DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE

DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 1 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

Resumen de Modificaciones

Revisión nro. Fecha de emisión Breve descripción de las modificaciones

1 04/03/2010 Emisión del documento.

Fecha Cargo Nombre Firma

Elaborado 09/10/08 Directora Ejecutiva Liliane Somma

Revisado 15/12/08 Comité de Acreditación M. Derrégibus

Aprobado 15/12/08 Comité de Acreditación M. Derrégibus

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 2 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

1. OBJETIVO

Establecer una directriz para sistematizar el desarrollo de las actividades de los laboratorios para la
validación de métodos de ensayo.

2. ALCANCE

Esta directriz es aplicable a todos los métodos de ensayo incluidos en el alcance de los laboratorios de
ensayo acreditados ante el OUA y los laboratorios que solicitan su acreditación.

Esta directriz debería ser utilizada por los evaluadores y expertos técnicos que actúan en los procesos de
acreditación y por los responsables de los laboratorios.

Nota: Esta directriz es aplicable a los métodos de ensayo. No se establece consideraciones para el
muestreo, la manipulación y el transporte de muestras.

3. REFERENCIAS

-International Organization for Standardization (ISO). ISO 3534-1 al 6:1993 - Statistics - Vocabulary and
Symbols - Part 1: Probability and general statistical terms.

-International Organization for Standardization (ISO). ISO 5725-1 a 6:1994 – Accuracy (trueness and
precision) of measurement methods and results.

-International Organization for Standardization (ISO). ISO 10012:2003, Measurement management

systems. Requirements for measurement process and measuring equipment.

-International Organization for Standardization (ISO). Guide 30. Terms and definitions used in
connection with reference materials.

-International Organization for Standardization (ISO). Guide 31. Reference materials. Contents of
certificates and labels.

-International Organization for Standardization (ISO). Guide 32. Calibration in analytical chemistry and
use of certified reference materials.

-International Organization for Standardization (ISO). Guide 33. Uses of certified reference materials.

-International Organization for Standardization (ISO). ISO 17000:2005 “Evaluación de la conformidad.

Vocabulario y principios generales”

-International Organization for Standardization (ISO). Guide ISO/IEC 43-1 a 2. Proficiency testing by
interlaboratory comparisons.

-International Organization for Standardization (ISO) Guide ISO/IEC 98:2005 "Guide to the expression
of uncertainty in measurement (GUM)"

-International Organization for Standardization (ISO) Guide ISO/IEC 99:2007 "International vocabulary
of basic and general concept and associated terms inmetrology (VIM)"

-International Organization for Standardization (ISO) Guide 3:1998 “International System of Units”

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 3 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

-Instituto Uruguayo de Normas Técnicas (UNIT), UNIT 301:1971 “Norma para Sistema Internacional de
Unidades”

-Instituto Uruguayo de Normalización (UNIT). Norma UNIT-ISO 9000: 2000. Sistemas de

Gestión de la Calidad. Fundamentos y vocabulario.

-Instituto Uruguayo de Normalización (UNIT). Norma UNIT-NM-ISO/IEC 17025: 2005.

-Instituto Uruguayo de Normalización (UNIT). Norma UNIT-NM -ISO 15189: 2007.

-EA-4/02 “Expresión of the uncertainty of mesurement in calibration” 1999.

-EA 4/16 “Guidelines on the expression of uncertainty in quantitative testing” 2003.

-ENAC- NT 32 "Análisis microbiológicos. Documento aclaratorio sobre la validación de métodos"

España. 2007.

-EURACHEM Guide. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method.
Validation and Related Topics.. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington: 1998.

-EURACHEM “Quantifying uncertainty in analytical measurement” 2000.

-EURACHEM Guide "Measurement uncertainty arising from sampling: A guide to methods and
approaches” 2007.

-EURACHEM-CITAC Guide Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. : 2000.

-International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), Limit of Detection, Spectrochim. Acta 33
B, 242, 1978.

-IUPAC “Harmonised guidelines for the in-house validation of methods of analysis (Technical Report)”
Pure & Appl. Chem., Vol.74, Nº 5: 835-855, Gran Bretaña. 2002.

-AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (APHA). Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater, 21st ed. Washington, 2005.

-ASTM International. ASTM D 5172:1991(2004) Standard Guide for Documenting the Standard
Operating Procedures used for the Analysis of Water.

-ASTM International. ASTM E178:2002 Standard Practice for Dealing With Outlying Observations.

-ASTM International. ASTM E 1169:2002 Standard Guide for Conducting Ruggedness Tests.

-Bruce, P., Minkkinen P., Riekkota M.L. Practical Method Validation: Validation Sufficient for an Analysis
Method. Mikrochim. Acta. 128, 93-106. 1998.

-EAL - P11. Validation of Test Methods - General principles and concepts. EAL European Cooperation
for Accreditation of Laboratories. 1997.

-GREEN, J.M. A Practical Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry. 1996. (68) 305A-
309A.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 4 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

-HUBER, Ludwig, Validation and Cualification in Analytical Laboratories. Interpharm Press.1999.

-LGC / VAM – In-House Method Validation - A Guide for Chemical Laboratories. 2003.

-NATA. Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation and
Verification of Chemical Test Methods. 1997.

-Miller, J.- Miller, J. "Estadística y quimiometría para química analítica" Pearson/Prentice Hall- España.
2002.

-Niemela, S. “Uncertainty of quantitative determinations derived by cultivation of microorganismes”

2002. Finlandia.

-Ramachandran, R.- Rashmi, R. “Uncertainty of measurements in spectrophotometric analysis: a case

study” Analyst, 124: 1099-1103. 1999.

4. DEFINICIONES

Validación: confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos para una utilización o aplicación específica prevista.

Característica de desempeño: parámetro de calidad que puede atribuirse a un método de ensayo.

Criterio de desempeño: requisito para una característica de desempeño de acuerdo a la cual puede
juzgarse que el método de ensayo satisface con el propósito y genera resultados confiables

Verificación: confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos especificados.

Valor verdadero convencional (de una magnitud): valor atribuido a una magnitud particular, y
aceptado a veces por convención, porque la representa, con una incertidumbre apropiada, para un fin
dado.

Mensurando: magnitud particular sometida a medición.

Incertidumbre de medición: parámetro, no negativo, caracterizando la dispersión de los valores

atribuibles al mensurando, basándose en la información utilizada.

Exactitud de una medición: proximidad entre el resultado de una medición y el valor verdadero del
mensurando.

Precisión de una medición: proximidad entre valores obtenidos por medición de replicados en el
mismo o similar material bajo condiciones especificadas.

Repetibilidad: precisión bajo condiciones de repetibilidad.

Condiciones de repetibilidad: condiciones bajo las cuales resultados de ensayos independientes son
obtenidos con el mismo método, en materiales presumiblemente idénticos, en el mismo lugar, con el
mismo equipo, por el mismo operador, en intervalos cortos de tiempo.

Reproducibilidad: precisión bajo condiciones de reproducibilidad.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 5 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

Condiciones de reproducibilidad: condiciones bajo las cuales se obtiene resultados replicados en

materiales presumiblemente idénticos, en diferentes lugares, con diferentes operadores utilizando
equipos diferentes.

Precisión intermedia: precisión de una medida bajo un conjunto de condiciones de precisión

intermedia de medición.

Condiciones de precisión intermedia: condiciones bajo las cuales se obtiene los resultados de
réplicas con el mismo método, en materiales presumiblemente idénticos y uno o más factores como
tiempo, equipo, operador, varían dentro de un mismo laboratorio.

Límite de detección: es la menor cantidad que puede ser distinguida del blanco con cierto nivel de
confianza especificado.

Límite de cuantificación: es la menor cantidad de mensurando que puede ser determinada con un
nivel aceptable de exactitud y precisión.

Especificidad: capacidad de un método para medir solamente lo que se intenta medir.

Selectividad: capacidad de un método para determinar con un nivel aceptable de exactitud y precisión
el mensurando de interés en la presencia de otros componentes en una matriz bajo las condiciones de
ensayos establecidos.

Linealidad: capacidad de un método para obtener resultados de ensayos proporcionales a la cantidad

de mesurando.

Sesgo: estimación del error sistemático de medición.

Intervalo de trabajo: conjunto de los valores de magnitudes de una misma naturaleza que un método
de ensayo puede medir con una incertidumbre especificada, en condiciones determinadas.

Nota: Se denomina, también, intervalo de medición o rango

Material de referencia (MR): material o sustancia uno o más de cuyas propiedades tienen valores
suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la
calibración de un equipo, la evaluación de un método de ensayo o la asignación de valores a
materiales.

Material de referencia certificado (MRC): material de referencia, acompañado de un certificado

otorgado por una autoridad, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados
mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la
que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una
incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.

Robustez: sensibilidad que presenta un método ante pequeñas variaciones en las condiciones de
ensayo.

Método de referencia: método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las
condiciones y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o más propiedades y que
ha demostrado tener una exactitud y precisión apropiadas para el uso que pretende hacerse del
mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros métodos empleados para

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 6 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

realizar la misma medición y, en particular, para caracterizar un material de referencia. En general se

trata de un método normalizado.

Método normalizado: método publicado como norma internacional, regional o nacional, o por
organizaciones técnicas reconocidas (Ej: ISO, IEC, COPANT, AMN, UNIT, AOAC, APHA, etc.).

Método alternativo: método que ha sido validado por comparación con el método de referencia que
corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado y es reconocido formalmente como equivalente al
método de referencia por un organismo competente de acuerdo a datos experimentales obtenidos, por
ejemplo mediante ensayos colaborativos.

Método basado en norma: método descrito en un procedimiento interno del laboratorio, que está
basado claramente en un método normalizado y que no supone una modificación técnica respecto del
método de referencia que ponga en cuestión su validez técnica. Debe mantenerse actualizado en
relación con el método de referencia en que se fundamentan.

Método desarrollado: método de ensayo desarrollado por el laboratorio o por un fabricante o

proveedor de equipos, de medios de cultivo etc., de forma unilateral y que no dispone del
reconocimiento de los métodos normalizados o de los métodos alternativos.

Modificación de método normalizado o alternativo: método normalizado o alternativo que es

modificado significativamente para atender a requisitos específicos.

5. DESCRIPCIÓN

Introducción

Es fundamental que los laboratorios dispongan de criterios objetivos para demostrar, por medio de la
validación, que los métodos de ensayo que ejecutan conducen a resultados confiables y adecuados a
las características de desempeño establecidas.

La realización de actividades de validación de los métodos de ensayo utilizados por el laboratorio,

contempla la satisfacción de las necesidades del cliente y la adecuación para realizar los ensayos
previstos.

El objetivo de la validación es confirmar la aptitud de los métodos, así como la capacidad del
laboratorio, para la ejecución de ciertos ensayos bajo sus condiciones operativas habituales. Ello
significa que la validación debería realizarse para confirmar que el laboratorio puede aplicar
correctamente el método de ensayo antes de utilizarlo como método de ensayo de rutina.

La validación se basa en la comparación de los resultados obtenidos con los criterios de desempeño
establecidos para el procedimiento empleado para las características seleccionadas.

La metodología y la extensión de la validación no son siempre las mismas y deberían ser establecidas
individualmente.

Extensión de la validación

La extensión de la validación debería ser determinada por el Responsable Calificado (ver 3.2.a) de
manera confiable y científica.
La siguiente tabla establece la extensión de las actividades de validación de acuerdo al método de
ensayo a emplear por el laboratorio.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 7 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDACIÓN REQUERIDA

Métodos normalizados publicados o métodos Confirmación de las características de
alternativos desempeño publicadas de acuerdo con el
requisito del apartado 5.4.2 de la norma
UNIT-ISO/IEC 17025
Puede requerirse validación solamente si
se han hecho algunos cambios, de acuerdo
con el requisito del apartado 5.4.4 de la
norma UNIT-ISO/IEC 17025 para métodos
no normalizados
Método desarrollado por el laboratorio Validación completa
Método publicado en la literatura científica sin Validación completa
ninguna información de desempeño
Métodos publicados en la literatura científica Confirmación de las características de
con información de desempeño desempeño publicadas, pero se requiere una
validación más completa que la establecida
por el apartado 5.4.5 de la norma UNIT-
ISO/IEC 17025
Cambios en la implementación de un método La extensión de la validación variará para
previamente validado – por ej.: cambios en el demostrar que los cambios no tienen un
equipo, en los reactivos, en el ambiente del impacto significativo en las
laboratorio o en el personal características de desempeño

Método normalizado publicado que se aplica a Se requiere validación y la extensión variará,

diferentes matrices, para diferentes rangos de por ej.: si se tiene propiedades similares a las
concentración, para diferentes mensurandos o de las matrices y de los mensurandos
método normalizado publicado usado para un representativos
propósito similar pero condiciones diferentes
Método normalizado publicado no vigente o Confirmación de las características de
previamente validado que vuelve a usarse desempeño previamente establecidas

Ensayos ad hoc o especiales La extensión de la validación está fijada por

las circunstancias
Kits de ensayo comerciales – evaluados Confirmación de las características de
mediante ensayos colaborativos desempeño publicadas pero puede
requerirse una validación completa si se
efectúa cualquier cambio en el uso
Kits de ensayo comerciales cuya información Validación completa
de desempeño no está disponible, es
incompleta o no es aplicable

Planificación de la validación

a. Personal

El laboratorio debería designar a una persona en carácter de Responsable Calificado para la

supervisión del trabajo y con la autoridad necesaria para tomar las decisiones apropiadas durante la
realización de la validación.
El operador que lleva a cabo las actividades de validación debería ser competente en el área de
estudio y necesitaría tener conocimiento suficiente sobre la matriz de ensayo en estudio.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 8 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

b. Equipos

Los equipos empleados para las actividades de validación deben cumplir con las especificaciones
pertinentes para el método de ensayo, funcionar correctamente y estar confirmados metrológicamente.

c. Metodología

En el desarrollo de las actividades de validación, se recomienda la siguiente secuencia de trabajo:

- definir la aplicación, objetivo y alcance del método de ensayo

- establecer las características de desempeño a evaluar

- especificar los criterios que debe cumplir el método de ensayo

- verificar si las especificaciones de los equipos a utilizar son compatibles con lo exigido por el
método de ensayo en estudio

- seleccionar los materiales (por ejemplo, patrones y reactivos) de la calidad requerida

- planificar las actividades de validación

- elaborar un procedimiento para la validación

- hacer los ensayos preliminares de validación

- ajustar los requisitos, de ser necesario (por ejemplo: puede obtenerse una repetibilidad del 7 %
en vez del 5 % establecido y, de todas maneras, se considera el método adecuado)

- realizar los ensayos completos de validación

- elaborar el informe de validación

- redactar un procedimiento operacional que permita la implantación del método, de manera clara
y sin ambigüedades, en la rutina diaria del laboratorio.

d. Informe de validación

Las actividades de validación de cada método de ensayo deben estar debidamente documentadas.

Todos los datos relevantes en el estudio de validación de un método, como la planificación, la

ejecución y la totalidad de los resultados obtenidos, deberían ser documentados y registrados en un
informe de validación de forma de posibilitar la trazabilidad de todas las actividades realizadas.

Cada validación debería ir acompañada de un informe cuyo título se debería redactar de una forma
similar a la siguiente: “Informe de validación de (designación del mensurando) en (tipo de matriz
.mediante (metodología de ensayo que se ha validado)”.

Dicho informe debería ser preparado por el operador que ha realizado la validación, mientras que el
Responsable Calificado sería quien lo revise y apruebe.

El Informe de Validación debería considerar los siguientes puntos, cuando corresponda:

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 9 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

- objetivo y alcance del método

- material a ensayar
- acondicionamiento de las muestras
- detalle de insumos, reactivos y materiales de referencia
- lista de equipos, instrumentos y dispositivos
- resultados de las características de desempeño estudiadas
- registro de las condiciones de los ensayo, gráficos representativos (curva de calibración,
registros de correlación) y cálculos necesarios
- personal involucrado en las actividades de validación del método
- evaluación de los resultados de la validación, de la cual resultan conclusiones y la decisión
sobre la aptitud del método para su aplicación
- justificación, por parte del Personal Responsable Calificado del método de ensayo, de los
cambios a los criterios fijados
- fijación de criterios de para la revalidación.

6. ESTUDIO PARTICULAR DE LAS CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO A

EVALUAR

Introducción

Es necesario considerar que las características de desempeño que deberían evaluarse durante las
actividades de validación varían de acuerdo con el tipo de método de ensayo con la finalidad de facilitar
la decisión final de considerar el método como validado.

6.1 Características de desempeño a estudiar

La totalidad de las características de desempeño que pueden ser evaluadas en una validación
completa para un método de ensayo son las siguientes:

- exactitud
- precisión (repetibilidad, reproducibilidad intermedia, reproducibilidad)
- especificidad
- selectividad
- linealidad
- intervalo de trabajo
- sensibilidad
- límite de detección
- límite de cuantificación
- robustez
- incertidumbre.

Para cada método de ensayo se seleccionará las características a evaluar. Se puede tomar como
orientación la siguiente tabla:

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 10 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

Características de desempeño a evaluar en base al tipo de ensayo

Tipo de ensayo
Determinación de
Propiedades
Característica componentes
Cualitativo Cuantitativo físicas
mayores

exactitud X X X
Precisión X X X
Especificidad / selectividad X X X X
Robustez X X X X
Sensibilidad / linealidad /
X X X
intervalo de trabajo
Límite de detección X X
Límite de cuantificación X

6.1.1 Exactitud

Se define como la concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado como
convencionalmente verdadero.

Las metodologías habitualmente utilizadas para evaluarla son, entre otras:

- uso de materiales de referencia

- participación en comparaciones interlaboratorios
- realización de ensayo de recuperación.

La exactitud, cuando se aplica a una serie de resultados de ensayo, implica una combinación de
componentes de errores aleatorios y sistemáticos.

La exactitud se cuantifica con el sesgo que se define como la diferencia entre el valor más probable y el
valor experimental.

La determinación del sesgo con relación a los valores de referencia apropiados es importante en el
establecimiento de la trazabilidad a los patrones reconocidos.

Una forma de evaluar la exactitud del método es por medio del cálculo del error relativo, expresado
en porcentaje.

6.1.2 Precisión

Precisión es un término general para evaluar la dispersión de resultados entre ensayos independientes,
que son repetidos sobre una misma muestra, muestras semejantes o patrones, en condiciones
definidas. Habitualmente se determina para circunstancias específicas de ensayo. En general se
estudia mediante la repetibilidad, la reproducibilidad y la precisión intermedia, siendo usualmente
expresadas por la desviación estándar.

Tanto la repetibilidad como la reproducibilidad son, generalmente, dependientes de la concentración

del mensurando y, de este modo, deberían ser determinadas para diferentes concentraciones. En
algunos casos debe establecerse la relación entre la precisión y la concentración del mensurando.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 11 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

La repetibilidad es el grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas de un

mismo mensurando, efectuadas bajo las mismas condiciones de ensayo, las cuales son:

- mismo procedimiento de ensayo

- mismo operador
- mismo equipo usado bajo las mismas condiciones
- mismo local
- repeticiones efectuadas en un corto intervalo de tiempo.

La repetibilidad puede ser expresada cuantitativamente en términos de la característica de la

dispersión de los resultados y puede ser determinada por medio del ensayo de patrones, material de
referencia o adición a blanco en varias concentraciones en el intervalo de trabajo. Se sugieren 7 o más
repeticiones para el cálculo de la desviación estándar para cada concentración, llamado desviación
estándar de repetibilidad.

La reproducibilidad es el grado de concordancia entre los resultados de las mediciones de un mismo

mensurando, efectuadas bajo condiciones variadas de ensayo. Es considerada importante cuando un
laboratorio busca la verificación del desempeño de sus métodos en relación a los datos de validación
obtenidos por medio de comparación interlaboratorios.

La precisión (o reproducibilidad) intermedia se refiere a la precisión evaluada sobre la misma

muestra, muestras idénticas al patrón, utilizando el mismo método, en el mismo laboratorio, pero
definido exactamente cuales son las condiciones a variar (una o más), tales como:

- diferentes operadores
- diferentes equipos
- diferentes tiempos.

Esta medida de la precisión es reconocida como la más representativa de la variabilidad de los

resultados en un laboratorio y, como tal, más aconsejable para ser usada.

Para determinar la precisión intermedia de un método, se efectúan mediciones por duplicado, o en

ensayo único, sobre la muestra, en las condiciones predefinidas, pues existen varios métodos para
estudiar este tipo de precisión. Cuando es aplicable, este procedimiento es repetido sobre otras
muestras, abarcando otros niveles de concentración.

Un método simplificado para estimar la precisión intermedia se basa en la ejecución de n mediciones (n

≥ 15), en condiciones predefinidas, sobre:

- una misma muestra

- muestras presumiblemente idénticas
- patrones o materiales de referencia.

En la siguiente tabla, se presenta un resumen de la determinación de la repetibilidad, reproducibilidad y

precisión intermedia.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 12 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

.Repetibilidad, reproducibilidad y precisión intermedia

Ensayar: Patrones,
materiales de referencia o
muestras blanco Repeticiones ¿Qué calcular a
Comentarios
fortificadas a varias independientes partir de los datos?
concentraciones a lo largo
del intervalo de trabajo
Determinar la Determinar la
a) Mismo operador, desviación estándar
desviación estándar
equipo, laboratorio, ≥7 de la repetibilidad de
de cada
período corto cada concentración
concentración
b) Operadores y equipos Determinar la Determinar la
diferentes, mismo laboratorio, desviación estándar desviación estándar
período ≥7 de cada de la reproducibilidad
extendido (precisión concentración intralaboratorio de
intermedia) cada concentración
Determinar la
Determinar la desviación estándar
c) Operadores, equipos y desviación estándar de la reproducibilidad
laboratorios diferentes, ≥7 de cada interlaboratorio de
período extendido concentración cada concentración.
Requiere estudio de
colaboración

6.2.3 Especificidad y selectividad

Una muestra, de manera general, está constituida por los mensurandos, la matriz y otros componentes
que pueden tener algún efecto en la medición, pero que no se desea cuantificar. La especificidad y la
selectividad están relacionadas con la detección.

Un método que produce respuesta para un único mensurando es llamado específico. Un método que
produce respuestas para varios mensurandos, pero que puede distinguir la respuesta de un
mensurando de la de otros, es llamado selectivo.

Las diferentes metodologías para evaluar la especificidad y la selectividad tratan de responder a la

pregunta: ¿lo que se mide es lo que se piensa que se mide?

Para poder diseñar la metodología de evaluación más apropiada es necesario comprender los
diferentes mecanismos que causan interferencias cuando se determina el mensurando de interés. El
método de ensayo puede tener diferentes desempeños debido a que los reactivos, la matriz u otros
componentes alteran la sensibilidad del sensor que mide el mensurando de interés o porque estos
componentes afectan directamente a la respuesta.

Al mismo tiempo pueden ocurrir errores constantes debido a interferencias y errores proporcionales
debido al denominado efecto matriz.

Las metodologías empleadas para evaluar la especificidad y la selectividad son:

- adición de patrón
- ensayo de múltiples componentes o
- cambios en el pretratamiento, la separación o la detección.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 13 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

6.1.4 Linealidad

Es la capacidad de un método de ensayo de obtener resultados que sean directamente proporcionales

a la concentración del mensurando dentro de un cierto intervalo de concentración.

La cuantificación requiere que se conozca la relación entre la respuesta y la concentración del

mensurando.

La ecuación de la recta que relaciona a las dos variables es:

y = ax + b

Donde:
y = respuesta
x = concentración
a = pendiente de la curva de calibración
b = intersección con el eje y, cuando x = 0.

La linealidad de un método puede observarse por el gráfico de los resultados de los ensayos en
función de la concentración del mensurando o puede calcularse a partir de la ecuación de la regresión
lineal, determinada por el método de los mínimos cuadrados. El coeficiente de correlación lineal es
frecuentemente usado para indicar cuanto puede ser considerada adecuada la recta como modelo
matemático.

6.1.5 Intervalo de trabajo

Para cualquier método cuantitativo, existe un intervalo de concentraciones del mensurando en el cual el
método puede ser aplicado.

En el límite inferior del intervalo de concentración, los factores limitantes son los valores de los límites
de detección y de cuantificación. En el límite superior, los factores limitantes dependen del sistema de
respuesta del equipo de medición.

Dentro del intervalo de trabajo puede existir un intervalo de respuesta lineal y dentro de éste la
respuesta de la señal tendrá una relación lineal con el mensurando. La extensión en este intervalo
puede ser establecida durante la evaluación del intervalo de trabajo.

El intervalo lineal de trabajo de un método de ensayo es el intervalo entre los niveles inferior y
superior de concentración del mensurando en el cual fue demostrado era posible la determinación con
la precisión, exactitud y linealidad exigidas, bajo las condiciones especificadas para el ensayo. El
intervalo lineal es definido como el intervalo de concentraciones en el cual la sensibilidad puede ser
considerada constante y es normalmente expresada en las mismas unidades del resultado obtenido
por el método de ensayo.

Para efectuar la selección del intervalo de trabajo es necesario cubrir el intervalo de aplicación para
el cual el ensayo va a ser usado. La concentración más probable de muestra debe, siempre que sea
posible, situarse en el centro del intervalo de trabajo.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 14 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

Metodologías para la determinación del intervalo de trabajo e intervalo lineal

Nº de Matriz Procedimiento
Replicas
- Blanco con adición de Objetivo: identificar inicialmente, el intervalo
concentraciones variadas del lineal aproximado y los límites superior e
mensurando o, inferior del intervalo de trabajo.
- Blanco de la muestra con - Colocar en el eje x las concentraciones del
Etapa (1):
adición de concentraciones mensurando y en el eje y las respuestas de
variadas del mensurando. las mediciones.
≥ 7 (siete)
Observación: preparar - Ir a la etapa (2).
diferentes concentraciones de
modo independiente y las
alícuotas de la misma solución
madre.
Objetivo: determinar el intervalo de trabajo
y confirmar la linealidad.
- Colocar en el eje x las concentraciones
del mensurando y en el eje y las
respuestas de las mediciones.
- Verificar visualmente la existencia de
valores dispersos que puedan interferir en
- Materiales de referencia
la regresión (antes de remover los
(diferentes concentraciones), en
Etapa (2): dispersos hacer determinaciones en las
el intervalo lineal o
proximidades de las concentraciones).
- Blanco de la muestra con
≥ 7 (siete) en el - Calcular los coeficientes de la recta de
adición de concentraciones
intervalo lineal regresión.
variadas del mensurando, en el
- Calcular y hacer el gráfico de los valores
intervalo lineal.
de los residuos para cada valor de x
(residuo es la diferencia entre el valor
observado y el valor calculado por la
ecuación de la recta de regresión). La
distribución aleatoria en torno de la línea
recta confirma la linealidad.
- Ir a etapa (3).
Etapa (3): Objetivo: determinar el límite de
cuantificación (LQ), que efectivamente
Blanco de la muestra con forma el límite más bajo del intervalo de
adición de concentraciones trabajo.
variadas del mensurando, - Expresar el LQ como la concentración
≥ 7 (siete) próximas al LD más baja del mensurando que puede ser
determinada con un nivel aceptable de
incertidumbre.

Observaciones:
Blanco = agua destilada o desionizada
Blanco de la muestra = matriz de la muestra sin el mensurando de interés.

6.1.6 Sensibilidad

Es una característica que demuestra la variación de la respuesta en función de la concentración del

mensurando.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 15 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

Puede ser expresada por la pendiente de la recta de regresión de calibración, y se determina

simultáneamente con las metodologías para la evaluación de la linealidad.

La sensibilidad depende de la naturaleza del mensurando y de la técnica de detección utilizada.

6.1.7 Límite de detección

Para la validación de un método de ensayo, es normalmente suficiente proporcionar una indicación del
nivel en que la detección del mensurando puede realizarse. En general esto puede obtenerse a partir
de la curva de calibración y corresponde con: “blanco + 3s” y “0 + 3s“ (en la cual s es la desviación
estándar).

En la siguiente tabla se presentan las metodologías para las evaluaciones cuantitativas del límite de
detección.

Evaluación del límite de detección (LD)

Nº de
Matriz Cálculos Observaciones
Replicas
La media y la
LD = X + ts donde: desviación estándar
X = media de los valores de los de los blancos de la
blancos de la muestra; muestra son
t es la abscisa de la distribución dependientes de la
Blanco de la
≥7 de Student, dependiente del matriz. Válido
muestra
tamaño de la muestra y del grado solamente cuando los
de confianza y, valores de los blancos
s = desviación estándar de los presentan una
blancos de la muestra desviación estándar
diferente de cero.

Se calcula la varianza (s2) y la desviación estándar (s) de las mediciones por duplicado. La fórmula
para el cálculo del LD es:

LD = t(n−1, 1−α ) . (s)

El LD para cada mensurando debe ser expresado en las unidades apropiadas, de acuerdo con lo
establecido en el método de ensayo. Se debe identificar la matriz usada para evaluar el LD.

6.2.8 Límite de cuantificación

Para los ensayos cuantitativos es necesario asegurar que el método de ensayo informa resultados que
sólo son atribuibles al mensurando. El límite de cuantificación (LQ) se toma como 10 veces la
desviación estándar.
Algunas veces es también denominado “límite de determinación”. En la práctica, corresponde
normalmente al patrón de calibración de menor concentración (excluido el blanco). Este límite,
después de haber sido determinado, debe ser ensayado para averiguar si la exactitud y la precisión
conseguidas son satisfactorias, a través del método de adiciones de concentraciones conocidas. La
siguiente tabla presenta un resumen del método de determinación del límite de cuantificación.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 16 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

Evaluación del límite de cuantificación (LQ)

N º Replicas Matriz Determinación

LC = X + 10s, donde:
≥7 Blanco de la muestra X = media de los valores de los blancos
s = desviación estándar de los blancos

6.1.9 Robustez

La robustez evalúa la sensibilidad que el método de ensayo presenta a las pequeñas variaciones en las
condiciones operativas. Un método se dice robusto si se revela prácticamente insensible a pequeñas
variaciones que puedan ocurrir cuando éste está siendo ejecutado.

Para determinar la robustez de un método de ensayo, se puede recurrir al test de Youden. Se trata de
un test que permite no sólo evaluar la robustez del método, sino también ordenar la influencia de cada
una de las variaciones en los resultados finales, indicando cuál es el tipo de influencia de cada una de
esas variaciones.

La siguiente tabla presenta un ejemplo de los efectos de las modificaciones en diversos factores de
influencia. Para esto se realiza 8 ensayos separados para determinar los efectos de la variación de las
7 diferentes etapas, en el método de ensayo. Las 8 mediciones pueden ser realizadas en un orden
aleatorio.

Ejemplo de variación en los factores para la determinación de la robustez

Factor Nominal Variación

Tiempo de agitación 10 min 12 min
Tamaño de muestra 5g 10 g
Concentración ácida 1M 1,1M
Temperatura de calentamiento 100 ºC 95ºC
Tiempo de calentamiento 5 min 10 min
Agitación si no
pH 6,0 6,5

6.2.10 Incertidumbre de los resultados

La incertidumbre caracteriza la dispersión de los valores atribuibles al mensurando, basándose en la

información utilizada para obtener los resultados.

En los documentos presentados en el Anexo II se encuentra informaciones detalladas sobre

incertidumbre de las mediciones.

7. EJECUCIÓN DE LOS ESTUDIOS DE VALIDACIÓN

Introducción

Es esencial establecer criterios objetivos para la aceptación de un estudio de validación y luego llevar a
cabo el mismo según una secuencia apropiada.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 17 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

7.1 Etapas

Básicamente cada validación de un método de ensayo consta de cuatro etapas:

1. Especificación de los requisitos que debe cumplir el método de ensayo (por ejemplo: límite
de detección <1 mg/L, intervalo lineal mayor a 2 órdenes de magnitud, incertidumbre de los
resultados <20%).

2. Determinación de las características de desempeño del método de ensayo bajo las

condiciones establecidas.

3. Comparación de los resultados obtenidos por las actividades de validación con los requisitos
especificados.

4. Decisión sobre la aptitud del método de ensayo para el uso previsto.

IMPORTANTE: Para facilitar la decisión final de los características a evaluar se recomienda tener en
cuenta la información establecida en las Tablas 2 y 3.

8. HERRAMIENTAS ALTERNATIVAS Y ADICIONALES PARA LA VALIDACIÓN

Introducción

En algunas oportunidades no es económica o técnicamente factible llevar a cabo los estudios de

validación, por lo cual el laboratorio debe emplear herramientas alternativas y adicionales que le
permitan demostrar que ha efectuado la confirmación de que los métodos empleados son aptos para el
uso específico.

8.1 Comparación de métodos

Consiste en la comparación de los resultados obtenidos por un nuevo método con los conseguidos con
un método de referencia.

El objetivo es estudiar el grado de proximidad de los resultados obtenidos por los dos métodos de
ensayo.

Los ensayos son efectuados por duplicado, utilizando los dos métodos de ensayo, por separado, sobre
las mismas muestras, en un intervalo restringido de concentraciones o en todo el intervalo de
concentraciones en que se pretende validar el método.

Existen varias técnicas estadísticas para comparar los resultados obtenidos.

8.2 Programas interlaboratorios

La Guía ISO/IEC 43-Parte 1 distingue entre los usos de comparaciones interlaboratorios para ensayo
de aptitud para la determinación del desempeño del laboratorio, como para otros propósitos tales
como:
- establecer la eficacia y la comparabilidad de nuevos métodos de ensayo
- comprobar el desempeño de métodos establecidos
- determinar las características de desempeño de un método.

Los ensayos de colaboración son una forma especial de ensayo para evaluar el desempeño de un

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)
 DIRECTRIZ PARA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE
DOCUMENTO
DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. nro. 1 Página 18 de 18 Fecha Emisión: 05/03/10

método en las condiciones normales de trabajo en varios laboratorios, por medio de ensayo de
muestras homogéneas preparadas cuidadosamente.

9. ANEXOS

No aplica.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Verificar su vigencia antes de usar esta
revisión en la página web del OUA (www.organismouruguayodeacreditacion.org)