la superficie del medio del cultivo.

TCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA

Para obtener un cultivo axnico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero, (b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas. (e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.

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RESULTADOS

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Medio de cultivo: Lectura de colonia: color, dimetro (mm), elevacin, superficie, borde.

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MTODO DE VERTIDO EN PLACA. Para obtener un cultivo axnico mediante este mtodo, (a) hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener una muestra con slo unos pocos cientos de bacterias, (b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. (c) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms pequeas) y en su superficie (ms grandes).

RESULTADOS 1ra dilucin 2da dilucin 3ra dilucin

N colonias

N colonias

N colonias
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Numeracin final:..

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