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    Pruebas Bioquimicas para Enterobacterias

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    Raissa Lorena Heredia
    El documento describe 5 pruebas bioquímicas para identificar enterobacterias: 1) Prueba del TSI para determinar la fermentación de azúcares y producción de H2S. 2) Prueba del LIA para determinar la descarboxilación/desaminación de lisina y producción de H2S. 3) Prueba del citrato para determinar la utilización del citrato. 4) Prueba de la urea para determinar la hidrólisis de la urea. 5) Prueba del SIM para determinar la producción de indol y H2S así

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    El documento describe 5 pruebas bioquímicas para identificar enterobacterias: 1) Prueba del TSI para determinar la fermentación de azúcares y producción de H2S. 2) Prueba del LIA para determinar la descarboxilación/desaminación de lisina y producción de H2S. 3) Prueba del citrato para determinar la utilización del citrato. 4) Prueba de la urea para determinar la hidrólisis de la urea. 5) Prueba del SIM para determinar la producción de indol y H2S así

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    Pruebas Bioquimicas Para Enterobacterias

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    El documento describe 5 pruebas bioquímicas para identificar enterobacterias: 1) Prueba del TSI para determinar la fermentación de azúcares y producción de H2S. 2) Prueba del LIA para determinar la descarboxilación/desaminación de lisina y producción de H2S. 3) Prueba del citrato para determinar la utilización del citrato. 4) Prueba de la urea para determinar la hidrólisis de la urea. 5) Prueba del SIM para determinar la producción de indol y H2S así

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    El documento describe 5 pruebas bioquímicas para identificar enterobacterias: 1) Prueba del TSI para determinar la fermentación de azúcares y producción de H2S. 2) Prueba del LIA para determinar la descarboxilación/desaminación de lisina y producción de H2S. 3) Prueba del citrato para determinar la utilización del citrato. 4) Prueba de la urea para determinar la hidrólisis de la urea. 5) Prueba del SIM para determinar la producción de indol y H2S así

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    PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

    1.

    TSI.- AGAR CON AZUCAR TRIPLE Y HIERRO a. Objetivo

    Determinar la capacidad de un microorganismo fermentar la glucosa, lactosa y sacarosa, con produccin de gas o sin ella y la produccin de acido sulfihidrico (H2S). b. Rojo Fenol: Alcalino: Rojo Acido: Amarillo Medio sin sembrar: naranja-rojizo c. Fundamento Indicador

    En este medio, el extracto de carne y pluripeptona aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. Los hidratos de carbono fermentables son: glucosa (0.1%), lactosa (1%) y sacarosa (1%). El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de H2S y el sulfato de hierro y amonio es el indicador de H2S. El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada expuesta en toda su superficial oxigeno es aerobia y la porcin inferior est protegida del aire es la anaerobia. La fermentacin tiene lugar tanto en anaerobiosis como en anaerobiosis. En el pico de flauta, el monosacridos glucosa es catabolizado por la va metablica Embed-Meyerhof-Parnas para producir es acido piruvico. El acido piruvico es degradado luego a travs del ciclo de Krebs, para rendir C0 2, H2O y energa. En el fondo existen condiciones anaerobias de forma que la glucosa se metaboliza por la va de Embed-Meyerhof-Parnas a ATP y acido piruvico que luego se convierte en acido lctico y otros cidos orgnicos. Fermentacin solo de glucosa: El pico de flauta es rojo (alcalino) porque al principio se degrada aerobicamente la glucosa pero debido a su baja concentracin se agota y el microorganismo empieza a usar las peptonas liberando Amoniaco y alcalinizando el medio. Sin embargo, el fondo es amarillo debido a la fermentacin de la glucosa por la va metablica Embed-Meyerhof-Parnas que da productos finales cidos, esta reaccin acida se mantienen en el fondo debido a la baja concentracin de O2. Fermentacin Lactosa, Sacarosa: la sacarosa y lactosa se degradan aerobicamente, lo que produce un medio acido (amarillo) en el pico, esta reaccin se mantiene por la alta concentracin de lactosa y sacarosa. La lactosa es degradadada a glucosa por la enzima - galactosidasa. La sacarosa mediante la enzima sacarosa sintasa o invertasa da lugar a la glucosa.

    Ausencia de fermentacin: los microorganismo incapaces de fermentar la glucosa, lactosa ni sacarosa, degradan aerobia y anaerbicamente la peptona lo que alcaliniza el medio. Formacin de H2S: el tiosulfato de sodio es el sustrato que en medio acido forma H 2S, el cual se combina con los iones frricos (Fe+3) y da lugar al sulfuro de hierro (negro).

    Formacin de gas: Se debe a la degradacin aerobia y anaerobia de la glucosa por va metablica Embed-Meyerhof-Parnas dando lugar al acido piruvico, el cual por el ciclo de Krebs va a rendir C02. d. Reacciones

    Fermentacin de Glucosa Pico Peptonas Fondo Glucosa E-M-P / Aerobio Ac. Orgnicos (Acido) Aerobico NH3 (Alcalino)

    Fermentacin de Lactosa, sacarosa y glucosa Pico Lactosa -galactosidasa / aerobia Acidos

    Sacarosa Fondo Glucosa Ausencia Fermentacin Pico/fondo Peptona Formacin H2S Tiosulfato de sodio

    Sacarosa invertasa /Aerobico

    Acidos

    E-M-P Aerobico

    Ac. Orgnicos (Acido)

    Aerobio/anaerobio

    NH3

    Medio Acido

    H2S + Fe+3

    Sulfuro Ferroso (Precipitado)

    e.

    Lectura GLU (+), LAC (-), SAC (-)

    Pico Alcalino (rojo) /Fondo Acido (amarillo)

    2.

    Pico Acido (amarillo) / Fondo Acido (amarillo) GLU (+), LAC (+), SAC (+) Pico Alcalino (rojo) / Fondo Alcalino (rojo) GLU (-), LAC (-), SAC (-) Ennegrecimiento H2S (+) Burbuja GAS (+) LIA ( AGAR CON LISINA Y HIERRO) a. Objetivo

    Determinar la capacidad enzimtica de un microorganismo de descarboxilizar/desaminar la lisina y la capacidad de producir H2S. b. Indicador

    Purpura de Bromocresol Acido: Amarillo Alcalino: Purpura Medio sin sembrar: purpura c. Fundamento

    En este medio, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo de la bacteria. La glucosa es el nico hidrato de carbono fermentable. La lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de la enzima descarboxilasa o desaminasa. El tiosulfato es el sustrato para la produccin de H2S y el citrato de hierro y amonio es el revelador. La descarboxilacion de la lisina tiene lugar en medio acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada acidificando el medio; el aminocido lisina es descarboxilado por la accin de la enzima lisina descarboxilasa para formar una diamina denominada Cadaverina y CO2, que alcaliniza el medio (purpura). En cambio la desaminacion de la lisina produce un acido ceto-carbonico, el cual con la sal de hierro y bajo la influencia del oxigeno forma un color rojo en la superficie. Para la formacin de H2S, el tiosulfato de sodio en medio acido produce H2S, el cual se combina con los iones frricos (Fe+3) del citrato de hierro y amonio para producir u n precipitado negro de sulfuro de hierro. Los microorganismo que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs. de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de peptonas, y el fondo amarillo. d. Descarboxilacion 1. Glucosa E-M-P Medio Acido Reacciones

    2. Lisina

    Lisina Descarboxilasa / H+

    Cadaverina (Alcalino)

    Desaminacion 1. Glucosa E-M-P Medio Acido

    2. Lisina Produccin H2S Tiosulfato de sodio H+

    Lisina Desaminasa / H+

    Acido ceto-carbonico

    H2S + Fe+3

    Sulfuro Ferroso (Precipitado negro)

    3.

    e. Lectura Descarboxilacion lisina o Positivo Pico Alcalino (purpura) / Fondo Alcalino (purpura) o Negativo Pico Alcalino (purpura) / Fondo Acido (Amarillo) Desaminacion lisina Pico Rojizo / Fondo Amarillo Produccin H2S Ennegrecimiento CITRATO a. Objetivo

    Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y energa, como alcalinidad resultante. b. Indicador

    Azul de Bromotimol Acido: amarillo (no observado) Alcalino: Azul de Prusia oscuro Medio no Inoculado: verde c. Fundamento

    En el medio, el fosfato de amonio es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono/ el magnesio es el co-factor enzimtico. El metabolismo del citrato se realiza en presencia de la enzima citrasa o citrato permeasa a travs de la va metablica del acido tricarboxilico, la citrasa para actuar necesita un catin divalente (Mg 2+). El desdoblamiento del citrato da lugar, progresivamente, oxalacetato y piruvato. El piruvato en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos carbnicos que al ser utilizados como fuente de carbono producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El microorganismo que puede utilizar el citrato como nica fuente de carbono, tambin utiliza las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. El fosfato de amonio es degradado a amoniaco lo que alcaliniza ms el medio al producir hidrxido de amonio.

    d. 1.

    Reacciones Citrasa /Mg+2 Oxacelato Piruvato + CO2

    Citrato

    Piruvato

    OH-

    Ac. Carbonico (energia) Acetato + format (Alcalino)

    Ac. Carbonicos 2.

    Fosfato de amonio

    NH3+

    NH4OH (Aumenta alcalinidad)

    4.

    e. Lectura Positivo Crecimiento y azul Negativo El medio permanece verde UREA a.

    Objetivo

    Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea por la accin de la enzima ureasa. b. Rojo Fenol Acido: Amarillo Alcalino: Rojo Medio sin siembra: Naranja-rojizo c. Fundamento Indicador

    En este medio, el extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y aporta los nutrientes especiales para el desarrollo bacteriano, las sales de fosfato constituyen el sistema buffer y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. El sustrato urea es una diamida del acido carbnico. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa pueden utilizar el nitrgeno proveniente de la urea, la hidrolizan liberando dos molculas de amoniaco y CO 2. Estos productos alcalinizan el medio. d. Reacciones Urea + 2 H2O e. Lectura Positivo Rosado Negativo Amarillo Ureasa CO2 + 2 NH3

    5.

    SIM a. Objetivo

    En el agar SIM, se determina la capacidad de un microorganismo de moverse, producir indol y H 2S. b. Revelador

    Reactivo de Kovacs (para indol) c. Fundamento

    El triptfano es un aminocido que puede ser hidrolizado por las bacterias que poseen un sistema de enzimas denominada Triptofanasa para formar indol, acido piruvico y amoniaco. El indol producido se combina con el p-dimetilamina-benzaldehido del reactivo de Kovacs para originar un compuesto de color rojo. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de H2S, el cual se combina con los iones ferricos (Fe+3) y da lugar a un precipitado negro de sulfuro ferroso. d. Reacciones Triptofanasa Indol + Acido Piruvico + NH3

    Triptofano

    Indol + P- dimetilamina benzaldehido

    Compuesto Color Rojo

    Formacin H2 S Tiosulfato de sodio H+ H2S + Fe+3 H+ Sulfuro Ferroso (Precipitado Negro)

    e. Lectura Movilidad Turbidez ms all de la siembra. Inmovilidad Crecimiento solo en la lnea de siembra H2S (+) Ennegrecimiento H2S (-) Sin cambio de color Indol (+) Anillo Rojo (al agregar Reactivo Kovacs) Indol (-) Sin anillo (al agregar Reactivo Kovacs)

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