Jos Mara Obn de Castro Dpto.

Ingeniera Qumica y Ambiental Universidad Politcnica de Cartagena

Anlisis microbiolgico del agua

Anlisis microbiolgico del agua

Se puede definir el anlisis microbiolgico como el conjunto de operaciones encaminadas a determinar los microorganismos presentes en una muestra problema de AGUA.

E. coli

Proteus vulgaris

Factores que inciden en la flora bacteriana

La acidez disminuye el contenido de microorganismos. La materia orgnica lo aumenta. Mucho oxgeno disuelto disminuye los microorganismos anaerobios. Las sales, si son abundantes, producen que el agua sea casi estril. Si existe poca cantidad de sales se estimula el desarrollo bacteriano. La filtracin disminuye el nmero de microorganismos. La temperatura puede aumentar o disminuir el contenido bacteriano. La turbidez hace que el contenido bacteriano pueda aumentar, ya que los rayos U.V. no manifiestan su accin. Los protozoos fagocitan bacterias y as disminuyen el nmero de estas.

Anlisis microbiolgico del agua

El inters se centra en los microorganismos patgenos, que son los diferentes tipos de bacterias, virus, protozoos y otros organismos, que transmiten enfermedades.
Enfermedad Origen bacteriano Fiebres tifoideas y Salmonella typhi, paratifoideas Salmonella Agente
Bacterias

Paratyphi A y B

Disentera bacilar Shigella Clera Vibrio cholerae Gastroenteritis agudas Escherichia coli ET y diarreas Campylobacter Yersinia enterocolitica Salmonella sp Shigella sp

Anlisis microbiolgico del agua

Origen viral Hepatitis A y E Virus de la hepatitis A y E Poliomielitis Virus de la polio Gastroenteritis agudas Virus Nortwalk, Rotavirus, y diarreas Astrovirus, Calicivirus, Enterovirus, Adenovirus, Reovirus Origen parasitario Disentera amebiana Entamoeba histolytica
Entamoeba Virus de la hepatitis

Giardia lambia Cristosporidium

En los pases en vas de desarrollo las enfermedades producidas por estos patgenos son uno de los motivos ms importantes de muerte prematura, sobre todo de nios. Normalmente estos microbios llegan al agua en las heces y otros restos orgnicos que producen las personas infectadas.

Anlisis microbiolgico del agua

Al hacer el anlisis de las aguas no buscamos tal o cual microorganismo patgeno, es decir, no aislamos o identificamos los microorganismos patgenos del agua, sino que averiguamos si esta tiene o no contaminacin de origen fecal.
Criterio sanitario para un agua de consumo humano (Real Decreto 140/2003)
Anexo I. Caractersticas microbiolgicas

*) Cuando la determinacin de Clostridium sea positiva y exista una turbidez mayor 5 UNF se determinarn, en la salida de ETAP o depsito, si la autoridad sanitaria lo considera oportuno, Cryptosporidium u otros microorganismos o parsitos.

Anlisis microbiolgico del agua

Mtodos de anlisis: 1. Bacterias coliformes y Escherichia coli (E. coli): UNE EN ISO 9308-1:2000. 2. Enterococos: UNE EN ISO 7899-2:2001. 3. Clostridium perfringens (incluidas las esporas) 4. Enumeracin de microorganismos cultivables-Recuento de colonias a 22 C: UNE EN ISO 6222:1999. Otros tests complementarios: Salmonelas Estafilococos patgenos Bacterifagos fecales Enterovirus Protozoos Animlculos (gusanos-larvas), Invertebrados bnticos

Toma de muestras para anlisis microbiolgico

Las muestras que se tomarn para el anlisis deben ser representativas para poder determinar as su calidad microbiolgica. Hay normas para la toma de muestras de aguas segn sus distintas procedencias (grifos, pozos, depsitos, lagos, ros, manantiales, etc.). Para su recogida debe utilizarse frascos estriles y debe recolectarse cantidades comprendidas entre 500 y 1000 ml. En todos los casos los envases se llenarn por completo para excluir el aire. Cuando se estime probable que el agua a analizar contenga trazas de cloro, cloramina u ozono, ser necesario neutralizar su efecto bactericida en el momento del muestreo. Para ello se aadir una cantidad suficiente de tiosulfato sdico. Para un volumen de 250 ml son suficientes 0,2 ml de una solucin acuosa al 3% de tiosulfato sdico. Su anlisis debe comenzar antes de que hayan transcurrido 6 h desde

el momento de la toma de muestras. En circunstancias excepcionales, las muestras pueden conservarse a una temperatura de 4C durante un periodo mximo de 24 h antes de su anlisis.

Anlisis microbiolgico: Bacterias coliformes

1. FUNDAMENTO Los coliformes reagrupan ciertas especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, de morfologa bacilar, Gram negativas, aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa negativa, no esporuladas y que fermentan la lactosa con produccin de cido a 37C en 24-48 horas. Del grupo coliformes forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter. - Escherichia coli produce dolor abdominal, diarrea, nauseas, vmitos y fiebre. - Klebsiella produce enfermedades respiratorias. - Citrobacter produce alteraciones a nivel del colon y a nivel intestinal.

Anlisis microbiolgico: Bacterias coliformes

2. MTODO El mtodo consiste en desarrollar solo una prueba presuntiva en el que una reaccin negativa excluye la presencia del grupo coliforme. 3. PROCEDIMIENTO. Inocular caldo de peptona con diluciones decimales de la muestra de agua, expresados en 10-1, 10-2, 10-3. Inocular 3 tubos de lactosa bilis verde brillante (a los que se les aade un tubo de Durham invertido) con 1 ml de cada dilucin. Incubar a 37C (+/-1C) durante 24 48h. 4. LECTURA E INTERPRETACIN. Si se observa crecimiento bacteriano con produccin de gas las 24h o antes, la presencia de bacterias coliformes fecales se considerar confirmada, prosiguiendo con el mtodo del filtro de membrana para conteo.

Anlisis microbiolgico: Coliformes fecales

Mtodo de filtracin de membrana. (UNE EN ISO 9308-1:2000) 1. FUNDAMENTO Las bacterias coliformes de origen fecal son aquellas comprendidas en el grupo anterior (coliformes totales), que adems son capaces de fermentar la lactosa, con produccin de cido y de gas a 44C, en un tiempo mximo de 24h. 2. MTODO El mtodo consiste en la determinacin del n de coliformes mediante filtracin de volmenes determinados del agua a analizar por filtros de membrana e incubacin sobre medio de lactosa enriquecido (agar de lactosa TTC con heptadecilsulfato de sodio) y una temperatura de 44,5C (+/-0,2C). 3. TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO. Se utiliza la muestra de agua tomada para el anlisis de coliformes totales que se encontraba guardada en frigorfico a 4C.

Anlisis microbiolgico: Coliformes fecales

4. PROCEDIMIENTO Colocar un filtro de membrana estril sobre el soporte de filtracin. Adaptar el embudo y conectar el matraz a una bomba elctrica de vaco. Filtrar 100 ml de muestra si se trata de agua potable, y 0,1 y 1 ml si se trata de aguas no potables, previamente homogeneizadas. Lavar con unos 30 ml de agua destilada. Retirar el embudo. Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante sobre el medio de cultivo contenido en una placa de Petri, de modo que la superficie de filtracin quede hacia arriba. Cerrar e invertir la placa e incubar a 44C (+/-1C ) durante 24h ( +/-2h ). 5. LECTURA E INTERPRETACION La lectura de los resultados requiere el examen de las colonias aparecidas sobre la membrana y el examen de los halos en la capa de agar subyacente a la membrana. La fermentacin de la lactosa provoca la formacin de un halo amarillo. Por ello se considera coliformes aquellas colonias que presentan halo amarillo, halo amarillo con centro naranja (Escherichia y Citrobacter), o halo amarillo con centro rojo ladrillo (Klebsiella y Enterobacter). La densidad se estima como el total de coliformes totales por 100ml, utilizando aquellos filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no ms de 200.

Anlisis microbiolgico: Enterococos fecales

(Norma UNE-EN ISO 7899-2: 2001) 1. FUNDAMENTO Los enterococos pueden considerarse como indicadores de contaminacin fecal. Sin embargo, algunos enterococos presentes en las aguas pueden proceder de otros hbitats. Se pueden detectar y cuantificar las especies: Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans y E. hirae. Adems, pueden determinarse ocasionalmente otras especies de Enterococcus y algunas especies de Streptococcus (en particular S. bovis y S. equinus). Estas especies de Streptococcus no tienen una supervivencia larga en agua y probablemente no puedan determinarse cuantitativamente. Como enterococos intestinales se consideran aquellos microorganismos capaces de reducir el cloruro de 2,3,5trifeniltetrazolio (TTC) y de hidrolizar la esculina en las condiciones y sobre unos medios especificos. 2. MTODO Se utiliza para la determinacin del nmero de enterococos intestinales mediante filtracin de un volumen determinado del agua a analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Anlisis microbiolgico: Enterococos fecales

3. PROCEDIMIENTO Se filtran 100 ml del agua a analizar previamente homogeneizada. Se coloca el filtro de membrana sobre el medio de Slanetz y Bartley y se incuban las placas a 37C durante 48 h. 4. LECTURA E INTERPRETACIN Tras la incubacin, se consideran como colonias tpicas de enterococos todas las que muestren un color rojo, marrn o rosado, en el centro o en toda la colonia, consecuencia de la reduccin del TTC (incoloro) a trifenilformazn (rojo).
NOTA: Aunque no est incluido en la Normativa se realizar una tincin de Gram de una de las colonias positivas. Si hay colonias tpicas se realizar un ensayo confirmativo. Para ello, con ayuda de unas pinzas estriles, se transfiere el filtro de membrana con las colonias, sin invertirla, sobre una placa con agar bilis-esculinaazida, precalentada a 44C. Se incuba a 44C durante 2 h y se lee la placa inmediatamente. En este medio, los enterococos hidrolizan la esculina dando origen a esculetina (6,7-dihidrocumarina) que se combina con los iones Fe3+ formando un compuesto de color marrn a negro. Por tanto, se considera que todas las colonias tpicas que muestren un color de marrn a negro, en el medio circundante, dan reaccin positiva y se cuentan como enterococos.

Anlisis microbiolgico: Clostridium perfringens

1.FUNDAMENTO Los bacterias incluidas en el gnero Clostridium tienen morfologa bacilar, son Gram positivas, anaerobias estrictas y capaces de formar esporas. La especie C. perfringens est normalmente presente en heces. Sus esporas son resistentes al calor, a los procesos de desinfeccin y a los tratamientos de depuracin habituales de las aguas (cloracin), por lo que su supervivencia en agua es mayor. La diferenciacin de C. perfringens de otras especies de Clostridium, se basa en su capacidad de fermentar la sacarosa con produccin de cido, en su incapacidad de fermentar la celobiosa (debido a la ausencia de -D-glucosidasa) y en la produccin de fosfatasa cida. 2. MTODO Se utiliza de mtodo de filtracin para la determinacin del nmero de C. perfringens mediante filtracin de un volumen determinado del agua a analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

(incluidas esporas)

Anlisis microbiolgico: Clostridium perfringens

(incluidas esporas)
3. PROCEDIMIENTO Siguiendo el mtodo de filtracin, se filtran 100 ml del agua a analizar, previamente homogeneizado. Se coloca el filtro de membrana sobre el medio de m-CP y se incuban las placas a 44C durante 24 h en condiciones de anaerobiosis. 4. LECTURA E INTERPRETACIN Tras la incubacin, se consideran como colonias tpicas de C. perfringens todas las que muestren un color amarillo opaco, consecuencia de la acidificacin del medio tras la fermentacin de la sacarosa, y que cambien a color rosa o rojo al cabo de 20 a 30 segundos de exposicin a vapores de hidrxido amnico. En general, el resto de las especies de Clostridium aparecen de color azul-verdoso si, adems de fermentar la sacarosa, son -D-glucosidasa positivas (hidrolizan el indoxil--D-glucsido) o de color prpura si no fermentan la sacarosa. NOTA: Aunque no est incluido en la Normativa se realizar una tincin de Gram de una de las colonias positivas para observar al microscopio.

Anlisis microbiolgico: Bacterias aerobias

UNE EN ISO 6222:1999 1. FUNDAMENTO Las bacterias aerobias son todas las bacterias hetertrofas, aerobias o anaerobias facultativas, mesfilas y psicotrficas capaces de crecer en un medio de agar nutritivo. Este recuento de colonias es til para evaluar el estado de los recursos de agua en su origen y la eficacia del proceso de tratamiento de las aguas destinadas al consumo humano e indica la limpieza y el estado de los sistemas de distribucin. De igual modo, permite detectar cambios anmalos en el nmero de microorganismos en la red de distribucin. As, todo aumento repentino del nmero obtenido puede advertir de la existencia de un foco de contaminacin y requerira su inmediata investigacin. 2. MTODO Este mtodo se basa en contar el n de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo slido, en el que se ha sembrado un volumen conocido de agua muestra, transcurrido un tiempo y una temperatura de incubacin determinados.

Anlisis microbiolgico: Bacterias aerobias

3. PROCEDIMIENTO Preparar 3 tubos con 9 ml de agua peptonada cada uno. Inocular el caldo de peptona con diluciones decimales de la muestra de agua problema expresados en 10-1, 10-2, 10-3. De cada dilucin depositar 1 ml en cada placa de Petri. Verter 30 ml de medio de cultivo de agar en cada placa y dejar solidificar (5-10min), invertir las placas y meterlas en la estufa a 37C (+/-1C), incubar durante 48h. Tambin se emplean placas con medio agar extracto de levadura en las que se siembra un volumen conocido de agua, y la incubacin se lleva a cabo a 22C durante 72 horas. 4. LECTURA Y EXPRESIN DE RESULTADOS Transcurridos 48h (+/-3h) contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. El resultado se expresar, como n de bacterias totales en 1 ml. Se estima utilizando aquellos filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no ms de 200.

Aerobios totales: diluciones

10-2 10-3 10-4 10-5

Plate 1

Plate 2

Otras determinaciones
Rara vez se hacen otras determinaciones microbiolgicas. As, cuando la determinacin de C. perfringens sea positiva y exista una turbidez mayor a 5 UNF (Unidad Nefelomtrica de Formacina) se determinarn, si la autoridad sanitaria lo considera oportuno, Cryptosporidium u otros microorganismos o parsitos. De igual modo, slo en el caso de un brote epidmico se lleva a efecto la investigacin de microorganismos transmitidos a travs del agua: Salmonelas, Shigella, Vibrio cholerae Estafilococos patgenos Bacterifagos fecales Enterovirus Protozoos Animlculos (gusanos-larvas)

Parmetros de la calidad microbiolgica del agua

Depende del uso que se le:
- Uso domstico o potable Para aguas potables nos guiaremos por la Reglamentacin Tcnico-sanitaria para aguas potables de consumo pblico (Real Decreto 140/2003) o la Directiva comunitaria 75/440/CEE. - Acuicultura (peces, crustceos,...) y otros usos (envasada, medicinales, para bao, industria alimentaria, aplicaciones biolgicas, anlisis qumicos,...) Hay reglamentaciones especficas en todos los casos. Por ejemplo para bao y usos recreativos se sigue la Directiva comunitaria 76/160/CEE, y para piscicultura la 78/659/CEE.

Parmetros de la calidad microbiolgica del agua

- Depurada para vertido Para aguas residuales, por ende vertido, seguiremos la reglamentacin europea en sus diferentes directivas, segn se trate de vertidos a aguas subterrneas (D. 80/68/CEE), o a litorales o aguas continentales (D. 76/464/CEE), o la Normativa espaola dada por la Ley de Aguas R.D. 849/86 y de Costas (R.D. 1471/89).

A modo orientativo un agua residual urbana puede llegar a contener 108 coliformes totales/100 ml.

Borrador de Real Decreto que establece la reutilizacin de las aguas depuradas

Uso 1. USOS URBANOS
1.1. Residenciales: Riego de jardines, descarga de aparatos sanitarios, sistemas de calefaccin y refrigeracin de aire y otros usos domsticos. 1.2. Servicios urbanos: Riego de zonas verdes urbanas (parques, campos deportivos,); baldeo de calles; sistemas contra incendios; fuentes y lminas ornamentales. Lavado industrial de vehculos. < 1 huevo/10 L 0 ufc /100 mL

Nematodos intestinales

Escherichia coli

Otros

Legionella spp.

(si aerosoles) < 1000 ufc/L

< 1 huevo/10 L

< 200 ufc/100 mL

Legionella spp.

(si aerosoles) < 1000 ufc/L

2. USOS AGRCOLAS
2.1. Cultivos de Invernadero. Riego de cultivos para consumo en crudo. Frutales regados por aspersin. 2.2. Riego de pastos para consumo de animales productores de leche o carne. Riego de cultivos destinados a industrias conserveras y productos que no se consuman crudos. Riego de frutales excepto por aspersin. Acuicultura 2.3. Riego de cultivos industriales, viveros, forrajes ensilados, cereales, semillas oleaginosas y cultivo de flores ornamentales excepto por aspersin <1 huevo/10 L < 200 ufc/100 mL

Legionella spp.

(si aerosoles) < 1000 ufc/L

<1 huevo/1L

<1.000 ufc/100 mL

Taenia saginata y T. Solium

No se fija lmite

<1 huevo/1L

<10.000 ufc/100 mL

No se fija lmite

- Taxativamente prohibido el uso de agua regenerada para el cultivo de moluscos filtradores en Acuicultura

Borrador de Real Decreto que establece la reutilizacin de las aguas depuradas

Uso 3. USOS INDUSTRIALES
3.1. Refrigeracin Industrial. - Queda prohibida la reutilizacin de aguas depuradas en los circuitos de refrigeracin industrial de la industria alimentaria y similares. No se fija lmite <10.000 ufc/100 mL

Nematodos intestinales

Escherichia coli

Otros

Legionella spp
<100 ufc/L

4. USOS AMBIENTALES Y RECREATIVOS

4.1. Riego de campos de golf 4.2. Estanques, lminas de agua, fuentes y caudales circulantes de uso recreativo en los que no est impedido el acceso del pblico al agua (excepto bao). 4.3. Estanques, lminas de agua y caudales circulantes ornamentales, en los que est impedido el acceso del pblico al agua. 4.4. Riego de bosques, zonas verdes y de otro tipo no accesibles al pblico. Silvicultura. <1 huevo/10 L <1 huevo/10 L < 200 ufc/100 mL < 200 ufc/100 mL No se fija lmite

No se fija lmite

<10.000 ufc/100 mL

No se fija lmite

No se fija lmite

No se fija lmite

No se fija lmite

5. RECARGA DE ACUFEROS
5.1. Recarga de acuferos por percolacin localizada a travs del terreno 5.2. Recarga de acuferos por inyeccin directa No se fija lmite < 1 huevo/10 L < 1.000 ufc/100 mL 0 ufc/100 mL No se fija lmite

USOS ESTABLECIDOS: 1. Los usos establecidos no sern los nicos posibles ni permitidos para el agua regenerada, cualquier nuevo uso no contemplado en la normativa bsica deber ser objeto de una regulacin particular por la autoridad concedente del mismo. 2. Los criterios de calidad indicados para cada uno de los usos establecidos deben ser considerados como mnimos exigibles para la reutilizacin, pudiendo las autoridades competentes hacerlos ms estrictos en las concesiones de agua si lo consideran conveniente. 3. Dentro de la categora de los Nemtodos intestinales, se considerarn los gneros siguientes: Ancylostoma, Trichuris, Ascaris. 4. Se permite la reutilizacin de agua depurada para usos domiciliarios, con excepcin del consumo humano que queda taxativamente prohibido, excepto en situaciones catastrficas o de emergencia. Dado el riesgo que comporta este uso, las autoridades debern prestar una atencin especial a la autorizacin de este tipo de concesin, adems de asegurar un control estricto de las condiciones de reutilizacin exigidas.