La Coloracion de Gram en el Diagnóstico

de la Infección Urinaria
Alba Lucia ARAMBULA DE OBREGON[1]

El propósito de este estudio, fue validar la coloración de Gram de la orina centrifugada con el método de cultivo cuantitativo con
recuento de 105 unidades formadoras de colonia (UFC) / mL de orina, como prueba de referencia o ‘’gold standar´´, en muestras
de personas a quienes se les solicitó urocultivo, para investigación de Infección del Tracto Urinario ( ITU ) en el Laboratorio
Clínico de la Escuela de Bacteriología, Facultad de Salud de la UIS; el cual se realizó a partir de 601 muestras, en el periodo
comprendido entre Enero del 2.001 a Marzo del 2.003. Las orinas se centrifugaron y el sedimento coloreado con Gram fue
analizado microscopicamente, las muestras que presentaban bacterias fueron cultivadas en medios selectivos de acuerdo con la
morfología y la tinción observada, aquellas en las que no se observaron bacterias no se cultivaron en ningún medio, pero si se hizo
el recuento de bacterias. Mediante la coloración de Gram se encontró que de las 601 muestras analizadas, se obtuvo 165 (27.4%)
positivas para bacterias de las cuales 149 (90.3%) mostraron bacilos Gram negativos, mientras solo 16 (9.7 %) presentaban cocos
Gram positivos. Adicionalmente 161 ( 26.7 %) de las muestras positivas mostraron presencia de leucocitos. El 96.3 %( 155 ) de
las muestras leucocito positivas presentaron recuentos entre 104 y 105 unidades formadora de colonia por mililitro de orina (UFC/
mL.). Obteniéndose con este trabajo que la sensibilidad de 93.9 % y una especificidad de 97.7% de la coloración de Gram en orina
centrifugada, dado que en 436 del total de muestras no se observó bacterias ni leucocitos por tanto sus recuentos fueron negativos
y en aquellas en las que se observaron bacterias y leucocitos se obtuvieron recuentos 105 UFC/mL que indicaban una infección
urinaria con un solo tipo de bacteria. 2004;36:132-137

Palabras claves: Infección Urinaria. Gram. Piuria. Bacteriuria

The purpose of this work was to validate the Gram stain of centrifuged urine related in front of with the bacterium count by the
cuantitative method, with count of bacterium = 105 CUF /mL of urine or “gold stand “ in samples of persons from whom cultures
were solicited the urine culture in the Laboratory of Clinic Escuela de Bacteriología Facultad de Salud de la UIS, the present study
was carried out to determine the degree of reliability and sensitivity of the Gram method for the diagnosis of Urinary infection
(UIT) beginning at the 601 samples of urine in the period understood to be between January 2001 and March 2003. The urine was
centrifuged and the sediment was microscopically analyzed by Gram stain end the samples that showed bacteria were cultivated
in selective mediums in accordance with the morphology and observed dyes, those in which bacteria was not observed were not
cultivated by any medium, but they had a bacteria count. During the Gram stain it was found that of the 601 analyzed samples,
165 ( 27.4 %) showed positive for bacteria and of those 149 ( 90.3 %) showed Gram negative bacillus, while only 16 ( 9.7 % )
Gram positive cocci. Additionally 161 26.7 %) of the positive samples showed rhe presence of leukocites. The 96.3 % (155) of
the positive leukocite samples showed counts between 104 and 105 UFC /mL. In conclusion this work, the sensitivity was 93.0
% and specificity 97.7% of Gram stain in centrifuged urine , given that in 436 of the total samples neither bacterias nor leukocites
were observed for as much as their counts were negative and in those that bacterias and leukocites were observed they displayed
counts of 105 UFC/ mL that indicated a urinary infection with only one type of bacteria. 2004;36:132-137

keys words : Urinary infections. Gram. piuria. bacteriuria

INTRODUCCIÓN clasificar en Gram positivas y Gram negativas, según

retengan o no el colorante de cristal violeta después de
a coloración de Gram, descrita desde 1884 por el agregar una solución decolorante, bien sea alcohol al
médico danés Christian Gram es una coloración 100% o alcohol-acetona. La captación del colorante de
diferencial de uso común en Bacteriología 1 . Las Gram depende en gran parte de la composición de la
preparaciones sobre portaobjetos que contienen pared bacteriana, donde eventos físicos como
bacterias tratadas con esta coloración se pueden solubilidad, difusión, permeabilidad y adsorción y
químicos como cargas eléctricas y pH están
involucrados1. La compleja composición de la pared de
[1]
Profesora Asistente Escuela de Bacteriologia Facultad de las diversas especies bacterianas como ácidos teicoicos,
Salud UIS.
proteínas, lípidos y aminoácidos, establece las diferencias
Correspondencia: Escuela de Bacteriologia. Facultad de Salud.
de las reacciones observadas al Gram.
UIS. Carrera 32 # 29-31 Bucaramanga. [email protected]

132
 COLORACIÓN DE GRAM EN LA INFECCIÓN URINARIA

Esta coloración permite visualizar la morfología y el tipo MATERIALES Y MÉTODOS

de agrupación de las bacterias como cocos en cadena o
en racimo, bacilos Gram negativos o Gram positivos.
Población de estudio y muestra
Algunos de ellos, producen enfermedades localizadas o
Se analizaron 601 muestras de orina de personas adultas
sistémicas y dentro de estas destacaremos en este
y niños que asistieron al Laboratorio Clínico, para
manuscrito las relacionadas con las vías urinarias.
practicarse un urocultivo solicitado por el médico.
Las infecciones del tracto urinario son las más frecuentes,
Las muestras fueron recolectadas en condiciones de
especialmente en niñas en edad preescolar y mujeres en
esterilidad, teniendo en cuenta que fuera la primera orina
edad reproductiva 3,4. Estas infecciones pueden ser
de la mañana previo lavado de genitales externos. La
asintomáticas o sintomáticas. Las sintomáticas tienen
orina fue recolectada directamente en el frasco
importancia en mujeres embarazadas y en ancianos. Las
suministrado por el Laboratorio, descartando la primera
sintomáticas presentan cuadros clínicos diversos como
y última parte de la micción y las muestras fueron
síndrome uretral agudo, cistitis y pielonefritis 5.
entregadas entes de dos horas después de la recolección.
La coloración de Gram en la muestras de orina para
Urocultivo permite evaluar el tipo de bacteria, la presencia Procesamiento de las muestras
de píuria y determinar si hubo una adecuada recolección Urocultivo por la técnica de la dilución en tubo:
de la muestra.
1. Estudio del Sedimento por coloración de Gram Las
Las bacterias son la causa más frecuente de la infecciones muestras de orina se procesaron previa
urinarias, siendo las bacterias Gram negativas las mas homogenización de la misma. De cada muestra se
involucradas. La Escherichia coli produce el 90 % de tomó una alícuota de 10 mL y se centrifugó a 3.500
las infecciones urinarias, Enterococcus 9%, rpm por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y
Staphylococcus 2% y Streptococcus 2% 6,7,8. realizó la coloración de Gram del sedimento obtenido.

En una infección urinaria es de gran importancia 2. Cultivo del sedimento: se hicieron cultivos a partir de
identificar el agente etiológico lo mas pronto posible, los sedimentos que exibian bacterias de un solo tipo
para entablar un tratamiento oportuno, prevenir de morfología y tinción : en Agar Sangre, si se
reincidencias y cronicidad, evitando el daño renal que observaban cocos Gram positivos y en Agar
puede ser fatal para el paciente. Es importante realizar MacConkey, si se observaban bacilos Gram . Si en la
diagnostico diferencial con otras infecciones como muestra se observaba biota variada ( lactobacilos,
uretritis y vaginitis, ya que estas presentan cocos gram positivos, bacilos gram positivos del tipo
sintomatología semejante a la infección urinaria y Corynebacterium, diplococs gram negativos y
necesitan diferente protocolo terapéutico 3,9. bacilos gram negativos) no se cultivaba y se
solicitaba nueva muestra.
El presente estudio rescata la relevancia de la coloración
de Gram como un método sencillo, rápido predictor de 3. El recuento de bacterias, se preparaba una dilución
la infección urinaria. El uso de este método deberá 1:100 posteriormente se sembraba 1 mL de esta
constituirse en herramienta rutinaria como parámetro dilución en caja de petri estéril y luego se agregaba
de orientación clínica, permitiendo una ventaja costo- 25 mL de agar de recuento previamente fundido a 45
beneficio, al servir de tamizaje de muestras que cumplen grados, se mezclaba por rotación y se dejaba
la calidad requerida para el estudio bacteriológico solidificar, para luego incubar a 35-37º C por 24 horas.
consecuente. Se tiene establecido que una gota de orina
sin centrifugar que tenga una bacteria por campo en A cada sedimento se practicó en lámina portaobjetos
100 campos con objetivo de 100X y que sea de un solo por triplicado.
tipo se considera que equivale a 105 UFC 7,14,16,18 , esto
cuando se sabe que una orina está infectada, pero Los resultados se analizaron estadísticamente utilizando
cuando son orinas de personas asintomáticas o que una base de datos en Epi-info 6.0. Se determinó la
tienen bajos recuentos la mayoría de los investigadores sensibilidad y especificidad del Gram, utilizando la tabla
no lo tienen en cuenta, por eso en este trabajo se realizó del dos por dos.
el Gram centrifugando la orina.

133
 ALBA ARAMBULA

RESULTADOS recuento = 105 UFC/mL. Tabla 1. así mismo los leucocitos

se hicieron presentes en el 97.6 % de estas (161/165) ;
De las 601 muestras cuyos sedimentos obtenidos fueron destacándose que en un 46 % de las muestras
coloreados con Gram, en 165 (27.4%) se observaron correspondían a la presencia de menos de 5 leucocitos
bacterias, de las cuales el 96.3% (155/165) registró por campo. Tabla 2.

Gram del sedimento No de muestras % Muestras con > 10 5 % Muestras con ? 10 5 %

UFC/mL UFC/mL
Con bacterias 165 27.4 155 96.3 10 6.1
Sin bacterias 436 72.5 0 0 0 0

Total 601 99.9 155 96.3 10 6.1

Tabla1. Recuento de UFC/mL en muestras positivas para bacterias al Gram.

El 97.6% (155/165) de las muestras con bacterias al Gram y recuentos = 105 UFC/mL de orina presentaron leucocitos
identificados en el sedimento urinario coloreado indicando así la presencia de infección urinaria. Table 2,

Recuento de bacterias n % Leucocitos n %

5
? 10 UFC/mL 155 96.3 presencia 161 97.6
5
< 10 UFC/mL 10 1.66 presencia 6 0.27
165

Tabla 2. UFC/mL y Leucocitos en muestras con bacterias observadas con sedimentos coloreados con Gram

Al relacionar la cantidad de leucocitos con el recuento de colonias, se observó que cerca del 40% (74) correspondía
a menos de 5 leucocitos por campo, seguramente al concentrar la orina por centrifugación permite visualizar los
leucocitos si estos se encuentran en escasa cantidad. Tabla 3

Cantidad de leucocitos No de muestras %

Abundante ( ?10) 45 27.9
Media ( 5 a 10) 42 26.1
Escasa (< 5) 74 46
Total 161 100

Tabla 3. Proporción en que se encontraron los leucocitos en las orinas que contenían recuentos entre = 105 UFC /ml

En cuanto a la etiología identificada en este estudio se observó que el 90.3% de las bacterias presentes correspondieron
a bacilos Gram negativos, y la especie mas frecuente la E. coli en un 74 %, seguido de otros bacilos Gram negativos
en un 18% y de cocos Gram positivos en 9%, en este estudio. Tabla 4.

Tipo de bacteria al
N % Especie bacteriana N %
Gram
Escherichia coli 119 74
Bacilos Gram
149 9 0. 3
negativos
Otros Gram negativos 28 18

Enterococcus faecalis 9 6
Cocos Gram
14 8.5 S t a p h y l o c o c c u s a u r e us 3 2
positivos
Streptococcus grupo D 2 1

Tabla 4. Tipos bacterianos mas frecuentes versus especies bacterianas más Frecuentes

134
 COLORACIÓN DE GRAM EN LA INFECCIÓN URINARIA

DISCUSIÓN en lo que corresponde a la sensibilidad y especificidad

de la coloración de Gram. y concluyeron que este método
Desde la década de los 80, la literatura científica ha aumentaba la sensibilidad de detección de bacterias hasta
proporcionado gran cantidad de informes, sobre un 98% en recuentos iguales a = 105 UFC/mL de orina,
diferentes métodos utilizados para evaluar una orina para cuando se centrifugaba la misma 4 . En este estudio de
diagnóstico de ITU 10-11. Estos métodos han variado 165 (27.4%) se observaron bacterias, de las cuales el
desde los microscópicos, enzimáticos, fotométricos, 96.3% (155/165) registró recuento = 105 UFC/mL, con
filtración, por bioluminiscencia hasta los automatizados. una sensibilidad del 93.9% y una especificidad de 97.7%.
Todos ellos han sido evaluados y confrontados con el
método de cultivo cuantitativo, con recuento de 105 Pezzlo reportó una sensibilidad del 87% para una
unidades formadoras de colonia (UFC) / mL de orina, coloración de Gram de orina, sin centrifugar y la cual
como prueba de referencia o “gold standar” 7,13,14,15,18 . En aumentaba hasta un 97% cuando las muestra de orina,
este trabajo la metodología que se ha querido evaluar es contenían un solo tipo de bacteria 7. Este estudio muestra
la coloración de Gram de las orinas centrifugada versus que 149 de las orinas centrifugadas se observaron al
el método de cultivo cuantitativo, teniendo en cuenta Gram bacilos Gram negativos y en 14 se observaron cocos
también la presencia de leucocitos. Gram positivos.

Pezzlo en 1.988, hizo una revisión de algunos de los Aunque Kass reporta que la observación de una o mas
métodos rápidos utilizados hasta el momento para hacer bacterias por campo microscópico, con objetivo de
análisis de orina para detectar infección del tracto urinario, inmersión de una gota de orina sin centrifugar coloreada
teniendo en cuenta el tiempo de detección, sensibilidad, con Gram, tiene una sensibilidad del 85% cuando se
especificidad y valor predictivo negativo para diferentes correlaciona con un conteo de = 105 UFC/ mL de orina .
recuentos de UFC/ mL. de orina, detección de píuria, Otros como Tilton reportan una sensibilidad del 96% y
costo por prueba y ventajas y limitaciones de cada Washington del 95%, con valores predictivos negativos
método 6. Concluyó que la metodología microscópica = 99% 11,15,16.
por coloración de Gram, es una prueba rápida y confiable
en la detección de bacteriuria significativa a partir de Mas aún, la sensibilidad del Gram para recuentos de 105
una muestra de orina, y además la mas económica UFC/mL ha sido del 95%, del 90% para recuentos de 104
comparada con las otras metodologías 13,14. UFC/ mL de orina y del 78% para recuentos de 103 UFC/
mL de orina. Y un valor predictivo negativo del 99 %
Sin embargo, muchos investigadores han demostrado que para recuentos de 105 UFC/ mL de orina: del 94% para
cuando se han evaluado muestras de orina con recuentos recuentos de 104 UFC/mL de orina y del 81% para
menores de 105 UFC/ mL de orina, con la mayoría de los recuentos de 103 UFC/mL de orina 12.
métodos, utilizados como son la bioluminiscencia, los
fotométricos, los enzimáticos y los automatizados, los Su capacidad de detectar piuria y su bajo costo, hacen
resultados no son tan favorables, debido a que muchos que la coloración de Gram , sea ampliamente utilizada por
de ellos carecen de sensibilidad y valor predictivo negativo los bacteriólogos con el propósito de diferenciar una
cuando los recuentos están bajos y adicionalmente no orina contaminada de una que presente una verdadera
detectan la presencia de leucocitos11. infección, cualquiera que sea el método utilizado, y sirve
de guía para la detección de infecciones asintomáticas 13.
La coloración de Gram , es una técnica que ha sido Autores como Stamm demostraron que el 90% de
ampliamente utilizado como un estimativo de bacteruria pacientes que presentaban cistitis con un bajo recuento
cuando se correlaciona con un recuento de = 105 UFC/ de bacterias tuvieron hasta 10 leucocitos por campo. En
mililitro de orina, y a pesar de que la sensibilidad del este estudio los leucocitos se hicieron presentes en el
Gram decrece en recuentos bajos ,se recomienda realizarlo 97.6 % de estas (161/165) ; destacándose que en un 46 %
en orinas de pacientes asintomáticos y en aquellos en de las muestras correspondían a la presencia de menos
los que se sospecha una pielonefritis 1. de 5 leucocitos por campo. Table 3.

Jenkins y colaboradores, hicieron un estudio relacionado Robbins reporta que una gota de orina sin centrifugar
con la microscopía urinaria para detección de bacteriuria que no muestre al Gram bacterias ni leucocitos es una
y encontraron una gran variación en los resultados muestra que no debe ser cultivada18. En este estudio en
obtenidos al Gram con muestras de orinas centrifugadas donde se centrifugó la orina se encontró que en 436 de
y no centrifugadas y sugirieron criterios de interpretación las muestras no se observó al Gram ningún tipo de

135
 ALBA ARAMBULA

bacteria y al relacionarlo con el recuento de bacterias no invaluable para el bacteriólogo en la selección de muestras
se obtuvo crecimiento alguno ver .Tabla 1. negativas, dedicando más tiempo a las positivas, y
mejorando de esta manera la eficiencia y el costo-
Kunin y cols. mostraron la importancia de tener en cuenta beneficio del diagnóstico para el paciente13.
las orinas con bajos recuentos de bacterias y concluyeron
que podría tratarse de infecciones tempranas no Teniendo en cuenta las anteriores consideraciones con
establecidas todavía, o de bacterias que provenían de la respecto de la coloración de Gram, esta no se debe omitir
uretra infectada 3,18, . Stamm confirma estos hechos en su de hacer en cualquiera de las metodologías que se utilicen
estudio en donde compara, los bajos recuentos de en el Laboratorio para llevar a cabo la investigación de la
colonias tomando muestras por punción suprapúbica ITU. Se debe replantear su utilización como una
de estos pacientes y comprobando de esta manera que herramienta imprescindible en el diagnóstico presuntivo
las bacterias provenían de la uretra infectada, de las infecciones del tracto urinario. Valdría la pena hacer
principalmente15,8. En este estudio se observó que las investigaciones dirigidas a su evaluación frente a otras
muestras que contenían recuento de colonias < 105 UFC/ metodologías diagnósticas utilizadas.
mL, mostraron bacterias al Gram y también la presencia
de leucocitos como se muestra en la Tabla 2. REFERENCIAS
En la Tabla 3 se muestra que las que presentaron 1 Levy J, Campbell JJR, Blackburn TH. Introductory
leucocitos no todos tenían la misma cantidad de ellos. Microbiology.The University of British Columbia
Se ha establecido que el hallazgo de píuria en la muestra Vancouver. Canada .John Wiley & Sons, INC 1.975.
de orina con objetivo de inmersión ( 100X ) es también 2 Lockhart GR: Lewander WJ, Cimini DM, Josephson
un parámetro importante de evaluar en una infección SL, Linakis JG. Use of urinary gram stain for detection
urinaria, y muchos de los métodos que han sido of urinary tract infection in infants. Ann Emerg Med
evaluados como son los automatizados no detectan 1.995; 25: 31-5.
leucocitos.1,16,18. En este estudio el 46% (74) correspondía 3 Kunin CM, Polyac F, Postel E. Periurethral bacteria
a menos de 5 leucocitos por campo, posiblemente se flora in woman prolonged intermittent colonization
deba a la concentración por centrifugación es lo que with Escherichia coli, Jama 1.980, 243 :134
permite visualizar los leucocitos si estos se encuentran 4 Stamm WE, Counts GW., Running KR, et al.
en escasa cantidad. Diagnosis of coliform infection in acutely dysuric
women. N Engl J Med 1.982; 307:463.
Lockhart y col. en su estudio para determinar si la 5 Washington JAII, White CM, Laganieri M, and Smith
coloración de Gram era mas sensible que el uroanálisis, LH. Detection of significant bacteriuria by
para la detección de ITU en niños lactantes, concluyó microscopic examination of urine. Lab Med 1.985; 12:
que la coloración de Gram es mas confiable debido a que 294-96
tiene una sensibilidad del 94% frente a un 67% del 6 Schaeter, Moselio,Medoff G, y et al. Microbiología.
uroanálisis y una especificidad del 92% frente a un 79% Mecanismos de las enfermedades infecciosas.
del uroanálisis 9. En este estudio se pudo establecer una Enfoque mediante problemas. 2a. Edi. Editorial
sensibilidad de 93.9% y una especificidad de 97.7%, más panamericana 1.994.
alta que la reportada por Lockhart 2. 7 Stamm WE. Interpretation of urine cultures. Clin.
Microbiol News1.983. 5:15.
En la Tabla 4. se muestra que los bacilos Gram negativos 8 Sodeman T M. A practical strategy for Diagnosis of
74%, como la E. coli son los que ocupan el primer lugar Urinary Tract Infections.Clin Lab Med 1.995 ; 2: 235-
como agentes etiológicos de infección urinaria, seguido 50.
de los cocos Gram positivos en una proporción mas baja 9 Latham RH, Wong ES, Larson A, et al. Laboratory
9% en este estudio realizado en el Laboratorio Clínico de diagnosis of urinary tract infection in ambulatory
la Escuela de Bacteriología. women. JAMA 1.985 ; 254:3333.
10 Hurbult TA,Littemberg B and The diagnostic
La validez de la coloración de Gram proporciona Technology Assesment Consortion. – J. Clin.
indicadores tales como la presencia de píuria y bacteriuria Microbiol and J. Infect Diss. Articulo Original. 1.991.
significativa, características morfológicas y tincionales 11 Pfaller MG, Ringenberg L.Rames, Hegeman J. and
de la bacteria implicada, información que puede ser Koontz F. The usulfulness of screening test for pyuria
utilizada por el médico en una terapia antibacteriana in combination with culture of urinary tract infecction.
inicial, adecuada y oportuna13. Dado que es una ayuda Diagn Microbiol. Infect Diss 1.987; 6: 207-215.

136
 COLORACIÓN DE GRAM EN LA INFECCIÓN URINARIA

12 Pezzlo M. Detection of Urinary Tract Infections by antimicrobialsusceptibility testing of mycroscopically

Rapid Methods.Clin Microbiol Rev. 988; 1:268-280 screened urine cultures. J. Clin. Microbiol. 1.980 ; 11:
13 Pezzlo MT, Tan GL, Peterson EM, de la Maza LM. 157-161.
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Screening of urine cultures by three automated Robbins,DG, Rogers KB, White RHR,and Osman MS.
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