MÉTODOS DE SIEMBRA

Agotamiento Masivo

Secreciones, coprocultivo, Para líquidos.

repique de tetrationato y BHI.

Rejilla Antibiograma

Para urocultivo con asa 1, 2 y 3 masivos con

calibrada (10 µ l ). escobillón. Debe ser un
rayado homogéneo.

*Nota: Todos los cultivos se incuban por 48 horas excepto las orinas que se
incuban a 24 horas (cuando es de punción suprapúbica se incuba por 48
horas)
 TIPO DE MUESTRA MEDIO DE CULTIVO TÉCNICA DE SIEMBRA RECOMENDACIONES
Orina 1. Agar Mc Conkey. 1. Agotamiento El frasco de orina no se
0-1 2. Agar sangre. 2. Rejilla. descarta si hay que dejar
1-5 Bacterias en el Primero en McK y luego en Con asa calibrada (10λ) para el PO. Sólo se le hace
5-10 gram agar sangre. gram cuando lo piden y se
>10 deja una gota sin extenderla
en la lámina.
Frotis vaginal 1. A. McK. Agotamiento con asa de Gram: En ovillo.
2. A.S. argolla. Fresco con solución salina y
3. BHI. entre lámina y laminilla.
Inóculos con el hisopo el cual
se toma con pinza estéril.
Secreción de ojo 1. A. McK. Agotamiento con asa de Gram: En ovillo.
2. A.S. argolla. A.S.: Estría de S. aureus.
3. A. Choc. El escobillón para el inóculo
4. BHI. se toma con pinza estéril.
Inóculo con el escobillón.
Secreción bronquial 1. A. McK. Agotamiento: Con palillo del BK: Extendido en lámina.
2. A.S. BK. Gram: En ovillo.
3. A. Choc. KOH 10%: Una gota entre
Esputo: A.S., A. McK, y A. lámina y laminilla.
Choc.
Secreción de oído 1. A. McK. Agotamiento con asa de KOH 10%.
2. A. S. argolla. Gram: Si lo piden.
3. BHI.
Inóculos con escobillón el
cual se toma con pinza
estéril.
Coprocultivo 1. A. McK. 1 y 2 por agotamiento. No se le hace gram.
2. HEA. 5 cm de caldo + 5 gotas de
 3. Caldo de tetrationato. lugol (yodo).
LCR 1. Agar chocolate. Masiva: Inóculo del Gram: Del sedimento, una
2. Agar sangre: Estría del sedimento, se toma con gota pequeña.
S. aureus. chupa estéril. Tinta china: Del sedimento,
3. BHI. una gota pequeña.
4. Agar Mc Conkey: No KOH 10%: Del sedimento y
siempre. se monta como un fresco.
BK: Una gota del sedimento.

Hemocultivos 1. A. McK. Agotamiento: Inóculo con la Gram: Una gota.

2. A. S. punta de la jeringa, siembra
con asa de argolla.
Líquido pleural 1. A. Choc. 1. Masivo. Gram: Una gota.
Centrifugar por 10 minutos a 2. A.S. 2. Masivo. KOH 10%: Entre lámina y
2500 rpm y trabajar con el 3. BHI. 3. Una gota. laminilla como un fresco (sin
sedimento. Se guarda el Inóculos del sedimento con Si crece en forma de nube en KOH) para ver mejor la
sobrenadante. chupa. También para líquido el BHI se debe sospechar de celularidad, a excepción del
ascítico (A.S., A. McK) y Mycobacterium. líquido peritoneal quirúrgico.
sinovial( A.S., A. Choc.)
Lavado broncoalveolar 1. A. Choc. Masivo. BK y KOH 10%: Una gota.
Cuando está muy líquido se 2. A.S.
debe centrifugar y tomar del 3. BHI.
sedimento con chupa estéril.
Líquido peritoneal y A.S., A. McK, BHI. Agotamiento. Gram.
quirúrgico
Líquido amniótico A.S., A. Choc., BHI. Gram.
Semen A.S., A. McK, A. Choc., BHI. Gram.
Catéteres y secreciones A.S., A. McK, BHI. Catéter: MAKI. Gram.
Secreciones: Agotamiento. KOH 10% si lo piden.
 BATERÍAS BIOQUÍMICAS

 TSI (Agar triple azúcar hierro)

- Indicador: Rojo de fenol. Para la detección del sulfuro de hidrógeno se

utiliza el tiosulfato de sodio como indicador.
- Siembra: En picadura y luego por agotamiento con asa recta. Agar en pico
de flauta.
- En presencia de ácidos producto de la fermentación de azúcares el medio
vira de rojo a amarillo, pues el pH está a menos de 6,8.
- Reacciones:
a) Pico alcalino / fondo alcalino: No fermentación de azúcares.
b) Pico alcalino / fondo ácido: Fermentación de glucosa únicamente.
c) Pico alcalino / fondo ácido: Fermentación de glucosa con
producción de gas H2S.
d) Pico ácido / fondo ácido: Fermentación de glucosa y de lactosa
(y/o sacarosa).

 INDOL

-Revelador: p-dimetilaminobenzaldehído (reactivo de Erlich o de Kovach).

-Técnica: Inocular por picadura e incubar a 35º C durante 18-24 horas. Al
finalizar este período añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.
Si se emplea reactivo de Erlich este paso debe ser precedido por la adición de
1ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovach.
-El desarrollo de un color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo
segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una
prueba positiva.

 ROJO DE METILO

-Indicador: Rojo de metilo.

-Técnica: Inocular el caldo con un cultivo puro del organismo en estudio.
Incubar a 35º C durante 48-72 horas. Finalizado este período, añadir
directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo.
-El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la
producción de ácido es suficiente como para bajar el pH a 4,4 y es una prueba
positiva. Dado que otros microorganismos pueden producir cantidades
menores de ácido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color
naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba
positiva.
  VOGES-PROSKAUER

-Reveladores:
a) α -naftol al 5% como intensificador de color (α -naftol = 5 g;
alcohol etílico absoluto = 100 ml).
b) Hidróxido de potasio al 40% como agente oxidante (KOH = 40 g;
agua destilada = 100 ml).
-Técnica: Inocular un tubo de caldo RM / VP con un cultivo puro del
microorganismo en estudio. Incubar durante 24 horas a 35º C. Al finalizar este
período, transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Añadir 0,6 ml de
α -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40% (6 gotas de α -naftol y 2 gotas de KOH
al 40%). Es esencial adicionar los reactivos en este orden. Agitar el tubo
cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo
reposar durante 10 - 15 minutos.
-Una prueba positiva está indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15
minutos de añadir los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto
de oxidación de la acetoína. La prueba no debe leerse luego de más de una
hora pues los cultivos como este negativos pueden producir un color cobrizo,
con la posibilidad de una interpretación falsa positiva.

 CITRATO

-Indicador: Azul de bromotimol, amarillo a pH menor que 6 y azul a pH mayor

de 7,6.
-Técnica: Inocular (inóculo escaso) en una sola estría con asa recta en el pico
del agar inclinado (agar en pico de flauta). Si el inóculo es demasiado
abundante los compuestos orgánicos preformados dentro de las paredes
celulares de las bacterias que van muriendo pueden liberar suficiente carbono y
nitrógeno como para producir un resultado falso positivo. Al trabajar con series
es importante estriar primero el medio con citrato a fin de evitar el arrastre de
proteínas e hidratos de carbono de los otros medio.
-El agar es originalmente de color verde; el desarrollo de un color azul intenso
en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo ha
sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de
productos alcalinos. La prueba es también positiva en ausencia de color azul si
existe un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estría de inoculación.
Esto es posible debido a que para que el organismo sea visible, debe
encontrarse en la fase logarítmica, lo cual es factible solo si el carbono y el
nitrógeno han sido asimilados. Esta interpretación se puede confirmar
incubando el tubo durante 24 horas más, en que usualmente aparece un color
azul.
  UREA

-Indicador: Fenolftaleína (incolora a pH <8,1; rosa-rojo a pH >8,1).

-Técnica: Estriar la superficie del agar en pico de flauta con el microorganismo
en estudio. Incubar a 35º C durante 18-24 horas.
-Los microorganismos que hidrolizan urea rápidamente pueden producir
reacciones positivas en 1 o 2 horas, las especies menos activas pueden
requerir 3 o más días.
-Reacciones:
a) Degradadores rápidos de urea: Color rojo en todo el medio. Ureasa
fuerte (color fucsia).
b) Degradadores lentos de urea: Color rojo inicial solo en el pico y
gradualmente abarca todo el tubo.
c) No hay hidrólisis de urea: Color amarillo original.

 FENILALANINA DESAMINASA (PPA)

-Revelador: Cloruro férrico al 10%. No tiene indicador de pH.

-Técnica: Inocular una estría en la superficie del agar en “pico de flauta” con
una colonia de cultivo puro. Luego de incubar a 35º C durante 18-24 horas,
añadir 4-5 gotas de reactivo cloruro férrico al 10% directamente sobre la
superficie del agar. Al añadir el reactivo, rotar el tubo para desprender las
colonias de la superficie.
-La inmediata aparición de un color verde intenso (quelación del hierro) indica
la presencia de ácido fenilpirúvico (quela el hierro del cloruro férrico) y es una
prueba positiva.

 LIA (Agar Lisina Hierro)

-Indicador: Púrpura de bromocresol.

-Técnica: Sembrar en doble picadura y estriar la superficie del agar en “pico de
flauta”, incubar a 35º C durante 18-24 horas.
-Trabaja sobre la glucosa, a las 10 horas de incubación se ve amarillo en el
fondo (fermentación de la glucosa), baja el pH (inicialmente estabilizado a 6,0)
por la producción de ácido pirúvico y en ese momento se dispara la enzima
lisina descarboxilasa (activa a pH <5,5) y empieza a trabajar sobre la lisina, a
las 24 horas se vuelve alcalino por la producción de aminas y el medio toma un
color púrpura indicando una prueba positiva. Por el tiosulfato y el citrato
amónico férrico se puede producir gas.
  MALONATO

-Indicador: Azul de bromotimol. Caldo estabilizado a pH de 6,7.

-Técnica: Inocular el caldo con una colonia de cultivo puro del microorganismo
en estudio.
-Un microorganismo es incapaz de crecer en el caldo a menos que pueda
utilizar el malonato como única fuente de carbono.
-Reacciones:
a) Positivo: Color azul intenso en todo el caldo. Alcalino (pH 7,6).
b) Negativo: No hay cambio de color (verde) o se vuelve amarillo (pH 6)
pues únicamente hay fermentación de glucosa.

 MOTILIDAD

-Se emplean tubos con agar semisólido. Los medios contienen

concentraciones de agar de 0.4% o menos para permitir la libre diseminación
de los microorganismos.
-Técnica: Se siembra por picadura pero solo medio centímetro de profundidad.
-La prueba se interpreta realizando un examen macroscópico del medio para
observar una zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación.
-En la mayoría de las especies móviles , la movilidad puede observarse a
35ºC; pero Yersinia enterocolítica y Listeria monocytogenes son móviles
únicamente a 22º C.

 ONPG (O-NITROFENIL-B-D-GALACTOPIRANOSIDO)

-Técnica: Emulsificar un asa cargado de desarrollo bacteriano en 0,5 ml de

solución fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha
suspensión una gota de tolueno y mezclar unos segundos para liberar la
enzima B-galactosidasa de las células bacterianas. Añadir a la suspensión
igual cantidad de solución de buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de
agua a 37º C.
-Interpretación: La velocidad de hidrólisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser
elevada en algunos microorganismos, produciéndose una acción que se
visualiza por la aparición de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayoría de
las pruebas son positivas en una hora; sin embargo, las reacciones no se
deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubación. El color
amarillo suele ser bien definido e indica que el organismo ha producido
ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la B-galactosidasa.
Microorganism TSI H2S/GAS LIA CITRATO UREA PPA INDOL MOTILIDAD RM VP MALONATO
o

E. coli A/A -/+ K/K - - - + + (-) + - -

E. coli inactiva K/A -/+ K/K - - - + + (-) + - -
E.coli A/A -/+ K/K - - - - + (-) + - -
indonógena
Shigella boydii K/A - /+ K/A - - - - (+) - + - -
Shigella K/A -/- K/A - - - Var. - + - -
dysenteriae
Shigella flexneri K/A -/- K/A - - - Var. - + - -
Shigella sonei K/A -/- K/A - - - - - + - -
Salmonella tiphy K/A +/- K/K - - - - + + - -
Salmonella K/A - (++) / + K/A - - - - + + - -
paratiphy A
Salmonella K/A Var. / + K/K - (+) - - - + + - -
choleraesuis
Citrobacter K/A ++ / + K/K(A) + + (-) - - + + - - (+)
freundii
Citrobacter K/A -/+ K/K(A) + +/- - + + + - +
diversus
Klebsiella A/A -/+ K/K + + - + - - + +
oxytoca
Klebsiella A/A -/+ K/K + + - - - - + +
pneumoniae
Klebsiella K/A -/- K/A - - - - - + - +
rhinoscleromatis
Serratia K(A)/A - / + (-) K/K + - - - + - + -
liquefaciens
Serratia K/A - / Var. K/K + - (+) - - + - + -
marcescens
Serratia rubidae A/A - / - (+) K/K(A) + - - - + (-) - + +
Enterobacter A/A -/+ K/K + - - - + - + + (-)
aerogenes
Enterobacter K(A)/A - / - (+) K/A Var. - (+) - (+) - (+) + (-) - + (-) + (-)
agglomerans
Proteus mirabilis K/A ++ / + KR/A (+) - + + - + + -(+) -
Proteus vulgaris K/A ++ / + (-) R/A - (+) + + + + + - -
Providencia K/A -/- R/A + - + + + (-) + - -
stuartii
Providencia K/A -/- R/A + + + + + + - -
rettgeri
Morganella K(A)/A -/+ R/A - + + + + + - -
morganii
Yersinia K/A -/- K/A - + (-) - Var. - + - -
enterocolítica
Pseudomona K/K -/- K/K + Var. / - - + +/- - +
aeruginosa +débil
Acinetobacter K/K -/- K/K + Var. - - - + - +
Se mira principalmenteTSI, RM y VP.
Citrobacter freundii Vs. Salmonella: Hacer polivalente A = Salmonella aglutina.
Salmonella y Shigella tienen significado patógeno en coprocultivo.

E. coli : VP (-)
Klebsiella Pseudomona = Motilidad (+)
A/A Enterobacter VP (+) K/A Acinetobacter = Motilidad (-). Colonias rosadas.
Serratia

Citrato (-) = E. coli (-) = Klebsiella.

(+) Motilidad (+) = Enterobacter = DNasa (-)
ó Serratia = DNasa (+)
 ANTÍGENOS BACTERIANOS EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

LCR

Separar en dos tubos estériles

(se deja un poco para el citoquímico)

Tubo 1 Tubo 2

Baño María 100º C Centrifugar por 10 minutos

por 3 minutos a 2500 rpm

Reactivos 1-5 del Sedimento Sobrenadante

Directigen

Cultivo, gram, KOH, Reactivo 6 Reincubar

tinta china del Directigen* en tubo
estéril y
guardar

Antígenos bacterianos Directigen Meningitis Combo Test

50 µl de LCR + 1 gota del reactivo correspondiente

Agitador 8-10 minutos

Leer por aglutinación

*Con el reactivo 6 no se inactiva el LCR porque es para E. coli que es

termolábil, de lo contrario no se verá la reacción.
  HEMOCULTIVOS

-Limpiar tapa del frasco:

1. Alcohol.
2. Alcohol yodado.
3. Algodón seco.
-Agita el frasco y tomar con jeringa estéril, quitar la punta de la jeringa y dejar caer una
gota como inóculo en el medio de cultivo.

 TETRATIONATO

Repicar en AS, McK y XLD por agotamiento. No se debe emulsionar el caldo. El

caldo de tetrationato favorece el desarrollo de Salmonella y Shigella, inhibiendo el
crecimiento de coliformes hasta 18-24 horas. Antes de usarlo agregar 5 gotas de
yodo.

 GRAM

1. Flamear para fijar la preparación.

2. Violeta de genciana 1 minuto.
3. Lavar con agua.
4. Lugol 1 minuto.
5. Lavar con agua.
6. Alcohol acetona 10 segundos.
7. Lavar con agua.
8. Safranina 30 segundos.
9. Lavar con agua.

 ZN

1. Flamear lámina para fijar. Se flamea por los bordes externos de la lámina,
nunca hacia el centro de la misma.
2. Fuschina y flamear hasta obtener los 3 vapores.
3. Lavar con agua.
4. Alcohol ácido hasta que no quede nada rojo.
5. Lavar con agua.
6. Azul de metileno 5 minutos.
7. Lavar con agua.

 INFORME DE LÁMINAS

-Gram de esputo: Se observa primero en 10X si hay más de 25 PMN y células

epiteliales. Se observa si hay biota mixta o única; y si hay predominio de un tipo de
microorganismo especial. Se observa si hay presencia de blastoconidias y
pseudomicelios. También se informa la cantidad de reacción leucocitaria. Se debe
realizar el examen microscópico en 10X para determinar el grado de contaminación,
cuantificando células epiteliales y leucocitos: *Clasificación según Barlett. >25 células
epiteliales y <25 PMN no sirve. Microbiota predominante o microbiota mixta:
Abundante, escaso o moderado.

GRUPO LEUCOCITOS CÉL.

*Grupos 1,2 y 3 EPITELIALES
no se pueden 6 >25 <25
cultivar. 5 >25 <10
4 >25 10-25
3 <25 >25
2 10-25 >25
1 <10 >25

Cuando se observan pocas células escamosas y predominio de bacterias se debe

reportar. Si hay ausencia de leucocitos indica que es una muestra mal recolectada, o
se trata de un paciente sin respuesta inmunológica. Si se sospecha infección
pulmonar por anaerobios, el gram y el cultivo no tienen ningún valor.

-Secreciones de piel: Reacción leucocitaria en número (0-1 x c, 1-5 x c, 6-10 x c, + 10

x c) y microorganismos en abundante, moderado o escaso.

-Hemocultivo: Se informa el tipo de microorganismo que se encuentre pero no se

cuantifica.

-Gram de orina: Las bacterias se informan en número = 0-1 x c,1-5 x c, 6-10 x c, + 10

x c.

-BK: Observar toda la lámina e informar así:

(-) = No hay BAAR en 100 c.
(+) = < 1 BAAR x c en 100 c. En el BK las blastoconidias se ven azules.
(++) = 1-10 BAAR x c en 50 c. > 25 PMN y < 25 células epiteliales.
(+++) = >10 BAAR x c en 20 c.

-Fresco de frotis vaginal: Se informan las células guía como (+) o (-). En el fresco se
observa si hay presencia de Trichomonas, pseudomicelios y blastoconidias. Se
informa la respuesta leucocitaria si está aumentada y si es así se buscan
pseudomicelios y blastoconidias. Cuando se duda de células guía, se confirman en el
gram.

-Gram de frotis vaginal: Las bacterias se informan como abundantes, moderadas o

escasas. Las células guía como (+) o (-), las blastoconidias como abundantes,
moderadas o escasas y la reacción leucocitaria en número = (0-1 x c, 1-5 x c, 6-10 x
c, + 10 x c). El sistema para el diagnóstico de vaginosis bacteriana está dividido en 3
partes:

A. Cuantificación de:

1. Bacilos gram positivos (Lactobacillus spp.).

2. Cocobacilos gram variables (G. vaginalis + Bacteroides).
3. Bacilos curvos gram negativos (Mobilluncus).

Las bacterias se cuantifican de 1+ a 4+ de acuerdo con el número que se encuentren

por campo microscópico.
0+ = No hay bacterias.
1+ = 1 bacteria x c.
2+ = 1-4 bacterias x c.
3+ = 5-30 bacterias x c.
4+ = > 30 bacterias x c.

B. Una vez establecida la cantidad, se asigna un puntaje de acuerdo con la siguiente

tabla:

Lactobacillus G. vaginalis y Bacteroides Mobilluncus

spp.
4+ = 0 puntos 4+ = 4 puntos 4+ = 2 puntos
3+ = 1 punto 3+ = 3 puntos 3+ = 2 puntos
2+ = 2 puntos 2+ = 2 puntos 2+ = 1 punto
1+ = 3 puntos 1+ = 1 punto 1+ = 1 punto
0+ = 4 puntos 0+ = 0 puntos 0+ = 0 puntos

C. La puntuación final se obtiene sumando los puntos de los 3 grupos.

De 7 o más puntos = Vaginosis bacteriana.

De 4 a 6 puntos = Vaginosis intermedia.
De 0 a 3 puntos = Normal.

ANTIBIOGRAMA

En agar MH, con una concentración de microorganismos de 0,5 según escala de

McFarland (que se vean las letras a través del tubo con caldo CASO). Introducir sólo
la cabeza del escobillón estéril, eliminar el exceso contra la pared del tubo, sembrar
suave y de manera homogénea. En una caja se pueden colocar hasta 7 antibióticos
(se recomienda no colocar sensidiscos en el centro). Con Enterococcus y S.
pneumoniae el antibiograma se realiza en agar sangre. En la lectura cuando se
encuentra doble halo de crecimiento se mide el interno.

• Gram negativos

Sensidiscos R I S
CTX (Cefotaxime) ≤14 15-22 ≥23
AN (Amikacina) ≤14 15-17 ≥18
GM (Gentamicina) ≤12 13-14 ≥15
FEP (Cefepime) ≤14 15-17 ≥18
CAZ (Ceftazidime) ≤14 15-17 ≥18
CRO (Ceftriaxone) ≤13 14-20 ≥21
CFPs (Cefoperazone) ≤15 16-20 ≥21
 • Gram positivos

Sensidiscos R I S
CC (Clindamicina) ≤14 15-20 ≥21
CF (Cephalotin) ≤14 15-17 ≥18
P (Penicilina) ≤28 (Stph) - ≥24 (Strp)
≥29 (Stph)
VA (Vancomicina) 10-11 ≥12
OX (Oxacilina)* ≤10 11-12 ≥13
AM (Ampicilina) ≤28 - ≥29
≥24 (Strp)
SXT(Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥16
SAM (Ampicilina Sulbactam) ≤11 12-14 ≥15
*Oxacilina no se le pone a Enterococcus.

• Pseudomonas y Acinetobacter (G-)

Sensidiscos R I S
CAZ (Ceftazidime) ≤14 15-17 ≥18
AN (Amikacina) ≤14 15-16 ≥17
CIP(Ciprofloxacina) ≤15 16-20 ≥21
ATM (Aztreonam) ≤15 16-21 ≥22
FEP (Cefepime) ≤14 15-17 ≥18
MEM (Meropenem) ≤13 14-15 ≥16
TZP (Piperacilina Tazobactam) ≤17 18-20 ≥21
SXT (Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥16
*Se ponen todos excepto AN y FEP para no repetirlos.

• Urocultivos

Sensidiscos R I S
AM (Ampicilina) ≤13 14-16 ≥17 (gram -)
≥29 (gram +)
SXT (Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥17
NOR (Norfloxacina) ≤12 13-16 ≥17
FM (Nitrofurantoína) ≤14 15-16 ≥17
CIP(Ciprofloxacina) ≤15 16-20 ≥21
ATM (Aztreonam) ≤15 16-21 ≥22
 • BLEE (Betalactamasas de espectro extendido) Técnica

Sensidiscos R I S
CTX/CLA (Cefotaxime/Ac. clavulánico) ≥22
CAZ/CLA (Ceftazidime/Ac. clavulánico)
AMC (Amoxicilina/Ac. clavulánico)

• Haemophilus influenzae

Sensidiscos R I S
CEC (Cefaclor) ≤16 17-19 ≥20
MEM (Meropenem) - - ≥20
CTX-CRO (Cefotaxime-Ceftriaxone) - - ≥26
SXT (Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥16
AM (Ampicilina) ≤18 19-21 ≥22
CLR (Claritromicina) ≤10 11-12 ≥13

• E. coli ATCC

Sensidiscos Halo
CIP (Ciprofloxacina) 30-40
FEP (Cefepime) 29-35
AN (Amikacina) 19-26
CTX (Cefotaxime) 29-35
CAZ (Ceftazidime) 29-35

• S. aureus ATCC

Sensidiscos Halo
E (Eritromicina) 22-30
VA (Vancomicina) 17-21
CF (Cephalotin) 29-37
OX (Oxacilina) 18-24

*Nota: No pueden pasar más de 15 minutos entre la siembra en MH y la ubicación de

los sensidiscos.
Las cepas control ATCC se siembran en MH (antibiograma) y en McK (E. coli, por
agotamiento) ó en AS (S. aureus, por agotamiento)
 ESTÁNDAR INTERPRETATIVO DE LA ZONA DE INHIBICIÓN
MÉTODO KIRBY BAUER

SENSIDISCO E. coli S. aureus P. aeruginosa

ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 27853
Amikacina (30) 19-26 20-26 18-26
Ampicilina (10) 15-23 27-38 -
Ampicilina Sulbactam (10/10) 20-24 29-37 -
Aztreonam (30) 28-36 - 23-29
Cefaclor (30) 23-27 27-31 -
Cefalotin (30) - 29-35 -
Cefotaxime (30) 29-35 - 18-22
Cefoperazona (75) 28-34 24-33 23-29
Ceftazidime (30) 29-35 - 22-29
Cefepime (30) 29-35 - 24-30
Ceftriaxona (30) 29-35 - 17-23
Ciprofloxacina (5) 30-40 22-30 25-33
Cloranfenicol (30) 24-27 19-26 -
Eritromicina (15) - 22-30 -
Gentamicina (30) 19-26 - -
Imipenem (10) 26-32 - 20-28
Meropenem (10) 28-34 - 27-33
Porfloxacina (10) 28-35 17-28 22-29
Oxacilina (1) - 18-24 -
Penicilina (10 UI) - 26-37 -
Trimetoprim Sulfametoxazol 24-32 24-32 -
(1,25/23,75)
Vancomicina (30) - 17-21 -
Clindamicina (2) - 24-30 -
Piperacilina Tazobactam (100/10)
- - -

ESCALA DE McFARLAND

10 tubos tapa rosca, solución de Cloruro de Bario al 1%, solución de Ácido Sulfúrico al
1%.
Tubo BaCl2 (ml) H2SO4 (ml) Concentración bacteriana/ml
( x108)
0,5 0,05 9,95 1,5
1 0,1 9,9 3
2 0,2 9,8 6
3 0,3 9,7 9
4 0,4 9,6 12
5 0,5 9,5 15
6 0,6 9,4 18
7 0,7 9,3 21
8 0,8 9,2 24
9 0,9 9,1 27
10 1,0 9,0 30
 IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS

Catalasa

(+) (-)

*Staphylococcus *Streptococcus

Coagulasa S. pyogenes
Bacitracina (+)
B-hemolíticos Grupo A
(+) (-)

S. aureus S. epidermidis TAXO A

Novobiocina (+) S. pneumoniae
Optoquina (+)
DNasa (+)
AB S. saprophyticus
Novobiocina (-) TAXO P
S. viridans
Optoquina (-)
Se le coloca Oxacilina para investigar “in vitro” la
susceptibilidad frente a la Penicilina G. Es
sensible a la oxacilina si el halo es ≥20mm. TAXO NB
SXT ≥19mm; VA ≥17mm; Clindamicina ≥19mm. Enterococo
No se le pone Penicilina. Bilis-esculina (+)
Si da sensible a la Oxacilina se informa como si lo NaCl (+)
fuese a la Penicilina G.

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

Serie / AB
Fermentadores = Serie / AB No fermentadores DNasa
Oxidasa

Serie / AB Serie / AB

Oxidasa (-) Oxidasa (+)

DNasa (-) DNasa (-)

Enterobacterias Pseudomona (TAXO N)

*Staphylococcus

S. aureus S. saprophyticus S. epidermidis

Coagulasa + - -
DNasa + - -
Novobiocina R R S

*Streptococcus

Bacitracina CAMP Bilis- NaCl Optoquina Hemólisis

Esculina 6,5%
Grupo A S - - - R β
Grupo B R + - V R β
Grupos V - - - R β
C, F, G
Enterococos R - + + R α, β, γ
Grupo D no R - + - R α, γ
enterococos
Viridans V - V - R α, γ
Neumococo V - - - S α

 HEMOCULTIVOS

En caldo tioglicolato se informa crecimiento teniendo en cuenta:

- Turbidez.
- Hemólisis.
- Presencia de colonias flotantes.
- Presencia de pequeños coágulos.
- Presencia de gas.
Si sale positivo para cualquiera de las anteriores posibilidades, se repica en AS y
A.McK. Si sale negativo se guarda hasta por 5 días.

 UROCULTIVO: Si se observan varios tipos de colonias en un urocultivo

indica que es una muestra contaminada.
Todo el medio lleno = +100.000 ufc. Negativo = - 10.000 ufc.
Se cuentan las colonias (del mismo tipo) y se multiplica por 1000.
Cuando en un urocultivo se encuentran colonias blancas sin hemólisis y sin
crecimiento en McK debe sospecharse de levaduras, Staphylococcus y
Corynebacterium; entonces se debe hacer primero un gram y luego las pruebas
correspondientes. Cuando se trata de un urocultivo de una PSP (punción
suprapúbica) cualquier colonia (del mismo tipo) que se encuentre sin importar la
cantidad es significativa.

 TÉCNICA DE MAKI (Cuantitativa)

Para punta de catéter. Se siembra en AS, McK y BHI. Se toma el catéter y se coloca
sobre el agar, se hace rotar 5 veces de arriba hacia abajo sobre el agar con ayuda de
un escobillón estéril. Luego de hacer la siembra en los dos agares se toma el catéter y
se introduce en el BHI.
Se informa a las 24 horas. Si se ven >15 ufc sobre el agar, de los diferentes tipos de
colonias es útil. Si hay < 15 ufc sobre el agar, no tiene validez aunque tenga un BHI
con crecimiento. Y si no hay colonias, se informa como negativo.

 CATALASA

Con una aguja de inoculación o con un palillo de madera, transferir parte del centro de
una colonia a la superficie de un portaobjetos. Agregar una gota de peróxido de
hidrógeno al 3% y observar la formación de burbujas. La aparición rápida y sostenida
de burbujas constituye una reacción positiva. La observación de unas pequeñas
burbujas después de 20 a 30 segundos no se considera un resultado positivo. Debe
tenerse cuidado de no tomar eritrocitos junto con el material de la colonia.

 COAGULASA

1. Prueba en portaobjetos (coagulasa unida): 2 gotas de agua o solución

fisiológica estériles dentro de dos círculos en un portaobjetos.
Emulsificar las colonias en el líquido dentro de cada círculo. Colocar 1
gota de plasma en uno de los círculos y mezclar con palillo. Leer
aglutinación: De 10-15 segundos es positiva; y es negativa si no hay
aglutinación en el término de 2 minutos.
2. Prueba en tubo (coagulasa libre): Emulsificar la colonia en un tubo con
0,5 ml de plasma. Incubar a 35-37º C por 4 horas y observar la
formación del coágulo. Si no se ve el coágulo reincubar a temperatura
ambiente y leer luego de 18 horas.

 OXIDASA

1. Técnica directa en placa: Agregar 2-3 gotas del reactivo (tetrametil o

dimetil p-fenilendiamina) directamente sobre colonias aisladas en agar.
2. Procedimiento indirecto con tiras de papel: Añadir unas gotas del
reactivo a una tira de papel filtro o se usan tiras o discos comerciales
impregnados con reactivo desecado. La colonia se dispersa con el asa
sobre la zona reactiva del papel.
3. HURGV: 1,5 ml de plasma + TAXO N (disco) + colonia. Si cambia a
morado en menos de 2 minutos es positiva.

El derivado tetrametilo de la p-fenilendiamina es más estable y sensible, menos tóxico

que el derivado dimetilo. Es una prueba positiva cuando toma un color morado en 10
segundos, si está entre 10-60 segundos hay que hacer la prueba nuevamente.

 BILIS-ESCULINA

-Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D y especies de

Enterococcus, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis (4% de sales biliares o
40% de bilis); esto da como resultado la formación de glucosa esculetina que
reacciona con los iones férricos (dados por el citrato férrico del medio inorgánico) para
formar un compuesto negro que se difunde.
-Técnica: Inocular en estría el agar inclinado, incubar a 35º C por 24-48 horas. El
ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta indica hidrólisis de la
esculina.

-Nota: Algunos estreptococos del grupo viridans (3%) pueden hidrolizar la esculina en
presencia de bilis.

 PRUEBA DE CAMP

1. Hacer en el centro de la placa de agar sangre una única estría en línea

recta con S. aureus producto de B-hemolisina.
2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, realizar una
estría de los estreptococos betahemolíticos a identificar, en forma
perpendicular a la estría del estafilococo. Realizar estas estrías de tal
manera que, después de la incubación, el desarrollo de los
microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de 3
a 4 cm de longitud. En la misma placa deben sembrarse en forma
similar cepas conocidas de estreptococos del grupo A y del grupo B
como controles negativo y positivo, respectivamente.
3. Incubar la placa a 35º C en aire atmosférico durante 18-24 horas.

-Resultado: Se observa una zona de mayor hemólisis (hemólisis sinérgica) cuando la

B-hemolisina secretada por el estafilococo y el factor CAMP (proteína extracelular)
secretado por el estreptococo del grupo B se intersectan.

 TOLERANCIA A LA SAL

-Técnica: Inocular 2-3 colonias en el caldo (NaCl 6,5%) e incubar toda la noche a 35º
C.
-HURGV: 0,5 ml de NaCl 6,5% + colonia. Incubar toda la noche.
-Resultado: Es una prueba positiva cuando hay presencia de desarrollo bacteriano.

 SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA Y SXT

Tomar las colonias aisladas de estreptococos betahemolíticos y estriar el inóculo hasta

el centro de la mitad de una placa de agar sangre. Con un hisopo estéril o un asa
diseminar el inóculo sobre toda la mitad de la placa. Colocar en forma aséptica un
disco de bacitracina Taxo “A” y un disco de SXT sobre el área sembrada. Asegurarse
de que los discos estén igualmente separados. Utilizando pinzas flameadas, golpear
con suavidad los discos para que se adhieran a la superficie del agar. Incubar la placa
a 35º C.
Sensible: Cualquier tamaño de halo alrededor de cualquiera de los discos.
Resistente: Desarrollo hasta el borde del disco.

Bacitracina SXT Identificación

S R Presumiblemente grupo A
R R Presumiblemente grupo B
S/R S Ni A ni B
  SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

Se utilizan discos de novobiocina de 5 µg. Se prepara una suspensión del

microorganismo aislado en agua estéril o caldo, con una turbidez equivalente a 0,5 de
Mc Farland (con hisopo se distribuye sobre la mitad de la placa de AS) y se coloca un
disco de novobiocina sobre el área sembrada. Incubar durante 18-24 horas a 35º C.
Resistente: Halo 6-12 mm, S. saprophyticus.
Sensible: Halo mayor de 12 mm, S. epidermidis.

 OPTOQUINA

Estriar las colonias en una mitad a un tercio de la placa de AS (área sembrada de 3

cm2). Colocar un disco de optoquina (5 µg/ml) en el tercio superior del área sembrada.
Incubar a 35º C por 18-24 horas en jara con vela o en estufa con 5-7% de CO2. Halos
mayores de 15 mm (o ≥20 mm según HURGV) son característicos de S.pneumoniae.

 CRECIMIENTO EN CALDO GLUCOSA AZIDA (CALDO SF)

El caldo SF es selectivo para estreptococos fecales o enterococos. Crecimiento y

fermentación de glucosa. Homogeneizar en el caldo una colonia de 24 horas de
crecimiento, se realiza a 45º C por 24.48 horas, se puede incubar a 37º C. Indicador:
Púrpura de bromocresol.
Positivo: Turbidez (crecimiento) y fermentación (de rosado o púrpura a amarillo).

 DNasa

Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNasa que es capaz de clivar los

enlaces fosfodiéster internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que
contiene verde de metilo el cual se combina co DNA altamente polimerizado. Cuando
la combinación no ocurre, por acción de la DNasa, se produce una decoloración del
medio.
Se toma una colonia y se inocula en ovillo sobre el agar, se hace un control positivo.
Incubar a 37º C por 24 horas.

 TUBO GERMINAL

Se suspende una pequeña porción de una colonia aislada de la levadura a investigar

en un tubo de ensayo con 0,5 ml de suero o plasma de conejo o humano. Se incuba a
35º C hasta 2 horas máximo. Se coloca una gota de la suspensión de levaduras en
suero sobre un portaobjetos, se cubre con una laminilla y examina al microscopio. Si
es una prueba positiva se trata de Candida albicans.
  FLUIDOS VAGINALES: Se origina en el cuello uterino y la mucosa de la
vagina. Alteraciones:
- Cervicitis: Exocervicitis (Herpes virus), Endocervicitis (N. gonorrhoeae, C.
trachomatis)
- Vaginitis: Trichomonas, Cándida.
- Vaginosis: Gardnerella, bacterias anaerobias. Flujo grisáceo, maloliente, muy
acuoso.

Toma de muestra:
1. Usar espéculo estéril ojalá desechable. Se introduce de lado, luego se voltea y se
abre y observa.
2. Localizar el cuello uterino y observarlo lo mismo que las paredes de la vagina.

 SECRECIONES URETRALES: Secreción tomada directamente de la uretra.

Primera porción de la orina matinal. Si la secreción está presente y es evidente
en la uretra, se limpia la secreción presente con algodón o gasa estéril, y se
toma de la secreción siguiente con escobillón, si no está presente la secreción
se exprime la uretra suavemente con el dedo de la mano enguantada, esto en
el caso de la mujer. Si es un hombre se utiliza asa de argolla o escobillón. Se
hace gram y cultivo del material.

Lactobacilos pocos
Corines No es una reacción normal.
Bacilos gram (-)
Rx leucocitaria

Lactobacilos: Rx normal.

Diplococos gram (-)

intracelulares tipo
Neisseria con proliferación De endocervix, anormal. Hay que hacer cultivo.
de PMN

Diplococos gram (-)

intra y extracelulares
con abundante rx En hombre, rx anormal.
leucocitaria

Vaginosis bacteriana: No hay lactobacilos, test de aminas positivo con KOH al 20%
(2-3 gotas). Sale olor a pescado, pH 7, fresco y gram, no hay presencia de leucocitos
porque es flora normal, no hay inflamación, células guía.

Vaginitis: Rx leucocitaria abundante, flujo purulento, inflamación, pH alterado muy

alcalino.

 Mycobacterium leprae: No se puede cultivar pero si se puede observar por

Ziehl-Neelsen.

- Utilidad de la Bx en lepra: No es Dx.

1. Clasificación de los enfermos.
2. Control del tratamiento: El tratamiento dura dos años, control cada 3 meses.
3. Epidemiología: Por tipo de lepra.
4. Evaluación del programa.

Lepra lepromatosa, lepra tuberculoide, lepra indeterminada o limítrofe.

- Clasificación de la lepra: Histopatológica, biopsia de nervio.

Clasificación Espectro
R-J TT BT BB BL LL
Tuberculoide Dimorfa Lepromatosa
PB=0* MB>0*
*Indice bacteriológico

La clasificación bacteriológica del enfermo de lepra determina el tipo de tratamiento,

duración del mismo, período de vigilancia, manejo de convivientes.

-Control del tratamiento:

Paucibacilares: Al finalizar el tratamiento.
Multibacilares: Cada 3 meses (lepra lepromatosa).
Se toman muestras de los mismos sitios utilizados para la clasificación.

Se toma muestra de linfa de oreja, moco nasal o de los lepromitas o lepromas (piel),
codo:

Lesión o. i. Lesión 2 o. d.

Oreja izq. Oreja der.

Ident.

Para tomar muestra: Lanceta, láminas, desinfectante, pinzas (hacer isquemia).

Procedimiento: Limpieza (gasa con alcohol), isquemia (digital, pinza), lanceta
(bisturí), gota en lámina.
Procedimiento frotis moco nasal: Bolsa plástica, escobillón.
Coloración: Secar a temperatura ambiente, fijar en mechero, colorear técnica ZN.
Se observa: Bacilos agrupados en globias (como paquetes de cigarrillos)

-Escala de lectura semicuantitativa: Igual que en M. tuberculosis. Se hace

sumatoria.

IB = Sumatoria de cruces en 5 sitios (Globias en cada sitio o de bacilos)

5
Sólo en lepra lepromatosa hay presencia de bacilos.
 Coloración de azul de metileno de Loeffler

I. PRINCIPIO: El azul de metileno es una coloración simple que es particularmente

útil para la identificación de especies de Corynebacterium. Los gránulos
metacromáticos de C. diphtheriae toman con facilidad el azul de metileno y
aparecen con un color azul intenso . aunque algunos autores han sostenido que la
formación de gránulos citoplasmáticos característicos de C. diphtheriae se ve
raramente en las especies saprofitas de Corynebacterium, este criterio es poco
confiable y no puede ser utlizado para la identificación definitiva de C. diphtheriae
sin realizar estudios adicionales.

II. MEDIOS Y REACTIVOS

Azul de metileno (contenido de colorante del 80%) = 0,3 g.
Alcohol etílico (95%) = 30 ml.
Agua destilada = 100 ml.

III. PROEDIMIENTO
1. Fijar el frotis con calor. Cubrir su superficie con la solución de azul de metileno
durante 1 minuto. Lavar el portaobjetos con agua y secar con papel.
2. Antiguamente era necesario agregar un álcali a la solución antes de usar. Sin
embargo, los colorantes de azul de metileno preparados en los últimos años no
requieren este paso adicional, debido a que las impurezas ácidas encontradas en
los antiguos colorantes han sido eliminadas.