Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico I.

Introduccin: El cido ctrico es un cido orgnico tricarboxlico que est presente en la mayora de las frutas, sobre todo en ctricos como el limn y la naranja. Es un importante producto intermedio en el catabolismo de los carbohidratos de todos los seres vivos aerobios (incluido el ser humano), conservador y antioxidante natural que se aade industrialmente como aditivo. Sus funciones son como agente secuestrante, agente dispersante y acidificante. El cido ctrico es un componente esencial de la mayora de las bebidas refrescantes del mismo modo que el que se encuentra presente en muchas frutas produce la acidez de sus zumos, potenciando tambin el sabor a fruta. Con el mismo fin se utiliza en los caramelos, en pastelera, helados, etc. Es tambin un aditivo especialmente eficaz para evitar el oscurecimiento que se produce rpidamente en las superficies cortadas de algunas frutas y otros vegetales.

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La produccin de cido ctrico ha crecido notablemente en el presente siglo. Actualmente, la capacidad instalada mundial es de 750.000 tn/ao, con una produccin real de 550.000 tn/ao. El cido ctrico es un aditivo que se fabrica en ms de 20 pases. La Unin Europea, Estados Unidos y China renen el 88% del total mundial. Recientemente, se observ un aumento importante en la capacidad productiva de Europa Oriental y del Lejano Oriente, particularmente en China. Por otro lado la expansin de la demanda mundial de cido ctrico se debe, fundamentalmente, a su utilizacin como aditivo en la industria de alimentos y bebidas. Por ejemplo, en Estados Unidos este sector demanda el 72% del total. El consumo de cido ctrico en el mundo crece a razn de 5-8% anual y la tendencia parece mantenerse estable.

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Figura 1. Consumo de cido ctrico por sector o destino.

II. Materias Primas:

Fuente de Carbono: Melaza o jarabe de Caa de Azcar

Como fuente de carbohidratos pueden ser utilizados una serie de materias primas tales como almidn de papa, jarabe de glucosa de almidn sacarificado, sacarosa de diferentes niveles de pureza, jarabe de caa de azcar, melazas de caa de azcar y de remolacha.

Fuente de Nitrgeno: Amoniaco, NH3

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa En la fermentacin de la glucosa con Aspergillus Nger, el amoniaco representa una importante fuente de nitrgeno, til para que se lleve a cabo la germinacin y crecimiento del hongo.

cido sulfrico.

En el proceso es muy importante porque reacciona con el citrato de calcio y lo hace precipitar en forma de yeso o sulfato clcico, permitiendo liberar el cido ctrico presente.

Cal viva, Oxido de Calcio, (CaO).

Es usada para formar citrato de calcio y as poder separar el cido ctrico.

Resinas de Intercambio Inico. Los principios del intercambio inico han sido utilizados en mtodos de purificacin, anlisis qumico, tratamiento de agua y otras aplicaciones, a escala industrial y de laboratorio, lo que unido al amplio surtido y diversidad de resinas disponibles, permite ofrecer soluciones a muchos problemas cientfico-tcnicos del campo farmacutico y sanitario. Son insolubles en agua, muy tiles gracias a su naturaleza polimrica, es decir que contienen grupos ionizados (aniones o cationes), en forma repetitiva a lo largo de la cadena que las conforman. Estos grupos tienen su carga neutralizada por iones de signo contrario (contra iones), que pueden ser intercambiados de manera estequiomtrica por otros iones de igual signo al ponerse en contacto con una solucin de electrlitos. Las resinas intercambiadoras de cationes se denominan catinicas y las de aniones, aninicas.

Carbn activado. El carbn activado posee la virtud de adherir o retener en su superficie uno o ms componentes (tomos, molculas, iones) del lquido que est en contacto con l.

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa Este fenmeno se denomina poder adsorbente. La adsorcin es la responsable de purificar, deodorizar y decolorar el agua u otos slidos, lquidos o gases que entren en contacto con el elemento adsorbente.

Aspergillus Nger Es un microorganismo que fue catalogado por primera vez en el 1729 por un sacerdote bilogo italiano. El Aspergillus Niger es utilizado mundialmente en el 99% de las producciones de cido ctrico (casi 5 millones de toneladas por ao). Estos microorganismos elaboran los azucares que se le suministran y los transforman en grandes cantidades de cido ctrico (casi el 80-90% del azcar se convierte en cido ctrico) que posteriormente se recoge y se purifica.

III.

Va Catablica del cido Ctrico:

El cido ctrico (cido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxlico) es un producto metablico primario y se forma en el ciclo de los cidos tricarboxlicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la produccin de este cido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosntesis se metaboliza por reacciones de la va de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato. Durante la fase de crecimiento la relacin entre estas dos vas es de 2:1 En los microorganismos productores de cido ctrico las enzimas de la va EMP estn presentes a lo largo del proceso de fermentacin y la actividad de la va est regulada en forma positiva por la fosfofructoquinasa y en forma negativa por la piruvato quinasa. Cuando el piruvato es descarboxilado con formacin de acetil-CoA, el residuo de acetato se canaliza hacia el ciclo de los cidos tricarboxlicos. Durante la idiofase (fase en el crecimiento de una bacteria en la que se producen metabolitos secundarios, que son productos no fundamentales en el metabolismo bacteriano) se expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la -cetoglutarato deshidrogenasa. La actividad de la citrato sintasa (enzima condensante) aumenta por un
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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa factor 10 durante la produccin del cido ctrico, mientras las actividades de las enzimas que catabolizan cido ctrico, como la aconitasa y la isocitrato deshidrogenasa, se reducen drsticamente en comparacin con su actividad durante la trofofase (fase en la vida de las colonias de microorganismos en que crecen de forma exponencial). Una de las tres isoenzimas, la isocitrato deshidrogenasa, una enzima mitocondrial que es especfica para NADP, se inhibe por el glicerol que se acumula durante el proceso de germinacin de las esporas. Adems, la produccin de cido ctrico es inhibida por concentraciones altas de amonio. La citrato sintasa no puede ser solamente responsable del mantenimiento de la actividad del ciclo de los cidos tricarboxlicos, ya que el ciclo se detendra si el cido ctrico fuera removido. Por lo tanto deben existir durante la fase de produccin distintas secuencias que rellenan los intermediarios del ciclo de los cidos tricarboxlicos (secuencias anaplerticas), como se ve en la siguiente figura.

Figura 2: Reacciones que conectan el ciclo de los cidos tricarboxlicos

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa La primera enzima anaplertica presente en Aspergillus es una piruvato carboxilasa (Reaccin 4) que convierte piruvato y CO2 en oxalacetato, fosfato inorgnico y ADP (mientras consume ATP). La reaccin depende de iones Mg2+y K+; no se necesita acetil-CoA para la reaccin, en contraste con sus requerimientos en las reacciones metablicas de otros microorganismos. La piruvato descarboxilasa es la enzima clave para la produccin de cido ctrico. La segunda secuencia anaplertica implica una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Reaccin 2), que convierte PEP y CO2 en oxalacetato y ATP en presencia de ADP. El sistema requiere Mg2+o Mn2+y K+o (NH4)+. Si se utilizan como fuente de carbono acetato o compuestos alifticos superiores, como n-alcanos (C9-C23), se encuentra en Aspergillus niger una tercera secuencia anaplertica. En ausencia de glucosa opera el ciclo del glioxilato (Reaccin 6); la isocitrato liasa se induce, y est presente la malato sintasa. Si se aade glucosa el ciclo del glioxilato se reprime, aunque la isocitrato liasa es todava parcialmente activa.

Figura 3: Ciclo del cido Ctrico

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Figura 4: Reaccin Bioqumica para la obtencin de cido Ctrico

IV. Bioprocesamiento Tecnolgico: Condiciones y controles de los procesos El cido ctrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Los procesos en superficie pueden ser subdivididos a su vez de acuerdo con el estado del medio de cultivo que se utilice: slido o lquido. De procesos sumergidos se utilizan dos tipos: fermentadores agitados o fermentadores de elevacin por aire (air-lift). Varios factores afectan la eleccin del tipo de proceso: la existencia de capital de inversin, la abundancia de energa, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de tcnicas para la medida y la regulacin. El material utilizado como inculo para la produccin de cido ctrico es una suspensin de esporas, las cuales germinan en el medio de cultivo a 32C, y se forma micelio en forma de bolillas o pellets (para los sistemas sumergidos). Es necesario tener el cultivo de la cepa bien desarrollado en estra (agar Sabouroud o papa dextrosa), bien esporulado y de 10-20 das de edad.

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa Procesos en superficie

Medio slido Plantas de baja produccin, muy limitadas, unas 500 toneladas al ao. Se usa sustrato slido, como migas de pan o pulpa de almidn. El pH del medio se reduce hasta 4 o 5 antes de la esterilizacin. Despus se inocula con esporas, extendindolo sobre bandejas en capas de 3 a 5cm de grosor y se incuba a 28C. El proceso dura unas 90 h, al final de las cuales la solucin entera se extrae con agua caliente para aislar el cido ctrico.

Medio lquido Es el mtodo ms antiguo de produccin. Actualmente se produce el 20% del total de cido ctrico con este mtodo. Permanece en uso todava debido a la baja inversin que requiere para su funcionamiento, ya que la tecnologa es sencilla y el costo en energa para los sistemas de refrigerado es bajo. El mayor costo viene por la mano de obra, ms grande que en los reactores sumergidos, pero es mano de obra no especializada. En reactores sumergidos se requiere menos mano de obra, pero capacitada. En los sistemas modernos, el medio se esteriliza en continuo. La solucin nutritiva estril fluye automticamente por un sistema de distribucin sobre las bandejas. La inoculacin se hace en cmaras de inoculacin a 3040C, diseminando esporas secas o pulverizando una suspensin de esporas. La temperatura se mantiene constante mediante un sistema de corriente de aire. La ventilacin es muy importante tambin, para el flujo de gases. La velocidad de produccin de cido ctrico baja si la concentracin de CO2 pasa del 10%. Al cabo de 24 h de la inoculacin, las esporas germinan y forman una fina capa de micelio sobre la superficie de la solucin. Al cabo de 30 h empieza la idiofase. La fermentacin se detiene al cabo de 8 a 14 das. Si hay demasiado hierro se producir cido oxlico, producindose una sustancia amarillenta que dificulta el proceso de recuperacin. Durante la recuperacin se separa el micelio de los nutrientes por filtracin. En algunos casos se usan prensas para obtener ms ctrico a partir de las clulas. En los procesos en slidos se hace as.

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa Procesos sumergidos

El 80% de la produccin mundial de cido ctrico se hace mediante procesos sumergidos. Aunque dura ms das que los otros mtodos presenta varias ventajas: menor inversin en la construccin y menor inversin total, es necesaria menos mano de obra. Tambin presenta algunas desventajas respecto de los mtodos anteriores: mayor costo de energa, la tecnologa de control es ms sofisticada, con lo que se requiere un personal ms especializado, la formacin de espuma tambin es un problema en la produccin de cido ctrico, pero se soluciona por la adicin de antiespumantes. En resumen, el rendimiento es mayor en la produccin sumergida. Existen 3 factores especialmente importantes para los procesos sumergidos: La calidad del material para construir el fermentador: El fermentador debe estar protegido de la accin de los cidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser as, cuando se alcancen valores de pH de 1 2, se liberarn metales de las paredes del fermentador, que podrn inhibir la formacin de cido ctrico. La estructura del micelio: Si el micelio es largo y filamentoso, la produccin de cido ctrico en la idiofase desciende. Para conseguir una velocidad ptima de produccin el micelio debe estar formado por pellets slidos muy pequeos. La relacin Cu/Fe determina la estructura del micelio. Suministro de O2: Aunque A. Nger requiere poco oxgeno, es sensible a su ausencia. Por lo tanto, es necesaria la presencia de oxgeno a una concentracin solo del 2025% de su valor de saturacin

Obtencin del cido ctrico por medio de Aspergillus Nger La preparacin del cido ctrico consiste, en trminos generales, en una fermentacin aerbica del azcar, utilizando un cultivo de Aspergillus Nger que es un hongo que produce como metabolito primario cido ctrico, por eso en este proceso se usa como
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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa agente fermentador. Luego la posterior purificacin, mediante el proceso cal-sulfrico y la recuperacin final del producto.

1.

Preparacin del sustrato (melaza)

El objetivo de esta primera etapa del proceso es la purificacin del jarabe. Se inicia mezclando el jarabe con agua para diluirlo; una vez diluido se pasa por un filtro de vaco para eliminar los slidos suspendidos y las impurezas de la melaza. Luego el jarabe es pasado por una celda de intercambio inico para retirar los iones del flujo. Despus el jarabe es sometido a un proceso de pasteurizacin que consiste en elevar la temperatura a 105C durante tres minutos y bajarla nuevamente hasta 37C. La pasteurizacin se lleva a cabo primero en un calentador de evaporacin instantnea, despus se utiliza un circuito de acumulacin y un enfriador de jarabe.

2.

Fermentacin Una vez pasteurizado, es bombeado al fermentador el cual es un recipiente rgido de 150 m3 en donde se lleva a cabo la transformacin de la sacarosa en cido ctrico por medio del Aspergillus Nger. El Aspergillus Nger es inoculado en este fermentador. Se hace el ajuste del pH y se aaden nutrientes (amoniaco NH3, sales de fermentacin). El aire estril se burbujea dentro del fermentador. Luego de la fermentacin, el flujo es pasado por un filtro rotatorio al vaco para separar el micelio. La masa conformada por el micelio y el microorganismo muerto se denomina biomasa o torta y constituye un subproducto o un efluente del proceso.

3.

Purificacin del cido ctrico El cido ctrico debe ser separado del micelio, el microorganismo muerto, el azcar residual, las protenas producidas por la fermentacin y otras impurezas solubles. Para lo cual se lleva a cabo el proceso denominado cal-sulfrico: se basa en tratar el licor madre con una lachada de la cal (Ca(OH)2 cal apagada)de lo cual se forma citrato de calcio. Este citrato resultante es lavado y el micelio es filtrado. Posteriormente se aade cido sulfrico para descomponer el citrato de calcio. Por lo

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa tanto en esta etapa se forma sulfato de calcio el cual es retirado de la solucin por medio de un filtro rotatorio al vaco y se constituye como un desperdicio o como un subproducto del proceso.

3.1 Celdas primarias de carbn activado En estas celdas son removidas las impurezas solubles que producen color a la solucin de cido Ctrico y en general sustancias orgnicas contenidas en el licor. Debido que a lo largo del proceso se aaden sustancias que aumentan la cantidad de iones contenidos en la solucin de cido Ctrico, antes de cristalizarlo hay que retirar estos iones (Ca++ y SO4) para estos se usan celdas de resinas de intercambio inico. La corriente alimenta los evaporadores de doble o de triple efecto donde se busca retirar la mayor cantidad de agua para pasar al cristalizador.

3.2 Cristalizacin En este proceso se separan los cristales formados del lquido saturado que se denomina licor madre. Este licor se recircula a la etapa de intercambio inico (celdas de carbn) o al tanque de tratamiento por cal. Los cristales de cido ctrico hmedos se redisuelven y se recristalizan al vaco. Luego pasan a la centrifuga en donde es eliminado el licor madre de los cristales formados.

3.3 Secado Se realiza en un equipo de lecho fluidizado, que permite retirar humedad hasta cumplir con las especificaciones.

3.4 Clasificacin Estos cristales son alimentados a un clasificador con 4 mallas en el interior. Aqu se separan en tres presentaciones (cristal, granular y granular fino). Es rechazado cualquier material fuera de los tamaos estndares, es decir, los terrones y el polvillo.

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Empaque Los tamaos anteriormente clasificados son empacados en bolsa interior de polietileno de 50 kg y exterior de polipropileno.

Figura 5: Cintica de la fermentacin del cido ctrico

Rendimientos En la trofofase, parte de la glucosa aadida se utiliza para la produccin de micelio y se convierte a travs de la respiracin en CO2. En la idiofase el resto de la glucosa se convierte en cidos orgnicos y existe una prdida mnima por la respiracin. El rendimiento terico es de 123 g de cido ctrico 1-hidrato (o 112 g de cido ctrico anhidro) por cada 100 g de sacarosa. Sin embargo, tales rendimientos no se obtienen en la prctica debido a las prdidas durante la trofofase.

Recuperacin del producto Si se llega a formar cido oxlico como producto lateral debido a un bajo control de la fermentacin, se precipita como oxalato de calcio a pH bajo, dejando el cido ctrico en
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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa la solucin como citrato mono clcico. Se utilizan filtros rotatorios o centrfugas para separar el micelio y el precipitado de oxalato clcico del lquido. A pH 7,2 y 70-90C, precipita el cido ctrico, lo que permite a su vez que sea separado mediante filtros rotatorios y secado. Para algunos usos especiales, el cido ctrico es purificado por adicin de cido sulfrico para disolver el cido ctrico, formndose un precipitado de sulfato clcico. Las etapas subsiguientes de recuperacin incluyen el tratamiento con carbn activado, cambiadores de iones y la cristalizacin como cido ctrico o cido ctrico monohidratado. Por encima de 40C el cido ctrico cristaliza como cido anhidro y por debajo de 36,5Ccomo monohidrato. La pureza requerida del producto depende del uso para el que se prepare. Cuando se destina a la industria de los alimentos debe ser ms puro que el que se necesita para usos industriales.

DIAGRAMA DE PROCESO DE CIDO CTRICO

PRODUCCIN

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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa SEPARACIN

PURIFICACIN

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Figura 6: Diagrama del proceso de produccin de cido ctrico por cultivo sumergido a partir de melazas

V. Avances Tecnolgicos y Cientficos: A pesar de los espectaculares avances en la gentica de los microorganismos y la madurez alcanzada por la tecnologa de fermentaciones los mtodos de produccin de cido ctrico no difieren notablemente de aquellos usados 30 o 40 aos atrs. Varios intentos se han hecho de producir cido ctrico por cultivo continuo, mas la tendencia del hongo a adherirse a las paredes y la complejidad de las variables ambientales han retrasado su aplicacin industrial. Muchos esfuerzos se realizan encaminados a encontrar nuevas metodologas. Ciertos desarrollos merecen especial atencin por ser los orgenes de posibles innovaciones. En particular, el uso de levaduras y bacterias, aprovechando
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Tecnologa de Bioprocesamiento del cido Ctrico Universidad Nacional del Santa sus altas tasas de crecimiento y su facilidad para crecer en una gran variedad de sustratos, resulta promisorio. Finalmente, otro campo de sumo inters reside en el uso de las tcnicas de ingeniera gentica para mejorar los procesos existentes. Por citar uno de los muchos posibles ejemplos, la fermentacin resultara ms econmica si se consumieran fuentes de carbono ms baratos que la melaza, tales como desperdicios celulsicos. Esto podra lograrse transfiriendo a A. niger los genes que codifican celulasas de alta actividad o aumentando la dosis de las ya presentes.

VI.

Conclusiones: El proceso descrito nos mostr lo ampliamente que pueden estar relacionadas unas industrias con otras, en este caso el cido ctrico se convierte en materia prima para la elaboracin de otros productos. La produccin industrial de cido ctrico se lleva a cabo preferentemente mediante el uso de un microorganismo llamado Aspergillus Niger en fermentadores para cultivo sumergido, que en este caso presentan

mayor productividad y rendimiento respecto a otros reactores.

VII.Referencias Bibliogrficas: Garca Garibay (2004), Editorial LIMUSA S.A de C.V Biotecnologa Alimentaria http://www.iquimicas.com/el-acido-citrico-en-sintesis/ http://www.cibernetia.com/tesis_es/QUIMICA/BIOQUIMICA/PROCESOS_MET ABOLICOS/2#sthash.IgklGCFS.dpuf http://es.scribd.com/doc/13167007/Fermentaciones-aerobicas-especiales

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