NUTRICION DEL PULPO ROJO Octopus maya (Voss y Solís, 1966) DE LA

PENÍNSULA DE YUCATÁN: REQUERIMIENTOS METABOLICOS Y FISIOLOGICOS

INTRODUCCION
El pulpo Octopus maya es uno de los recursos pesqueros más importantes de la
Península de Yucatán. Su demanda en el extranjero, su alto valor comercial y el
aumento de la población dedicada a la pesca, ha producido un gran aumento de la
presión de pesca sobre esta especie. Lo anterior, aunado al aumento demográfico
costero esperado en los próximos años en Yucatán, plantea la necesidad de desarrollar
nuevas alternativas de producción de especies marinas, como lo es la acuacultura.

Los estudios que demuestran la factibilidad del cultivo de O. maya no son abundantes.
Sin embargo, dada su adaptación a condiciones de cautiverio, su de desarrollo directo
(sin fases larvales), y crecimiento rápido, se considera una de las principales especies
candidatas para la acuacultura. Así, es necesario determinar los parámetros ambientales
y biológicos que determinan el éxito del cultivo, como los que determinan la reproducción
en cautiverio, desoves de reproductores silvestres, así como los parámetros nutricionales
óptimos para el crecimiento y la engorda de juveniles, y la producción de reproductores
de laboratorio con desoves similares o mayores a los de las poblaciones silvestres.

En la Unidad Multidisciplinaria de Investigación y Docencia (UMDI) de la UNAM en Sisal,

ya se estan estudiando algunos de estos aspectos. En la nutrición, se han probado
ciertas dietas experimentales con alimentos naturales (jaiba, mejillón y almeja). Sin
embargo, para poder llevar el cultivo hasta una fase piloto con miras a implementarlo a
una escala comercial, es necesario establecer los requerimientos nutricionales para esta
especie, que a su vez permitirá la elaboración de dietas artificiales que permitan a futuro
su cultivo a gran escala. Este trabajo propone determinar estos requerimientos a nivel de
aminoácidos y plantear un modelo conceptual que permita explicar el metabolismo de
proteínas en esta especie enfatizando el metabolismo de aminoácidos.

ANTECEDENTES

Pesquería
Alrededor del 90% de la producción nacional de pulpo proviene de las capturas en los
estados de Yucatán y Campeche (SEMARNAP, 1999). Este recurso se ubica en tercer
lugar nacional en importancia, después del camarón y el atún (Hernández Flores et al.,
2001). Tiene alta demanda en países orientales (Japón, Korea), Europa occidental
(España, Portugal, Grecia, Italia), Marruecos, Mauritania y Argentina, por lo que presenta
un elevado valor comercial (Vaz-Pires et al., 2004).

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En la Península de Yucatán, la pesquería la componen dos especies: Octopus vulgaris
(Cuvier, 1797) y O. maya (Voss y Solís-Ramírez, 1966), siendo esta última la que
contribuye con el 70% de la producción (SAGARPA, 2004). O. maya es una especie
endémica que habita la plataforma continental de la península, desde Ciudad del
Carmen hasta Isla Mujeres (Voss y Solís-Ramírez, 1966; Solís-Ramírez, 1994, 1997).
Las actividades de captura (agosto-15 diciembre) están condicionadas por el clima, ya
que la temporada de nortes (junio-noviembre) trae consigo tormentas tropicales y
huracanes. En la temporada de pesca 2005 se estableció una cuota de 11,972 toneladas
(Solana et al., 2005). De estas, solo se capturaron alrededor de 5,000t (Oficinas
SAGARPA Yucatán, 2006) por restricciones a la navegación ante las condiciones
climáticas. Al mismo tiempo, la captura de O. maya se ha incrementado debido al
aumento de la población en la costa, aumentando los riesgos de la sobrepesca sobre el
reclutamiento a corto plazo, que provocaría una disminución en la producción en los
años siguientes. El status pesquero este recurso es que se encuentra aprovechado al
máximo sustentable desde hace varios años (DOF, 28 de agosto 2000).

La mayoría de los estudios sobre O. maya se refieren a evaluaciones poblacionales y

pesqueras (Solís-Ramírez y Chávez, 1986; Solís-Ramírez 1988, 1994, 1997; Arreguín-
Sánchez et al., 1994, 1996; Arreguín-Sanchéz, 2000; Solana et al., 2002; Pérez et al.,
2004; Solana et al., 2005), y solo algunos sobre evaluación bioeconómica (Cabrera y
Defeo, 2001) y biología reproductiva (Santos-Valencia y Re-Regis, 2000).

Cultivo
Ante la condición de la pesquería, el cultivo de O. maya se presenta como una opción de
producción alternativa. Algunas de las ventajas que se obtendrían con la implementación
de actividades acuícolas en esta especie son: 1) disminuir la presión de pesca que se
ejerce actualmente sobre el recurso, 2) ayudar a preservar este valioso recurso, 3)
eliminar la dependencia de las condiciones del medio para su captura, 4) tener
existencias del recurso durante todo el año, 5) planear su producción y comercialización,
y 6) aliviar un conflicto social en la zona limítrofe de los estados de Campeche y
Yucatán, originado por el aumento en el número de pescadores capturando este recurso
que a fin de cuentas es limitado pero de alto valor económico. En general, los estudios
del ciclo de vida, parámetros ambientales, reproducción, fisiología, bioenergética,
nutrición y crecimiento, todos necesarios para determinar la factibilidad de un cultivo, son
escasos para O. maya.

Varios aspectos acuaculturales se han estudiado extensamente en O. vulgaris (Mangold,

1983; Villanueva, 1995; Vaz-Pires et al., 2004; Petza et al., 2006), cultivado a pequeña
escala en España, Portugal e Italia (Vaz-Pires et al., 2004). Es una especie con alta
fecundidad y un estadio larvario denominado “paralarva” (Young y Harman, 1988). Sin

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embargo, este fase experimenta una mortalidad alta y requiere de 1.5 a 2.5 meses para
asentarse, faltando establecer con éxito su alimentación en esta fase (Villanueva, 1995;
Villanueva et al., 2002; Carrasco et al., 2003). La fase de paralarva representa un factor
limitante en el cultivo de esta especie, y las actividades acuícolas están dirigidas al
crecimiento de subadultos obtenidos de actividades pesqueras (Vaz-Pires et al., 2004).

A diferencia de la mayoría de las especies de cefalópodos que presentan huevos

pequeños y un desarrollo larvario complejo como O. vulgaris (Boletzky, 1974; Villanueva,
1995), las que presentan huevos grandes con desarrollo directo, y que aceptan dietas
muertas después de las primeras fases de desarrollo son las mas atractivas para la
acuacultura. Tal es el caso de O. maya, pues produce huevos grandes y de desarrollo
directo (Voss y Solis-Ramírez, 1966), teniendo uno de los mayores huevos de entre
todas las especies de pulpo, alcanzando 17 mm de largo. Esto hace que sea una de las
especies con más alto potencial para la acuacultura.

O. maya ha sido cultivado en el laboratorio (Solis, 1967; Van Heukelem, 1976; 1977;
DeRusha et al., 1989). El desarrollo embrionario dura entre 50-65 días en el medio
natural (Solís, 1967). Van Heukelem, (1983) menciona una duración de 45 días a
temperaturas entre 24 y 26°C. El mismo autor obtuvo tasas de conversión de alimento de
cerca de 40%, pudiendo alcanzar 1 kg en 4 meses, y hasta 3 kg en 9 meses cultivado a
25ºC. Hanlon y Forsythe (1985) citan que esta especie presenta un crecimiento rápido,
debido a sus elevadas tasas de ingestión y de conversión de alimento, ubicadas entre 30
y 60%. Estos autores señalan que, de entre las especies de pulpo con huevos de
desarrollo directo cultivadas en laboratorio, O. maya presentó el mayor crecimiento,
llegando a los 5.7 Kg, con tasas de crecimiento promedio del 4.1%/día durante su ciclo
de vida completo, por lo que es una de las especies mas apropiadas para el cultivo en
gran escala en densidades elevadas, después de O. bimaculoidis y O. digueti.

Hanlon y Forsythe (1985) reportaron mortalidades de 20-30% para la totalidad del ciclo
de vida, mientras que Van Heukelem (1983) menciona que la mortalidad en tanques de
cultivo es baja, y que O. maya cultivado en laboratorio crece más que los provenientes
del medio natural. Esto se relaciona con la temperatura media del cultivo, más elevada
en el laboratorio que en el medio natural, y con el alimento disponible.

Nutrición
Al nacer, los pequeños pulpos de O. maya tienen las características de un adulto, con
brazos hábiles para reptar y atrapar alimentos, y adoptan la vida bentónica de inmediato
(Solís y Chávez, 1985). Con relación a la alimentación, Hanlon y Forsythe (1985)
establecen para O. maya que durante las primeras fases del ciclo de vida es esencial
alimentarlos con presas vivas de tamaño adecuado, como los misidaceos. Van
Heukelem (1983) propone como alimento a gamarideos, anfípodos e isópodos; los

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juveniles pueden ser alimentados con gasterópodos y almejas o cangrejos, entre otras
presas naturales. De preferencia se deben ofrecer presas vivas, porque el canibalismo
aumenta con dietas inertes.

Uno de los factores que ha impedido el desarrollo de la acuacultura de cefalópodos a

escala comercial es la dependencia de las dietas naturales para su alimentación (O’Dor
& Wells, 1987; Lee et al., 1991). Vaz-Pires et al. (2004) citan que aunque O. vulgaris
acepta alimentos naturales en cautiverio, desde el punto de vista nutricional, su potencial
acuícola involucrará necesariamente cambios de los alimentos naturales a los
comerciales deshidratados.

Según Lee (1984), en el cultivo de cefalópodos, mas del 50% del trabajo está asociado a
la captura, mantenimiento o cultivo de las presas naturales. Si se congelan las presas, el
costo de mano de obra se reduce cerca de 30%. Inversamente, el costo asociado a
producciones de dietas artificiales es bastante menor, y disminuyen significativamente si
se producen estas dietas artificiales a gran escala. El desarrollo de dicha dieta es uno de
los objetivos importantes para llegar a un cultivo a nivel comercial (Lee, 1994). Uno de
los aspectos clave en este sentido es la obtención de dietas adecuadas y que tiendan a
ser de bajo costo. En general, de entre los cefalópodos, los pulpos suelen aceptar más
fácilmente dietas preparadas (Hanlon et al., 1991), aunque su sabor u olor no sean de
buena calidad (Castro, 1991; Domínguez, 1999).

Por las razones anteriores, es de vital importancia la determinación de los requerimientos

nutricionales básicos para cefalópodos, a través del desarrollo de dietas artificiales
equilibradas, con alta durabilidad y eficientes que promuevan un crecimiento aceptable y
que sean atractivas para O. maya. Una dieta de composición conocida y determinada
puede ayudar a entender la fisiología de la nutrición de la especie, así como ayudar a
determinar los requisitos nutricionales de estos organismos (Domínguez et al., 2004).
Una vez logrado esto será posible escalar los cultivos de laboratorio a una escala piloto
experimental y posteriormente a la escala comercial, a costos razonables.

Requerimientos nutricionales
La dieta natural de O. maya esta constituida de crustáceos, moluscos bivalvos y algunos
peces, siendo los decápodos su alimento preferido y con una elevada proporción en la
misma, tales como cangrejos y jaibas. Estudios recientes en la UMDI-UNAM en Sisal,
sugieren que O. maya tiene un alto requerimiento de proteínas al considerar el tipo de
presas con las que se han obtenido los mayores crecimientos (cangrejos, almejas,
camarones). Resultados preliminares demostraron que dietas balanceadas con niveles
de proteínas (P), lípidos (L) y carbohidratos (CHO) de 40, 11, y 20%, respectivamente,
podrían no ser apropiadas para el crecimiento de O. maya. Con esta dieta los pulpos no
aumentaron de peso en 40 días. Sin embargo, con animales alimentados con jaibas

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congeladas (56% P, 4% L y 10% CHO) se obtuvieron incrementos superiores al 5%/día,
al pasar de 400 a 1500g en solo 30 días (Domínguez et al., en prensa). Esos resultados
permiten suponer que el metabolismo de estos pulpos es altamente dependiente de las
proteínas, principal nutriente del cual están compuestas las jaibas y que, posiblemente,
tengan requerimientos relativamente bajos de lípidos y carbohidratos.

Lee (1994) propone que el balance de aa en la dieta de cefalópodos es el mejor

indicador de una buena dieta, desalentando el uso de la relación proteína/energía (P/E)
ya que no es fiable ni buena indicadora de una dieta apropiada para cefalópodos. Por lo
tanto, es muy importante conocer la composición en aa de los cefalópodos,
principalmente de los de elevado potencial para acuacultura como Sepia officinalis u O.
maya (Domínguez et al., 2004). En este sentido, se deben incorporar las
concentraciones de todos los aa esenciales y su correcto balance en las dietas para que
estas puedan dar resultados satisfactorios en el cultivo.

Además de los aa esenciales, la elaboración de dietas debe considerar la elevada

necesidad de algunos aa que aunque no sean esenciales, por su intenso uso y
requerimiento para la producción de energía, deben ser considerados como tales
(Domínguez et al., 2004). Tal es el caso de la prolina y alanina, que en un estudio de
Domínguez (1999) con S. officinalis fueron los aa más rápidamente utilizados para
energía como substratos del ciclo TCA (Ballantyne et al., 1981). La prolina es el primer
aa que se oxida a glutamato para producir energía (Lehninger et al., 1993), y por tanto el
primero a ser usado si el cefalópodo no está bien alimentado o en buena condición.

Domingues et al. (en prensa) lograron aceptación e ingestión de un alimento balanceado

(base comercial de camarón y pasta de calamar) con O. maya, aunque con un
crecimiento mínimo y una considerable producción de heces. Mencionan que estos
resultados pueden deberse a deficiencias en algunos aa, lo que puede explicarse a partir
del contenido energético de las heces y de la determinación de la composición de aa. En
la futura elaboración de dietas, se debe tratar de obtener una composición similar a la de
la composición de aa del manto de los pulpos analizados en dicho experimento. A partir
de estos resultados, se probaron dos niveles de proteína (40 y 60%), con una dieta
control de jaibas congeladas (todos con valores de contenido de energía similar) que
resultó con el mayor crecimiento. Los resultados mostraron que las diferencias
observadas se relacionan con la digestibilidad o con la composición de los nutrientes de
las dietas (Aguila, 2006). Posteriormente, se probaron 5 dietas con diferentes niveles de
hidrolizado de pescado (0, 5, 10, 15, 20%) procurando hacer disponibles más péptidos y
aa a los organismos El mejor crecimiento se observó con un 15% de hidrolizado, que fue
sin embargo mucho menor que la dieta control. Por lo cual, nuevamente se hace
referencia a la composición de los nutrientes, en específico de los aa.

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Se ha determinado la composición de aa en algunos cefalópodos, principalmente en
órganos y tejidos de juveniles y adultos de O. vulgaris (Iwasaki y Arada, 1985, O’Dor y
Wells, 1973; Villanueva et al., 2004; Seidou et al., 1988). Sin embargo, la información
sobre la composición de aa en los estadios tempranos (paralarvas o juveniles) es
escasa. Por lo tanto, los requerimientos de aa de dichos estadios es poco conocida
(Villanueva et al. 2004).

Diversos factores influyen en el crecimiento de cefalópodos (Forsythe y Van Heukelem,

1987), siendo muy probable que la variabilidad en cantidad y calidad del alimento afecte
el crecimiento en los estadios tempranos. En general, no existen estudios cuantitativos
sobre el efecto de la ración alimenticia en el crecimiento de las larvas planctónicas de
cefalópodos (Villanueva et al., 2002). Lo anterior aplicaría también para los estadíos
tempranos en O. maya. Villanueva et al. (2004) encontraron en estadios tempranos de
O. vulgaris, Sepia officinalis y Loligo vulgaris que la leucina, lisina y arginina representan
casi la mitad de los aa esenciales, indicativo de que pueden ser aa esenciales limitativos
en sus dietas. En O. vulgaris, la arginina alcanzó altos niveles en forma libre, así como la
taurina, involucrada en procesos de osmoregulación (Florkin y Bricteux-Grégoire, 1972).

Cazares (2006) encontró en O. maya que la elevada presión osmótica de los huevos se
reduce durante el desarrollo embrionario hasta alcanzar la presión osmótica del agua de
mar justo antes de la eclosión. Esto puede estar relacionado con la presencia de
aminoácidos libres en el líquido perivitelino, registrándose un aumento de peso y
volumen de los huevos como parte de este mecanismo. A su vez, puede utilizar los aa
como fuente de moléculas para su desarrollo y adquiere espacio para su crecimiento.
También concluye que en general, diferentes dietas aplicadas a los reproductores
afectan a la cantidad de huevos depositados, no a la calidad de los mismos en términos
de contenido de proteínas, lípidos y presión osmótica presentes.

Villanueva et al. (2004) encontraron que la cantidad total de aa aumentó con el peso
seco en juveniles de O. vulgaris silvestres, indicando cambios bioquímicos asociados a
fuertes cambios morfométricos en las proporciones corporales después del
asentamiento, cuando desarrollan los tentáculos, abundantes en proteína. Cazares
(2006) también cita que la reducción de lípidos en el tejido y cambios en las proporciones
corporales (largo de los tentáculos con respecto al manto) demuestran que juveniles
tempranos de O. maya en los primeros 10 días de vida pasan de una condición
dependiente de reservas lipídicas a una conducta netamente depredadora, asociada con
el uso de las proteínas. Por lo tanto, puede pensarse que a partir de cambios
morfométricos y bioquímicos que presenta la especie conforme crece, sus necesidades
nutricionales se modifiquen, en especial los requerimientos proteicos y por lo tanto de aa.

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Estos antecedentes indican la importancia de determinar los requerimientos de aa desde
el desarrollo embrionario continuando hasta la etapa inicial del ciclo de vida de O. maya.

La etapa de juvenil temprano (duración de 30 días) en O. maya es parte de una división

artificial propuesta en función de las características observadas durante el primer mes de
vida. Los juveniles tempranos pesan en promedio al nacer 0.1 g, con las características
de un adulto con brazos hábiles para reptar y atrapar alimento. La mayoría nace con el
saco vitelino reabsorbido y los que lo hace prematuramente, lo absorben parcialmente y
se desprende a los pocos minutos de haber emergido del huevo.

Metabolismo de proteínas
En general, el metabolismo de los cefalópodos es casi totalmente dependiente de
proteínas (Lee, 1994), por lo que el requerimiento de aminoácidos (aa) para la
producción de las mismas es elevado (Houlihan et al., 1990). En cefalópodos adultos, la
movilización directa de las proteínas musculares proporciona la energía metabólica
durante periodos de inanición o de hambre y el uso directo de proteína como reserva
energética puede explicar la ausencia de las reservas principales de glicógeno o lípidos
en los tejidos de los cefalópodos (Storey y Storey, 1978, 1983; O´Dor et al., 1984).

Digestión de proteínas.
La formulación de dietas para los estadíos tempranos de cefalópodos debe considerar
los requerimientos mencionados, así como sus capacidades digestivas en forma similar
a la enzimología larval de peces carnívoros cultivados (Caruso et al., 1993; Kuz´mina,
1996). Se conoce que las enzimas digestivas de larvas de peces muestran diferente
nivel de actividad cuando las larvas son alimentadas con dietas compuestas o con
presas vivas (Abi-Ayad y Kestemont, 1994), por lo que en el caso de cefalópodos, es
necesario el conocer las necesidades alimenticias en sus estadíos tempranos y la
determinación de sus capacidades digestivas, a través de la determinación de la
actividad proteolítica.

Enzimas digestivas.
En pulpos, los principales órganos que segregan enzimas digestivas son las glándulas
intermedias, la glándula digestiva, el ciego y los canales digestivos. Ni el estomago, ni el
esófago segregan enzimas. Por lo tanto, las enzimas digestivas que degradan los
alimentos en estos dos órganos provienen de otros órganos, principalmente de las
glándulas salivares o digestiva (Boucaud-Camou y Boucher-Rodoni, 1983). Existe
actividad proteolítica en el lumen del aparato digestivo, desde el esófago hasta el
intestino (Boucaud-Camou, 1973). Esta actividad se origina en varias secreciones de
distintos órganos: las glándulas salivares y digestiva, el ciego y el intestino. Sawano
(1935), Guiretti (1950) y Morishita (1974, 1978) han encontrado fuerte actividad

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proteolítica en las glándulas salivares posteriores de Octopus, probablemente
involucrada con la digestión externa. Morishita (1978) concluye que las glándulas
salivares posteriores juegan un papel muy importante en la digestión de proteínas,
mientras que Best (1981) presentó fuerte evidencia de tal función en Octopus.
Koslovskaya and Vaskovsky (1970) mostraron una actividad proteolítica importante en la
glándula digestiva de cefalópodos. Sawano (1935) y Takahashi (1960) encontraron
actividad proteolítica también en los canales digestivos de pulpos y calamares. Boucaud-
Camou y Boucher-Rodoni (1983) han señalado que al estudiar la composición de las
enzimas proteolíticas en cefalópodos, las diferencias encontradas por diferentes autores
puede ser resultado de diferentes estados de la digestión o del ciclo de vida al momento
del muestreo. En cuanto al ciclo de vida, Sakaguchi (1968) reportó una fuerte actividad
en la glándula digestiva y en las glándulas salivares posteriores de Octopus. Después
del desove en hembras, la actividad enzimática descendió considerablemente en ambos
órganos.

El conocimiento de la actividad de las enzimas proteolíticas contribuirá también a

elucidar las capacidades digestivas, que a su vez se relacionan con los requerimientos
nutricionales de O. maya bajo condiciones de cultivo.

Fisiología energética
Los estudios de fisiología energética son de gran utilidad para establecer las
necesidades de energía de los organismos cultivados. Se puede establecer como la
energía ingerida del alimento (I) es absorbida (Ab) en la glándula digestiva al conocer a
cantidad de heces producidas (H) y la energía contenida en estas (Ab = I – H). De la
energía absorbida una parte es perdida en los productos de excreción nitrogenada (U) y
otra es dirigida a los procesos metabólicos (R) y al crecimiento (P) integrándose así en la
energía asimilada (AS), por lo que As = (Ab – U) = R + P (Lucas, 1989).

En general la utilización del análisis del balance energético en cefalópodos son escasos
(Petza et al., 2006). Van Heukelem (1976) realizó una aproximación del balance
energético en O. maya. Sin embargo, los fines para los que se experimentó con la
especie fueron biomédicos y no para su aplicación en acuacultura. Por lo tanto, es
necesario obtener y formalizar el balance energético en O. maya bajo diferentes
tratamientos alimenticios conocidos que defina las proporciones de la energía que son
ingerida, absorbida, perdida como heces y en procesos metabólicos, y finalmente la
asimilada dirigida al crecimiento-reproducción. En este sentido, es importante la
determinación de los requerimientos nutricionales ya mencionados.

PREGUNTAS E HIPOTESIS

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Tomando en consideración que en general el metabolismo de los cefalópodos es
esencialmente proteico, es posible pensar que este tipo de organismos tienen un
requerimiento de proteínas elevado. En este contexto el requerimiento de aa en términos
de cantidad y calidad debe ser un factor clave para establecer sus requerimientos
nutricionales.

La presencia de aa en el líquido perivitelino puede representar una función relevante

desde el punto de vista nutricional. Cabe preguntarse si estos aa son movilizados,
metabolizados almacenados e incluso utilizados entre el líquido perivitelino y el vitelo (y
por ende al embrión) durante el desarrollo ontogénico, en función de las necesidades
osmóticas y nutricionales del embrión. De existir una dinámica definida de aa al interior
del huevo, es posible que no todos los aa participen, sino probablemente solo aquellos
que tengan una alta concentración, por ejemplo.

Puede suponerse que la composición proteica y aminoacídica de las presas naturales

(Callinectes sp.) de O. maya, con las que se han obtenido los mejores crecimientos,
sean un indicativo de los principales requerimientos nutricionales necesarios para el
desarrollo de los pulpos. Es de pensarse que las composiciones de aa tanto del alimento
natural como del obtenido en el desarrollo ontogénico tienen una alta correspondencia.

Dietas experimentales, basadas en los requerimientos de aa obtenidos a partir de los

perfiles en los embriones y del alimento natural, pueden satisfacer las necesidades
nutricionales de los juveniles tempranos de O. maya.

Dados los cambios morfológicos, conductuales y posiblemente bioquímicos durante la

etapa de juvenil temprano, los requerimientos proteicos y en especial de aa se modifican
durante esta etapa.

A partir de la hipótesis anterior, es de suponerse que la actividad proteolítica de los

pulpos, así como de las enzimas involucradas, sea diferente conforme el animal crece en
concordancia con los cambios morfológicos y bioquímicos señalados.

OBJETIVO GENERAL

Generar un modelo conceptual que explique el funcionamiento del metabolismo de

proteínas en Octopus maya con particular énfasis en el metabolismo de aminoácidos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

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• Evaluar la forma en que los aminoácidos modulan el metabolismo de las proteínas
durante el desarrollo ontogénico del pulpo O. maya.

• Determinar los requerimientos de aminoácidos de los juveniles tempranos de O.

maya en función de la composición aminoacídica establecida en el desarrollo
ontogénico.

• Determinar la forma en que la composición aminoacídica de la dieta afecta la

sobrevivencia, el crecimiento y el balance energético de juveniles tempranos de O.
maya.

METAS

• Determinar la composición de aa durante el desarrollo ontogénico de O. maya en el

líquido perivitelino, en el vitelo y en el embrión.

• Determinar el perfil de aa de las presas naturales de O. maya, en este caso jaibas

(Callinectes sp.).

• Diseñar dietas experimentales con una composición conocida, basadas en la

determinación de los requerimientos de aa.

• Aplicar las dietas elaboradas y determinar el perfil de aa en juveniles tempranos de

O. maya.

• Determinar la actividad de las enzimas digestivas de juveniles tempranos de O.

maya sometidos a las dietas elaboradas.

• Determinar los componentes del balance energético: tasa de crecimiento (TC), tasa
de respiración (VO2), tasa de excreción nitrogenada (N), tasa de ingestión de
alimento (energía ingerida, I), heces (H) y eficiencia de asimilación (EA), en juveniles
tempranos de O. maya sometidos a los diferentes tratamientos alimenticios.

• Integrar la información proveniente de los perfiles de aminoácidos, del metabolismo

nitrogenado y de la actividad enzimática, con el fin de generar el modelo conceptual.

METODOLOGIA

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I. Determinación de los perfiles de aa en embriones de O. maya y en jaiba
Callinectes.

Disponibilidad de pulpos hembras y huevos

A partir de hembras maduras provenientes del laboratorio, alimentadas con una dieta
estándar de jaiba-mejillón elaborada y probada en la UMDI-UNAM en Sisal, se obtendrán
los huevos respectivos. La disponibilidad de estas hembras en el laboratorio no
representa inconveniente ya que se posee al momento con una infraestructura que
permite el cuidado y la maduración de estas hembras, hasta la puesta de huevos,
incluyendo un sistema de incubación diseñado en la misma UMDI-UNAM de Sisal.

Presión osmótica
Se realizarán muestreos periódicos cada 10 días hasta llegar a los 50 días, edad a la
cual se tiene la seguridad de haber sucedido la liberación de los embriones de los
huevos. Se determinará la presión osmótica de una muestra de 10 huevos, realizando
cuidadosamente una disección para obtener muestras provenientes del líquido
perivitelino, el vitelo y el mismo embrión. Se utilizará un micro-osmómetro Mod. 3 MO
plus que reporta los resultados como mosm / Kg. de agua (American Advanced
Instruments).

Composición de aa
Las mismas muestras del líquido perivitelino, vitelo y embrión servirán para determinar,
mediante la técnica de cromatografía líquida de alta precisión (HPLC), la composición de
aa en cada uno. Para la determinación de la composición de aa, las muestras se tratarán
previamente liofilizándolas y procediendo a la hidrolización, reconstitución y
derivatización de las mismas para finalmente correr los análisis y obtener el
cromatograma respectivo. Se utilizará un HPLC marca Waters con detector de
fluorescencia y dual (absorbancia).

A partir del día 20, edad a la cual el embrión muestra una diferenciación evidente en su
morfología, se muestreará el tejido muscular de los tentáculos y de ser posible la
glándula digestiva por separado, en 5 embriones, para la misma determinación de la
composición de aa.

Para el muestreo en las jaibas, se procederá a diseccionar 5 organismos, extrayando

muestras de: músculo (a nivel de quelas mayores e interior del caparazón), las branquias
y el ovario. Cada muestra se almacenará en nitrógeno líquido hasta su análisis, el cual
consistirá del mismo procedimiento que para las muestras de embriones.
Tomando en cuenta la duración del desarrollo embrionario (45 días aproximadamente),
el tiempo para la toma de muestras de los huevos y embriones y análisis de las
muestras, se espera consumir 3 meses de trabajo en esta etapa. Este tiempo puede

11
variar dependiendo de la sobrevivencia de los embriones y de la disponibilidad inmediata
de los huevos.

II. Formulación de dietas artificiales

En el laboratorio, se elaborarán las dietas experimentales (tratamientos) basadas en la

determinación de los requerimientos de aa obtenidos a partir de las composiciones de aa
de los embriones y de las jaibas.

Estudios previos (Villanueva et al., 2004 con O. vulgaris; Domínguez et al., en prensa
con O. maya) coinciden en señalar que lisina, leucina y arginina representan la mitad de
los aa esenciales, mientras que ácido aspártico y el ácido glutámico representan casi la
mitad de los aa no esenciales. Por lo tanto, como punto inicial se elaborarán 5 dietas,
correspondientes con niveles diferentes de estos aminoácidos. Se utilizará una dieta
base ya elaborada en la UMDI, complementada con una mezcla de aa cristalinos,
similares a los requerimientos determinados, excepto para el aa bajo prueba. Tomando
la metodología seguida por Millanema et al. (1996), las dietas se elaborarán
incrementando los niveles de el aa correspondiente, que serán en función de un
porcentaje de la dieta proteica. Los niveles del aa estarán por debajo y por arriba de los
niveles de aa determinados en los requerimientos previos. De ser necesario, se
modificarán los niveles de ácido aspártico y ácido glutámico con el fin de mantener, en
base de nitrógeno, las dietas isonitrogenadas.

Se mezclarán todos los ingredientes hasta obtener una consistencia en forma de pasta
conteniendo un 5% de humedad. Estas dietas serán almacenadas en frío hasta su
aplicación.

Para los organismos marcados como control se utilizará una dieta estándar que consiste
en una mezcla de jaiba-mejillón (70% y 30%), la cual en experimentos previos con dietas
naturales ha demostrado ser bien aceptada por los organismos y que produce un
crecimiento significativo.

III. Aplicación de las dietas

Cada una de las dietas serán probadas de la siguiente manera: 10 organismos juveniles
serán colocados en estanques experimentales de 0.5 lt de capacidad, de forma
individualizada. Los estanques serán acondicionados con aireación constante y flujo de
agua de mar equivalente a un recambio de 300% diario. Con esto se aseguran niveles
de nitrógeno amoniacal y nitrito por debajo de 0.1 mg/l, y nitrato de menos de 50 mg/l,
así como un pH entre 7.7. y 8.2 (Rosas et al, 1997). Estos parámetros se citan como los

12
recomendados como los más adecuados para el mantenimiento y cultivo de diferentes
especies de Octopus, incluyendo a O. maya (Hanlon y Forsythe, 1985).

Los organismos serán alimentados diariamente a las 9:00 horas, ofreciendo en un

principio 20% de su biomasa corporal, acomodando el alimento en conchas de bivalvos
vacías y colocándolas en los tanques experimentales. Después de 4 horas de la
aplicación del alimento, se retirarán las heces y el resto de la materia orgánica producto
del alimento no ingerido. Cada una de las dietas se aplicarán durante 30 días.

Tomando en cuenta el tiempo invertido en la preparación del sistema, la aplicación de la

dieta y la toma de muestras y análisis de las mismas. Se espera consumir un tiempo de
mínimo 40-45 días para probar cada dieta (correspondiente a cada aminoácido),
multiplicado por 5 dietas, arrojan un estimado de al menos 225 días de trabajo en esta
etapa. Este tiempo puede aumentar en caso de determinarse el análisis de un número
mayor de aa que representen más dietas a probar.

Determinación de proteasas y proteínas totales

De forma individualizada, se obtendrán las proteasas totales y las proteínas totales

mediante la técnica siguiente: En un tubo Eppendorf de 1.5 ml se colocaron 125 μl de
AZOCOLL (Sigma A4341), (diluido en buffer sodio fosfato 10mM, ph 7) como sustrato,
75 μl de agua libre de pirógenos, y 25 μl de extracto (dilución 1:100) se agitó en el
vórtex, incubando la reacción a 37 °C por 30 minutos, posteriormente se adiciona 1 mL
de TCA al 5% (ácido tricloroacético) para parar la reacción haciendo que las proteínas se
precipiten. Después se centrifugan las muestras a 10,000 rpm durante 10 min. Se lee el
sobrenadante a 520 nm en el espectrofotómetro (Spectronic modelo 21D), en la función
de absorbancia de luz visible en sensibilidad media (Todd, 1949).

Para la medición de la proteinas totales, se utilizará una prueba comercial para micro-
determinaciones según la técnica de Bradford (1976). Se utilizarán 10 μl de plasma
diluido (5μl de plasma en 3000 μl de agua inyectable libre de pirógenos) en una micro
placa de lector de ELISA (Fig.9) y se añadirán 200 μL de solución reactiva. Las muestras
se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos registrándose la absorbancia a
595 nm. La concentración de proteínas (mg/ml) se calcula con una curva patrón
utilizando el estándar comercial de albúmina bovina.

Efecto de la dieta en juveniles tempranos

13
Determinación de proteínas y aminoácidos.
Se realizarán muestreos de los juveniles cada 2 días durante un periodo de 30 días, lo
que hace un total de 15 muestreos. Se procederá a determinar tanto las proteínas como
los aminoácidos iniciales, así como las proteínas al momento del muestreo en el tiempo t
(días) hasta finalizar el periodo de experimentación (t=0, t=2, t=4, … t=30). Se aplicarán
las mismas técnicas para determinación de proteínas y composición de aminoácidos ya
descritas para los embriones.

Balance energético

Crecimiento y sobrevivencia.
En cada muestreo se determinará el crecimiento y la sobrevivencia. La tasa de
crecimiento específica (TCE) se calculará utilizando la ecuación TC=[(ln P2 – lnP1)/T2 –
T1] x 100 , donde P1 y P2 sopn el peso humedo inicial y final (g), respectivamente, y T1 y
T2 son el tiempo inicial y final del periodo experimental respectivo. La sobrevivencia se
obtendrá de la diferencia de los animales al inicio y al final del periodo de crecimiento.

Consumo de oxígeno y excreción de amonio.

Al final de cada periodo experimental (30 días), se procederá a determinar en los
organismos sometidos en cada dieta el consumo de oxígeno y la excreción de amonio.
Para el consumo de oxígeno se utilizarán 5 organismos de cada tratamiento,
colocándolos individualmente en cámaras respirométricas conectadas a un sistema
cerrado de circulación de agua de mar donde se controle la temperatura y se detecte la
concentración de oxígeno con un oxímetro con precisión de 0.1 mg02/ml. Se aplicará la
ecuación: V02 = (Oxie – Oxis) x F , donde Oxie y Oxis son las concentraciones de oxígeno
a al entrada y a la salida de la cámara, respectivamente y F es el flujo de agua.

Para evaluar la tasa de excreción de amonio, se analizarán muestras de agua antes y

después de su paso por cada cámara tanto en animales en ayuno (Nrut= N de rutina)
como alimentados (NENPA). El valor del amonio excretado se transforma a su
equivalente energético utilizando el factor de 20.5 joules/mg de amonio excretado, el cual
se utiliza para evaluar la energía perdida en los productos de excreción nitrogenada (U).

Cronograma propuesto

14
 Meses
Actividad 1 5 1 1 2 2 3 3

0 5 0 5 0 5

Protocolo
completo
(proyecto)
Obtención
huevos
Desarrollo
embrionar
Muestras
embriones
y análisis
aa
Elaborar
dietas
Aplicar
dietas
Enzimas
digestivas
Balance
energético
Estancia
investigac
España
Integrar
informació
n
Modelo
conceptual
Document
o final

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