UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO ACADMICO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial

Prctica I Bioseguridad
La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biolgicos, fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores, visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicacin adecuada de normas de bioseguridad as como la importancia de estas normas antes, durante y despus de cada

prctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se est desenvolviendo.

Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de anlisis, investigacin y dems, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeo seguro y garantizar resultados exitosos. Las normas generales son:

El acceso al laboratorio estar limitado solo al personal autorizado. El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de bioseguridad.

Toda rea debe estar marcada con la respectiva seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin.

Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga, abotonada y limpia, as mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y dems objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los bancos o mesas.

Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesin de laboratorio para evitar la contaminacin por corrientes de aire.

Al inicio y trmino de una prctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una solucin desinfectante.

El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el trmino del mismo.

Se deben lavar las manos al inicio y al trmino de cada sesin de trabajo, secndolas posteriormente con toallas de papel.

Se debern usar todos los implementos necesarios para la proteccin segn el nivel de riesgo biolgico.

Durante la prctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.

Se debe colocar un calzado adecuado para las prcticas en el laboratorio, as como mantener las uas cortas, limpias y sin esmalte.

Utilizar los equipos segn las instrucciones o los procedimientos operativos estandarizados.

Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de cadas no se produzca salpicadura.

Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales potencialmente infecciosos sin la debida proteccin.

Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de laboratorio.

Utilizar mscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles. Apagar los instrumentos elctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1. Algunos smbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

1. Principios bsicos de bioseguridad El trmino contencin se utiliza para describir mtodos seguros para manejar materiales infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contencin es reducir o eliminar la exposicin de quienes trabajan en laboratorios, de otras personas y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contencin El elemento ms importante de la contencin es el cumplimiento estricto de las prcticas y tcnicas microbiolgicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando las prcticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o un procedimiento de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas medidas adicionales corresponden a los equipos de seguridad diseados para la proteccin del personal y las prcticas de manejo (barrera primaria), as como el diseo de instalacin y caractersticas de ingeniera adecuados (barrera secundaria). 1.2 Barreras primarias Constituyen la primera lnea de defensa cuando se manipulan materiales biolgicos, qumicos o fsicos. Se considera que las barreras de proteccin primaria son: equipos de proteccin personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biolgica (con barreras de aire, que permiten que ste fluya en una sola direccin y a una velocidad constante originando el flujo de aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que atrapan las partculas contenidas en el flujo de aire); normas de higiene personal; inmunizacin (vacunacin); desinfeccin (alcohol, compuestos fenlicos, hipocloritos) y esterilizacin (calor hmedo, calor seco) de instrumentos y superficies. Principalmente se busca la proteccin del personal presente en un ambiente frente a los agentes infecciosos o productos qumicos de riesgo. Seguridad. 1.3 Barreras secundarias El diseo y construccin de un laboratorio se conoce como contencin o barrera secundaria, contribuye a la proteccin del personal del laboratorio as como el que se localiza fuera del laboratorio y personas de la comunidad en general, frente a posibles escapes

accidentales de agentes infecciosos. Se incluye la localizacin del laboratorio fuera del rea de trnsito, acceso restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble puerta ( nivel 3), presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al calor moderado, cidos y lcalis, reas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin, tratamiento de residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y elctrico de fcil acceso.

2. Clasificacin de los agentes biolgicos por grupo de riesgo 2.1 Agentes biolgicos del grupo 1 Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo: Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la elaboracin de quesos, embutidos, entre otros.

2.2 Agentes biolgicos del grupo 2 Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patologa infecciosa de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre otros. 2.3 Agentes biolgicos del grupo 3 Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patologa grave, de difcil y largo

tratamiento, pueden curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y ms frecuente peligro es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos. Ejemplo: Mycobacterium. tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros. 2.4 Agentes biolgicos del grupo 4 Son aqullos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad y sin que exista generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son

microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus, etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratorios Se consideran cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biolgica descritos: tcnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseo arquitectnico de las instalaciones del laboratorio. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de actividades que se realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad el laboratorio. De forma general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contencin necesaria para proteger al personal y al ambiente.

3.1 Nivel de bioseguridad 1 Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biolgicos del grupo de riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros de enseanza donde se emplean microorganismos no patgenos. 3.2 Nivel de bioseguridad 2 Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal especializado para el manejo de stos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de microbiologa clnica y de control de calidad sanitaria (tcnicos de laboratorio, especialistas en microbiologa). 3.3 Nivel de bioseguridad 3 Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo de riesgo 3. El material biolgico slo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con infraestructura apropiada para el nivel de contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de bioseguridad, entre otras caractersticas; correspondiendo a algunos laboratorios de microbiologa clnica, de produccin de biolgicos y de control de calidad sanitaria. 3.4 Nivel de bioseguridad 4 Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biolgico de riesgo 4, especialmente patgeno infecto contagioso, extico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel tambin puede utilizarse para trabajar con animales de experimentacin infectados por microorganismos del grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliogrficas Granados, E. & Villaverde C. (1977). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios. Serie de Normas Tcnicas N 18 (2 ed.). Per Per, Ministerio de Salud. (2001). Buenas Prcticas de Laboratorio. Seminario Taller, Lambayeque, Per.

Prctica II Material y equipo de laboratorio

1. Introduccin

Las tres fuentes del conocimiento son la observacin, la experimentacin y el razonamiento. La experimentacin exige menos esfuerzo mental pero ms tiempo, es decir ms presencia; por consiguiente se necesita equilibrar la enseanza con ms horas de laboratorio para un buen aprendizaje. Una buena enseanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre observar un fenmeno o una reaccin, y el poder interpretarlo. La correcta observacin le dar el domino real sobre la materia. La capacidad de interpretacin le proporcionar adems la preparacin tcnico-cientfica necesaria para ser un buen investigador. Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de laboratorio, slo as se lograr obtener buenas lecturas lo que permitir una buena interpretacin de los resultados.

2. 2.1 2.2 2.3

Objetivos Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa. Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiologa. Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiologa.

3. 3.1 3.1.1

Procedimiento Reconocimiento de material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa Tubos de ensayo

Existe una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro, paredes gruesas y sin rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioqumicos se usan tubos de 13 X 100 mm. y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X 125 mm. 3.1.2 Placas de Petri

Estn compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el ms grande hace de tapa. Se emplean para el aislamiento y cultivo de microorganismos. 3.1.3 Tubos de Smith

Son utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de fermentacin. 3.1.4 Campanas de Durham

Son tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y permiten detectar la produccin de gas en los procesos de fermentacin.

3.1.5

Pipetas serolgicas o de medida

Presentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20C. Las marcas ms conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para trabajos de precisin, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en Norteamrica y tienen las siglas NBS y el ao de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX serolgica de 1 mL de capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una pipeta PIREX del mismo volumen tiene un ET de 0.02 (2%). Las pipetas serolgicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL. Las de mayor uso son: Pipetas de 10 mL Pipetas de 5 mL. Pipetas de 1 ml. Pipetas de 0.1 mL. Pipetas de Dhan de 0,125 Pipetas de Dhan de 0,250 Pipetas de Bang de 0,2 0,1 mL 0,1 mL 0,1 y 0,01 mL 0,1 y 0,001 mL 0,0125 mL 0,0250 mL 0,08 y 0,005 ml

Las pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la punta de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la ltima lnea de graduacin. 3.1.6 Pipetas Pasteur

Son confeccionadas de varillas de vidrio de dimetro de 4 X 20 mm. y de 30 40 cm. de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la accin directa de la llama del mechero, para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la toma de pequeos inculos de siembra. Modo de emplear la pipeta Pasteur La pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio. Se coloca la punta de la pipeta en el

lquido por medir, bastante profundo, para que se pueda aspirar el volumen necesario sin aire. Con aspiracin suave, se llena el lquido por encima de la marca de calibracin. Se cierra la pieza de la boca con el dedo ndice. Se seca el exceso del lquido en el exterior de la pipeta con un pao o un papel limpio,

y colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del lquido baje hasta la marca de calibracin moviendo con suavidad el ndice sobre la pieza de boca. El dedo no debe retirarse. Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepcin, colocando su punta contra la pared. Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vace durante el tiempo

necesario. No se debe soplar para hacer salir la ltima gota al emplear una pipeta volumtrica o cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el vaciamiento sea correcto.
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3.1.7

Buretas

Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con un tubo corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las ms comunes son de 50 mL y estn graduadas al dcimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de lquidos o soluciones y se las usa mayormente en las titulaciones volumtricas. Modo de usar la bureta La bureta limpia y vaca se mantiene en posicin vertical mediante un soporte adecuado. Se enjuaga la bureta con el mismo lquido que se va a descargar. Se llena la bureta con el lquido hasta un poco ms arriba de la graduacin y se descarga

el lquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduacin y el pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solucin. errores. Despus de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojo debe estar al nivel del menisco para evitar

ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o tambin pueden colocarse en el soporte con las puntas hacia arriba. Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con

cera y resina. La lubricacin adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca. 3.1.8 Matraces

Son recipientes volumtricos muy tiles en la preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamao son muy variables. Matraces cnicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que

reducir a un mnimo la evaporacin; son tiles para las titulaciones. En Microbiologa sirven para la preparacin de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de alambre cuando se realiza el calentamiento evitando as el contacto directo entre el matraz y la llama. Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el

mechero. Para calentar solventes orgnicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es preferible emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores correspondientes y permiten un cierre mucho ms hermtico que los tapones de caucho o de corcho. Matraces aforados o fiolas: Idnticos a los matraces erlenmeyer. Estn calibrados a

medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica la medida. Se emplean para la preparacin de reactivos y de soluciones buffer. Matraces kitasato: Son matraces que adems de la boca tienen una tabulacin corta

lateral para hacer vaco. Se utilizan como complemento del equipo de filtracin (esterilizacin en fro).
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3.1.9

Esptulas de Drigalsky

Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fraccin recta y horizontal facilita la siembra y aislamiento de bacterias por diseminacin. 3.1.10 Probetas Recipientes cilndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener capacidad de 10 mL hasta 2 000 mL. Las ms utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL. 3.1.11 Beacker o vasos de precipitacin Recipientes cilndricos y cortos, con una depresin en el margen de la boca. El vidrio debe ser necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad. 3.1.12 Varillas de vidrio macizo Fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confeccin de agitadores o baguetas. Las varillas cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra. 3.1.13 Frascos reactivos Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color mbar. Son cilndricos, tienen cuello estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar su vaciado y su tamao vara de 25 mL a 1000 mL).En los frascos pequeos se pueden almacenar HCl, H2SO4, CCl4, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos desinfectantes u otros reactivos. 3.1.14 Frascos goteros Tienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o mbar, y sus tapones son ranurados para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para colorantes o para indicadores. 3.1.15 Picetas Son botellas plsticas de color blanco con una especie de cao que al presionar el frasco permite que el lquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar lminas portaobjetos con tinciones. 3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos Los portaobjetos son lminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mnimo grosor. Los cubreobjetos son finsimas laminillas de mucho menor tamao que los portaobjetos y pueden ser de forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para la observacin microscpica de las bacterias u otros organismos. 3.1.17 Jarra de Brewer Denominada tambin campana de anaerobiosis, est constituida por una tapa de baquelita en cuya parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo es un cilindro de vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es cerrada hermticamente mediante una abrazadera de metal.

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3.1.18 Asas de siembra Con mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrn resistente a elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos. 3.1.19 Mangos de Kolle Vstagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para insertar el alambre de platino o micrn en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio. 3.1.20 Alambres de platino en aro y en punta Pueden ser acoplados a los mangos de Kolle. 3.1.21 Canastillas o cestos de metal Las mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas, sin riesgo de roturas. 3.1.22 Gradillas Permiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes. 3.1.23 Soportes universales Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc. Son de metal de preferencia de fierro y son muy buenos soportes de recipientes sometidos al

calentamiento. 3.1.24 Trpodes Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento. De variada altura y dimetro. 3.1.25 Rejilla o malla metlica Malla de alambre galvanizado, resistente a la corrosin a elevadas temperaturas. Se coloca sobre el trpode. 3.1.26 Mecheros Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de

metal por donde se introduce la mecha. Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos ms tiles en el

laboratorio. Fue inventado por el alemn Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de mecheros, algunos tienen regulacin de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son simples, no regulan el gas, y queman gas propano. 3.1.27 Autoclave Consta de una caldera de acero o de cobre batido estaado interiormente, protegida por una camisa metlica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base est instalada la fuente calrica (gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, est la placa cribosa para apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa que es pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno est adaptado un arandel de caucho
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para el cierre hermtico del aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el cierre, evitndose el escape del vapor. Presenta adems, un manmetro (que marca las libras de presin), una vlvula de seguridad, un termmetro y una llave o espita (para la salida del aire y vapor al empezar a hervir el agua). El vapor de agua se aplica en una cmara cerrada en la que existe un generador de vapor; cuando ste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el momento en que ya sale vapor. Posteriormente se consigue la presin deseada, teniendo en cuenta que el vapor a 1 atm. de presin corresponde a 121C de temperatura. Esta temperatura, aplicada durante 15 o 20 minutos, una temperatura de 134 C durante 7 minutos destruye todas las formas vegetativas y esporuladas. El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente se han dado las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilizacin ms usados son productos qumicos (que cambian de color segn los niveles alcanzados) y esporas de ciertas bacterias. 3.1.28 Horno Pasteur Es un aparato muy utilizado en la esterilizacin por calor seco. Es cilndrico, de metal, de triple pared; la intermedia ms corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas paralelas (concntricas) que se comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro hace fondo. Las paredes son metlicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta. Por los lados o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero mltiple o juego de resistencia (fuente calorfica). 3.1.29 Espectrofotmetro Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza mucho en anlisis bioqumicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda ms cortas del azul y el verde. 3.1.30 Potencimetro Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biolgicos, medios de cultivo, etc. 3.1.31 Contador de colonias Lo ms difcil en la determinacin de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El contador de colonias soluciona este problema convirtindose en un auxiliar indispensable para todo laboratorio microbiolgico y adems no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo.

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3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras Son incubadoras de temperaturas fras. Se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros y reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento ms prolongado de sueros, enzimas, etc. Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberas de agua caliente. 3.1.33 Estufas de cultivo Sirven para realizar el proceso de incubacin, que brinda una temperatura adecuada para que los microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos mtodos de incubacin:

Incubacin por calor seco: Se realiza en incubadoras

e incluso en hornos. Las

incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre stos radica en la temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato que es capaz de soportar temperaturas de 100 C ms. El ms conocido es el horno Pasteur.

Incubacin por calor hmedo (bao Mara): El llamado bao Mara presenta un

dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio de una corriente de conveccin, lo que permite que el agua se caliente en forma ms uniforme. 3.1.34 Microscopio ptico La Microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio. Podemos encontrar un microscopio simple que no es ms que una lente biconvexa, o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayor aumento. Los microscopios se clasifican bsicamente en dos grupos en funcin del tipo de luz utilizada y amplificacin: microscopio de luz ptica y microscopio electrnico. El microscopio mediante el cual la amplificacin de la imagen se obtiene por un sistema de lentes pticas, corresponde a los microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificacin de la imagen se hace a travs de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio electrnico. Los diversos componentes del microscopio ptico pueden ser agrupados en cuatro sistemas:

a) b) c) d)

Sistema de soporte: Pie, bastidor, revlver portaobjetivos, platina. Sistema de aumento : Objetivos, oculares Sistema de iluminacin: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros. Sistema de ajuste: Tornillo macromtrico, tornillo micromtrico, condensador,

elevador del diafragma iris, reguladores de la platina mecnica, tornillos para centrar el condensador.

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Sistema de aumento La amplificacin de la imagen en un microscopio ptico se obtiene mediante dos sistemas de lentes convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del tubo del microscopio, justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan objetivos y forman la imagen real del objeto que se est observando. El poder de aumento de cada uno de ellos es indicado por un nmero grabado ejemplo: 40 indica un aumento del objetivo de 40 veces. El segundo sistema de lentes que se sita en el extremo superior del tubo del microscopio, est ms alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano. Son los oculares y se encargan de ampliar la imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano. La amplificacin del ocular suele venir indicada en la parte superior del lente ocular o en la lateral. Poder de aumento del microscopio Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se emplea un objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de aumento del microscopio ser de 450. Poder de resolucin del microscopio Es la distancia entre dos estructuras de un espcimen en la cual todava se pueden observar como estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolucin se define como el espacio de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar con claridad como dos entidades independientes y si se les acerca un poco ms, ya no se distinguen, y se les ve como un solo punto. El poder de resolucin est sujeto a la longitud de onda () del espectro de luz visible y a la propiedad de las lentes conocidas como la abertura numrica (AN). El lmite del poder de resolucin de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 /AN que para un microscopio ptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes, ser mejor el poder de resolucin del microscopio

Abertura numrica de un objetivo Depende del ndice de refraccin (N) del medio que llena el espacio entre el espcimen y la parte frontal del objetivo, y del ngulo () de los rayos de luz mas oblicuos que pueden entrar al objetivo. Usando una lente con mayor abertura numrica, se obtiene mayor poder de resolucin. AN = N x Sen /2 El aire tiene un ndice de refraccin de 1, que limita la resolucin que se puede obtener, pero se puede incrementar la abertura numrica colocando aceite de inmersin entre el especmen y el objetivo, aumentando as el poder de resolucin del microscopio.

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Aceite de inmersin Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego se desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el punto objeto es el aceite. Este tiene un ndice de refracccin de 1,5, lo que aumenta considerablemente la abertura numrica. La observacin de algas, hongos y protozoos se puede hacer con los objetivos secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espcimen y el objetivo, pero para observar las bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo de inmersin de aceite. Iluminacin La iluminacin es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolucin de un microscopio. La luz proceder de la fuente de iluminacin que se situar en la parte ms baja del microscopio. Dicha luz penetrar en el condensador y ste llegar al objetivo que lo amplificar, as pues deber llegar un cono de luz muy grande para que su amplificacin sea mayor. Este tamao de cono de luz que llega al objetivo se podr controlar con el diafragma situado inmediatamente debajo del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma estuviera completamente abierto, se perdera contraste y nitidez. Si se utiliza el objetivo de inmersin, la distancia de trabajo es muy pequea y, en estos casos, hay que abrir ms el diafragma para facilitar una mayor amplificacin que aumente el mximo poder de resolucin.

3.2

Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiologa

.3.2.1 Microscopio - Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriolgica estril. - Homogenizar la muestra en solucin salina fisiolgica estril (1 gota) sobre una lmina porta objetos. - Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo. - Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X. 3.2.2

Horno Pasteur

Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado. Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura del horno a 180 C y mantener el material por espacio de 2 horas. Precauciones en el manejo No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio.

Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de sta manera se evitar la carbonizacin del papel y tapones de algodn.

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No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales, guantes de goma, etc.

3.2.3 -

Autoclave

Depositar agua en la caldera hasta unos centmetros de la parrilla. Colocar el material a esterilizar en la canastilla. Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en dos tornillos diagonalmente opuestos.

Dejar abierta la espita. Encender la fuente de calor. Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo. Observar el manmetro y mantener la presin en 15 libras mediante el control de la temperatura (121 C) durante 15 a 20 minutos.

Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presin deseada.

Apagar el sistema de calefaccin, despus del tiempo de esterilizacin. Dejar enfriar hasta que el manmetro marque cero. Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua. Aflojar los tornillos y levantar la tapa ponindose detrs del aparato para evitar que los vapores lleguen a la cara del operador.

Precauciones en el manejo:
Para evitar la prdida de material por ebullicin se recomienda no llenar los recipientes. No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la

circulacin del vapor.

No bajar la presin abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar prdida de material

y ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presin. 3.2.4 Estufa - Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el medio de cultivo inoculado. - Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica. - Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubacin durante 24, 48 horas o ms tiempo si es requerido. 3.2.5 Bao Mara - Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo. - Encender la fuente calorfica. - Graduar la temperatura deseada. - Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo deseado.
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3.3

Esterilizacin del material de uso en el laboratorio de Microbiologa

Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o

3..3.1 Placas de Petri de descarte y

esterilizar en autoclave a 121 C durante 20 minutos.

Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y

dejar secar.
Envolver con papel y asegurar con pabilo. Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.

3.3.2

Tubos de ensayo
En una canastilla o un depsito que los sostenga depositar los tubos que contengan

material contaminado o de descarte.

Esterilizar en el autoclave a l21 C durante 20 minutos. Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y

dejar secar.
Taponar los tubos con algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente

y facilite su uso posterior.

Envolver con papel. De preferencia formar grupos

de

seis tubos, envolver y

asegurar con pabilo.

Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.

3.3.3

Matraces
Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recin

preparados o cultivos de descarte.

Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar. Colocar tapones de algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente y

facilite su uso posterior.

Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.

3.3.4

Pipetas
Colocar un tapn de algodn ligeramente ajustado en el orificio superior de las

pipetas.
Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas. Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.

17

Anexo

Figura 2.1 Equipos de uso en microbiologa, a. Autoclave, b. Estufa c. Horno, d. Espectrofotmetro

18

c
d

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiologa, a. Potencimetro, b. Refrigeradora, c. Microscopio binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Bao mara.

19

5. Referencias bibliogrficas Granados, E. & Villaverde C. (1997). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Mendo, M. (1999).Instrumentacin de Laboratorio. Lima, Per: Editorial Cientfica

Mundi E.I.R.L.

20

Prctica III Observacin de bacterias

1. Introduccin Leewenhoek realiz observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta

entonces slo se poda especular de la existencia de agentes infecciosos ms pequeos que lo que el ojo humano poda distinguir. Desde ese momento el microscopio ptico se ha transformado en una herramienta muy importante en la determinacin y clasificacin microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con slo unas pocas coloraciones y un microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo individual ms eficiente y econmico para el diagnstico rpido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos a. b. c. d. Reconocer la morfologa de las bacterias. Adquirir destreza en la obtencin de un frotis. Describir las tcnicas de coloracin simple y compuesta. Adquirir destreza en la tincin de Gram

3. Procedimiento a. Obtencin de un frotis

El frotis constituye la extensin y fijacin de la muestra sobre una lmina portaobjetos limpia y desengrasada.

Extensin: Se coloca en el centro de una lmina portaobjetos una gota del cultivo

lquido. Si el cultivo fuera slido, se coloca previamente una gota de solucin salina o agua destilada sobre la lmina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequea porcin de una colonia tomada con el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lmina.

Fijacin: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea

arrastrado durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

21

b D

Figura 3.1 Tecnica para la obtencin de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b) colocar una gota de solucion salina esteril en una lmina portaobjetos c) tomar una colonia de la placa de Petri. c), d) realizar una emulsin , luego extender la muestra sobre la lamina y muestra al calor . fijar la

b.

Coloracin simple

Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc. Procedimiento:

En una lmina portaobjetos realizar el frotis de la muestra. Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5

minutos.

Lavar el frotis a chorro de agua. Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio y esquematizar.

c.

Coloracin compuesta: Tcnica de Gram

Coloracin compuesta es aquella que utiliza ms de un colorante. La ms comn es la tincin de Gram, donde las bacterias se tien con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las

bacterias Gram positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.

22

Procedimiento:

En una lmina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el

frotis.

Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos. Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto. Lavar a chorro de agua y decolorar rpidamente con alcohol acetona. Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos. Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersin. Comparar y esquematizar.

23

4. Anexo

Reactivos para la tincin de Gram

A) Soluc. A Soluc. B

Violeta de Genciana de Hucker Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g

Alcohol etlico ............................................................................... 20,0 mL Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B)

Solucin de safranina

Safranina ...................................................................................... 0,25 g Alcohol etlico .............................................................................. 10,0 mL Agua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C)

Solucin de lugol

Yodo .............................................................................................. 1,0 g Yoduro de potasio ......................................................................... 2,0 g Agua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D)

Alcohol acetona

Alcohol de 95 ............................................................................... 70,0 mL. Acetona .......................................................................................... 30,0 mL

5. Referencias bibliogrficas -

Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10
ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

24

Prctica IV Medios de cultivo

1. Introduccin Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicacin de los microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrgeno, debe presentar un equilibrio cido base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes (esterilizado en autoclave a 121 C, 15 libras de presin, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo segn su naturaleza 1.1.1 a. b. 1.1.2 Naturales Origen animal: Leche, huevos. Origen vegetal: Papas. Artificiales: Son aquellos que tienen una composicin qumica conocida y constante ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo segn su utilidad 1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Entre ellos estn el caldo comn, agar comn, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo comn (g/L) Peptona NaCl Agua destilada csp pH 10,0 5,0 1000 mL 7,0

Agar comn (g/L) Peptona NaCl Agar Agua destilada csp pH 10,0 5,0 15,0 1000 mL 7.0

25

Caldo nutritivo (g/L) Peptona NaCl Extracto de carne Agua destilada csp pH 10,0 5 ,0 3,0 1000 mL 7,0

Agar nutritivo (g/L) Peptona NaCl Agar Extracto de carne Agua destilada csp pH 10,0 5,0 15,0 3,0 1000 mL 7,0

1.2.2

Medios especiales

a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos orgnicos como sangre, yema de huevo, suero, etc. Agar sangre Agar comn fluidificado y enfriado a 45 C Sangre citratada 95 mL 5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos e inhiben a otros acompaantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de sodio. Agar Chapman (g/L) Peptona Extracto de carne NaCl Manitol Agar Agua destilada csp Rojo de fenol pH 10,0 1,0 75,0 10,0 15,0 1000 mL 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo) 7,4

26

c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos y a la vez los diferencian segn la utilizacin del sustrato. Ejemplo: Agar Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L) Peptona Peptona proteosa Lactosa Sales biliares Cristal violeta NaCl Agar Agua destilada csp Rojo neutro pH 17,0 3,0 10,0 1,5 0,001 5,0 15,0 1000 mL 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro) 7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioqumica de los microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI, Agar LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L) Peptona Extracto de Levadura Dextrosa Lisina Ctrato amnico frrico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua pH 5,0 3,0 1,0 10,0 0, 5 0, 04 0, 02 15 g 1 000 mL 6,7

27

1.3 Clases de medios segn su consistencia 1.3.1 1.3.2 Lquidos Slidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un polisacrido extrado de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a 80 100 C y de solidificarse a 40 C. As mismo, el agar no es degradado por las bacterias. 1.3.3 Semislidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos 2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiologa. 2.2 Adquirir destreza en la preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

3. Procedimiento 3.1 Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y adicionar la cantidad de agua destilada requerida. b. Disolver en Bao Mara. c. Enfriar y ajustar el pH segn convenga. d. Colocar un tapn de algodn en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y asegurar con pabilo. e. Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 libras de presin durante 15 minutos.

3.2 Metodologa para servir medios de cultivo a. Fluidificar los medios slidos al calor, enfriar a 50 C y frente a la llama del mechero servir en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada. b. Servir los medios lquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 C. b. Observar y descartar los medios que presenten (contaminante). desarrollo de algn microorganismo

28

Adicionar los ingredientes en el matraz.

Agua destilada

Llevar el medio a autoclave

Llevar el medio de cultivo a control de esterilidad.

Servir los medios a placas

Llevar a control de esterilidad

Adicionar los ingredientes en el matraz.

Agua destilada

Homogenizar el medio de cultivo

Servir el medio de cultivo

Los tubos son colocados en una gradia y son taponados con algodn

Los tubos son llevados a autoclave

Los tubos son inclinados y llevados a control de esterilidad.

Figura 4.1 Metodologa para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo slidos y lquidos

4. Referencias bibliogrficas -

Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10
ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

29

Prctica V Siembra y aislamiento de bacterias

1. Introduccin Sembrar es la accin de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato que permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y para trasplante. La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo comn sta presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos. Generalmente se utiliza la tcnica de agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple. Cuando se desea contar el nmero de bacterias se utiliza la tcnica de placa vertida. La siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie microbiana (cepa). Tambin se denomina repique. El objetivo es el mantenimiento del microorganismo conocido cambindolo a un nuevo medio de cultivo. La siembra por trasplante puede ser:

De un medio slido a otro medio slido De un medio slido a un medio lquido De un medio lquido a otro medio lquido De un medio lquido a un medio slido

2. Objetivos - Realizar una siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple. - Realizar una siembra por difusin en placa o placa vertida - Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento 3.1 Siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biolgica.

Tomar una alcuota de la muestra (inculo) y depositarla en uno de los extremos

superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido y controlado.

Realizar movimientos en zig zag (estras) muy juntos en el primer tercio de la placa

para agotar el inculo. Posteriormente realizar estras muy separadas de un extremo a otro lado de la placa no tomando nuevo inculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la placa.

Incubar a 37 C (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

30

Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusin en placa o placa vertida Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biolgica.

Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de Petri estril y vaca. Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 50 C. Homogenizar por movimientos de rotacin de la placa de Petri para la dispersin de microorganismos en forma ms o menos homognea, hasta la solidificacin.

Incubar a 37 C durante 24 horas. Realizar el recuento de colonias.

3.3 a.

Obtencin de un cultivo puro de bacterias Tratamiento de la muestra

Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio y por lo tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biolgicas que pueden ser de varios tipos: a.1 Muestras que contienen abundante nmero y tipo de microorganismos en las que

previamente se deben realizar diluciones en solucin salina fisiolgica estril. Ejemplo suelo. a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea investigar, por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el nmero del microorganismo requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche. a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el microorganismo

investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningn pre-tratamiento. Ejemplos sangre,

31

b.

Aislamiento primario

Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento primario a travs de la siembra en placa de Petri mediante la tcnica de estra en la superficie de medios enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos diferenciales (agar Mac Conkey). Despus de un periodo de incubacin de 24 horas (puede variar en funcin del microorganismo), se observarn las colonias de bacterias (masas constituidas por millones de bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a partir de una clula). Se observar el tamao y el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada gnero y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como caracterstica diferencial. A continuacin se realizar una tincin de Gram para determinar la morfologa y reaccin tintorial de las bacterias constituyentes de la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas sobre el medio de cultivo.

32

c.

Aislamiento secundario

En caso que la morfologa y reaccin a la tincin de Gram de las clulas bacterianas coincidan con el microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a travs de una siembra para trasplante o transferencia de una pequea porcin de la colonia hacia un tubo con medio de cultivo inclinado que permitir el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano (poblacin de bacterias que procede de una clula) y que a su vez puede ser mantenido e identificado merced a sus propiedades culturales y fisiolgicas.

4. Referencias bibliogrficas Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental
-

Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos
(10 ed.) Madrid, Espaa: Pearson Educacin, S.A.

33

Prctica VI IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. Introduccin Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificacin del gnero y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificacin comienzan con el estudio morfolgico de la colonia, estudio morfolgico de las clulas, motilidad, prueba de catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidacin fermentacin, metabolismo de carbohidratos, metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas segn la bacteria que va a ser identificada.

2. Objetivos 2.1 Caracterizar morfolgicamente las colonias bacterianas. 2.2 Caracterizar morfolgicamente las clulas bacterianas. 2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa. 2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidacin-fermentacin 2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1 Estudio morfolgico de las colonias bacterianas Determinar el tamao, forma, borde, elevacin, consistencia, aspecto y color de la colonia bacteriana. a) Tamao: Pequeo, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo, invadiendo toda la superficie del medio. b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme. c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados. d) Elevacin: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada. e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente. f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

34

Forma

Elevacin

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevacin de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo a los estreptococos. Tcnica del porta objetos: En una lmina portaobjetos depositar una colonia bacteriana procedente de un cultivo joven y aadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes. Interpretacin: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxigeno molecular. 2 H202 = 2 H20 + 02

35

Figura 6.1 Reaccin positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas Reaccin Morfologa Staphylacoccus Cocos Micrococcus Streptococcus Enterococcus Bacilos esporulados Bacilos no esporulados Bacillus Clostridium Listeria Corynebacterium Erysipelotrix Catalasa + + + + + Gram + + + + + + + + +

3.3 Estudio morfolgico de las clulas bacterianas Realizar un frotis de una pequea porcin de la colonia y una tincin de Gram para determinar la morfologa celular y reaccin a la tincin de Gram de las clulas bacterianas.

36

3.4 Prueba de oxidacin fermentacin Determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la va oxidativa, el aceptor final de electrones es el oxgeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la va fermentativa, el aceptor final de electrones es un compuesto orgnico procedente de la misma va, por consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez. La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas producen cido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias fermentativas producen mucho cido en todo el tubo. Tcnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de los tubos con vaselina o aceite de parafina estril. Incubar a 37 C por 24 horas, aunque a veces es necesario una incubacin de hasta 14 das. Interpretacin: Si la va es oxidativa, slo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en la parte superior al amarillo y ms tarde se extender por todo el tubo, pero nunca con produccin de gas. Si la va es fermentativa, se observar un viraje intenso al amarillo que se inicia en la parte inferior de los dos tubos con o sin produccin de gas. Utilizacin: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratos Investigar la fermentacin de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formacin de acidez (medio RMVP), utilizacin del citrato como fuente de carbono y energa (medio citrato de Simmons) e hidrlisis del almidn (agar almidn).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenados Investigar la descarboxilacin de la lisina (agar LIA) y formacin de indol (caldo peptonado)

37

AGAR TSI (Agar triple azcar de hierro) (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composicin Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Peptona proteasa Lactosa Sacarosa Glucosa Sulfato ferroso (FeSO4) Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) Agar Rojo de fenol Agua csp pH 3,0 g 3,0 g 15 g 5,0 g 10 g 10 g 1,0 g 0.2 g 5,0 g 0,3 g 15 g 0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo) 1 litro 7,4

2. Fundamento Este medio se utiliza para la identificacin de enterobacterias segn su capacidad para metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formacin de sulfuro de hidrgeno (H2S) y gas. Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el indicador rojo de fenol a un color amarillo. La fermentacin de la glucosa se lee al fondo del tubo (amarillo), la fermentacin de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la fermentacin de la lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo). Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las protenas que alcalinizan el medio por la formacin de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo acentuado, debido a que la pequea cantidad de glucosa (0.1%) se consume rpidamente en la superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo). En la produccin de sulfuro de hidrgeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio hasta hidrgeno sulfurado (o sulfuro de hidrgeno) y ste se une al fierro (del FeSO4) formando un compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier parte del tubo, especialmente en el fondo. En la formacin de CO2 e H2 durante la fermentacin de los carbohidratos: el agar se rompe o se forman cavidades con aire en el medio de cultivo.
38

3. Tcnica

Sembrar por puntura y estra en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI. Incubar a 37 C durante 24 horas. Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

amarillo amarillo

rojo amarillo

rojo negro amarillo

A/A
amarillo todo el tubo

K/A
amarillo en el fondo del tubo y rojo en la parte superior

K/A
amarillo en el fondo del tubo y rojo en la parte superior

Gas (+) H2S (-) glucosa (+) lactosa (+) sacarosa (+)

Gas (-) H2S (-) glucosa (+) lactosa (-) sacarosa (-)

Gas (-) H2S (+) glucosa (+) lactosa (-) sacarosa (-)

39

Medio MRVP (Rojo de Metilo Voges Proskauer)

1. Composicin (g/L) Polipeptona Glucosa Fosfato dipotsico Agua csp Indicador rojo de metilo 7,0 5,0 5,0 1000 mL pH 4,5 = Rojo pH 6,3 = Amarillo pH 6,9

2. Fundamento Este medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba de rojo de metilo detecta la formacin de cidos (lctico, actico, frmico) por fermentacin cido mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de cidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener el pH bajo despus de una incubacin prolongada de 48 horas. 3. Tcnica
Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP. Incubar a 37 C durante 48 horas. Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.

4. Lectura El desarrollo de un color rojo estable indica que la produccin de cido es suficiente como para bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores de cido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. sta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna amarillo.

40

MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composicin (g/L) Fosfato amnico Citrato sdico Cloruro sdico Fosfato bipotsico Indicador azul de bromotimol pH 6 = amarillo, pH 7.6 = azul Sulfato magnsico Agar Agua csp pH 2. Fundamento Este medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono y energa. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y bicarbonatos (C02 se junta con el sodio). Simultneamente los microorganismos utilizan el fosfato amnico como fuente de nitrgeno y liberan amonaco. La presencia de carbonatos, bicarbonatos y amonaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira al azul. 3. Tcnica
Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar citrato inclinado. Incubar a 37 C durante 24 horas. Observar el cambio de coloracin del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.

1,0 2,0 5,0 1,0 0,08

0.20 15 1000 mL 6.9

4. Lectura En caso positivo se observar el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador, observndose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observar crecimiento de la bacteria y el medio permanecer de color verde.

MEDIO AGAR ALMIDN

1. Composicin (g/L) Agar nutritivo Almidn 100 mL 1.0

2. Fundamento El almidn es un polmero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidn a molculas ms simples como la maltosa y glucosa, stas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloracin azul.

3. Tcnica

Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar almidn inclinado. Incubar a 37 C durante 24 horas. Adicionar dos gotas de lugol. Observar la presencia o no de una coloracin azul.

4. Lectura En una hidrlisis positiva del almidn, despus de adicionar el lugol no se observar coloracin alguna. Por el contrario, en una hidrlisis negativa despus de adicionar el lugol se observar una coloracin azul.

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)

1. Composicin (g/L) Peptona Extracto de levadura Dextrosa Lisina Ctrato amnico frrico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua pH 5,0 3,0 1,0 10,0 0, 5 0,04 0,02 15,0 1 litro 6.7

2. Fundamento Este medio permite evidenciar la descarboxilacin de la lisina y la formacin de cido sulfhidrico (H2S).

Para que se lleve a cabo la descarboxilacin tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0) debe

por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo

utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color violeta (K / K).

La produccin de H2S se evidencia por la coloracin negra debido al sulfuro de fierro Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un

formado.

cetocido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales frricas y un color rojizo bajo la influencia del oxgeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A).

Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa

producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Tcnica

Sembrar por puntura y estra en superficie en un tubo conteniendo medio LIA Incubar a 37 C durante 24 horas. Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

Negro Violeta Rojo Violeta Amarillo Amarillo Amarillo

K/K

R/A

K/A

A/A

LIA (-)

LIA (+)

MEDIO CALDO PEPTONADO 1. Composicin (g/L) Peptona Na Cl H2O csp pH Reactivo de Kovac : 10,0 3,0 1000 7,0 Alcohol amlico o isoamlico puro p dimetilaminobenzaldehido HCl concentrado 2. Fundamento Este medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrlisis del aminoacido triptfano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido del p dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac) 3. Tcnica

150 10 50

Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio. Incubar a 37 C durante 24 horas. Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac.

4. Lectura Observar la formacin de un anillo coloreado en la zona de reaccin (color rojo) = Indol (+)

Tabla 6.2. Reaccin a ciertas pruebas bioqumicas claves para la diferenciacin de bacterias entricas Lisina Gneros H2S Indol Rojo de metilo Escherichia Enterobacter Shigella Salmonella Klebsiella Citrobacter Proteus + +/+/+ +/+/+ + + + + + d + + + + +/+ + D + + + + + +/+ + + d descarb. Citrato Gas (glucosa) Lactosa

4. Referencias bibliogrficas Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque, Per.
MERCK (2005). Curso Taller de Actualizacin terico-prcrtico. Tcnicas Microbiolgicas de Anlisis de Aguas y Alimentos. Piura, Per.

Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental

Doyle, M., Beuchat, L. & Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos. Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A.

Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos
(10 ed.) Madrid, Espaa: Pearson Educacin, S.A.

PRCTICA VII
RECONOCIMIENTO DE LAS ETAPAS DE UN PROCESO DE FERMENTACIN INDUSTRIAL
Un proceso de fermentacin tpico es aquel que se lleva a cabo en un recipiente llamado fermentador o biorreactor, en el que determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa (producto). En el esquema general de un proceso de fermentacin existen cuatro etapas diferenciadas: propagacin de cultivos, fermentacin, operaciones y procesos de separacin y purificacin de los productos (recuperacin de producto) y tratamiento de los residuos.

1.

Propagacin de cultivos La propagacin de cultivos se realiza en laboratorio y comienza con un tubo de ensayo que

contiene un cultivo reciente de un microorganismo o un tubo liofilizado o congelado, donde se conserva el microorganismo de inters obtenido comercialmente. En ambos casos el proceso, comprende aislamiento, seleccin, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos de inters industrial.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos .La fuente de todos los microorganismos industriales es el ambiente natural (suelo, agua), animales y plantas enfermas, alimentos de fermentaciones naturales (vino, pan, queso) y materiales en descomposicin. A nivel industrial, en general, cada firma posee su propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a travs de tcnicas clsicas de mutacin o de ingeniera gentica En el mundo existe un gran nmero de colecciones depositarias de cultivos como American Type Culture Collection (ATCC), USA y la Coleccin Espaola de cultivos tipo (CECT) las cuales mantienen bacterias, levaduras, algas, actinomycetos, mohos, protozoos, virus y lneas celulares.

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica utilizada, siendo las alternativas: a) aislamiento directo b) enriquecimiento de la muestra con o sin pretratamiento. Una vez efectuado el aislamiento de los microorganismos se procede al screening primario que es una seleccin cualitativa para detectar si el microorganismo produce o no un compuesto. Por ejemplo, seleccionar microorganismos productores de cidos orgnicos, enzimas, antibiticos por la presencia de halos transparentes o de zonas de

inhibicin de crecimiento, respetivamente. Se prosigue con el screening" se cundario, que es una seleccin cuantitativa para valorar la produccin y productividad industrial. Por ejemplo, determinar el espectro antimicrobiano, la concentracin de cidos orgnicos o de enzimas producidas.

Despus de la seleccin de

microorganismos industriales es preciso mantenerlos y

conservarlos. El mantenimiento es por cortos perodos de tiempo (das) y la conservacin por largos perodos de tiempo (aos), a travs de diferentes tcnicas que corresponden a la desecacin, congelacin y liofilizacin. En general los organismos aislados de la naturaleza producen metabolitos de inters

industrial en concentraciones muy bajas, por lo tanto se hace necesario incrementar estos rendimientos, para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio de cultivo y de las condiciones de operacin, pero est limitado por la capacidad de sntesis mxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa por seleccin natural de variantes, mutacin inducida y recombinacin gentica. La productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo ser modificado para incrementar los rendimientos. Con el organismo modificado se reexaminan las condiciones de cultivo para lograr nuevamente la mxima productividad.

Finalmente, se procede a la propagacin de los cultivos o inculos, teniendo como material de partida los microorganismos seleccionados y en el mejor de los casos mejorados, debiendo aumentar la cantidad de los mismos mediante sucesivos pasajes en frascos de volmenes crecientes, que son generalmente operados en agitadores (5 a 100 mL y entre 100 a 10 000 mL respectivamente)

2.

Fermentacin Un proceso tpico de fermentacin comienza con la formulacin y esterilizacin del medio

de cultivo as como la esterilizacin del equipo (tanque de inculo o prefermentador y fermentador de produccin). El inculo propagado sucesivamente en matraces se siembra en el tanque de inculo o prefermentador que puede tener un volumen de 10 L a 1 000 L, segn la

escala industrial posterior. Del tanque de inculo se siembra al fermentador industrial o de produccin cuyo volumen vara de acuerdo al producto a obtener y a su concentracin y est comprendido entre 1000 a 100 000 L. En algunos casos especiales, como la produccin de protena microbiana, los tanques de fermentacin pueden llegar hasta 1 000 000 L.

El tamao de inculo generalmente es de 1 a 10 % del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporcin se puede prolongar el periodo de latencia, lo que incrementar el periodo de fermentacin. Se considera 5 a 10 % para hongos y actinomicetos y 0,1 a 3,0 % para bacterias, a excepcin de los actinomicetos.

3.

Operaciones y procesos de separacin y purificacin de los productos Estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente: a) separacin de insolubles

por filtracin, centrifugacin o decantacin; b) separaciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin; c) purificacin por extraccin lquido lquido o extraccin a dos fases acuosas, o cromatografa de afinidad, y finalmente del producto. d) aislamiento

4.

Tratamiento de residuos Si bien no tiene una relacin directa con el producto, que es la razn de ser la industria de

fermentacin, representa una etapa imprescindible, porque es fundamental controlar la calidad y cantidad de residuos que salen de la fbrica y que son enviados generalmente a un curso de agua, sea un canal, arroyo, un ro o al mar.

Procesos y Propagacin de los cultivos Fermentacin operaciones de separacin y purificacin Tratamiento de residuos

Separacin

Residuos

Esterilizacin

Purificacin

Tratamiento

Preparacin de medios

Producto

Materias primas

Aislamiento Seleccin Mantenimiento Mejoramiento Propagacin multiplicacin cultivos o de

Figura 1. Esquema general de un proceso de fermentacin o bioproceso.

5. Referencias bibliogrficas

Dorn, P. (1995). Principios de Ingeniera de los Bioprocesos. Espaa: Editorial Acribia.

Ertola, R., Yantorn, O. & Mignon, C. (1994). Microbiologa Industrial. Argentina.

Madigan M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos. 10 a ed. Madrid: Pearson Educacin, S.A.

PRCTICA VIII AISLAMIENTO, SELECCIN Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS LCTICOS TERMFILOS:

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus
1. Introduccin Los cultivos lcticos iniciadores, fermentos o starters son microorganismos seleccionados que se emplean en la industria de alimentos fermentados. Segn la temperatura ptima de crecimiento, los cultivos lcticos comerciales pueden ser termfilos y mesfilos y segn su composicin pueden ser fermentos de cepa nica, mltiples y mixtos. Los cultivos lcticos termfilos contienen bacterias cuya temperatura ptima de crecimiento est entre 40 a 45 C. Son utilizados para la elaboracin de yogurt y quesos duros y estn constituidos por Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus y L. lactis. El yogurt es un producto lcteo fermentado que resulta del crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en leche concentrada (por evaporacin o por adicin de slidos). Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus es un bacilo Gram positivo, largo, no mvil, que produce cido D (-) lctico. Fermenta fructosa, galactosa, glucosa y lactosa, pero no maltosa y sacarosa. Requiere 11 a 15 aminocidos, segn las cepas y acidifica la leche ms lentamente que los estreptococos, pero generalmente ms intensamente gracias a una mayor resistencia al pH cido (hasta pH 3,5) y a una concentracin ms elevada de cido lctico (mximo 27 g/L). Streptococcus thermophilus es un coco Gram positivo, esfrico, agrupado en pares o en cadenas, homofermentativo y produce cido L (+) lctico a partir de glucosa, fructosa, lactosa y sacarosa. Se distingue bsicamente por su crecimiento termfilo con un ptimo de 42 a 43 C y termorresistencia a 60 C durante 30 minutos. Los estreptococos y lactobacilos transforman 20 a 30 % de la lactosa de la leche en cido lctico. La lactosa es hidrolizada a travs de una B D galactosidasa en D glucosa y B D galactosa. A continuacin, la D glucosa es trasformada en cido pirvico y despus en cido lctico, mientras que la galactosa es excretada y se acumula progresivamente en la leche, porque no es utilizada por los microorganismos del yogurt. Durante la fermentacin del yogurt (42 a 45 C) se mantiene un equilibrio entre la poblacin de estreptococos y lactobacilos y un favorable efecto sinrgico entre los dos grmenes, ya que su crecimiento conjunto es ms rpido que el crecimiento en un cultivo puro de cada uno de ellos. El estreptococo utiliza pptidos y aminocidos (valina) liberados a partir

de las protenas de la leche por los lactobacilos y a su vez, el crecimiento de stos es estimulado por compuestos producidos por los estreptococos como cido frmico, anhdrido carbnico y cido pirvico. Los criterios de caracterizacin y seleccin de las bacterias lcticas termfilas utilizadas en la elaboracin del yogurt se basan en cuatro propiedades que se determinan despus de su cultivo en leche: acidificacin a temperatura elevada, acidificacin a baja temperatura, produccin de acetaldehdo y viscosidad del medio de cultivo. La medida de la produccin de cido lctico a 44 C, durante la fase de crecimiento exponencial, caracteriza la actividad acidificante en la fermentacin del yogurt. El control de la produccin de cido lctico a temperaturas entre 4 a 12 C despus del crecimiento exponencial, durante 24 das, permite predecir los fenmenos de post acidificacin, durante la comercializacin del producto. La cantidad de acetaldehdo producido representa una buena forma de apreciar el efecto de una bacteria sobre el aroma del yogurt, ya que el acetaldehdo es el componente mayoritario en este aroma. Finalmente, la medida de la viscosidad de la leche por determinacin de las fuerzas de cizallamiento, permite conocer directamente la contribucin de una bacteria a la viscosidad del producto final. La elaboracin de yogurt a pequea escala permite comprobar las propiedades tecnolgicas de las mezclas de bacterias previamente seleccionadas en laboratorio. El anlisis organolptico de los productos obtenidos a escala industrial aporta informacin suplementaria sobre las aptitudes de las mezclas de cepas, en lo que respecta a su contribucin al aroma y viscosidad del producto final. Una vez seleccionadas las bacterias lcticas, stas son conservadas y comercializadas en diversas formas, cada una de las cuales presenta ventajas y desventajas.

a) Cultivos lquidos frescos o estrter lquidos Para su obtencin se requiere de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 a 12 % extracto seco magro, E.S.M.), esterilizada en autoclave a 15 libras de presin durante 10 a 15 minutos e incubada a 30 C durante 1 semana para comprobar su esterilidad. Tras la inoculacin (1 a 2 %) la leche es incubada a 30 C durante 16 a 18 horas o a 42 C durante 3 horas a 4 horas. Despus, el cultivo coagulado es refrigerado y cuando la acidez del cultivo refrigerado es de aproximadamente 0,85 % de cido lctico se tiene la garanta que durante 1 semana se mantendr su actividad y la relacin cocos: bacilos (1:1), recomendndose realizar como mximo 15 a 20 resiembras. Este tipo de estrter se conoce en la industria lctica como cultivos de reserva de trabajo. Su principal desventaja consiste en su corto periodo de conservacin, debido al posterior desarrollo de acidez y contacto de las clulas con el medio cido, lo que resta actividad al cultivo.

Se puede conseguir una conservacin ms prolongada de cultivos lquidos utilizando leche Litmus esterilizada en autoclave e incubada durante 1 semana para comprobar su esterilidad. Despus de la siembra se incuba a 42 C durante 12 horas y se almacena en refrigeracin. Estos cultivos solo tienen que ser reactivados una vez cada 3 semanas y son conocidos como cultivos de reserva.

b) Cultivos liofilizados (no concentrados) El estrter se cultiva en leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en autoclave con un porcentaje de inoculacin de 2 % y se incuba a 42 C durante 4 horas. Despus, se mantiene a 5 C durante 18 horas y posteriormente se distribuye en alcuotas de 2 a 3 mL en viales de vidrio estriles. Los viales se congelan a 40 C durante 2 a 3 horas, despus son liofilizados durante 36 horas, cerrados al vaco, sellados y se mantienen a 5 C hasta su utilizacin. Para la activacin de los cultivos liofilizados se vierte el contenido del vial en 250

mL de leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en autoclave y se incuba a 42 C durante 12 a 15 horas. Para lograr una actividad total se realizan una a dos siembras en el mismo medio con una tasa de inoculacin de 2 % y una incubacin a 42 C durante 4 horas. Como desventaja, los cultivos liofilizados presentan largas fases de latencia, siendo preciso la resiembra como mnimo dos veces para lograr cultivos lquidos activos, de all que para la produccin de los cultivos finales se utilice el sistema de Siembra a gran escala (sistema 1), ya que de otro modo se precisa una gran cantidad de cultivo deshidratado y largos periodos de incubacin.

c) Cultivos congelados (no concentrados) El estrter es congelado en forma rpida a temperaturas de 40 a 45 C, pudiendo mantenerse as por 3 a 8 meses. Las unidades deben ser descongeladas y propagadas una vez previa a su utilizacin a nivel industrial. Como desventaja se puede sealar que las posibilidades de transporte a bajas temperaturas se ven limitadas desde el punto de vista econmico.

d) Cultivos congelados o liofilizados concentrados de inoculacin directa En el mercado existen cultivos congelados o liofilizados concentrados, fcilmente utilizables para la inoculacin directa de los cultivos estarter definitvos (sistema 2) o alternativamente, para la inoculacin directa de la leche en el caso de fbricas de yogurt a pequea escala, En ambos casos, aunque el tiempo de produccin puede verse incrementado en 1 o 2 horas, se consigue un importante ahorro, al eliminar la necesidad de personal especializado en el manejo de cultivos estarter.

Los cultivos congelados o liofilizados concentrados vienen en presentaciones listas para su uso que no necesitan activacin previa y que son destinadas para volmenes desde 10 hasta miles de litros. Adems de contener proporciones determinadas de Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus y S. thermophilus se suplementan con otros microorganismos como Lactobacillus acidophilus.

Cuadro 1. Recuento de microorganismos viables en algunos cultivos estrter del yogurt

Tipo de cultivo o mtodo de conservacin Lquido Liofilizado Concentrado liofilizado Congelado en nitrgeno lquido Fuente: Tamine & Robinson, 1991

Recuento de microorganismos viables 3 5 x 108/mL 2 3 x 109/g 4 6 x 1010/g 2 x 109/mL

2. Objetivos 2.1 Aislar e identificar thermophilus. 2.2 Caracterizar y seleccionar Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus segn la acidificacin de la leche a 44 C. 2.3 Mantener Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus como cultivos de reserva de trabajo. 2.4 Obtener y mantener adecuadamente un cultivo estrter lquido (cultivo de reserva de trabajo) de yogurt. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus

3. Procedimiento 3.1 Aislamiento e identificacin de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus a. Muestra Leche fresca, yogurt natural. b. Pretratamiento de la muestra Para el aislamiento de S. thermophilus calentar la leche a 60 C, durante 30 minutos.

c. Enriquecimiento

Homogenizar la muestra de leche. Sembrar 1 mL de cada una de las muestras en tubos con 9 mL de caldo MRS.

Incubar los tubos a 30 C en una atmsfera de 5 a 8 % de CO 2 durante 24 horas (Jarra de Brewer).

d. Aislamiento
Tomar una asada de la muestra de leche enriquecida y sembrar mediante la

tcnica de agotamiento y estra sobre agar Rogosa (placas de Petri).

Incubar en jarra de Brewer a 30 C, por 24 horas. Seleccionar las colonias brillantes, convexas, de 1 a 2 mm de dimetro

(Lactobacilos) y las colonias puntiformes (Estreptococos). Realizar tincin de Gram para observar la morfologa bacteriana y reaccin a la tincin de Gram.
Subcultivar

en viales conteniendo agar Rogosa inclinado, para obtener

cultivos puros y proceder a su identificacin.

e. Identificacin
Prueba de catalasa. Crecimiento a 45 C (caldo MRS). Crecimiento a 10 C (caldo MRS). Crecimiento en 2 y 4 % NaCl (caldo MRS- NaCl). Acidez a partir de maltosa, sacarosa, manitol, glucosa, lactosa (tubos con

caldo MRS - carbohidrato).

Termoresistencia (caldo MRS).

Cuadro 2. Caractersticas diferenciales de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Termfilos bulgaricus helveticus 45 C + + Termfilo lactis + Mesfilos plantarum (+)(-) casei (+)() NaCl 2 % 60 C x 90 Maltosa Sacarosa Manitol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Termfilos acidophilus + fermentii +

Fuente: Holt et al. (1994) Cuadro 3. Caractersticas diferenciales de Streptococcus thermophilus S. termophilus 45 C 10 C NaCl 2 % NaCl 4 % Glucosa (acidez) Lactosa (acidez) Sacarosa (acidez) Maltosa (acidez) 60 C x 30 Fuente: Holt et al. (1994) + (+)(-) + + + + + + L. lactis ssp. lactis (+)(-) + + +

3.2 Caracterizacin y seleccin de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus segn la acidificacin de la leche a 44 C

Obtener una suspensin de clulas en solucin salina estril de cada una de las bacterias aisladas e identificadas y cultivadas en agar Rogosa durante 24 horas. Estandarizar la concentracin celular con el tubo 3 del Nefelmetro de Mc Farland. Tambin se puede sembrar cada bacteria en caldo MRS, a 30 C por 24 horas

Sembrar 2 mL de cada suspensin celular o de caldo MRS cultivado, en un matraz conteniendo 98 mL de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 12 % ESM),

esterilizada en autoclave a 15 libras durante 10 minutos e incubada a 30 C durante 24 horas para comprobar su esterilidad (leche tratada).

Incubar los matraces a 44 C durante 6 horas. Determinar el porcentaje de acidez expresada en cido lctico, utilizando el mtodo Acidimtrico de Mann, a las 0 y 6 horas despus de la inoculacin. Tomar 10 mL del contenido de cada matraz, agregar tres gotas de una solucin alcohlica de fenoltalena 1 % y titular con NaOH 0,1N, hasta que aparezca un color ligeramente rosado persistente. Cada mililitro de NaOH 0,1N gastado en la titulacin equivale a 0,009 de cido lctico. Ejemplo de clculo de porcentaje de acidez: Suponer que para titular 50 mL de caldo fermentado se gastaron 10 mL de NaOH 0,1N

Seleccionar las bacterias que presentan el mayor porcentaje de acidez titulable. S. thermophilus produce en la leche 0,7 a 0,8 % de cido lctico. Algunas cepas llegan hasta 1,0 %. Por su parte, L. delbrueckii ssp. bulgaricus produce hasta 1,7 % de cido lctico en leche.

3.3 Mantenimiento de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus como cultivos de reserva de trabajo

Independientemente, obtener una suspensin de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus y estandarizar su concentracin celular con el tubo 3 del nefelmetro de Mc Farland. A continuacin, tomar 2 mL de cada una de las suspensiones e inocularlos independientemente en matraces con 100 mL de leche tratada. Incubar a 42 C durante 4 horas. Mantener en refrigeracin a 8 C y subcultivar semanalmente.

3.4 Obtencin y mantenimiento de un cultivo iniciador lquido de yogurt (cultivo de reserva de trabajo)

Sembrar 1,0 mL de Streptococcus thermophilus y 1,0 mL de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (proporcin 1:1), haciendo un total de 2 mL, en un matraz con 100 mL de leche tratada.

Incubar a 42 C durante 4 horas. Determinar el porcentaje de acidez titulable (debe ser de 0,85 %). Mantener en refrigeracin y resembrar semanalmente.

1 mL

Lactobacilos

9 mL caldo MRS

Muestra: Leche fresca

Calentar la leche a 60 C durante 30 minutos

Pretratamiento de la muestra para estreptococos

1 mL

9 mL caldo MRS

Estreptococos

Figura 1. Pretratamiento y enriquecimiento de la muestra.

Lactobacilos
Incubar en jarra de Brewer a 30 C por 24 horas

Lactobacilos

AISLAMIENTO

ENRIQUECIMIENTO

Tincin de Gram

Subcultivar en Agar Rogosa

Tomar una asada y sembrar en agar Rogosa.

Estreptococos

Estreptococos

Figura 2. Aislamiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

30 C con 5 a 8 % de CO2, 24 horas

Lactobacilos

Resultados
Maltosa

L. delbrueckii ssp. bulgaricus

45 C

IDENTIFICACIN

NaCl 2 % Maltosa - 45 C NaCl 2 %

Resultados
Maltosa

+ S. thermophilus

45 C
NaCl 4 %

Maltosa - 45 C NaCl 4 % Estreptococos

Figura 3. Identificacin de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

2 mL

5 mL

L. delbrueckii ssp. bulgaricus Suspensin Tubo 3 del nefelmetro 98 mL de leche tratada: 44 C por 6 horas % de acidez: 3 gotas de fenolftalena y titular con NaOH 0.1N

5 mL

S. thermophilus
2 mL

Figura 4. Caracterizacin y seleccin de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

2 mL

L. delbrueckii ssp. bulgaricus Suspensin Tubo 3 del nefelmetro 98 mL de leche tratada: 42 C por 4 horas

CRT L. delbrueckii ssp. bulgaricus

S. thermophilus
2 mL CRT S. thermophilus

Figura 5. Obtencin de cultivos de reserva de trabajo (CRT).

CRT L. delbrueckii ssp. bulgaricus

1 mL

Incubar a 42 C por 4 horas

Cultivo iniciador lquido de yogurt

(CRT mixto)
1 mL CRT S. thermophilus

Figura 6. Obtencin y mantenimiento de un cultivo iniciador lquido de yogurt (CRT mixto).

4. Anexos

4.1 Peptona

Agar Rogosa (g/L) l0,0 5,0 20,0 6,0 2,0 1,0 15,0 0,120 0,034 0,575 15,0 1L 5,5**

Extracto de levadura Glucosa K H2 PO4 Citrato amnico Tween 80* Acetato de sodio** Sulfato de manganeso* Sulfato de hierro* Sulfato de magnesio* Agar agar Agua destilada csp pH No autoclavar **Selectividad para Lactobacillus *Factores de crecimiento para Lactobacillus

4.2

Caldo MRS: Man, Rogosa, Sharpe (g/L) 10,0 5,0 10,0 20,0 2,0 1,0 2,0 5,0 0,05 0,02 1000 mL 6,5

Peptona Estracto de levadura Extracto de carne Glucosa K H2 PO4 Tween 80* Citrato biamnico Acetato de sodio* Sulfato de manganeso* Sulfato de magnesio* Agua destilada csp pH *Factores de crecimiento para Lactobacillus

Cuadro 4. Caractersticas de algunas especies de Lactobacillus ADN (%) 49-51 49-51 49-51 34-37 33-35 38-40 45-47 45-47 45-47 45-47 42-44 42-44 44-46 44-46 45-47 44-46 40-42 40-42 52-54 45-47 45-47 36-38 Acido lctico D D D DL DL DL L DL L L DL L DL DL DL DL DL DL DL DL DL DL

Especie L. delbrueckii ssp. delbrueckii L. delbrueckii ssp. bulgaricus I L. delbrueckii ssp. lactis L. acidophilus L. gasseri L. helveticus L. casei ssp. casei L. casei ssp. pseudoplantarun L. casei ssp. tolerans II L. casei ssp. rhamnousus L. sake, Lb. curvatus L. bavaricus L. plantarum L. bifermentans L. brevis L. buchneri L. kefir III L. reuteri L. fermentii L. confusus L. viridescens L. Sanfrancisco
Fuente: Leveau y Bouix (2000)

Peptidoglicano Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp meso DAP Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Orn D Asp Lys Ala Lys Ala Ser Lys Ala

Hbitat vegetales yogur, queso queso boca, vagina boca, vagina queso rumen queso, forraje boca, vagina tracto intestinal vegetales vegetales vegetales, queso queso vegetales, queso vegetales, queso kefir tracto intestinal vegetales, queso vegetales productos crnicos pan, panettone

a.

Homofermentativos obligatorios
Fermentacin de pentosas y gluconato (-). Clulas largas, rectas,a menudo en empalizadas. Hasta 18 g/litro cido D () lctico .

b.

Homofermentativos facultativos
Fermentacin de pentosas y gluconato (+) (heterofermentativa). Clulas cortas a menudo ordenadas en filamentos. Poco cido lctico 3 a 13 g/L (DL L+).

c.

Heterofermentativos
Fermentacin de pentosas: cido lctico y actico. Clulas cortas y separadas. Dbil produccin cido lctico 5 g/L (DL).

Cuadro 5. Bacterias cido lcticas y especies predominantes utilizadas en los productos lcteos fermentados.
Productos Mantequilla fermentada Tradicional Recombinante Yogurt Tradicional Bioyogurt Biogarde Yakult Leche acidfila S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. acidophilus S. thermophilus, L. acidophilus, Bifidobacterium bifidum L. casei L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis, Leuconostoc., L. acidophilus Kfir Koumis Leben Queso fresco Quark Cottage Camembert y Brie Roquefort o azul Queso semicurado Muenster Stilton Queso madurado Cheddar Gouda/Edam L. lactis lactis, L. lactis cremoris L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis, Leuconostoc ssp. Emmenthal S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus, Propionibacterium spp. Parmesano L. lactis lactis, L. lactis cremoris, S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus Mozzarella Fuente: Lee, 1996 L. lactis lactis, S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus L. lactis lactis, L. lactis cremoris L. lactis lactis, L. lactis cremoris, Leuconostoc ssp. L. lactis lactis, L. lactis cremoris L. lactis lactis, L. lactis cremoris L. lactis lactis, L. lactis cremoris, P. camemberii Cultivo lctico, P. roqueforii o caseicolum L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. casei, L. caucasicus, Sach. kefir L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, levaduras Lactococcus, Lactobacillus Especies utilizadas* L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis, Leuconostoc cremoris L. helveticus

5. Referencias bibliogrficas

Fonseca, L. & Larrea, C. (2006). Efecto de la concentracin de melaza e inculo mixto de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en la elaboracin de ensilado de jurel (Trachurus picturatus murphyi). Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Leveau, J. & Bouix, M. (2000). Microbiologa Industrial. Los microorganismos de inters industrial. Espaa: Editorial Acribia, S.A. Marguet, E. & Vallejo, M. (2007). Curso Internacional:Biotecnologa de Bacterias AcidoLcticas. Su importancia en procesos Industriales. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 23 al 28 de abril de 2007, Lima Servicio Nacional de Adiestamiento en Trabjo Industrial, SENATI, (1999) Elaboracin de yogurt Lquido, Batido y Aflanado. Lima: Artes Grficas del IPACE. Tamine, A. & Robinson, R. (1991). Yogurt: Ciencia y Tecnologa. Espaa: Editorial Acribia S.A.

PRACTICA IX RECUPERACIN DE PRODUCTO EXTRACELULAR: Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides PRODUCTOR DE EXOPOLISACARIDO DEXTRANO
1. Introduccin El trmino recuperacin (dowstream processing) es un trmino colectivo, para todos las etapas que se requieren para recuperar (separar, extraer y purificar) productos tiles de un proceso industrial. En muchos casos la primera etapa del final de una fermentacin, es la separacin de los slidos del lquido, que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo puede ser el producto final deseado; sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que est presente intracelularmente (cidos nucleicos, vitaminas) o extracelularmente (aminocidos, cido ctrico, alcohol, antibiticos).

Para la separacin de las partculas o separacin de la biomasa celular y los componentes solubles del sobrenadante del cultivo existen varios mtodos que incluyen la floculacin, flotacin, filtracin y centrifugacin. Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, ste debe ser liberado de las clulas antes de proceder a la siguiente etapa. Para la desintegracin de los microorganismos se pueden utilizar mtodos qumicos (uso de lcalis, solventes orgnicos, detergentes, cloruro de sodio), mtodos biolgicos (lisis enzimtica) y mtodos fsicos (ultrasonido, congelacin y descongelacin, accin mecnica). Una vez que el metabolito ha sido separado de las clulas, la seleccin de etapas adicionales de purificacin depender del producto deseado. Los mtodos de aislamiento permiten separar y en su caso purificar el producto de inters e incluyen la cromatografa, extraccin, cristalizacin, precipitacin y desecacin.

Leuconostoc mesenteroides es una bacteria Gram positiva, con un porcentaje de

G+C

en su ADN, que se encuentra entre 37 a 41 %. Son cocos dispuestos en pares o en cadenas ms o menos cortas, heterofermentativos con produccin de cido D (-) lctico, etanol y CO2, son mesfilos con desarrollo ptimo a 28 C. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides se caracteriza porque utiliza citrato y sintetiza el polisacrido dextrano, pero no produce

acetona ni diacetilo.

El dextrano es una goma soluble en agua que se utiliza ampliamente como espesante, gelificante, agente de suspensin y coloide protector en distintos productos de consumo humano. Este polisacrido muestra caractersticas propias aplicables en productos alimenticios como estabilizador de jarabes azucarados, helados, dulces y clnicamente como expansor del plasma sanguneo. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides es una bacteria constituyente de la microbiota del jugo de la caa de azcar que procede de la molienda en las empresas azucareras y es la subespecie de mayor inters industrial como productor de dextrano.

2. Objetivos 2.1 Aislar e identificar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides. 2.2 Recuperar el dextrano producido. 2.3 Seleccionar producido. 2.4 Mantener adecuadamente Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productor de dextrano. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides segn el dextrano

3. Procedimiento 3.1 Aislamiento e identificacin de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides a. Muestra Jugo Crusher o jugo primario de la molienda de caa de azcar (tambin se puede utilizar jugo mezclado y jugo residual).

b. Procesamiento de la muestra Realizar diluciones de la muestra en solucin salina estril hasta 10-2.

c. Aislamiento de Leuconostoc

Tomar una alcuota de la dilucin 10-2 y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar hipersacarosado (placas de Petri)

Incubar en aerobiosis a 30 C durante 48 horas. Seleccionar cuatro colonias puntiformes que al estar rodeadas de dextrano presentan tamao grande (0,5 a 3,0 cm de dimetro), forma circular, bordes enteros, elevacin convexa, consistencia gomosa, aspecto opaco, y son incoloras.

Cultivar las colonias seleccionadas hacia

una placa conteniendo agar

hipersacarosado modificado. Incubar en aerobiosis a 30 C por 24 horas.

d. Identificacin de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides Para identificar la especie y subespecie, utilizar las colonias desarrolladas sobre agar hipersacarosado modificado y tomar en cuenta la morfologa y fisiologa celular. Para determinar la morfologa observar las colonias caractersticas sin dextrano: puntiformes, 0.5 a 1 mm de dimetro, bordes enteros, lisas, brillantes, incoloras. Realizar una tincin de Gram y reconocer la morfologa celular: cocos Gram positivos, dispuestos en pares y en cadenas cortas sin formas esporuladas. Para determinar la fisiologa realizar las pruebas de catalasa (negativo), la fermentacin de carbohidratos (Glucosa: acidez +, gas +; Arabinosa (acidez +); Fructosa, sucrosa o trehalosa (acidez +) y formacin de dextrano a partir de sacarosa (+). Subcultivar la especie identificada en dos viales, uno conteniendo agar hipersacarosado y otro con agar hipersacarosado modificado.

Cuadro 1. Caractersticas diferenciales de Leuconostoc mesenteroides

Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Arabinosa Fructosa, sucrosa o trehalosa Formacin de Dextrano a partir de sucrosa ssp. dextranicum + + ssp. mesenteroides + + +

Fuente: Holt et al. (1994)

3.1 Seleccin de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides segn el producido a. Obtencin de inculo

dextrano

Tomar una asada

de las colonias de Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides desasrrolladas en agar hipersacarosado y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar hipersacarosado (placas de Petri)

Incubar a 30 C durante 48 horas. Seleccionar las tres colonias con dextrano que presenten el mayor dimetro.

b. Produccin de dextrano

Transferir

las tres colonias seleccionadas hacia un matraz de 250 mL el asa

conteniendo 40 mL de caldo hipersacarosado. Para lograrlo, con

micolgica cortar el disco de agar de aproximadamente 0,5 cm de dimetro que contiene integramente a cada una de las colonias seleccionadas.

Incubar a 30 C durante 72 horas para permitir la produccin y acumulacin de dextrano.

c. Recuperacin del producto dextrano

Verter el caldo hipersacarosado fermentado en un vaso de precipitacin y adicionar lentamente 30 mL de metanol absoluto, agitando constantemente con movimientos rotatorios.

Dejar en reposo 5 horas o centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos. Filtrar el caldo fermentado y llevar el dextrano precipitado a estufa a durante 48 hasta alcanzar peso constante. 40 C

Seleccionar la cepa de L. mesenteroides ssp. mesenteroides que alcanze el mayor peso en dextrano seco.

3.2 Mantenimiento de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productoras de dextrano Cultivar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides en viales con agar hipersacarosado e hipersacarosado modificado. Incubar a refrigeracin. 30 C y mantener en

Diluciones hasta 10-2

De la dilucin 10-2 sembrar por tcnica de agotamiento y estra

Jugo crusher

10-1

10-2

Agar Hipersacarosado (AH)

Tincin de Gram

30 C/48 horas en aerobiosis

Subcultivar 30 C/48 horas en aerobiosis Seleccionar colonias que al estar rodeadas de dextrano presentan tamao grande

Agar hipersacarosado modificado (AHM)

(AHM)

(AH)

30C / 24 horas L. mesenteroides ssp. mesenteroides

Caldo Arabinosa

Arabinosa

Figura 1. Aislamiento e identificacin de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.

OBTENCIN DE INCULO

(AH)

Subcultivar por agotamiento y estra 30 C/48 horas

L. mesenteroides

Agar hipersacarosado

PRODUCCIN DE DEXTRANO

30 C/72 h

Sembrar en 40 mL de caldo hipersacarosado

Cortar tres discos de agar con colonias

RECUPERACIN DEL DEXRRANO

Agregar 30 mL de metanol absoluto

Filtrar

Reposar 5 horas

Llevar el dextrano precipitado a estufa a 40 C (peso constante)

Pesar el dextrano

Figura 2. Obtencin de inculo, produccin y recuperacin de dextrano.

Figura 3. Dextrano producido por diferentes cepas de L. mesenteroides ssp. mesenteroides.

4.

Anexo

4.1 Agar hipersacarosado (g/L) Extracto de levadura Triptona Citrato sdico Glucosa Gelatina Sacarosa Agar Agua destilada csp pH 5,0 10,0 1,0 5,0 2,5 100,0 15,0 1L 7

A 100 mL de agar hipersacarosado adicionar aspticamente 0,75 mL de una solucin estril al 1 % de azida de sodio.

4.2 Agar hipersacarosado modificado (g/L) Extracto de levadura Triptona Citrato sdico Glucosa Gelatina Agar Agua destilada csp pH 5,0 10,0 1,0 5,0 2,5 15,0 1L 7

4.3 Caldo hipersacarosado (g/L) Extracto de levadura Triptona Citrato sdico Glucosa Gelatina Sacarosa Agua destilada csp pH 5,0 10,0 1,0 5,0 2,5 100,0 1L 7

5. Referencias bibliogrficas

Gastelo, E. & Ortiz, J. (2005). Niveles de contaminacin por Leuconostoc mesenteroides y Leuconostoc dextranicum en el proceso de elaboracin del azcar de caa. Empresa agroindustrial Tumn, S.A. 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Len, E. & Soplapuco, C. (2007). Efecto de la concentracin de sacarosa contenida en el extracto de vainas de algarrobo (Prosopis pallida) en la produccin de exopolmeros por cepas nativas de Xanthomonas campestris y Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Velsquez, M. (2005). Leuconostoc mesenteroides productores de dextrano aisladas del jugo de caa de cooperativas de produccin azucarera. Chiclayo. Enero, Marzo.2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

PRCTICA X BACTERIAS ACTICAS PRODUCTORAS DEL VINAGRE: ACETOBACTER Y GLUCONOBACTER

1. Introduccin
La actividad metablica microbiana no tiene siempre como consecuencia la proliferacin

celular. Si se considera la actividad metablica de un cultivo microbiano a lo largo de toda la curva de crecimiento se diferencian aquellos procesos metablicos asociados al crecimiento celular (metabolismo primario), de aquellos que tienen lugar en la fase estacionaria, una vez que ha cesado el crecimiento de la biomasa (metabolismo secundario). Como resultado, se producen diferentes tipos de compuestos, metabolitos primarios y secundarios. Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que intervienen bien como productos finales o intermediarios en las distintas rutas anablicas y catablicas y se forman durante la fase primaria del crecimiento microbiano. Los ms importantes desde el punto de vista industrial son alcoholes (etanol), aminocidos (cido glutmico, lisina, treonina), cidos orgnicos (lctico, actico, propinico, succnico, fumrico, mlico, tartrico, ctrico, glucornico), polioles (glicerol, manitol), polisacridos (xantano, dextrano), azcares (fructosa, sorbosa) y vitaminas (riboflavina B2, cianocobalamina B12). Las bacterias acticas son microorganismos bacilares o pleomrficos Gram negativos (Gram positivos en cultivos viejos) y estrictamente aerobios. Se distribuyen en los gneros Acetobacter y Gluconobacter segn tengan o no capacidad de oxidar el acetato (presencia del ciclo de Krebs funcional). Los integrantes de ambos grupos pueden diferenciarse cultivndolos en agar slido que contenga alcohol y una suspensin de cal. Como consecuencia de la formacin de cido actico por oxidacin del alcohol primero se formar alrededor de las colonias de ambos grupos un halo claro en el agar que tiene aspecto opaco y turbio porque el cido actico transforma la cal en acetato de cal soluble. En las del grupo Gluconobacter esta zona se mantiene y aumenta lentamente. Por el contrario en Acetobacter el acetato clcico se precipita como CaCO3 que se degradar a CO2 y H2O con lo que la zona clara en torno a las colonias se enturbiar otra vez si se siguen incubando las placas. La caracterstica metablica que define al grupo de las bacterias acticas es la capacidad de utilizar una gran diversidad de sustratos y la incapacidad de oxidarlos completamente. A pesar de tratarse de microorganismos aerobios, acumulan en el medio que crecen una gran cantidad de catabolitos diferentes. Son responsables de la fermentacin actica a partir del etanol y tambin de la formacin de cido glucornico a partir de la glucosa, sorbosa del sorbitol, dihidroxiacetona de la glicerina y 5 cetogluconato de la glucosa. Las bacterias del cido

actico, adems de muchos alcoholes, oxidan cidos orgnicos como el pirvico y el lctico y algunos de ellos producen celulosa. Gluconobacter es siempre catalasa positivo, pero en las especies del gnero Acetobacter la prueba de catalasa puede dar una reaccin dbil e incluso nula ( A. peroxydans). Las bacterias acticas pueden aislarse fcilmente de vinagre y tambin del vino, cerveza o de zumos de frutas agriadas. A su vez, el gnero Acetobacter inicialmente fue dividido en tres grupos: peroxydans (A. peroxydans y A. paradoxum); oxydans levanicux, A. ascendens y (A. pasteurianus, A.

A. rauceus) y mesoxydans (A. aceti, A. xylinum

y A.

mesoxydans). Actualmente se aceptan solo tres especies: A. aceti, A. pasteurianus y A. peroxydans, las dems seran subespecies.

2. Objetivos 2.1 Aislar e identificar bacterias acticas. 2.2 Seleccionar bacterias acticas segn su produccin de acidez. 2.3 Mantener adecuadamente bacterias acticas productoras de acidez. 3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificacin de bacterias acticas

Muestra Frutas cidas: limn, naranja, lima, uva. Enriquecimiento de la muestra

Depositar 20 mL de cerveza en frascos de boca ancha. Sumergir por 15 minutos y en frascos separados uva, manzana, limn y naranja. Retirar los frutos. Cubrir los frascos con gasa o malla para evitar la entrada de insectos. Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 das. Observar el crecimiento bacteriano en forma de un velo o pelcula blanquecina sobre la superficie.

Realizar una tincin de Gram para determinar la presencia de bacilos cortos Gram negativos.

Aislamiento

Tomar una pequea porcin de la

pelcula bacteriana desarrollada en las

muestras enriquecidas y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar Lee.

Incubar en aerobiosis a 30 C durante 24 horas.

Seleccionar las colonias amarillas. Realizar tincin de Gram. Repicar a viales conteniendo Agar Manitol o un frasco con 25 mL de cerveza.

Identificacin

Catalasa: Positiva para Acetobacter y Gluconobacter. Crecimiento a pH 4.5: Positivo en caldo levadura glucosa pH 4,5. Oxidacin del etanol a CO2: Cultivar en tubos conteniendo Agar Lee. A las 24 horas el medio de cultivo las colonias que produjeron cido actico se observarn de color amarillo. A las 48 o 72 horas el medio de cultivo y las colonias que oxidan el etanol a CO2 retornan al color inicial del medio de cultivo.

3.2 Seleccin de bacterias acticas segn su produccin de acidez Tomar 2,5 mL de una suspensin en solucin salina de cada una de las bacterias acticas (agar manitol) o 2,5 mL de cerveza culivada y sembarlos en matraces conteniendo 50 mL de cerveza. Incubar a 30 C durante 48 horas. Determinar la acidez titulable a travs del mtodo acidimtrico de Mann (Factor para cido actico = 0, 006005) Realizar los clculos correspondientes.

Cuadro 1.

Caractersticas diferenciales de los gneros Gluconobacter, Acetobacter y Pseudomonas

Caractersticas

Gluconobacter Polar o

Acetobacter Peritrica o ninguna +

Pseudomonas Polar

Flagelacin Crecimiento a pH 4.5 Oxidacin de: Etanol a cido actico a CO2 cido actico a CO2 Lactato a CO2 Glucosa a gluconato Aminocidos por clulas en reposo Ciclo de Krebs Produccin de 5 cetogluconato Cetognesis Quinonas Q10 Quinonas Q9 Hidrlisis de: Lactosa y almidn Gelatina Pigmentos verdosos y/o fluorescentes -/D M: marcado, F: fuerte, d: variable Fuente: Pars y Jurez, 1997 + + + + (M) + +

ninguna

+ (F) + + d

d + d

+ + d d +

+ + -

d d d

3.3 Mantenimiento de bacterias acticas Cultivar las bacterias acticas en tubos tapa rosca con medio Estndar GYC, incubar a 30 C y mantener en refrigeracin. Subcultivar mensualmente. Las bacterias acticas tambin se pueden mantener en cerveza, renovndola semanalmente.

Frutas cidas

20 mL de cerveza

Frutas cidas en cerveza por 15 minutos

Retirar los frutos

Cubrir los frascos con gasa para evitar la entrada de insectos

Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 das

Observar crecimiento bacteriano en forma de pelcula superficial

Tincin de Gram: bacilos cortos Gram negativos

Figura 1. Enriquecimiento de la muestra para aislamiento de bacterias acticas.

Alcuota de la pelcula

Aerobiosis a 30 C/24 horas Muestra enriquecida

Agar Lee

Cultivar

Tincin de Gram

Gluconobacter

Incubar a 30 C / 48 horas

Incubar a 30C/ 24 horas

Agar Lee Bacilos Gram negativos Acetobacter

Figura 2. Aislamiento de bacterias acticas.

Sembrar 2,5 mL de la suspensin

Incubar en aerobiosis a 30 C/48 horas 50 mL de cerveza Suspensin de bacterias acticas en cerveza Sembrar 2,5 mL de la suspensin

Determinar la acidez

Mantenimiento 50 mL de cerveza

Renovar cerveza semanalmente

Figura 3. Seleccin y mantenimiento de bacterias acticas segn su produccin de acidez. 4. Anexo 4.1 Medio de enriquecimiento: Cerveza Colocar aspticamente en frascos de boca ancha 20 mL de cerveza.

4.2 Medio Lee (g/L) CaCO3 KH2PO4 K2HPO4 Peptona Casaaminocidos Extracto de levadura Glucosa Agar agar 2,0 0,1 0,2 10,0 1,0 10,0 10,0 16,0 1L 7,0 Azul de bromotimol

Agua destilada csp pH Indicador

Disolver y esterilizar a 121 C x 15 minutos. Antes de su uso incorporar 5 mL de etanol.

4.3 Medio estndar, GYC (g/L) Extracto de malta Extracto de levadura D glucosa Agar agar 3,0 10,0 50,0 g 25,0 g 1L

Agua csp Mantener en frascos con tapa rosca

4.4 Medio agar manitol (g/L) Extracto de levadura Peptona Manitol Agar agar H2O csp pH Mantener en frascos con tapa rosca 5,0 3,0 25,0 15,0 1L 7,0

5. Referencias bibliogrficas Alva, R. & Romero, J. (2001). Obtencin de vino y vinagre a partir de la banana. Tesis Ingeniero Qumico .Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Castillo, M. & Chavarri, N. (2004).Optimizacin de la concentracin de inculo, sustrato y tiempo de incubacin en la obtencin de vinagre utilizando Acetobacter aceti CECT 298T a partir de licor de maz en biorreactor Airlift. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Per. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Pars, R. & Jurez, A. (1997). Bioqumica de los Microorganismos. Mxico: Editorial Revert.

PRCTICA XI

ACTINOMICETOS PRODUCTORES DE ANTIBITICOS

1. Introduccin Los metabolitos secundarios como los antibiticos son molculas sintetizadas por determinados microorganismos normalmente en una fase tarda del ciclo de crecimiento. Son compuestos que no son necesarios para la biosntesis celular, no tienen por lo tanto un papel directo en el metabolismo energtico y, en consecuencia no se conoce con claridad la razn de su existencia. La biosntesis de los metabolitos secundarios est estrechamente relacionada con el metabolismo primario de las clulas que los producen, ya que usualmente sus precursores son metabolitos primarios normales o modificados como cidos orgnicos, unidades de isopropano, aminocidos alifticos y aromticos, bases purinas o pirimdicas.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentacin los ms importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios entre los que se incluyen, adems de los antibiticos, ciertas toxinas de hongos, alcaloides, insecticidas, factores de crecimiento vegetal (giberelinas), pigmentos y tensioactivos.

Los actinomicetos comprenden bacterias en su mayora aerobias y algunas anaerobias encontradas en animales y el hombre. Generalmente son Gram positivos, presentan una diversidad morfolgica considerable desde formas bacilares hasta formas filamentosas ramificadas a modo de esporulacin compleja con un pocentaje de G + C en su ADN superior al 55 %. Su crecimiento es lento y las colonias desarrollan sobre la superficie de los medios slidos con una consistencia firme y adheridas firmemente al sustrato solidificado. Estn constituidas por micelio vegetativo (inmerso en el medio de cultivo slido) y micelio areo en cuyos extremos se encuentran las conidias (esporas asexuadas) que brindan a la colonia su pigmentacin y su apariecia polvorienta; sin embargo algunos actinomicetos slo producen micelio vegetativo.

Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos y aunque las primeras cepas fueron aisladas de fuentes humanas y animales, el suelo constituye su reservorio ms rico y a partir del cual estos microorganismos pueden invadir numerosos biotopos.

2.

Objetivos 2.1 Aislar actinomicetos de suelo agrcola. 2.2 Seleccionar actinomicetos productores de antibiticos. 2.3 Identificar actinomicetos productores de antibiticos. 2.4 Mantener adecuadamente actinomicetos productores de antibiticos.

3.

Procedimiento

3.1 Aislamiento de actinomicetos de suelo

a.

Muestra 100 g de suelo agrcola

b.

Tratamiento de la muestra Si la muestra de suelo se encuentra hmeda, dejarla secar bajo sombra.A continuacin, triturarla con rodillo y posteriormente tamizarla (malla de 1,6 mm )

Realizar diluciones de la muestra en solucin salina

hasta 10-2. Para la (10-1). Agitar

primera dilucin tomar una submuestra de 25 g del tamizado y depositarlos en un matraz conteniendo 225 mL de solucin salina estril vigorosamente durante 20 minutos. Para la dilucin 10-2 tomar 1 mL de la dilucin anterior y trasvasar a un tubo con 9 mL de solucin salina estril. c.

Aislamiento Tomar una alcuota de la dilucin 10-2 y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar Jensen al que se le ha incorporado Nistatina ms Ciclohexamida (50 g/ mL.) para inhibir el desarrollo de mohos y y Polimixina B (5g/ mL) y Penicilina (1g/ mL) para limitar el crecimiento de otras bacterias.

Incubar en aerobiosis a temperatura ambiente (30 C) hasta por 5 das. Seleccionar las colonias caractersticas de actinomicetos: pequeas, adheridas fuertemente al sustrato, compactas, secas, pulverulentas, mayormente pigmentadas, con olor a tierra hmeda.

Realizar tincin de Gram de cada una de las colonias. Observar la morfologa celular, disposicin de conidias, esporas y presencia o ausencia de fragmentacin en el micelio.

Cultivar en viales conteniendo agar Jensen inclinado.

3.2 Seleccin de actinomicetos productores de antibiticos (Test de antibiosis)

Sembrar cada uno de los actinomicetos, agotando completamente sobre la tercera parte de una placa de Petri con agar Waksman e incubar en aerobiosis, a 30 C durante 4 das.

Sembrar por estra y en forma perpendicular al actinomiceto (a 2 mm) cada una de las cinco bacterias prueba: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus

anthracis, Staphylococcus aureus y B. subtilis. Incubar a 37 C durante 24 horas.

Observar y medir la zona de inhibicin del crecimiento de las bacterias prueba.

3.3 Identificacin morfolgica de actinomicetos productores de antibiticos Tomar en cuenta las caractersticas macroscpicas de las colonias y microscpicas de las clulas. En cuanto a las colonias la forma es circular, tamao pequeo, mayormente pigmentadas, de textura coricea, fuertemente adheridas al sustrato, compactas, de aspecto polvoriento y con olor a tierra hmeda. Para determinar las caracteristicas microscpicas de las clulas realizar el microcultivo de cada una de los actinomicetos e investigar la presencia de conidias y disposicin (aisladas, en pares, cadenas cortas, cadenas largas, espirales, rectas) o la presencia de esporangios (con esporas mviles o no mviles). Realizar una tincin de Gram y observar clulas Gram positivas y formacin de filamentos ramificados con o sin fragmentacin y presencia de conidias con diferente disposicin.

Microcultivo (Mtodo de Riddell) Utilizar una cmara hmeda que consiste en una placa de Petri con un tringulo de vidrio como soporte de una lmina portaobjetos y un algodn ligeramente humedecido. Colocar en la parte central de la lmina portaobjetos un pequeo bloque cuadrado de agar Jensen y sembrar cada actinomiceto en la periferia del agar. Posteriormente cubrir el bloque de agar con una laminilla cubre objetos estril e incubar durante 3 das a temperatura ambiente.

3.4 Mantenimiento de actinomicetos productores de antibiticos

Sembrar cada uno de los actinomicetos productores de antibiticos en caldo glicerinado 20 %.

Incubar a 30 C durante 3 das. Mantener en refrigeracin.

Muestra: 100 g de suelo agrcola

Tamizar la muestra

Pesar 25 g de la muestra

Sembrar por agotamiento y estra

Agar Jensen Incubar a 30 C/hasta por 5 das

Dilucin 10-2

Dilucin 10-1

Cultivar

Agar Jensen

Seleccionar colonia de actinomiceto

Tincin de Gram

Figura 1. Aislamiento de actinomicetos de suelos agrcolas.

30 C/ 4 das

Cultivo puro de actinomiceto

Sembrar el actinomiceto agotando completamente sobre la tercera parte de la placa con Agar Waksman

Sembrar por estra y en forma perpendicular al actinomiceto cada una de las cinco bacterias prueba

37 C / 24horas

Bacter ias pr ueba

1) Escherichia coli 2) Klebsiella pneumoniae 3) Bacillus anthracis 4) Staphylococcus aureus 5) Bacillus subtilis

Observar y medir la zona de inhibicin del crecimiento de las bacterias prueba

Figura 2. Seleccin de actinomicetos productores de antibiticos (Test de antibiosis).

4.

Anexo

4.1 Agar Jensen (g/L) Sacarosa Casena hidrolizada Sulfato de magnesio Cloruro frrico Agar agar 2,0 0,25 0,20 0,10 20,0 1L 7,0

Agua destilada csp pH

4.2 Medio Waksman para la produccin de antibiticos (g/L) Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio Glucosa Agar agar 5,0 5,0 5,0 10,0 15,0 1L 7,0

Agua destilada csp pH

4.3 Caldo glicerinado Cloruro de sodio Peptona Glicerina Agua destilada pH 0,5 1,0 20 mL 80 mL 7,0

5.

Referencias bibliogrficas control de Epinotia aporema barrenador de brotes en Medicago sativa alfalfa Ferreafe, Lambayeque, Marzo diciembre.2001. Tesis de Licenciatura .Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Hernndez, A. & Mondragn, A. (2002). Actinomicetos aislados de suelos agrcolas para el

Huaman, S. & Lupuche, J. (2002). Evaluacin de la actividad insecticida de los actinomicetos aislados de suelos agrcolas del distrito San Jos, frente a Spodoptera frugiperda cogollero del maz. Lambayeque, Febrero-Octubre, 2001. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Per. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Sandoval, M. & Vsquez, J. (2001). Actinomicetos mesoflicos aerobios con actividad

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PRCTICA XII

Aspergillus niger PRODUCTOR DE CIDO CTRICO

1. Introduccin

Los cidos orgnicos producidos por microorganismos se obtienen en fermentaciones clsicas o anaerobias (cido lctico, cido propinico) y en las fermentaciones oxidativas u oxidaciones incompletas (cido actico, cido glucnico, cido fumrico, cido ctrico, cido glutmico, cetocidos, oxocidos).

Los microorganismos productores de cidos pueden ser detectados cuando son cultivados en medio con agar y carbonato de calcio. Los carbonatos insolubles como el CaCO3 finamente pulverizado son muy tiles, porque debido a su insolubilidad no crean en el medio de cultivo condiciones fuertemente alcalinas, especialmente si se usan con otros amortiguadores; sin embargo, cuando el pH disminuye por debajo de 7,0 el carbonato se descompone con

desprendimiento de CO2. Las colonias microbianas productoras de cidos disuelven la caliza precipitada o insoluble observndose fcilmente zonas claras sobre el fondo opaco del medio de cultivo.

Muchos cidos se obtienen a escala industrial en procesos con hongos. La ventaja de su utilizacin se basa sobre todo en la fcil recuperacin de los organismos a partir del caldo de cultivo. Entre los principales cidos producidos por hongos se encuentran el lctico ( Rhizopus), fumrico (Mucor, Cunninghamella, Circinella, Rhizopus), glucnico y ctrico (Aspergillus, Penicillium).

El cido ctrico se produce en su totalidad por fermentacin. El descubrimiento de la capacidad de algunos hongos filamentosos de producir cido ctrico se remonta a 1893, gracias a los estudios de Wehmer. En 1917 Currie demostr que especies de Aspergillus niger acumulaban cido ctrico a la par con cido oxlico. Posteriormente se definieron las condiciones que reducan la produccin del cido oxlico contaminante. A partir de entonces, variedades de Aspergillus niger han dominado la produccin industrial, fundamentalmente porque su fisiologa es ms conocida que la de otros hongos y porque utilizan materias primas de bajo costo como melazas de caa.

2. Objetivos

2.1 Aislar e identificar Aspergillus niger. 2.2 Detectar y seleccionar cepas de A. niger productores de cidos orgnicos. 2.3 Mantener adecuadamente A. niger productores de cidos orgnicos.

3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificacin de A. niger

1- Muestra 100 g de suelo agrcola 2- Procesamiento de la muestra

Tamizar la muestra de suelo (tamiz con malla de 1,6 mm) y del material obtenido tomar 10 g y llevarlos a un matraz con 90 mL de solucin salina estril (10-1).

Homogenizar durante 20 minutos. Realizar una dilucin en solucin salina hasta 10-2.

3- Aislamiento e identificacin de Aspergillus niger

Tomar un alcuota de la dilucin 10-2 y y sembrarla por agotamiento y estra sobre agar Sabouraud Dextrosa (placas de Petri)

Incubar las placas a temperatura ambiente (30 C) hasta por 5 das. Seleccionar las colonias caractersticas de Aspergillus niger, tomando en cuenta las caractersticas macroscpicas y microscpicas.

Repicar las colonias seleccionadas a tubos conteniendo agar Sabouraud Dextrosa inclinado.

4- Caractersticas macroscpicas de la colonia de Aspergillus niger La colonia es inicialmente blanca o amarilla y rpidamente desarrolla un efecto de pimienta negra sobre la superficie a medida que se forman las conidias (que pueden volverse densas) de tal manera que la colonia se vuelve negra con el reverso de color crema. El aspecto de la colonia es pulvurulenta y uniforme.

5- Caractersticas microscpicas de la colonia de Aspergillus niger Hifas vegetativas: Hifas tabicadas que forman micelio filamentoso irregular, ramificado, tabicado y de pared gruesa.

 Conidiforo (Esporforo de sostn): Hifas frtiles que emergen o parten de una clula alargada del micelio vegetativo denominada clula pie (foot cell) y terminan en una porcin ensanchada o vescula. Son incoloras, o amarillo pardo, lisas, no tabicadas y de paredes gruesas. Vescula o cabeza esporifera: Vescula esfrica de la cual emergen estructuras de forma de botella denominados fialides, cuyos extremos son puntos de crecimiento, de donde las conidas continuamente se estn formando. La

conidia ms joven es la que est ms cerca de la filide y la ms vieja es la que est ms lejos, al final de la cadena (Basipetalmente). Segn algunos autores las fialides se presentan en dos series: primarias y secundarias. Segn otros autores las estructuras que salen directamente de la vescula se denominan mtulas y estn adosadas en paquetes cubriendo la vescula (forma radial) y sobre ellos estn las fialides que son ms pequeas, con distribucin ms uniforme y es a partir de ellas de donde emergen las conidias. Conidias: Se ubican sobre las filides formando cadenas (catenuladas) y al madurar presentan una pared gruesa y rugosa debido a una sustancia negra (aspergilina) que se deposita sobre su superficie y por tanto oscurecen la superficie de la vescula. 3.2 Deteccin y seleccin de A. niger productor de cidos orgnicos b. Deteccin (screening primario)

Tomar un pequeo fragmento de colonia de cada una de las cepas de A. niger y colocarlo en el centro de placas de Petri servidas con agar carbonato de calcio.

Incubar a temperatura ambiente (30 C) por 4 das. A continuacin mantener las placas de Petri en refrigeracin por 48 horas.

Reconocer la produccin de acidez por la formacin de un halo traslcido alrededor y por debajo de la colonia.

c. Seleccin (screening secundario)

Sembrar un fragmento de 1 cm de la colonia de A. niger productora de acidez en un matraz con 50 mL de medio de fermentacin.

Determinar la acidez inicial (mtodo acidimtrico de Mann). Incubar a tempratura ambiente (30 C) durante 5 das. Determinar la acidez final (mtodo acidimtrico de Mann). Factor para cido ctrico: 0,007005

Clculo de acidez

Volumen titulado Gasto de NaoH

: 5 mL : 7,5 mL : 0,007005 : : 1,05075 % de acidez expresada como cido ctrico

Factor para cido ctrico % acidez acidez

3.3 Mantenimiento de A. niger productor de cidos orgnicos Sembrar A. niger productor de acidez en tubos conteniendo agar papa dextrosa

(PDA). Incubar a 30 durante 5 das. Mantener en refrigeracin.

Muestra: 100 g de suelo agrcola

Tamizar la muestra

Pesar 10 g de la muestra

Sembrar por agotamiento y estra

Agar Sabouraud Dextrosa Incubar a 30 C/ hasta por 5 das

Dilucin 10-2

Agregar 10 g de la muestra en 90 mL de SSE (10-1)

Cultivar

Agar Sabouraud Dextrosa

Aspergillus niger

Figura 1. Aislamiento e identificacin de Aspergillus niger.

Tomar un fragmento

30 C / 4 das y luego refrigerar

Aspergillus niger Agar Carbonato de Calcio Halo alrededor de la colonia

Figura 2. Deteccin y seleccin de Aspergillus niger productor de cidos orgnicos.

Incubar a 30 C por 5 dias

Aspergillus niger Tomar 5 mL del cultivo y titular con NaOH 0.1N

50 mL de medio de fermentacin

Figura 3. Deteccin y seleccin de Aspergillus niger productor de cidos orgnicos.

Subcultivar en agar papa Dextrosa

Incubar a 30 C hasta por 5 das

Aspergillus niger

Mantener en refrigeracin

Figura 4. Mantenimiento de Aspergillus niger productor de cidos orgnicos.

4. Anexo

4.1 Agar Papa Dextrosa (g/L) Infusin de papa Dextrosa Agar agar 500 mL 20,0 20,0 1L 5,6

H2O destilada csp pH

Para obtener la infusin de papa hervir 200 g de papa pelada y picada en 500 mL. de agua destilada. Despus de 15 minutos completar a 500 mL con agua destilada, enfriar, filtrar y completar nuevamente.

4.2 Agar Sabouraud Dextrosa (g/L) Dextrosa Peptona Agar agar H2O destilada csp pH 20,0 10,0 20 ,0 1L 5,6

Para inhibir el desarrollo bacteriano agregar cloramfenicol al 0,05 % (disolver una cpsula de cloramfenicol de 250 mg en 10 mL de metanol). Agregar 2 mL del antibitico en 1 L de agar Sabouraud Dextrosa estril y enfriado a a 45 50 C.

4.3 Medio agar carbonato de calcio (g/L) Extracto de levadura NaCl Glucosa Peptona Na2HPO4.12H2O Agar Carbonato de calcio (CaCO3) H2O destilada csp pH 10,0 5,0 30,0 5,0 1,0 15,0 10,0 1L 6,5

4.4 Caldo sacarosado para produccin de cidos orgnicos: Medio de fermentacin (g/L) Sacarosa MgSO4.7H2O (NH4)NO3 CaCO3 KH2PO4 H2O destilada csp pH 190 ,0 0,3 2,3 5,0 1,0 1L 3 (ajustar con HCl 2M)

5. Referencias bibliogrficas

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PRCTICA XIII SELECCIN DE UNA CEPA ENOLGICA DE Saccharomyces cerevisiae

I. Introduccin En el mercado existen levaduras enolgicas como Saccharomyces cerevisiae Montrachet y Pasteur Champagne; sin embargo, se prefiere el uso de cepas levaduriformes que procedan de la zona vincola donde se van a utilizar. Estas levaduras nativas o levaduras locales seleccionadas, estn adaptadas a las condiciones climticas de la zona, a la materia prima, es decir al mosto a fermentar y son responsables, al menos parcialmente de las caractersticas nicas de los vinos obtenidos. 1.1 Aislamiento de levaduras El primer paso para seleccionar una levadura nativa, es conocer la biota autctona a travs de un estudio ecolgico en el que se realizan aislamientos de fermentaciones espontneas en la zona a estudiar, durante varias campaas. De esta manera, adems de tener un nmero mayor de cepas, el aislamiento de una misma cepa durante aos consecutivos puede ser un buen indicador de que se trata de una cepa bien adaptada a las condiciones de la zona. 1.2 Identificacin de cepas de levaduras La primera diferenciacin que se debe realizar a las colonias de levaduras aisladas es a nivel de especie, mediante medios selectivos, concretamente el medio lisina en donde Saccharomyces cerevisiae no crece (porque la nica fuente de nitrgeno es la lisina), pero si desarrollan otras levaduras. La segunda diferenciacin, para la cual se eligen 40 a 50 colonias de S. cerevisiae aleatoriamente, permite la identificacin a nivel de cepa utilizando tcnicas de biologa molecular (anlisis de los perfiles de restriccin del ADN mitocondrial: RFLPs). 1.3 Proceso de seleccin en laboratorio Los criterios utilizados para la seleccin de cepas de S. cerevisiae consistan en una sucesin de pruebas para determinar la ausencia o presencia de ciertos caracteres importantes en cepas vnicas como presencia de factor killer, tiempo de fermentacin, capacidad fermentativa en mostos con elevada concentracin de azcar, formacin de sulfuro de hidrgeno; sin embargo, el ir probando cada una de las cepas en fermentaciones individuales y caracterizar todos los productos finales es una labor muy tediosa, por lo que es preferible realizar la seleccin de cepas en fermentaciones masivas por competencia. Se elige un nmero definido de cepas de S. cerevisiae, se inoculan en un mismo fermentador y se hace un seguimiento de su crecimiento durante la fermentacin. La poblacin inicial de las cepas debe ser la misma para que todas tengan las mismas posibilidades de imposicin (1 x 105 UFC/ mL). El nmero de cepas a analizar depender de las cepas aisladas, pero no sera aconsejable utilizar un nmero superior a 20 (poblacin final de 2 x 107 UFC / mL).Si se tiene un nmero superior a 20 cepas, es recomendable descartar algunas. Un criterio a seguir puede ser tomar como referencia las fermentaciones espontneas y elegir aquellas cepas que hayan tenido una presencia relevante a lo largo de stas. De hecho, se pueden dar casos de cepas, que se hayan aislado en porcentajes muy bajos en un momento determinado de la fermentacin y en un solo ao y que por tanto, no puedan considerarse levaduras representativas de la zona, ya que probablemente se trate de cepas poco resistentes al etanol y a las condiciones existentes, y que por tanto, no se impondran en un fermentacin competitiva.

Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, es decir, en pequeos fermentadores (botellas de 500 mL de capacidad). Es importante intentar simular las condiciones de fermentacin que posteriormente se utilizarn en bodega. Para ello, lo ideal es utilizar mosto concentrado diluido (450 mL con una concentracin final de azcar de 200 g/L, una acidez de 6 y un pH inicial de 3.3), ya que tiene todos los nutrientes necesarios para una correcta fermentacin. Adems, al utilizar este mosto concentrado se puede regular la concentracin de azcares, lo cual ya supone una caracterstica adicional de seleccin al poderse fijar unas condiciones ms o menos restrictivas de fermentacin (por ejemplo, altos contenidos en azcar condicionarn altos grados alcohlicos). Aparte de la propia competencia entre cepas, se puede aplicar algn otro criterio de seleccin que pueda resultar interesante y as acelerar el proceso de seleccin. Este criterio depender del tipo de fermentacin al que se dirija la seleccin (Cuadro 9). El seguimiento de las cepas se realiza por RFLPs del ADN mitocondrial seleccionando las cepas que se imponen en la fermentacin.

Cuadro 1. Caractersticas deseables y no deseables en la seleccin de una cepa enolgica de Saccharomyces cerevisiae. Caractersticas deseables Alta tolerancia al etanol Total degradacin de azcares fermentables Resistencia al SO2 Capacidad fermentativa a bajas temperaturas Mxima reduccin de fase de latencia Degradacin de cido mlico Capacidad fermentativa a altas presiones Produccin de glicerol Produccin de B glucosidasa Fenotipo Killer Fuente: Torija, 2002 Caractersticas no deseables Produccin de SO2 Produccin de H2S Produccin de acidez voltil Produccin de acetaldehdo y piruvato Produccin de espuma Formacin de precursores del carbamato de etilo Produccin de polifenol oxidasas

1.4 Fermentaciones industriales en laboratorio (bodega experimental) Cada una de las cepas de S. cerevisiae seleccionadas se inocula de forma individual en un fermentador con mosto concentrado diluido y se monitorea durante la fermentacin. Aunque parezca de poca importancia, se trata de un paso bsico, ya que el hecho de una cepa se haya impuesto en una fermentacin masiva no garantiza que pueda realizar una fermentacin completa por ella sola. Adems, se deben analizar las caractersticas organolpticas del vino obtenido con cada cepa, anlisis que hasta ahora no se haba podido hacer porque al ser un conjunto de cepas no se poda saber cual era la que proporcionaba las diferentes caractersticas, favorables o desfavorables. Despus de las pruebas en el laboratorio que permiten determinar qu cepas presentan buena capacidad fermentativa (estudio de la velocidad y duracin de la fermentacin), resistencia a elevadas concentraciones de azcares (debido a las caractersticas particulares de la zona de seleccin), resistencia a elevadas concentraciones de etanol, produccin de glicerol, steres, alcoholes superiores, baja acidez voltil y resistencia a SO2, se realiza una cata y se eligen las cepas que adems de fermentar correctamente, tienen el mejor perfil cromtico, aromtico y gustativo.

1.5 Fermentaciones industriales (bodega industrial) Las levaduras elegidas se inoculan de forma independiente en un depsito a escala industrial. Se hace el seguimiento de la fermentacin, controlando la imposicin de la cepa estudiada sobre la biota autctona de la zona mediante RFLPs del ADN mitocondrial. En caso de imposicin, se realiza una analtica completa de los vinos obtenidos, tal y como se ha explicado en las fermentaciones en laboratorio, con la posterior cata realizada por especialistas. Las cepas que cumplan todos stos requisitos estarn aptas para ser seleccionadas. Si se tienen varias, en la eleccin de una u otra se debern valorar, principalmente, las caractersticas organolpticas, es decir, aquellas que proporcionen un vino de mayor calidad. 1.6 Deshidratacin Si las cepas levaduriformes seleccionadas son de inters comercial, queda un ltimo paso por investigar que es su deshidratacin. No todas las cepas resisten bien ni mantienen sus caractersticas tras el secado y la posterior rehidratacin y por tanto, aunque se trate de una cepa de caractersticas extraordinarias, sino se puede deshidratar, no ser una buena levadura para uso industrial. La produccin de levaduras secas activas (LSA) es un proceso muy importante, ya que se realiza en aerobiosis (es decir, en presencia de oxgeno), para conseguir una elevada biomasa y una reserva de cidos grasos insaturados y esteroles muy necesarios durante el proceso fermentativo (en semianaerobiosis) donde la sntesis de estos compuestos est inhibida. Este proceso hace que las levaduras estn metablicamente activas cuando se rehidratan y por tanto, su imposicin sea ms rpida. Por este motivo, no es necesario hacer un pie de cuba antes de inocular estas LSA. De hecho, el hacer demasiadas rplicas al preparar el pie de cuba antes de inocular, puede restarle efectividad a las LSA. Una vez que la levadura ha superado todas estas fases, an se hace necesario el anlisis de su estabilidad gentica. Es conocida una cierta inestabilidad que hace que despus de muchas generaciones (como en la produccin industrial de LSA), el porcentaje de mutaciones de las cepas levaduriformes sea elevada, por lo que dicho anlisis es un requisito imprescindible. 1.7 Proceso de seleccin en bodega Una vez superadas las diferentes fases del proceso de seleccin y de produccin industrial (incluido el secado), queda la ltima fase y definitiva: su uso industrial en bodega y su aceptacin final, que es la autntica prueba de fuego de todo el proceso. 2 Objetivos 2.1 Aislar e identificar S. cerevisiae de mosto fermentado. 2.2 Seleccionar S. cerevisiae segn el tiempo de duracin de la fermentacin y grado alcohlico alcanzado. 2.3 Mantener adecuadamente S. cerevisiae seleccionada. Procedimiento 3.1 Aislamiento e identificacin de S. cerevisiae a partir de mosto fermentado 3.1.1. Obtencin de mosto fermentado a) Adquirir 0,5 kg de uva dulce tinta (pulpa y hollejo prpura) o tintrea (hollejo prpura). b) Proceder al desgranado: Manualmente separar los granos del raspn en cada racimo y colocarlos en un depsito limpio. En simultneo eliminar los frutos deteriorados. c) Realizar el estrujado: Triturar los granos de uva, lo suficiente para lograr la separacin total de hollejo y la pulpa pero no para deteriorar las pepas.

d) Depositar el material resultante o mosto en un matraz de fermentacin previamente esterilizado. Tapar con algodn e incubar a 30 C durante 24 horas. Cambiar el algodn por una tapa hermtica de goma que presenta un agujero en el centro para permitir la salida de CO2 a travs de una cnula que desemboca en un frasco conteniendo una solucin de NaCl al 20 %. Incubar a 30 C durante 72 horas. 3.1.2 Aislamiento de levaduras b) Tomar una alcuota del mosto fermentado y sembrar mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar Sabouraud glucosado con antibitico (placas de Petri). c) Incubar a 30 C durante 24 a 48 horas. d) Seleccionar las colonias redondas, blancas o cremosas, convexas, con bordes enteros, de consistencia mantecosa, con un dimetro aproximado de hasta 5 mm y realizar una tincin simple con azul de metileno para verificar la presencia de levaduras. e) Subcultivar las colonias levaduriformes en viales conteniendo conteniendo agar Sabouraud glucosado inclinado e incubar a 30 C durante 24 horas. 3.2 Identificacin de S. cerevisiae a) Para identificar el gnero Saccharomyces inducir la formacin de la fase sexual (facultad esporulante), cultivando cada una de las cepas levaduriformes en agar Sabouraud glucosado durante 24 horas y sembrndolas por dos veces consecutivas en medio de preesporulacin agar nutritivo enriquecido contenido en tubos de prueba. Despus de incubar a 30 C durante 48 horas en cada una de las resiembras, sembrar en el medio de esporulacin agar acetato contenido en tubos de prueba. Incubar a 30 C y examinar los cultivos semanalmente hasta por 20 das mediante extensiones coloreadas con la tincin de Schimwell modificada por Mc Chung para investigar la presencia de ascas con ascosporas. El mtodo de coloracin consiste en: Tomar una pequea muestra del cultivo examinado y mezclar con una gota de agua sobre una lmina portaobjetos. Fijar en la llama del mechero muy lentamente y cubrir con verde de malaquita 5 % durante 30 a 60 segundos. Calentar por tres veces hasta la emisin de vapores. Enjuagar con agua tibia durante 30 segundos. Cubrir con una solucin acuosa de safranina 0,5% durante 30 segundos. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin. Anotar la presencia de ascosporas coloreadas de verde y el resto de material color rojo. Contar su nmero y la forma de las mismas en el interior del asca. Las ascosporas de S. cerevisiae se forman en nmero de una a cuatro en un asca. Son redondas y lisas con un dimetro aproximado de 3.5 m. Con frecuencia se forma una cua protoplasmtica entre las ascosporas. b) Para identificar la especie S. cerevisiae realizar la prueba de fermentacin de carbohidratos. Obtener una suspensin de clulas (de cada una de las cepas de levaduras cultivadas en agar Sabouraud glucosado durante 24 horas) en solucin salina estrilizada e inocular 0,1 mL en tubos de 16 x 160 mm (con campana de Durham) conteniendo 9 mL de medio base de fermentacin ms carbohidratos al 2 %: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y 4 % de rafinosa. Incubar por 48 horas (hasta por 15 das) a 30 C. No ajustar hermticamente el tapn de los tubos. La fermentacin es positiva cuando en las campanas de Durham se observa la presencia de gas. Un color amarillo indica la utilizacin del carbohidrato ms no la fermentacin de ste.

c)

Para determinar las caractersticas morfolgicas de las levaduras, sembrar 0.1 mL de la suspensin de clulas en tubos conteniendo 9 mL de caldo extracto de malta. Incubar a 30 C durante 2 a 10 das. A partir del tercer da de incubacin tomar una gota del cultivo, realizar un frotis y una tincin con azul de metileno. Determinar la forma de las clulas, dimensiones y reproduccin vegetativa. S. cerevisiae puede tener forma elptica y redondeada siendo la forma de la mayor parte de las clulas jvenes redondeada u oval. Miden de 3 a 7 m de ancho por 4 a 14 m de longitud (la relacin entre la longitud y ancho por lo general es menor que 2). Su reproduccin vegetativa es por gemacin multilateral. A partir del quinto al dcimo da de incubacin observar que el crecimiento de S. cerevisiae en medio lquido se caracteriza por un desprendimiento gaseoso ms o menos abundante. El lquido se encuentra en un principio alterado apareciendo posteriormente un depsito cuando el lquido se clarifica. Observar cuidadosamente el aspecto de la espuma y luego del depsito o la pelcula.

3.3 Seleccin de S. cerevisiae segn el tiempo de duracin de la fermentacin y concentracin de alcohol alcanzado Obtencion del mosto Adquirir 1 kg de uvas dulces, lavarlas con agua potable y obtener mosto de manera similar a lo explicado en el item 3.1.1. Filtrar el mosto, determinar su volumen y proceder a su acondicionamiento (correccin del azcar, acidez y primer sulfitado). Para la correccin del azcar, homogenizar el mosto con una paleta de madera y determinar los grados Brix. Para iniciar el proceso de fermentacin el mosto debe tener un mximo de 24 Brix. Si el valor es menor agregar azcar blanca en una cantidad determinada a travs del siguiente clculo: 3.3.1

(Peso de la muestra de mosto)( Brix deseado - Brix inicial ) 100 Brix deseado
Ejemplo: Suponer que se toma una muestra de 750 g de mosto con 15 Brix.

(0,750)(24 15) 0,088Kg 100 24

Se deben agregar 88 g de azcar para alcanzar 24 Brix. En caso de no tener Brixmetro, agregar 120 g de azcar blanca por litro del volumen total del mosto a fermentar. Para la correcin de la acidez del mosto, medir con la cinta de pH y ajustar a 3,3 con cido tartrico. A continuacin realizar el primer sulfitado agregando 0,1 g de metabisulfito de sodio por litro de mosto. Homogenizar con la paleta de madera.

Fermentacin en laboratorio Depositar 285 mL de mostopreviamente acondicionado en matraces de 500 mL de capacidad e inocularlos con 15 mL de una suspensin de levaduras cultivadas en agar Sabouraud glucosado a 30 C por 24 horas. Determinar el nmero de clulas viables. La poblacin final de levaduras deber ser de aproximadamente 2 x 107 UFC / mL. Tapar con algodn e incubar a 30 C durante 24 horas. Cambiar el algodn por una tapa hermtica de goma que presenta un agujero en el centro para permitir la salida de CO2 a travs de una cnula que desemboca en un frasco conteniendo una solucin de NaCl al 20 %. y en donde se observar el burbujeo del CO2 eliminado durante el proceso Incubar a 25 C durante 72 horas.

3.3.2

La finalizacin del burbujeo determinar el final de la fermentacin, momento en el cual se medirn los grados de alcohol alcanzados (mtodo de destilacin o con el vinmetro). En caso de no tener el equipo necesario la capacidad productiva de alcohol tambin se puede determinar indirectamente pesando diariamente cada uno de los matraces previa agitacin a fin de eliminar el anhdrido carbnico. La determinacin del peso se debe realizar hasta que ste muestre un valor constante lo que indica que la fermentacin ha concludo.

3.4 Mantenimiento de cepa enolgica de S. cerevisiae seleccionada Sembrar la cepa de S. cerevisiae seleccionada en caldo Sabouraud Glucosado, incubar a 25 C durante 24 horas y mantener en refrigeracin.

0.5 Kg de uva

Desgranado

Estrujado

Cambiar el algodn por una tapa hermtica

30 C / 24horas

30 C por 72 horas.

Figura 1. Obtencin de mosto fermentado.

Sembrar sobre ASG con antibitico Tomar una alcuota del mosto fermentado

Incubar a 30 C por 24-48 horas

Seleccinar colonias

Tincin simple

Incubar a 30 C durante 24 horas Cultivo puro de levaduras

Subcultivar en ASG

Figura 2. Aislamiento de levaduras.

30 C/48h.

30 C/48h.

Cultivo puro levaduriforme

Incubar a 30 C y examinar los cultivos semanalmente hasta por 20 das Agar nutritivo enriquecido Agar Acetato

Tincin de Schimwell modificada

Figura 2. Identificacin del gnero Saccharomyces.

Inocular 0,1 mL

Gl

Ga

Sa Ma

La

Saccharomyces sp. Suspensin de Sacchromyces sp.

Carbohidratos: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa 30 C/2-15 das

Gl

Ga

Sa

Ma

La

(+)
Saccharomyces cerevisiae

(+)

(+)

(+)

( )

La fermentacin se evidencia por la presencia de gas en las campanas de Durham

Figura 3. Identificacin de Sacharomyces cerevisiae.

1 kg de uva

Lavar

Desgranar

Determinar su volumen Estrujar

600 mL de mosto

Filtrar

Agregar la cantidad necesaria de azcar blanca para obtener el 24 Brix

Medir el Brix

Mosto corregido

Figura 4. Obtencin del mosto corregido.

30 C /24 horas

Depositar 300 mL de mosto en frascos de 500 mL

Inocular 6 mL de la suspensin de S. cereviseae

Colocar tapa hermtica

30 C/72 horas (hasta finalizacin del burbujeo)

Medir con el vinometro los grados de alcohol alcanzados

Mosto fermentado

Figura 5. Fermentacin en laboratorio.

Anexo 4.1Agar Sabouraud glucosado (g/L) Peptona Glucosa Agar agar Agua csp pH

10,0 20,0 20,0 1L 5,6

4.2 Agar nutritivo enriquecido (g/L) Glucosa Extracto de levadura Caldo nutritivo Agar agar Agua destilada csp pH

50,0 10,0 30,0 20,0 1L 5,6

4.3 Medio Agar acetato (g/L) Acetato de potasio Glucosa Extracto de levadura Agar Agua csp pH

9,8 1,0 2,5 20,0 1L 6 0.5

4.4 Medio base para fermentacin de carbohidratos (g/L) Peptona 50,0 Extracto de carne 1,0 NaCl 5,0 Agua csp 1L pH 7.0 Una vez que se ha medido el pH agregar el indicador rojo de fenol 0,02 g por l L. Luego agregar el carbohidrato segn corresponda (2 o 4 %).

4.5 Caldo extracto de malta Pesar 1,5 g de extracto de malta para 100 mL de agua destilada.

4.6 Medio base para fermentacin de carbohidratos (g/L) Verde de malaquita 0,01 g Agua destilada 100 mL

4.7 Solucin safranina Safranina Agua

0,25 mL 100 mL

4.8 Recuento de clulas viables El recuento de clulas puede ser realizado en cmaras de contaje o hematocmetros (diseados para contar glbulos de sangre) que consisten en una lmina de cristal de una dimensin aproximada a la de una lmina portaobjetos, pero de mayor grosor. Tienen ranuras en forma de H, con rieles a cada lado que sostienen un cubreobjeto grueso especial a una distancia de 0,1 mm por encima de las dos porciones interiores de la H, que forman dos cmaras entre stas y el cubreobjeto. El cubreobjeto es grueso para impedir que se hunda en el centro en su parte no sostenida, lo cual reducira el volumen de las cmaras. El fondo de cada una de las cmaras tiene un rayado Neubauer de 9 mm2 (3 mm por lado) dividido en nueve cuadrados principales (C.P.) de 1 mm por lado, en los que se cuenta arbitrariamente el contenido de cinco: los cuatro de las esquinas y el central (A, B, C, D y E) para calcular la concentracin de propgulos cuando stos son relativamente grandes. Como el volumen sobre cada C.P. es 0,1 mm3, para calcular la concentracin por cc (10 000 veces mayor), se procede en la forma siguiente: SUMA de 5 C.P. x 2 000 = nmero / cc Cuando los propgulos son pequeos se usa el C.P. central que est dividido en 25 cuadrados secundarios (C.S.) de 32 mm por lado y a su vez cada uno est dividido en 16 cuadrados menores de 0.05 mm por lado. Entonces la concentracin se calcula as: NMERO en el C.P. CENTRAL x 10 000 = nmero / cc Se pueden conseguir resultados similares representativos haciendo contadas en una fraccin del C.P. central, con la consiguiente reduccin de la labor. Se cuentan lo propgulos en un nmero reducido de los C.S. Por ejemplo, si se observan los cuatro C.S. esquinados y el central, entonces: SUMA de 5 C.S. x 50 000 = nmero / cc Si se observan los cuatro C.S. esquinados y cuatro que rodean al central, entonces: SUMA de 8 C.S. x 31 250 = nmero / cc 4.1.1 Procedimiento para realizar el recuento de clulas levaduriformes viables - Realizar una suspensin acuosa del cultivo de S. cerevisiae. - Llevar 0,5 mL de la suspensin de levaduras hacia un tubo y adicionar 0,5 mL de azul de metileno (proporcin 1/1). - Homogenizar y hacer recuento en la cmara de Neubauer en los cinco cuadrados principales o primarios. - Las clulas viables se observan refringentes, incoloras y las clulas no viables de color azulado u opacas. - Realizar los clculos correspondientes y multiplicar por el factor de dilucin. Factor de dilucin = Volumen total diluido/Volumen de la muestra. 1/0.5 = 2

5. Referencias bibliogrficas Alvarado, X. & Muro, J. (2007). Concentracin de inculo y tiempo de fermentacin en la elaboracin de chicha de jora con Saccharomyces cerevisiae nativa.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Chirre, C. & Farroay, D. (2007). Concentracin de inculo y tiempo de fermentacin en la elaboracin de cerveza Lager en el Centro de Produccin-Investigacin de la Cervecera Industrial La Otra. Lambayeque.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Zamora, D., (2006). Concentracin de inculo y tiempo de fermentacin en la elaboracin de vino semiseco por Saccharomyces cerevisiae nativa a partir de Vitis vinfera uva.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Reao, A .& Sierra, Z. (2008). Estudio tcnico para la elaboracin de cerveza tipo Ale con adicin de zumo de pia como un sucedneo no amilceo. Tesis Ingeniero en Industrias Alimentarias. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Torija, J., (2002). Ecologa de levaduras: Seleccin y adaptacin a fermentacin vnica. Tesis Doctorado. Espaa, Universidad Rovira y Virgili.

PRCTICA XIV BIOINSECTICIDAS: Bacillus sp. COMO LARVICIDA DE Anopheles sp.

1. Introduccin

La malaria o paludismo es una enfermedad caracterizada porque en los glbulos rojos se encuentran protozoos del gnero Plasmodium, transmitidos por la picadura de la hembra del mosquito Anopheles vector de esta enfermedad endmica en el Per. Anopheles es un dptero que se desarrolla en climas tropicales, como el de la Amazona y la Costa Norte Peruana, donde su diseminacin es amplia. Los compuestos qumicos constituyen una excelente arma de lucha antivectorial, pero afectan a los seres vivos, contaminan el ambiente e inducen resistencia en el insecto vector. Como alternativa se han establecido programas de Control Vectorial Integrado basados en la combinacin racional de los mtodos de control disponibles qumicos, fsicos, biolgicos, especialmente los microbiolgicos. En el control microbiolgico se utilizan insecticidas elaborados con entomopatgenos como las bacterias del gnero Bacillus, especficamente Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus, que producen sustancias txicas con alto grado de especificidad para larvas de dpteros hematfagos. Actualmente, existen en el mercado biolarvicidas como Vertobac y Gresleaf elaborados con estos microorganismos y sus productos; sin embargo, a pesar de su eficacia larvicida presentan desventajas en cuanto a su efecto residual, debido a una poca adaptacin de estas cepas a las condiciones ambientales de cada regin, por lo que, en diversas reas malargenas se han desarrollado lneas de investigacin tendientes a buscar nuevas cepas de bacterias con capacidad larvicida, que puedan ser utilizadas eficientemente como controladores de insectos. 2. Objetivos 2.1 Aislar Bacillus spp. 2.2 Seleccionar Bacillus spp. segn su potencial biocida frente a larvas de Anopheles sp. 2.3 Identificar la especie de Bacillus controlador de larvas de Anopheles sp. 2.4 Mantener decuadamente Bacillus sp. controlador de Anopheles sp. 3. Procedimiento 3.1 Aislamiento de Bacillus sp. Muestra: 10 g de fango del fondo de criaderos de Anopheles sp. (totoral, arrozal, filtracin, dren) Pesar 2 g de la muestra de fango y realizar diluciones seriadas en solucin salina estril hasta 10-3 . Llevar la dilucin 10-3 a tratamiento trmico de 80 C durante 10 minutos (bao mara) y luego someter a enfriamiento rpido. De la dilucin 10-3 tomar una alcuota y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre la superficie de agar nutritivo (Placas de Petri). Incubar en aerobiosis a 30 C, durante 24 horas. Seleccionar las colonias desarrolladas y realizar una tincin de Gram para verificar la presencia de bacilos. Cultivar las colonias seleccionadas en viales con agar Tripticasa Soya (TSA), para obtener cultivos puros.

3.2 Seleccin de Bacillus segn su potencial biocida frente a larvas de Anopheles sp. 3.2.1 Obtencin de larvas de Anopheles sp. Seleccionar criaderos soleados con agua limpia y vegetacin herbcea emergente. Realizar la recoleccin de larvas de Anopheles sp. mediante el Mtodo de Cucharn, utilizando un cucharn blanco de mango largo que se sumerge con movimiento firme y en ngulo de 45 respecto a la superficie de agua, para posteriormente extraerlo sin que rebose el agua. Con un gotero plstico de boca ancha recolectar los estados larvales de Anopheles sp. y transferirlos a recipientes con agua del mismo criadero. En el laboratorio mantener las larvas en fuentes de fierro enlozado con agua del mismo criadero de origen hasta su empleo en los ensayos de patogenecidad.

Cuadro 11. Caractersticas de anofelinos a nivel del campo Caractersticas Posicin en la superficie del agua Sifn respiratorio Cabeza y trax Anofelinos Paralela Ausente Cabeza mas estrecha que trax Culicinos Perpendicular (en ngulo) Presente, Tamao variable Cabeza distinguible del trax

Anopheles: Larvas con poca fotofobia, movimiento rpido en forma de ltigo, respiran en posicin horizontal a la superficie. Aedes: Larvas con fotofobia y timidez, movimiento en forma de vbora, respiran en posicin perpendicular a la superficie. Culex: Larvas sin fotofobia movimiento en forma de ltigo, respiran en posicin inclinada. 3.2.2 Pruebas de patogenecidad de Bacillus sp. a. Obtencin de la suspensin bacteriana (esporas y cristales de Bacillus sp.) Cultivar Bacillus sp. sobre la superficie inclinada de agar Tripticasa Soya e incubar en aerobiosis a 30 C durante 5 das. Verificar la esporulacin a travs de una tincin de Gram. Realizar una suspensin celular en solucin salina y estandarizar la concentracin con el tubo 6 del nefelmetro de Mc Farland (1,8 x 10 9 esporas y cristales/ mL). b. Efecto de Bacillus sp. sobre larvas de Anopheles sp. Depositar 10 mL de cada una de las suspensiones bacterianas previamente estandarizadas sobre 90 mL de agua destilada estril contenida en recipientes plsticos de primer uso y con una capacidad de 250 mL. En cada recipiente se tendr una concentracin final de aproximadamente 1.8 x 108 esporas y cristales/mL. Colocar diez larvas de Anopheles sp. (de preferencia III estado). Acondicionar un control positivo con el insecticida Griselef ( Bacillus sphaericus cepa 2362) y un control negativo con 100 mL de agua destilada estril y diez larvas de Anopheles sp. Alimentar las larvas con comida para peces (para evitar el canibalismo).

Determinar la sobrevivencia de las larvas de Anopheles sp. despus de 24, 48 y 72 horas de entrar en contacto con la suspensin de Bacillus sp. Considerar como larvas muertas aquellas que no reaccionan al ser tocadas en la regin ceflica. En caso de que el control negativo presente una mortalidad comprendida entre 5 a 20 % corregir los porcentajes de mortalidad mediante la frmula de Abbott.

% Mortalidad Corregida
3.2.3

% mortalidad expuestas - % mortalidad del control negativo 100 100 - % mortalidad del control negativo

Recuperacin de Bacillus sp. Colectar las larvas muertas en el ensayo de de Bacillus sp. que presente la mayor mortalidad. Depositarlas en un frasco estril, desinfectarlas con hipoclorito de sodio al 0,1 % durante 1 minuto, enjuagarlas con agua destilada estril durante 1 minuto y triturarlas con 2 mL de solucin salina estril. Tomar una alcuota del triturado de larvas y sembrar mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre la superficie de agar nutritivo. Incubar en aerobiosis a 30 C durante 24 horas. Realizar una coloracin de Gram para determinar morfologa y reaccin tintorial. Obtener un cultivo puro en agar tripticasa soya.

Confirmacin del efecto Biocida de Bacillus sp. Con Bacillus sp. recuperado y cultivado en agar Tripticasa Soya durante 5 das obtener una suspensin bacteriana (esporas y cristales), estandarizar la concentracin en el tubo 6 del nefelmetro de Mc Farland y realizar un bioensayo con larvas de Anopheles sp. 3.3 Identificacin de las especies de Bacillus Caracterizacin macroscpica de colonia: Color, tamao, bordes, forma, elevacin. Caracterizacin microscpica de clulas: Forma, reaccin tintorial, presencia de espora y cristal. Para observar las esporas y cristales realizar la coloracin de verde de malaquita modificada (realizar un frotis, cubrirlo con verde de malaquita al 6 %, calentar en el mechero por debajo de la lmina hasta que exista desprendimiento de vapores blancos por tres veces, dejando enfriar cada vez, enjuagar con agua corriente, cubrir el frotis con carbol fucsina al 0,1 % durante 1 minuto, eliminar el exceso de colorante, enjuagar y dejar secar a medio ambiente) Pruebas de motilidad, hemlisis, hidrlisis de la gelatina, Voges Proskauer, rojo de metilo, indol, hidrlisis del almidn, utilizacin de carbohidratos glucosa, arabinosa, manitol.

3.2.4

3.4 Mantenimiento de Bacillus sp. Sembrar Bacillus sp. controlador de Anopheles sp. en viales conteniendo agar tripticasa soya, incubar a 30 C durante 24 horas y mantener en refrigeracin.

4. Anexo 4.1 Verde de Malaquita al 6 % Verde de malaquita Agua destilada csp 6g 100 mL

Disolver en caliente, homogenizar y guardar en frasco oscuro

4.2 Carbol fucsina al 1 % Fcsina bsica 10 g Etanol absoluto 100 mL Fenol al 5 % 1 000 mL Mezclar y guardar en frasco oscuro

5. Referencias bibliogrficas Novoa, N. y Pacherres, A. (2003) Cepas nativas de Bacillus spp. como potenciales conroladoresde larvas de Anopheles pseudopunctipennis. Sullana, enerosetiembre 2001. Tesis Licenciatura. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

PRACTICA XV BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRLEO DIESEL

1.

INTRODUCCIN La utilizacin masiva de combustibles fsiles genera anualmente 2 800 millones de

toneladas de dixido de carbono de los 76 000 millones de toneladas existentes en la atmsfera. El dixido de carbono junto con otros gases como el dixido nitroso, metano,

clorofluorocarbonados, compuestos halogenados y vapor de agua constituyen el grupo de gases invernadero que absorven la radiacin reflejada provocando el calentamiento global de la atmsfera y cambiando dramticamente el clima del planeta. Adicionalmente a los cambios climticos globales el uso masivo del petrleo como fuente de energa y como materia prima ha generado la contaminacin ambiental que ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del ambiente y constituye una amenaza real a la salud pblica as como es responsable de la extincin de gran cantidad de especies animales y vegetales. El principal origen del crudo y productos del petrleo tales como benceno, tolueno, xileno (BTX) e hidrocarburos aromticos polinucleares (PAHs) liberados al ambiente son las prdidas de los tanques de almacenamiento, los vertidos y accidentes durante su transporte. Una de las herramientas para combatir la contaminacin ambiental generada por derrames de petrleo es la biodegradacin del petrleo o ruptura de los compuestos complejos a compuestos simples y menos txicos. Durante los ltimos aos el inters por la bsqueda de microorganismos con capacidad degradativa de petrleo como bacterias, mohos y levaduras se ha incrementado con miras a utilizarlos en la recuperacin microbiana de los suelos y cuerpos de agua

contaminados con petrleo. La biorremediacin o utilizacin de microorganismos como las bacterias que metabolizan petrleo como fuente de carbono y energa, constituye una alternativa saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el derramamiento de crudos, permitiendo la biodegradacin de los hidrocarburos y recuperacin de los suelos contaminados.

2.

OBJETIVOS 2.1. Aislar bacterias degradadoras de petrleo Diesel a partir de suelo contaminado. 2.2. Cuantificar el petrleo Diesel degradado por contaminados. bacterias aisladas de suelos

3.

METODOLOGA 3.1 Muestra 100 g de suelo contaminado con petrleo

3.2 Aislamiento de bacterias hetertrofas Para favorecer el aislamiento de bacterias hetertrofas pesar 10 g de cada muestra de suelo contaminado y enriquecerlas en 90 mL de caldo Bushnell Haas, a 30 C,

durante 24 horas. Despus, tomar una alcuota de 0,1 mL y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar nutritivo, King B y Mac Conkey. Incubar a 30 C durante 24 horas. A continuacin, en el agar nutritivo agrupar las colonias desarrolladas, segn sus

caractersticas morfolgicas y seleccionar una representante de cada grupo. De igual manera en el agar King B seleccionar las colonias formadoras de fluorescencia y en el agar Mac Conkey las colonias lactosa negativas. Realizar una tincin de Gram y despus cultivar en agar Tripticasa Soya (TSA) y Bushnell Haas con 4 % de petrleo Diesel, constituyendo los cultivos puros, que sern guardados en refrigeracin a 8 C. 3.3 Tiempo requerido para la utilizacin del petrleo como fuente de carbono y energa Para la obtencin del inculo, cultivar cada bacteria nativa en 10 mL de caldo nutritivo, a 30 C durante 24 horas. Posteriormente, centrifugar el caldo nutritivo (3500 rpm) durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, lavar el sedimento con solucin salina

esterilizada (0,87 %, p/v) y estandarizar la concentracin celular con el tubo 3 del nefelmetro de Mc Farland (9 x 108 cel mL-1). A continuacin, de cada una de las suspensiones bacterianas previamente estandarizadas tomar 1 mL e inocularlo por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL de caldo Bushnell Haas con indicador prpura de bromocresol y 0,1 mL de petrleo Diesel. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como testigo. Incubar a 30 C hasta por 10 das, con agitacin manual, diariamente por 10 minutos y en simultneo investigar el viraje del indicador del lila al amarillo, que se interpretar como positivo para la utilizacin del petrleo como fuente de carbono y energa. 3.4 Cuantificacin de las Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) De cada uno de los inculos bacterianos previamente estandarizados tomar 1 mL e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL de caldo extracto de levadura ms 0,2 mL de etanol. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como testigo. Incubar a 30 C, durante 3 das con agitacin manual, diaria por 10 minutos y en simultneo investigar la presencia de burbujas y turbidez del medio de cultivo. A continuacin, verter el caldo cultivado en tubos y centrifugarlos (3500 rpm) durante 10 minutos. Despus, tomar 1 mL de cada sobrenadante y llevar a tubos de prueba con 9 mL de caldo extracto de levadura etanol ms 0,2 mL de petrleo Diesel. Tapar hermticamente (tapa rosca) y agitar manualmente durante 1 minuto hasta lograr una emulsin. Posteriormente, con un tubo blanco conteniendo caldo extracto de levadura etanol ms 0,2 mL de petrleo Diesel (testigo) calibrar a cero el espectrofotmetro digital de luz visible, 335 - 1000 nm, y leer la absorbancia de cada una de las muestras a 540 nm.

Despus, realizar la conversin de la absorbancia a unidades de actividad emulsificante por

mililitro, considerando 0,826 de absorbancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mililitro, UAE mL-1. 3.5 Eficiencia de la biorremediacin de suelo contaminado con petrleo por tres bacterias nativas seleccionadas Inocular las tres bacterias en terrarios con suelo contaminado con petrleo, donde se determinar la eficiencia de la biorremediacin usando las tecnologas de bioestimulacin y bioaumentacin. a. Recoleccin y acondicionamiento de suelo contaminado Colectar suelo contaminado con petrleo, homogenizar sobre una manta de

polietileno y tamizar a travs de una malla metlica de 15 mm de dimetro . b. Clculo y aplicacin de nutrientes para la bioestimulacin Realizar la bioestimulacin o aplicacin de los nutrientes nitrgeno y fsforo hasta alcanzar la relacin C:N:P de 100:10:1, para lo cual se agregarn 0,235 g de urea (46 % N) y 0,024 de fosfato diamnico (18 % N y 46 % P) por terrario. c. Propagacin de bacterias para la bioaumentacin Obtener el inculo de cada bacteria nativa por el mtodo de siembra a gran escala, trabajando con un inculo madre, intermedio y definitivo. Cultivar las bacterias nativas seleccionadas en 3 mL de caldo nutritivo, a 30 C durante 24 horas. A continuacin, obtener un paquete celular y estandarizar su concentracin con el tubo 3 del nefelmetro de Mc Farland , obteniendo una suspensin bacteriana con 9,0 x108 cel mL-1 Por ejemplo para la propagacin, inocular 0,6 mL de la suspensin bacteriana en 5,4 mL de caldo Bushnell Haas con 5 % de petrleo Diesel, incubndolos a 30 C por 24 horas, constituyendo el inculo madre. Inocular ste en 54 mL de caldo Bushnell Haas con petrleo Diesel incubndose a 30 C por 24 horas para constituir el inculo intermedio e inocular a su vez, ste en 540 mL del mismo caldo Bushnell Haas, incubado en las mismas condiciones y constituyendo el inculo definitivo en una cantidad de 600 mL. para 30 bandejas. Luego tomar una muestra representativa de 1 kg de suelo para determinar el contenido de Hidrocarburos Totales de Petrleo (TPH) y realizar la caracterizacin fsico qumica en el laboratorio de suelos A continuacin, distribuir el suelo contaminado en bandejas de plstico o terrarios, de 40 x 28 cm con un rea de 0,11 m2, a razn de 4 kg por unidad.. d. Inoculacin de bacterias nativas degradadoras de petrleo Para determinar la eficiencia de la biorremediacin de un suelo contaminado con petrleo se realiz un ensayo con quince tratamientos diez de ellos correspondieron a la inoculacin independiente de cada una de las bacterias seleccionadas, tres tratamientos fueron consorcios de bacterias y dos tratamientos fueron testigos con nitrgeno - fsforo, suplementado y absoluto. En cada tratamiento se tuvieron dos repeticiones, totalizando 30 unidades experimentales. En los tratamientos correspondientes a la inoculacin, independiente de las

bacterias nativas (T1 a T10) en cada terrario con 4 kg de suelo contaminado se aadieron 400 mL (10 %) del inculo, previamente obtenido. En los consorcios se inocularon 80 mL de cada una de las cinco bacterias seleccionadas por requerir el menor tiempo en la utilizacin del petrleo (T11), 80 mL de cada una de las cinco bacterias con el mayor nmero de UAE (T12) y 40 mL de cada una de las diez bacterias nativas seleccionadas (T13). El testigo con nitrgeno y fsforo no fue inoculado y a su vez el testigo absoluto no fue ni bioestimulado ni bioaumentado. Inmediatamente despus de la inoculacin, el contenido de los terrarios se mezcl durante 5 minutos y a continuacin stos se ubicaron bajo un rea techada de 5 x 6 m . Se realizaron riegos (Figura 44), interdiarios con agua de pozo, durante los primeros 60 das y dos veces por semana los ltimos 30 das y despus de cada riego el contenido de los terrarios fue removido durante 5 minutos. e. Monitorizacin del proceso: anlisis fsico qumico

Inmediatamente despus de la inoculacin bacteriana y despus de 30,60 y 90 das, tomar una muestra representativa de 30 g en cada tratamiento y llevar al laboratorio donde se tomarn tres submuestras de 10, 5 y 10 g para investigar el pH, humedad y bacterias, respectivamente. Para medir el pH depositar 10 g de suelo en un frasco con 25 mL de agua destilada (1: 2,5) y agitar durante 90 segundos antes de la medicin. Para la determinacin de la humedad obtener el peso de un crisol limpio y seco (Pb), pesar en ste 5 g de suelo (Pshb), y despus secarlos en horno a 105 C hasta obtener peso constante. Finalmente pesar el crisol con la muestra de suelo seco (Pssb). Determinar la humedad al inicio del ensayo y despus del riego correspondiente, interdiario durante los 60 primeros das y dos veces por semana durante los ltimos 30 das. Calcular el contenido de agua con la siguiente frmula: % g = (Pshb - Pssb) x 100 (Pssb - Pb)

f. lechuga. -

Monitorizacin del proceso: anlisis biolgico

Realizar el anlisis microbiolgico y un bioensayo de fitotoxicidad en Latuca sativa L.

Anlisis microbiolgico Inmediatamente despus de la inoculacin y mensualmente contar las bacterias

hetertrofas e hidrocarbonoclsticas. Para el recuento de bacterias hetertrofas utilizar

el

mtodo de placa fluida o vertido en placa, para lo cual se deben pesar 10 g de suelo con los que se obtendr una suspensin en 90 mL de agua destilada esterilizada, que a la vez constituir la dilucin 10-1. A continuacin, realizar diluciones decimales entre 10-4 a 10-7 , y de las tres

ltimas diluciones tomar 1 mL por duplicado y depositarlos en placas de Petri esterilizada Inmediatamente despus, agregar el agar Plate Count, licuado y enfriado entre 44 - 46 C y homogenizar, el contenido durante 30 segundos. Incubar a 30 C durante 48 horas y despus contar en las placas que presentaron entre 30 a 300 colonias. Cuando no se observen colonias en las placas considerar como un nmero menor de 1 dividido por el correspondiente volumen inoculado en la placa de Petri. Obtener la media del conteo de las placas correspondientes y expresar los resultados como Unidades Formadoras de Colonias por gramo de suelo (UFC g-1).

UFC/g suelo = Ncolonias x Volumen dilucin x mL dilucin factor dilucin

1 g suelo

Para el recuento de bacterias hidrocarbonoclsticas utilizar la tcnica del Nmero Ms Probable, o Mtodo de Tubos Mltiples, empleando el caldo Bushnell Haas (5

mL), con el indicador prpura de bromocresol y 0,025 mL de petrleo Diesel, como fuente de carbono. Para el recuento, inocular 1 mL de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra de suelo por duplicado en tubos con caldo, Bushnell Haas petrleo Diesel e incubar a 30C hasta por 5 das.Considerar como positivo el viraje del indicador prpura de bromocresol del lila al amarillo y realizar el clculo correspondiente. Bioensayo de fitotoxicidad Para determinar el efecto de las sustancias presentes en los suelos biorremediados sobre el ndice de germinacin, realizar un bioensayo de fitotoxicidad. De cada tratamiento tomar una muestra representativa de 10 g de suelo y realizar una dilucin 1/5, tomando 10 g de suelo con 50 mL de agua destilada esterilizada. A continuacin, colocar 20 semillas de lechuga var. GREAT LAKES, distribuidas por duplicado sobre un papel filtro circular depositado sobre la base de placas de Petri previamente esterilizadas y verter sobre ellas 6 mL de la dilucin de suelo biorremediado. Tapar las placas de Petri y cubrir con papel kraft durante 120 horas, a

temperatura ambiente. Incluir un control negativo, donde las diluciones de suelo sern reemplazadas por agua destilada esterilizada y dos controles positivos, en donde se depositarn las diluciones de suelo de los tratamientos testigo con N - P y testigo absoluto. Despus de 120 horas contar las semillas germinadas y medir la longitud de las radculas emergidas. Calcular el porcentaje de germinacin relativo, (PGR), el crecimiento relativo de radcula (CRR) y el ndice de germinacin (IG).

g. Eficiencia de la biorremediacin de suelos contaminados por petrleo Para determinar la eficiencia de la biorremediacin de suelo contaminado con petrleo expresado en porcentaje, realizar el anlisis de Hidrocarburos Totales de Petrleo (TPH), al finalizar el proceso (90 das) en los tratamientos que presenten el mayor ndice de germinacin y en los testigos nitrgeno fsforo y absoluto.

E = Si Sf x 100 Si

Donde: E = Eficiencia de degradacin de petrleo (%) Si = Concentracin inicial de TPH Sf = Concentracin final TPH

h. Identificacin y conservacin de bacterias nativas degradadoras de petrleo Realizar las pruebas correspondientes para determinar el gnero y especie de las bacterias degradadoras de petrleo.

4.

ANEXO 4.1 Caldo Bushnell Haas (g/L) KH2P04 K2HP04 (NH4)2S04 MgSO4 Cl2Ca FeCl3 Agus destilada csp pH 4.2 Caldo Extracto de levadura etanol (g/L) KH2 P04 K2HP04 MgS04 (NH4)2SO4 Extracto de levadura Etanol Agus destilada csp pH 18,0 6,0 0,2 4,0 3,0 20,0 mL 1000 mL 7,0 1,0 1,0 1,0 0,20 0,02 0,005 1000 mL 7,0

4.3 Clculo de las concentraciones de urea y fosfato diamnico requeridos para alcanzar una relacin C:N:P de 100:10:1 (en Carreo, 2008)

a) Clculo de FDA (18%N 46%) 100 kg FDA 46 U/P x 1 U/P x = 2,174 kg FDA.Ha-1 x = 0,217g FDA. m2 Adicin por terrario: 0,217g FDA 1 m2 x 0,112 m2 x = 0,024 g FDA 100 kg FDA 0,000024 kg FDA x = 0,000024 kg N x = 0,004 g N FDA 18 U/N x

b) Clculo de Urea (46% N) 100 kg urea x 46 U/N 10 U/N

x = 21,739 kg urea. Ha-1 x = 2,1739 g urea. m2 Adicin por terrario: 2,174 g urea 1 m2 x 0,112 m2 x = 0,239 g N 0,239 g N (urea) - 0,004 g N (FDA) x = 0,235 g urea

5.

BIBLIOGRAFIA

Llanos, C. (2012). Eficiencia de la biorremediacin de suelos contaminados con petrleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque, 2011. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Ramrez, N., (2005) Degradacin de petrleo Disesel a diferentes concentraciones de nitrgeno y fsforo por cepas nativas de Pseudomonas sp. Lambayeque, 2005. Tesis de Maestra. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Tapia, I., (2002) Capacidad degradativa del petrleo de hongos aislados de agua de marLitoral del Puerto Eten. Enero-Mayo, 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.