Evaluación Hematológica e Inmunofenotípica de La Erlichiosis Canina

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Medicina y Ciruga Animal
EVALUACIN HEMATOLGICA E INMUNOFENOTPICA DE LA EHRLICHIOSIS CANINA: EVOLUCIN TRAS LA ADMINISTRACIN DE DIPROPIONATO DE IMIDOCARB
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Carmen Lorente Mndez
Bajo la direccin de los doctores ngel Sainz Rodrguez Miguel ngel Tesouro Dez
Madrid, 2004
ISBN: 84-669-2853-7
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y CIRUGA ANIMAL
EVALUACIN HEMATOLGICA E INMUNOFENOTPICA DE LA EHRLICHIOSIS CANINA. EVOLUCIN TRAS LA ADMINISTRACIN DE DIPROPIONATO DE IMIDOCARB.
TESIS DOCTORAL
Presentada por: Dirigida por:
Carmen Lorente Mndez
ngel Sainz Rodrguez Miguel ngel Tesouro Dez
Madrid 2005
Este trabajo est dedicado a mis hijos Rafa y Jaime y a mis padres Carmita y Antonio. Gracias a mis padres por haberme dado la vida y a la vida por haberme dado a mis hijos. Todo alrededor de ellos es vida.
AGRADECIMIENTOS
A ngel Sainz y Miguel ngel Tesouro por haber dirigido este trabajo, por su hacer profesional y por el mpetu y trabajo aportado. Pero sobretodo por lo fcil que es trabajar con ellos, por su excelencia como personas, por su aliento y nimo continuo y por poder contar con su amistad. A Enrique Oconnor por accesibilidad y disposicin y porque su ayuda ha sido imprescindible en la realizacin de este proyecto. A Marta Escudero por su colaboracin y por el tiempo y dedicacin que me ha prestado en el procesamiento de las muestras. A Enrique Blas por su ayuda en el inicio de este proyecto. A Palmira, por su amor a los animales y su dedicacin exclusiva a ellos, por su actividad infatigable y por su buena disposicin y alegra en la colaboracin prestada. A Paco & Paco por su ayuda y compaa en la extraccin de sangre de tantos perros. A la SVPAP por su colaboracin a la investigacin y sobretodo a Nuria y a Carmen que me facilitaron el acceso a sus instalaciones. A Tino porque siempre coge el telfono contento y te recibe con una sonrisa. A Peter F. Moore que me proporcion los anticuerpos monoclonales. Al conjunto de todos mis compaeros de la Facultad, porque son compaeros y amigos y siempre han estado conmigo en los momentos difciles. En especial quiero agradecer la ayuda que me han prestado en momentos muy difciles para m a Mara, Marta, ngel Hernndez, Katy, Ana, Joaqun Ortega, ngel Garca, Loles, Fernando Liste y Santi; gracias por escucharme, por ayudarme y sobretodo por vuestra amistad. A Regino, que me escucha y me quiere. Gracias por recuperar el sol para m. A mis padres por su apoyo incondicional en todos los momentos de mi vida.
A mis hermanos por su cario, por sus risas, por sus bromas y por ser ellos. A mis primos y tos, porque somos una gran familia y siempre estn ah dispuestos a ayudar, transmitiendo confianza y felicidad. A mi yaya, que es una mujer sabia y siempre me ha dado amor y comprensin. A mis hijos porque estn llenos de vida, alegra y amor y porque han hecho la tesis conmigo. A Dios por haberme dado tanto.
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ABREVIATURAS 1.- INTRODUCCIN Y OBJETIVOS 2.- REVISIN BIBLIOGRFICA 2.1 CLASIFICACIN TAXONMICA DE EHRLICHIA 2.2 ESPECIES DEL GNERO Ehrlichia Y GNEROS PRXIMOS QUE AFECTAN A LOS CNIDOS 2.3.1. Gnero Ehrlichia 2.3.2. Gnero Anaplasma 2.3.3. Gnero Neorickettsia 2.3 EHRLICHIOSIS HUMANA 2.3.1 Etiologa y epidemiologa 2.3.2 Cuadro clnico 2.3.3 Concurrencias 2.4. EHRLICHIOSIS EN ESPAA 2.5. TRANSMISIN POR GARRAPATAS DE LAS EHRLICHIOSIS HUMANAS Y ANIMALES 2.6. INMUNOPATOGENIA 2.6.1. Inmunidad innata 2.6.2. Inmunidad adquirida 2.6.2.1 Inmunidad humoral 2.6.2.2 Inmunidad celular 2.7 CUADRO CLNICO 2.8 ALTERACIONES LABORATORIALES EN EL CURSO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA 2.8.1 Alteraciones hematolgicas 2.8.2 Alteraciones bioqumicas
1 5 11 13
17 17 21 24 26 26 30 31 33
36 42 43 48 49 51 63
67 67 70
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2.9 DIAGNSTICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA 2.9.1 Diagnstico clnico 2.9.2 Diagnstico diferencial 2.9.3 Diagnstico laboratorial 2.9.3.1 Pruebas laboratoriales inespecficas 2.9.3.2 Pruebas laboratoriales especficas 2.9.3.2.1 Examen microscpico del agente etiolgico 2.9.3.2.2 Diagnstico serolgico 2.9.3.2.3 Diagnstico molecular 2.10 TRATAMIENTO 2.10.1 Evolucin post-tratamiento 2.11 PROFILAXIS 2.12 CITOMETRA DE FLUJO 2.12.1 Deteccin de antgenos de superficie por inmunofluorescencia 2.12.2 Componentes del citmetro de flujo 2.12.2.1 Sistema ptico 2.12.2.2 Sistema de iluminacin 2.12.2.3 Sistema hidrulico 2.12.2.4 Sistema electrnico 2.12.3.5 Sistema de adquisicin y anlisis de datos 2.12.3 Grficos anexos de citometra de flujo 3.- MATERIAL Y MTODOS 3.1 PLAN DE TRABAJO 3.2 SELECCIN DE LOS ANIMALES 3.3 TRATAMIENTO 3.4 PLANIFICACIN DE LOS CONTROLES 3.5 RECOLECCIN DE LA SANGRE
73 73 74 75 75 76 76 77 80 82 85 87 90 93 95 95 96 96 97 98 99 103 105 106 108 108 109
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3.6 HEMATOLOGA COMPLETA 3.7 BIOQUMICA SANGUNEA 3.8 DIAGNSTICO INMUNOLGICO: INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA 3.8.1 Antgeno empleado 3.8.2 Tcnica de inmunofluorescencia indirecta 3.9 CITOMETRA DE FLUJO 3.10 ANTICUERPOS MONOCLONALES (MAB) 3.11 POBLACIONES LEUCOCITARIAS E INMUNOFENOTIPO 3.12 ESTUDIO ESTADSTICO 4.- RESULTADOS 4.1 SEROPREVALENCIA DE EHRLICHIOSIS EN LOS COLECTIVOS ESTUDIADOS 4.2 ESTADSTICOS BSICOS DEL GRUPO CONTROL 4.2.1 Eritrograma e ndices eritrocitarios 4.2.2 Plaquetas 4.2.3 Protenas sricas 4.2.4 Recuento leucocitario e inmunofenotipo 4.3 ESTADSTICOS BSICOS DEL GRUPO CON EHRLICHIOSIS 4.3.1 Eritrograma e ndices eritrocitarios 4.3.2 Plaquetas 4.3.3 Protenas sricas 4.3.4 Recuento leucocitario e inmunofenotipo
110 111 111 112 112 114 118 121 123 125 128 129 129 129 130 130 133 133 134 134 135
4.4 CORRELACIONES ENTRE LOS DISTINTOS PARMETROS BIOPATOLGICOS 138 4.4.1 Correlaciones entre las distintas variables en el grupo control 4.4.2 Correlaciones entre las distintas variables en el grupo de perros con ehrlichiosis 4.5 ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE DATOS OBTENIDOS DE POBLACIN SANA Y DE POBLACIN CANINA INFECTADA CON Ehrlichia canis ANTES DEL TRATAMIENTO 4.5.1 Hematologa: eritrograma e ndices eritrocitarios 158 158 147 139
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4.5.2 Plaquetas 4.5.3 Protenas sricas 4.5.4 Recuento leucocitario y poblaciones leucocitarias 4.5.5 Poblaciones linfocitarias 4.5.6 Subpoblaciones linfocitarias 4.6 EVOLUCIN POST-TERAPUTICA DE PARMETROS ESTUDIADOS EN PERROS CON EHRLICHIOSIS. 4.6.1 Hematologa: eritrograma e ndices eritrocitarios 4.6.2 Plaquetas 4.6.3 Protenas sricas 4.6.4 Recuento leucocitario e inmunofenotipo 4.6.5 Subpoblaciones linfocitarias referidas a la poblacin de linfocitos T 5.- DISCUSIN 5.1 PREVALENCIA DE EHRLICHIOSIS CANINA EN LAS POBLACIONES INCLUIDAS EN EL ESTUDIO 5.2 POBLACIN CONTROL 5.2.1 Hematologa: eritrograma, ndices eritrocitarios y plaquetas 5.2.2 Protenas sricas 5.2.3 Recuento leucocitario y recuento diferencial de leucocitos 5.2.4.Poblaciones linfocitarias: Inmunofenotipo 5.2.4.1 Poblaciones linfocitarias 5.2.4.2 Subpoblaciones linfocitarias 5.3 POBLACIN CON EHRLICHIOSIS 5.3.1 Hematologa: eritrograma e ndices eritrocitarios 5.3.2 Plaquetas 5.3.3 Protenas sricas 5.3.4 Recuento de leucocitos
161 162 164 169 173
179 179 186 188 194 215 223
225 226 227 227 227 228 230 233 237 238 239 240 241
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5.3.5 Recuento diferencial de poblaciones leucocitarias 5.3.6 Poblaciones linfocitarias: Inmunofenotipo 5.3.6.1 Poblaciones linfocitarias 5.3.6.2 Subpoblaciones linfocitarias 5.3.6.2 Correlaciones entre las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias con otros parmetros hematolgicos 5.4 EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE LOS PARMETROS ESTUDIADOS EN PERROS CON EHRLICHIOSIS 6.- CONCLUSIONES 7.- RESUMEN 8.- SUMMARY 9.- BIBLIOGRAFA
242 246 246 249
255
258 263 269 273 277
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
A/G ANA APC CHCM CMH Desv. EGC EGH EMC EMH Estnd. Felv FITC FIV FS GR HCM HB Htc IFI IL IFN- LGL MCP Mn
Cociente albmina/globulinas Anticuerpos antinucleares Clulas presentadoras de antgeno (Antigen presenting cells) Concentracin de hemoglobina corpuscular media Complejo Mayor de Histocompatibilidad Desviacin Ehrlichiosis granuloctica canina Ehrlichiosis granuloctica humana Ehrlichiosis monoctica canina Ehrlichiosis monoctica humana Estndar Virus de la leucemia felina Isotiocianato de fluorescena Virus de la inmunodeficiencia felina Dispersin frontal de luz Glbulos rojos Hemoglobina corpuscular media Hemoglobina Hematocrito Inmunofluorescencia indirecta Interleuquina Interfern-gamma Linfocitos granulares grandes Monocyte chemotactic protein Mnimo
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Abreviaturas
MIP NK PBS PE PMN PT SMF SS SVPAP Tc Test distr. N Th TCR TNF- VCM
Macrophage inflammatory protein Natural killer Solucin tamponada de fosfato Ficoeritrina Polimorfonucleares neutrfilos Protenas totales Sistema mononuclear fagocitario Dispersin lateral de luz Sociedad valenciana protectora de animales y plantas T citotxicos Test de distribucin normal T auxiliares Receptor antgeno-especfico de los linfocitos T Factor de necrosis tumoral-alfa Volumen corpuscular medio
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INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Introduccin y objetivos
1.- INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Me gustara comenzar esta memoria que recoge el trabajo que presento para optar al grado de doctora, con un reconocimiento a todas aquellas personas que inician un trabajo de investigacin y que, tras un periodo largo de estudio, por razones ajenas e inesperadas, ven interrumpido su trabajo sin posibilidades de proseguir con el mismo tema. Esta situacin tan desgraciada me sorprendi hace unos aos y, tras un periodo de lamento y dudas, decid proseguir con el esfuerzo de continuar con mi Tesis Doctoral, trabajo que afortunadamente hoy puedo presentar.
Desde el ao 1997 fue creciendo mi inters por el tipo de respuesta inmunitaria generada en el curso de la leishmaniosis canina. El conocimiento de nuevas tcnicas como la citometra de flujo y el marcaje con anticuerpos monoclonales de los linfocitos me motiv a realizar un estudio con el propsito de investigar el inmunofenotipo linfocitario en perros con leishmaniosis. Durante tres aos fui conservando muestras de sangre de perros con esta enfermedad, obtenidas antes y despus de su tratamiento, para su posterior estudio por citometra de flujo.
Cuando en el ao 2000 consegu los anticuerpos monoclonales para este estudio y la colaboracin del Servicio de Citometra de Flujo de la Universidad de Valencia,
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comprob que todas las muestras conservadas hasta aquel momento, desgraciadamente, se haban estropeado.
Mientras, la ehrlichiosis canina iba cobrando mayor relevancia en nuestro pas y se comprobaba la existencia de una elevada prevalencia en Valencia. Tanto la leishmaniosis como la ehrlichiosis son producidas por patgenos intracelulares, pareciendo similares sus mecanismos inmunitarios. La respuesta inmunitaria en el curso de la ehrlichiosis canina era incluso peor conocida que en el curso de la leishmaniosis. Adems, la ehrlichiosis canina haba suscitado un creciente inters en el equipo investigador del Servicio de Diagnstico de Ehrlichiosis y Leishmaniosis de la Universidad Complutense de Madrid, donde yo estaba realizando mis estudios de tercer ciclo, por lo que nos decidimos a cambiar el objeto de la investigacin a la tipificacin del inmunofenotipo de perros con ehrlichiosis. Las especiales caractersticas epidemiolgicas y nosolgicas de esta enfermedad podran facilitar el trabajo, aliviando en cierta medida el tiempo y esfuerzos previamente perdidos.
As, a mediados del ao 2001 planificamos e iniciamos esta investigacin, en la que nos proponamos profundizar en el estudio de la ehrlichiosis canina, comenzando con un aspecto en aquel momento muy poco conocido, el estudio del inmunofenotipo en los perros con esta enfermedad, para proseguir con este mismo estudio tras la aplicacin de un tratamiento especfico, analizando los posibles cambios que pudieran producirse en las poblaciones linfocitarias.
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En aquellos tiempos estbamos colaborando con algunas protectoras, lo que nos facilitaba poder contar con una amplia poblacin canina, que presumiblemente presentara una elevada prevalencia de ehrlichiosis. En estos colectivos, dadas sus caractersticas, igualmente coexisten en mayor o menor medida otras patologas que, en principio, podran interferir nuestro estudio. Por ello, decidimos trabajar con perros afectados de ehrlichiosis en fase subclnica, ya que de las distintas fases del curso de la enfermedad es, sin duda, la fase ms fcilmente reconocible y homognea. Adems, la ausencia de sntomas en los perros nos permita descartar otras enfermedades. En cualquier caso, para seleccionar nuestra muestra de animales, decidimos establecer diferentes criterios que nos descartaran la posible existencia de coinfecciones y, de ese modo, tener una mayor seguridad de que los perros seleccionados tan slo padecan ehrlichiosis.
Para el tratamiento, elegimos el dipropionato de imidocarb debido a los escasos estudios al respecto y al hecho de que el otro frmaco habitualmente empleado, la doxiciclina, parece poseer un cierto efecto inmunomodulador y, por lo tanto, podra influir en las variaciones del inmunofenotipo. Adems, con el tratamiento con dipropionato de imidocarb garantizbamos, mejor que con la doxiciclina, la correcta administracin del protocolo teraputico.
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Tras estas decisiones previas, nos planteamos como principales objetivos del trabajo:
Caracterizar el inmunofenotipo linfocitario en perros sanos, a travs del marcaje con anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD21, con el fin de obtener unos resultados de referencia.
Caracterizar el inmunofenotipo linfocitario en perros infectados naturalmente por Ehrlichia canis, en fase subclnica, y compararlos con los resultados obtenidos en perros sanos.
Caracterizar las alteraciones hematolgicas y de protenas sricas en perros en la fase subclnica de la infeccin por Ehrlichia canis, e investigar sus posibles asociaciones con los resultados del inmunofenotipo linfocitario con el fin de descubrir si alguno de estos parmetros rutinarios pudiera ser indicador de alguna poblacin o subpoblacin linfocitaria.
Valorar las variaciones en parmetros hematolgicos, protenas sricas y del inmunofenotipo linfocitario en perros con ehrlichiosis, en fase subclnica, tras el tratamiento con dipropionato de imidocarb.
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REVISIN BIBLIOGRFICA
Revisin bibliogrfica
2.1. CLASIFICACIN TAXONMICA DE EHRLICHIA

El gnero Ehrlichia se design como tal en 1945 en honor a Paul Ehrlich (Moshkovski, 1945; Silverstein, 1998). Erhlichia canis fue descrita en 1935 por Donatien y Lestoquard, aunque fue denominada Rickettsia canis. Estos autores tambin describen en 1936 E. bovis con la denominacin Rickettsia bovis. Parece ser que E. phagocytophila fue descrita por Tyzzer en 1938 como Cytoecetes microciti; sin embargo no existe material original ni cultivos que verifiquen su identidad (Ristic et Huxsoll, 1984). Con posterioridad se han ido describiendo otras especies Neorickettsia helminthoeca (Philip et al, 1953), E. sennetsu (Misao y Kobayashi, 1955), E. equi (Lewis et al, 1975), E. platys (French y Harvey, 1983), E. risticii (Holland et al, 1985b), E. chaffeensis (Anderson et al, 1991), E. ewingii (Anderson et al, 1992) y E. muris (Wen et al, 1995). En 1957, Philip reagrupa los gneros Ehrlichia (especie tipo Ehrlichia canis), Cowdria y Neorickettsia en la tribu Ehrlichieae (familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales) (Ristic y Kreier, 1984). En 1980, la nomenclatura de Ehrlichieae, Ehrlichia y Ehrlichia canis es incorporada a la Lista aprobada de nombres bacterianos, lo que les confiere el estatus de nomenclaturas pblicamente vlidas. La clasificacin taxonmica clsica se basaba en las caractersticas morfolgicas, ecolgicas y epidemiolgicas de las bacterias y en las manifestaciones clnicas de la enfermedad que producen (Dumler et al, 2001). El avance en tcnicas cientficas de clasificacin gentica, mucho ms objetivas, tales como el anlisis de secuencias de nucletidos de genes o de aminocidos de protenas de membrana externa y los anlisis antignicos, han llevado a la reorganizacin taxonmica de estos y otros muchos agentes bacterianos y han demostrado la imperfeccin de la anterior clasificacin taxonmica. (Weisburg et al, 1991; Woese et al, 1990; Brenner et al, 1993).
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Clasificacin taxonmica de Ehrlichia
Ningn sistema de clasificacin microbiolgica es perfecto. Sin embargo, la clasificacin gentica de los microorganismos es ptima en lo que se refiere a su capacidad de predecir los comportamientos biolgicos y la enfermedad producida por los agentes infecciosos incluidos en el mismo grupo (Dumler et al, 2001). Basndose en los resultados obtenidos de las secuencias del gen 16S rRNA y groESL y de los anlisis antignicos (Sumner et al, 1997; Zhang et al, 1997), Dumler et al en 2001 en un artculo publicado en el International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology proponen una reorganizacin de estas especies a travs de la eliminacin de las tribus de la familia Rickettsiaceae y la incorporacin de las especies de la anteriormente denominada tribu Ehrlichieae a la familia Anaplasmataceae. As los gneros: Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria y Neorickettsia se incorporan a la Familia Anaplasmataceae dentro del orden Rickettsiales y del Philum Proteobacteria. Basndose en la secuencia del gen 16S rRNA, las especies anteriormente incluidas en los gneros Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria y Neorickettsia se reorganizaran en cuatro grupos genticos (Dumler et al, 2001): Grupo 1: amplia el gnero Anaplasma, incluyendo en l: adems de las especies hasta entonces incluidas Anaplasma marginale, Anaplasma centrale y Anaplasma caudatum; las siguientes especies Ehrlichia phagocytophila (hoy llamada Anaplasma phagocytophilum), Ehrlichia bovis (actualmente Anaplasma bovis) y Ehrlichia platys (hoy Anaplasma platys). La especie tipo es A. Marginale. Grupo 2: El gnero Ehrlichia se ampla con la inclusin de Cowdria ruminantium (ahora Ehrlichia ruminantium). La especie tipo es E. canis; otras especies de este gnero son E. chaffeensis, E. Ewingii y E. Muris. Grupo 3: El gnero Neorickettsia, cuya especie tipo es N. helminthoeca, quedara ampliado al incluirse en el mismo las especies Ehrlichia risticii y Ehrlichia sennetsu (que pasan a denominarse N. risticii y N. sennetsu respectivamente).
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Grupo 4: la especie Wolbachia pipientis ser el nico miembro del gnero Wolbachia. Existe una elevada reaccin antignica cruzada entre las especies del mismo grupo, ya
que comparten varios antgenos superficiales homlogos; sin embargo, entre las especies de los diferentes grupos esta reaccin antignica cruzada es mucho menor (Yu et al, 2000; Dumler et al, 2001) La especie actualmente denominada Anaplasma phagocytophilum engloba tres especies anteriormente descritas, denominadas Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila y el agente de la ehrlichiosis granuloctica humana (EGH). Se ha observado tras los pertinentes estudios genticos y biolgicos que existen suficientes similitudes entre ellas como para clasificarlas en una nica especie (Anderson et al, 1991; Dumler et al, 1995; Sumner et al, 1997). La clasificacin actual del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Garrity et al 2001), es similar a la propuesta por Dumler y colaboradores, si bien incluye los gneros: Erhlichia, Anaplasma, Cowdria y Neorickettsia dentro de la familia Ehrlichiaceae, en lugar de en la familia Anaplasmataceae. Todos los miembros de la familia Ehrlichiaceae son bacterias intracelulares obligadas que se replican en el interior de una vacuola intracitoplasmtica derivada de la membrana externa de la clula eucariota hospedadora. Son organismos de cocoides a elipsoides, a menudo pleomrficos, pequeos y gram-negativos que residen en vacuolas citoplsmicas, formando inclusiones nicas o, ms habitualmente compactas (mrulas) (Theiler, 1910; Moshkovski, 1945; Ristic y Huxsoll, 1984; Ristic y Kreier, 1984; Dumler et al, 2001). Ultraestructuralmente existen dos morfologas: grandes clulas reticuladas y formas ms pequeas de protoplasma condensado denominadas en ingls dense-core forms (Popov et al, 1998).
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Clasificacin taxonmica de Ehrlichia
Los gneros Anaplasma, Ehrlichia y Neorickettsia se multiplican en clulas hematopoyticas maduras o inmaduras de hospedadores vertebrados. Wolbachia infecta exclusivamente a invertebrados, no habindose detectado infeccin en ningn organismo vertebrado. Las especies ehrlichiales incluidas en los gneros Ehrlichia y Anaplasma son trasmitidas por picadura de garrapatas. Las especies incluidas en los gneros Neorickettsia y Wolbachia son trasmitidas por cercarias o metacercarias de helmintos que infectan serpientes, peces, insectos acuticos o artrpodos (Rikihisa, 1991; Barlough et al, 1998; Pusterla et al, 2000). En el caso de las especies del gnero Neorickettsia la infeccin de hospedadores vertebrados superiores se producira por ingestin de peces o invertebrados portadores del agente (Barlough et al, 1998; Madigan et al, 2000a; Pusterla et al, 2000).
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2.2. ESPECIES DEL GNERO Ehrlichia Y GNEROS PRXIMOS QUE AFECTAN A LOS CNIDOS
Aunque las Ehrlichias fueron descritas a principios del siglo pasado, se consideraron patgenos de gran importancia veterinaria en la penltima dcada del siglo XX. Debido a los cambios taxonmicos anteriormente descritos, en la actualidad, se denomina ehrlichiosis a la enfermedad producida por las especies incluidas en los gneros Ehrlichia, Anaplasma y Neorikketsia. No obstante, la infeccin por agentes de los dos ltimos gneros se est comenzando a llamar anaplasmosis (Shaw, 2003) y neorickettsiosis (Chae et al, 2002), respectivamente.
2.2.1. GNERO EHRLICHIA Dentro del gnero Ehrlichia, cuya especie tipo es Ehrlichia canis, se encuentran incluidas las especies E. ewingii, E. chaffeensis, E. ruminantium y E. muris. Se han observado infecciones en perros con todas estas especies, excepto con E. muris (Breitschwerdt et al, 1998a; Allsopp y Allsopp, 2001; Suksawat et al, 2001). La primera ehrlichiosis canina descrita, as como la ms universalmente conocida, es aquella producida por Ehrlichia canis. Comenzaremos con una breve descripcin de la misma, para pasar a describir otras especies que se han identificado como infectivas en los cnidos. La ehrlichiosis monoctica canina (EMC) fue reconocida por primera vez en Argelia, en el Instituto Pasteur en 1935 (Donatien y Lestoquard, 1935), ante la presencia de una enfermedad febril, que condujo a la muerte a 4 de 5 perros parasitados intensamente
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Especies del gnero Ehrlichia y gneros prximos que afectan a los cnidos
por garrapatas. En los frotis de sangre de esos perros se observaron unos agregados granulares compatibles con Rickettsia en el interior de monocitos. El agente patgeno fue denominado Rickettsia canis. Moshkovskii en 1945 redenomin a este agente Ehrlichia canis en honor al bacterilogo alemn Paul Ehrlich. En los aos 40 se describen diversas infecciones por este agente en frica e India, en los aos 50 en las Antillas Holandesas y a partir de los aos 60 se describe la enfermedad en Singapur, Vietnam, Estados Unidos y Europa (Ewing, 1969) En la dcada de los 60, perros militares destacados en Vietnam sufrieron una enfermedad caracterizada por hemorragias, emaciacin y una elevada mortalidad. Este proceso se denomin pancitopenia tropical canina y posteriormente su etiologa se atribuy a E. canis (Keefe et al, 1982). Desde entonces ha sido reconocida mundialmente como una importante enfermedad infecciosa para perros y otros cnidos. E. canis produce una enfermedad febril aguda que puede progresar a cuadros clnicos ms graves e incluso mortales (Skotarczak, 2003). Ehrlichia canis es transmitida a travs de la picadura de garrapatas, siendo la especie responsable de esta transmisin Rhipicephalus sangineus, la garrapata marrn del perro. La ehrlichiosis canina es una enfermedad de distribucin mundial, existiendo reas consideradas endmicas de la enfermedad. En Turqua se ha estimado una prevalencia del 8 al 20 % segn las zonas (Batmaz et al, 2001). En Espaa en la Comunidad de Madrid, Sainz et al en 1994 determinan una prevalencia del 6.5%, aprecindose una gran variacin en cuanto al nmero de casos observados en funcin de que el hbitat sea urbano o rural, lo cual muestra la dependencia de la infeccin del grado de exposicin a las garrapatas (Sainz et al, 1998a). Recientemente E. canis o un organismo indistinguible de ella ha sido aislado de un humano en Venezuela, por lo que el riesgo zoontico de este agente parece confirmarse (Prez et al, 1996).
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Ehrlichia ewingii es uno de los agentes responsable de la ehrlichiosis granuloctica canina (EGC), que infecta neutrfilos y ms raramente, eosinfilos caninos. Fue descrita por primera vez en 1971 (Ewing, 1971), aunque su denominacin se debe a Anderson en 1992 (Anderson et al, 1992). La garrapata vector es Amblyomma americanum (Wolf et al, 2000), de distribucin exclusiva en los Estados Unidos por lo que esta infeccin se considera actualmente restringida a esta rea geogrfica (Anderson et al, 1993; Maretzki et al, 1994; Goldman et al, 1998; Magnarelli et al, 1999; Murphy et al, 1998; Goodman et al, 2003). Sin embargo, recientemente se ha observado la infeccin natural de este agente en otras especies de garrapatas como, Rhipicephalus sanguineus y Dermacentor variabilis en Oklahoma (Murphy et al, 1998). La enfermedad puede cursar sin sintomatologa o presentar un cuadro leve con signos variados, caracterizado en general por fiebre, letargia, anorexia y prdida de peso. Con cierta frecuencia se presenta con poliartritis neutroflica e incluso con signos neurolgicos como ataxia, parexia, dficit de propiocepcin, anisocoria, etc. La alteracin hematolgica ms frecuente es trombocitopenia, pudindose observar tambin anemia. (Goldman et al, 1998; Goodman et al, 2003). En lneas generales, la enfermedad que produce es ms leve que la producida por Ehrlichia canis (Madewell y Gribble, 1982). La ehrlichiosis granuloctica canina es tambin producida por la actualmente denominada Anaplasma phagocytophylum. En Europa los casos descritos de EGC son exclusivamente atribuidos a A. phagocytophylum (Johansson et al, 1995; Pusterla et al, 1998; Massung et al, 2000). Ehrlichia ewingii presenta una fuerte reaccin serolgica cruzada con Ehrlichia canis y Ehrlichia chaffeensis si bien la seroreactividad con A. phagocytophilum es mucho ms dbil (Buller et al, 1999; Wolf et al, 2000; Paddock et al, 2001). Tanto Ehrlichia ewingii como A. phagocytophilum son especies responsables de la ehrlichiosis granuloctica humana.
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Ehrlichia chafeensis, agente causal de la ehrlichiosis monoctica en personas, es capaz de infectar a los perros de manera natural y dar lugar a una enfermedad grave, clnica y serolgicamente indistinguible de la causada por E. canis o E. ewingii (Breitschwerdt et al, 1998a). La infeccin experimental produce una ligera respuesta febril sin anomalas hematolgicas (Dawson y Ewing, 1992), por lo que el perro no se considera un buen modelo como animal de experimentacin en esta infeccin. La garrapata Amblyomma americanum se considera el principal vector de E. chaffeensis, siendo los ciervos los reservorios principales de esta ehrlichia en la naturaleza (Anderson et al, 1993; Dawson et al, 1994). Debido a la distribucin geogrfica del vector, slo se han descrito casos de ehrlichiosis canina por E. chaffeensis en Estados Unidos (Kordick et al, 1999). En casos de infeccin natural en perros por E. chaffeensis, el tratamiento con doxiciclina no es efectivo, por lo que se recomienda el empleo de dipropionato de imidocarb (Breitschwerdt et al, 1998b). Ehrlichia ruminantium es el agente causal de la ehrlichiosis de los rumiantes, tambin llamada enfermedad del corazn acuoso, debido a que produce hidropericardio (Uilenberg et al, 1993). Esta ehrlichia infecta las clulas endoteliales, clulas de la lnea mieloblstica y clulas de la lnea monoblstica de los rumiantes. Su transmisin se realiza por garrapatas vectores del gnero Amblyomma spp, La distribucin de la enfermedad, ligada a la de su vector, se ha limitado al continente africano, aunque la exportacin de animales afectados ha podido distribuir la enfermedad a otras zonas, como el Caribe (Bezuidenhout, 1987; Walker y Olwage, 1987; Camus y Barre, 1993; Deem, 1998). En Sudfrica se ha descrito la existencia tanto de perros sanos portadores de la bacteria, como de animales enfermos con ehrlichiosis causada por E. ruminantium (Allsopp y Allsopp, 2001). El hallazgo de un genotipo de E. ruminantium que infecta perros enfatiza la multiplicidad de organismos que las tcnicas moleculares han sido capaces de revelar en el gnero Ehrlichia (Allsopp y Allsopp, 2001). Ehrlichia muris se aisl en 1983 del bazo de un roedor salvaje en Japn (Kawahara et al, 1993), asignndose esta denominacin en 1995 (Wen et al, 1995).
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Ehrlichia muris se ha aislado de la garrapata Haemaphysalis flava siendo probable su papel como vector, esta garrapata tan slo se ha identificado hasta el momento en Japn y en Corea. El poder patgeno de esta bacteria se desconoce. La inoculacin experimental de este agente en perros va intravenosa no produjo sintomatologa, observndose tan slo una ligera y fugaz elevacin del ttulo de anticuerpos. Mediante controles serolgicos se ha detectado la exposicin a este agente o a alguno similar en hombres, perros y otros animales (Kawahara et al, 1999).
2.2.2. GNERO ANAPLASMA El gnero Anaplasma, segn la ltima clasificacin del Bergeys manual (Garrity et al, 2001), incluye las siguientes especies: A. marginale, A. centrale, A. ovis, A. bovis, A. platys y A. phagocytophilum, siendo las dos ltimas especies las nicas de relevancia en medicina canina. Anaplasma platys es el agente de la trombocitopenia cclica infecciosa del perro. Esta Ehrlichia infecta exclusivamente plaquetas, no habindose encontrado en otro tipo de clulas. Se considera que la infeccin por este agente es especfica del perro. La transmisin de la infeccin se produce a travs de la picadura de garrapatas de la especie Rhipicephalus sanguineus (Simpson et al, 1991), las transfusiones sanguneas con sangre infectada tambin podran transmitir la infeccin (Woody et al, 1991; Breitschwerdt, 2003). La infeccin se ha descrito en EEUU, Venezuela, Asia (China, Taiwan, Japn), Israel, Australia y Europa, principalmente en Espaa, Grecia, sur de Francia, Alemania e Italia (Kontos et al, 1991; Chang et al, 1996; McBride et al, 1996; Harvey, 1998; Sainz et al, 1999a; Brown et al, 2001; Motoi et al, 2001). La infeccin es a menudo inaparente, pero tras una incubacin de 8 a 15 das, puede producirse fiebre, adenopata generalizada, leucopenia, anemia moderada, hipergammaglobulinemia moderada, hipoalbuminemia, hipocalcemia y especialmente trombocitopenia. La trombocitopenia se sucede en episodios de 3-4 das y a intervalos de 7-21 das, de ah que a la enfermedad se le haya denominado Trombocitopenia cclica
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infecciosa del perro. Los valores mnimos de plaquetas se observan en el primer episodio, siendo posible visualizar numerosas plaquetas infectadas en los frotis sanguneos. A pesar de la disminucin del nmero de plaquetas, es rara la aparicin de hemorragias espontneas, si bien se han descrito hemorragias graves tras ciruga o traumatismo intenso. Con el tiempo la trombocitopenia cclica da paso a una trombocitopenia crnica de lenta recuperacin (Harrus et al, 1997). Las cepas griega e israelita son ms agresivas y producen un cuadro caracterizado por fiebre elevada (41,5C), anorexia, apata, debilidad, palidez de mucosas y hemorragia (petequias en mucosas y lesiones hemorrgicas cutneas) (Kontos et al, 1991). En 1986, Glaze et Gaunt describieron un caso de uveitis bilateral en un perro infectado por Anaplasma platys sin presentar signo clnicos susceptibles de otras enfermedades responsables de uveitis en el perro (blastomycosis, histoplasmosis, criptococosis, toxoplasmosis, brucellosis, linfosarcoma). Coinfecciones de Anaplasma platys con otros agentes como Anaplasma phagocytophilum y Ehrlichia canis se han descrito en Tailandia, Venezuela y Espaa (Sainz et al, 1999b; Suksawat et al, 2001). Anaplasma phagocytophylum comprende actualmente las especies anteriormente denominadas como Ehrlichia phagocytophyla, Ehrlichia equi y el agente causal de la ehrlichiosis granuloctica humana. Estudios genticos determinaron la consideracin de estos tres agentes como una nica especie (Dumler et al, 2001). Este agente es capaz de infectar los leucocitos granulocticos de un gran nmero de especies diferentes como caballos, pequeos rumiantes, hombres, perros e incluso gatos (Dumler et al, 1995; Johansson et al, 1995; Engvall et al, 1996; Parola et al, 1998; Bjorsdorff, 1999a; Magnarelli, 1999; Madigan y Pusterla, 2000), produciendo ehrlichiosis granuloctica en la especie infectada. La ehrlichiosis granuloctica equina fue diagnosticada por primera vez en Suecia en 1989 (Van der Kolk, 1993). La ehrlichiosis granuloctica humana se diagnostic por vez primera en 1994 en Estados Unidos (Bakken et al, 1994).
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A. phagocytophylum se transmite principalmente por la garrapata Ixodes ricinus. Este agente est ampliamente distribuido en Europa (Pusterla et al, 1998) y en Estados Unidos (Greig et al, 1996; Magnarelli et al, 1997; Goldman et al, 1998). Los pequeos mamferos son hospedadores comunes de los estadios inmaduros de Ixodes ricinus, por lo que se sospecha que puedan ser reservorios naturales de A. phagocytophylum (Liz et al, 2000). En rumiantes, la enfermedad se caracteriza por fiebre y leucopenia severa (Taylor, 1941) debida a una linfopenia temprana y a una trombocitopenia y neutropenia prolongada con una reduccin significativa en la reactividad linfocitaria durante el periodo de rickettsiemia que predispone a otras enfermedades bacterianas y virales ms graves (Woldehiwet y Scott, 1982a; Woldehiwet y Scott, 1982b; Woldehiwet, 1987; Larsen et al, 1994; Gokce y Woldehiwet, 1999).
En quidos, la enfermedad cursa de manera semejante con
fiebre, anorexia,
depresin, edema de extremidades, trombocitopenia, leucopenia y anemia (Gribble, 1969).
La verdadera incidencia de A. phacocytophilum en perros es desconocida, sin embargo, se considera que en reas donde esta ehrlichiosis es endmica, en otras especies animales, puede representar un elevado porcentaje de la ehrlichiosis granuloctica canina (Greig et al, 1996; Magnarelli et al, 1997; Goldman et al, 1998). La enfermedad en perros cursa con sintomatologa muy inespecfica como anorexia, letargia, fiebre y trombocitopenia. No existen signos clnicos nicos atribuibles a esta ehrlichiosis y otros signos como conjuntivitis, cojeras o ataxia han sido descritos, aunque mucho menos frecuente que en la ehrlichiosis granuloctica canina producida por E. ewingii (Greig et al, 1996; Tarello, 2003). Se ha descrito una predisposicin de las hembras a padecer esta ehrlichiosis (Greig et al, 1996) en contraste con la ehrlichiosis granuloctica por E. ewingii, en la que se ha registrado una predisposicin de los machos a la enfermedad (Cohn, 2003).
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2.2.3. GNERO NEORICKETTSIA Las especies de este gnero se caracterizan porque su transmisin no se produce a travs de una garrapata vector, sino a travs de trematodos o nematodos que infestan caracoles, peces o insectos, de tal manera que la transmisin a vertebrados superiores se produce por ingestin de estos (Burg et al, 1994; Palmer y Benson, 1994; Chae et al, 2000; Pusterla et al, 2000; Madigan et al, 2000; Chae et al, 2002).
Neorickettsia risticii es el agente de la ehrlichiosis monoctica equina o fiebre de Potomac equina (Holland et al, 1985a). La infeccin se ha identificado en Estados Unidos, Canad, Uruguay, Brasil y seguramente exista en numerosos pases de Europa (Van der Kolk et al, 1993; Magnarelli y Anderson, 1993; Sainz et al, 1999a; Dutra et al, 2001). La enfermedad se caracteriza por fiebre, anorexia, edema de extremidades y sintomatologa digestiva con diarrea. La tasa de mortalidad en los caballos puede llegar al 30% (Dutra et al, 2001). Tambin se han descrito abortos asociados a esta enfermedad (Long et al, 1995 a; Long et al, 1995b).
En 1988, se demostr que los perros eran susceptibles a la infeccin experimental por este agente (Ristic et al, 1988). Posteriormente se han descrito casos de infeccin natural en perros, denominndose la enfermedad en estos ehrlichiosis canina atpica (Kakoma et al, 1991; Kakoma et al, 1994). El curso de esta patologa es muy semejante al de la ehrlichiosis canina clsica.
Neorickettsia sennetsu fue la primera ehrlichia identificada como patgena para el hombre (Misao y Kobayashi, 1955) La enfermedad producida por este agente parece estar limitada a Japn. La transmisin est ligada al consumo de pescado crudo infestado por cercarias de trematodos, por lo que los hbitos alimenticios condicionan la aparicin de la enfermedad (Fukuda y Yamamoto, 1981; Rikihisa, 1991a).
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Neorickettsia helminthoeca es la especie tipo del gnero. Este agente produce la enfermedad del envenenamiento por salmn, que ha sido reproducida experimentalmente en perros (Rikihisa et al, 1991).
En resumen, histricamente la infeccin con especies de Ehrlichia se consideraba especfica de hospedador, sin embargo, estudios recientes revelan la capacidad de una misma especie para infectar a una amplia variedad de hospedadores. Tambin, se ha observado la existencia de infecciones ehrlichiales mltiples en un mismo hospedador tanto en humanos como en perros (Breitschwerdt et al, 1998a; Meinkoth et al, 1998; Kordick et al, 1999; Sainz et al, 1999b; Suksawat et al, 2001) Pese a que en perros se ha descrito la infeccin con E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. ruminantium, A. phagocytophylum, A. platys, N. sennetsu y N. risticii, tan slo E. canis ha sido descrita como patgeno de distribucin mundial.
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Ehrlichiosis humana
2.3. EHRLICHIOSIS HUMANA
2.3.1. ETIOLOGA Y EPIDEMIOLOGA
Hacia finales del siglo XIX se comenz a comprender la importancia de las garrapatas como potenciales transmisores de enfermedades. Entre las enfermedades transmitidas por garrapatas se encuentran aquellas producidas por especies ehrlichiales. La Ehrlichiosis es el nombre genrico que reciben las enfermedades producidas por varias especies bacterianas pertenecientes a los gneros de la familia Ehrlichiaceae. Durante dcadas han sido identificados patgenos de esta familia que producan enfermedad en diferentes especies animales (perros, vacas, ovejas, cabras y caballos), as como en el hombre. Concretamente, en la actualidad se conocen 3 especies de Ehrlichia que son agentes causales de enfermedad en humanos en Estados Unidos y una especie en Japn. La ehrlichiosis humana en Estados Unidos se refiere a las enfermedades producidas por tres especies diferentes de ehrlichia: E. chaffeensis, E. ewingii y el agente de la ehrlichiosis humana granuloctica, actualmente identificado como Anaplasma phagocytophylum (Maeda et al, 1987; Bakken et al, 1994; Buller et al, 1999). Histricamente, fue en 1953 cuando se identific la primera especie de ehrlichia capaz de producir enfermedad en humanos; concretamente, fue en Japn y se trataba de Ehrlichia sennetsu, actualmente Neorickettsia sennetsu (Misao y Kobayashi, 1955). En 1981-1982 hubo un resurgimiento remarcable de casos de esta enfermedad en la misma zona, despus de varios aos de virtual ausencia. La enfermedad se ha descrito en el lejano Este y en el Sudeste asitico, y la mayora de los casos han sido descritos en el oeste de
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Japn, siendo muy rara en otras latitudes (Rapmund, 1984). En 1985 un estudio serolgico de 200 pacientes en Malasia aquejados de fiebre de origen desconocido revel que un 29% de ellos presentaban anticuerpos frente a E. sennetsu, lo que indicaba la existencia de una alta prevalencia de esta enfermedad en el Sudeste Asitico (Ristic et al, 1990). La transmisin de esta enfermedad esta relacionada con el consumo de pescado crudo infestado con parsitos portadores de la bacteria (Fukuda y Yamamoto, 1981; Rikihisa, 1991). En 1986, el estudio de las ehrlichiosis humanas sufri un espectacular avance debido a la descripcin del primer caso de ehrlichiosis monoctica humana (EMH) en los EEUU, en un paciente con sintomatologa compatible con Fiebre de las Montaas Rocosas. Este paciente fue negativo serolgicamente a Rickettsia rickettsii y dos semanas antes haba estado en Arkansas expuesto a picaduras de garrapatas. En este paciente se observaron en la fase aguda de la enfermedad inclusiones intracitoplasmticas en monocitos, cuyo estudio ultraestructural revel la existencia de pequeas bacterias cocoides compatibles con mrulas de Ehrlichia. Un anlisis serolgico frente a E. canis result ser positivo, por lo que se pens en la emergencia de una nueva zoonosis (Maeda et al, 1987). Si bien inicialmente se pensaba que el agente causal de esta nueva ehrlichiosis era E. canis, en 1990 Dawson y colaboradores consiguieron aislar al agente etiolgico de esta enfermedad de un paciente con sintomatologa leve en Fort Chaffee (Dawson et al, 1991). El agente fue caracterizado a travs de anlisis de secuencia del gen 16S rRNA y se denomin E. chaffeensis (Anderson et al, 1991). Desde entonces esta enfermedad considerada como anecdtica ha ido cobrando importancia al diagnosticarse en cada vez ms pacientes afectados por infestaciones por garrapatas, no slo en Estados Unidos sino en otras regiones del mundo. De 1985 a 1990 se examinaron 237 pacientes seropositivos a E. canis o E. chaffeensis en 21 estados de Norteamrica (Fishbein et al, 1994). Se han diagnosticado serolgicamente casos de ehrlichiosis monoctica humana (EMH) en Portugal (Morais et al, 1991), Mali (Uhaa et al, 1992), Blgica (Rikihisa, 1999) y China (Wen et al, 2003). Sin embargo, el principal vector de la enfermedad es una especie
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Ehrlichiosis humana
americana de garrapata, Amblyomma americanum, por lo que algunos autores consideran que realmente no se ha documentado ningn caso de ehrlichiosis humana por E. chaffeensis fuera de Estados Unidos (Brouqui y Dumler, 2000).
En EEUU se diagnosticaron 742 casos de ehrlichiosis monoctica humana hasta 1997 y el nmero de casos registrados anualmente ha ido en aumento (McQuiston et al, 1999; Olano et al, 2003), algunos de ellos mortales (Paddock et al, 1997). El nmero de infectados es probablemente superior al de afectados debido a la posible existencia de numerosos casos subclnicos (Rikihisa, 1999). Un estudio prospectivo de la enfermedad en Cape Girardeau, en el Sudeste de Missouri, revel una incidencia provisional de 11 casos por 100.000 habitantes en 1998 (Olano et al, 2003). Otros estudios han revelado que la EMH es incluso ms prevalente que la Fiebre de las montaas rocosas en estados como Carolina del Norte, donde sta ltima es endmica (Carpenter et al, 1999). En 1994 en el norte de Minnesota y Wisconsin se describi por primera vez una nueva entidad clnica, la ehrlichiosis granuloctica humana (EGH) a partir de seis pacientes con enfermedad febril en los que se observ, en el interior de granulocitos de sangre perifrica y en granulocitos esplnicos de una persona que muri, la existencia de mrulas intracitoplasmticas sugerentes de infeccin por Ehrlichia spp. (Bakken et al, 1994; Chen et al, 1994). Estudios sobre la secuencia de nucletidos del gen rRNA 16S de este agente causal mostraron una fuerte homologa con dos conocidos agentes de la enfermedad en Veterinaria: Ehrlichia equi, agente de la ehrlichiosis equina y Ehrlichia phagocytophila, agente de la fiebre de la garrapata en rumiantes. De hecho, en la actualidad los tres agentes han sido considerados como miembros de la misma especie que se ha pasado a denominar Anaplasma phagocytophilum (Dumler et al, 2001). Desde su aparicin en 1994, se han descrito casos de ehrlichiosis granuloctica humana en diferentes estados de Norteamrica, principalmente del medio oeste y del noreste. Aunque los datos son limitados, estudios en el norte del medio oeste sugieren una incidencia de 1 a 58 casos por cada 100.000 habitantes, (Bakken et al, 1996). Desde 1995, se ha notificado la evidencia serolgica de ehrlichiosis granuloctica humana en varios
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pases europeos como Suiza (Pusterla et al, 1999), en reas endmicas de enfermedad de Lyme por Borrelia burgdorferi. Adems, se han documentado casos de infeccin humana con especies granulocticas de Ehrlichia en Eslovenia (Petrovec et al, 1997; Lotric-Furlan et al, 2001), Holanda (Van Dobbenburgh et al, 1999) y Suecia (Bjorsdorff et al, 1999a). Hasta la fecha ms de 600 pacientes con EGH han sido identificados en USA y Europa (Gewirtz et al, 1996; Foley et al, 1999; McQuiston et al, 1999; Bakken y Dumler, 2000). En Agosto de 1999 un caso de EGH fue descrito en el Hospital de la Rioja en nuestro pas (Oteo et al, 2000).
Un estudio retrospectivo reciente seala que se dan el doble de casos de ehrlichiosis granuloctica humana que de ehrlichiosis monoctica humana, casos de otras ehrlichiosis son prcticamente anecdticos (Gardner et al, 2003)
Recientemente se ha descrito la infeccin por Ehrlichia ewingii, el agente etiolgico de la ehrlichiosis canina granuloctica, en el hombre, presentndose la mayora de los casos descritos en pacientes con inmunodeficiencia. (Buller et al, 1999; Paddock et al, 2001). La enfermedad se caracteriza por un cuadro febril que cursa con dolor de cabeza, mialgias y trombocitopenia. En 1990 se observ que los monocitos humanos son susceptibles de infeccin por E. canis, por lo que se considero posible la infeccin de personas por E. canis (Ristic et al, 1990). Con posterioridad, E. canis se ha aislado de una persona sana, un veterinario en Venezuela (Prez et al, 1996), comprobndose genticamente la identidad de esta ehrlichia (Unver et al, 2001). En 1999, se describe la existencia de infeccin en un humano por un agente similar a E. platys (Arraga-Alvarado et al, 1999).
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Ehrlichiosis humana
Tambin se han descrito coinfecciones de ehrlichiosis monoctica humana con babesiosis y borreliosis (Magnarelli et al, 1998; Javed et al, 2001).
2.3.2 CUADRO CLNICO El cuadro clnico de la ehrlichiosis humana es bastante inespecfico y se caracteriza por fiebre, malestar general, cefalea, mialgias, nauseas y anorexia (Peterson et al, 1989; Eng et al, 1990; Ristic, 1990). Posteriormente aparece linfadenopata y en un 30% de los casos se describen erupciones cutneas y sintomatologa digestiva. Tambin se pueden observar cuadros neurolgicos y respiratorios segn la gravedad del proceso (Harkess et al, 1989; Eng et al, 1990; Rohrbach et al, 1990; Harkess, 1991; Bakken y Dumler, 2000). A nivel laboratorial se observa trombocitopenia, leucopenia y anemia (Pearce et al, 1988; Eng et al, 1990; Bakken et al, 1996). El cuadro clnico y lesional es muy semejante al observado en el curso de la ehrlichiosis canina. Independientemente de la especie causante de la ehrlichiosis, el cuadro clnico puede variar de asintomtico a fatal. Sin embargo, se debe reconocer que la ehrlichiosis monoctica humana causada por E. chaffeensis es la ms grave (Maeda et al, 1987; Fichtenbaum et al, 1993; Fishbein et al, 1994; Paddok y Childs, 2003). Esta enfermedad se ha asociado con sndrome de dificultad respiratoria grave en adultos y meningoencefalitis incluso en pacientes inmunocompetentes (Ratnasamy et al, 1996; Vugia et al, 1996; Weaver et al, 1999; Patel et al, 1999), si bien es en pacientes con la inmunidad comprometida donde la enfermedad es mucho ms grave, incluso mortal (Manian et al, 1989; Paddock et al, 1993; Marty et al, 1995; Anthony et al, 1995; Sadikot et al, 1999). E. ewingii ha sido asociada con enfermedad principalmente en personas inmunodeprimidas (Buller et al, 1999). Mientras que la ehrlichiosis granuloctica humana producida por A. phagocytophilum suele causar una enfermedad ms leve.
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En resumen, se ha podido constatar la infeccin en humanos con, al menos, 5 especies diferentes de Ehrlichia: Anaplasma phagocytophilum, E. ewingii, E. chaffeensis, E. canis y Neorickettsia sennetsu. (Everett et al, 1994; Fishbein et al, 1994; Bakken et al, 1996; Buller et al, 1999; Winslow et al, 2000; Olano et al, 2003).
2.3.3. CONCURRENCIAS La presentacin de enfermedades concomitantes, principalmente enfermedades que inmunocomprometen al individuo, en personas previamente infectadas por Ehrlichia spp. pueden generar la aparicin del cuadro clnico o acrecentar la gravedad del mismo. As, desde la primera descripcin del SIDA en humanos se han ido incrementando los casos de personas afectadas por esta enfermedad en las que otras infecciones concomitantes hacen estragos. La primera concurrencia entre infeccin por SIDA y E. chaffeensis fue descrita en 1993, otras descripciones posteriores han sido espordicas (Paddock et al, 1993; Martin et al, 1999). En personas infectadas con el virus del SIDA la infeccin por E. chaffeensis suele ser mortal (Paddock et al, 1993; Paddock et al, 1997; Martin et al, 1999). Entre 1992 y 2000, 21 pacientes con SIDA fueron diagnosticados de ehrlichiosis, 17 de ellos en los EEUU entre 1997 y 2000 (Paddock, 2001), 20 individuos (95%) eran hombres con una edad media 31-56 aos. El diagnstico de la ehrlichiosis en personas infectadas por SIDA se ve dificultado por la similitud del cuadro clnico de ehrlichiosis con la sintomatologa propia de las complicaciones de la enfermedad. En la poblacin infectada exclusivamente por SIDA es frecuente encontrar alteraciones hematolgicas como citopenias, lo que supone que los hallazgos hematolgicos, considerados significativos de ehrlichiosis en la poblacin normal, sean ms sutiles y ms sujetos a confusin en los individuos afectados por el SIDA (Perkocha y Rodgers, 1988; Sloand et al, 1992; Everett et al, 1994) Tambin se han diagnosticado infecciones concurrentes de HGE y otras enfermedades transmitidas por garrapatas como la enfermedad de Lyme (Bakken et al, 1996; Nadelman et al, 1997), aunque el nmero de casos es reducido. El agente causal de
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Ehrlichiosis humana
la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi, comparte el mismo vector en Europa y en los EEUU (Ostfeld, 1997) que Anaplasma phagocytophilum: las garrapatas del gnero Ixodes (Bakken et al, 1994; Reed et al, 1995; Telford et al, 1996; Schwartz et al, 1997). Debido a ello, parece lgico que las reas geogrficas donde se ha descrito la EGH se corresponden estrechamente con las zonas endmicas de enfermedad de Lyme (Centers of disease control and Prevention, 1996; Dumler et al, 1995; Kitron et al, 1997). En resumen, la existencia de infecciones en humanos por ehrlichias consideradas anteriormente exclusivas de animales, la presencia en la mayora de los casos de infecciones subclnicas, el desarrollo de enfermedad grave, incluso mortal, en individuos inmunodeprimidos y el auge de enfermedades y tratamientos que contribuyen a la inmunosupresin del individuo (SIDA, tratamientos quimioterpicos), hacen de estas enfermedades, hasta hace unos aos consideradas anecdticas un importante objeto de estudio.
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2.4. EHRLICHIOSIS EN ESPAA
La primera descripcin bibliogrfica de ehrlichiosis canina en Espaa data de 1988 y fue realizada en Catalua (Font et al, 1988). Desde entonces y de forma especial en estos ltimos aos, esta enfermedad ha sido diagnosticada de un modo rutinario por los clnicos veterinarios de toda Espaa. Distintos estudios sealan que la presencia de garrapatas es un factor predisponente para el desarrollo de infeccin por Ehrlichia spp. (Nims et al 1971; Botros et al 1995). A lo largo de la geografa espaola se pueden encontrar Rhipicephalus spp, Ixodes spp. y Dermacentor spp (Estrada, 1994). La ehrlichiosis canina est extendida por la prctica totalidad del territorio nacional, hecho que se puede deber a que la garrapata ms ubicua y frecuente del territorio espaol es precisamente el vector de E. canis, Rhipicephalus sanguineus, la cual en muchos reas es la nica existente (Cordero del Campillo, 1980; Herrero et al, 1992; Olmeda et al, 1993; Prieto et al, 1999). Los estudios epidemiolgicos realizados hasta el momento son escasos si bien todos ellos revelan una importante seroprevalencia en las distintas reas analizadas. En la Comunidad de Madrid, la prevalencia es del 6,5% (Sainz et al, 1998a). En Castilla-Len, posiblemente como consecuencia del hbitat, la prevalencia es mayor, 19,2% y variable dependiendo de las provincias (Sainz et al, 1996). En Valencia la tasa de prevalencia segn un estudio del ao 2000, se sita en el 13,7% (Gonzlez et al, 2000). En la isla de Gran Canaria se han diagnosticado casos autctonos, estando la prevalencia en aproximadamente un 2% (Sainz, 1998b). Estas prevalencias varan de las zonas rurales y
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Ehrlichiosis en Espaa
periurbanas a las urbanas, en general se encuentra una mayor prevalencia en reas rurales debido a un mayor contacto de los animales con garrapatas (Sainz et al, 1995; Tesouro y Sainz, 2001) Por otro lado, la mayor o menor exposicin al vector tambin parece influir en la prevalencia de la enfermedad. As, Sainz et al en 1995 encuentran una prevalencia de un 66.7% en una jaura de perros de caza con infestacin masiva por garrapatas en la comunidad de Madrid, mientras que en una poblacin de perros polica con un programa profilctico intensivo que dificultaba la presencia de garrapatas encontraron un prevalencia de tan slo un 2.29%. Adems de E. canis, en los ltimos aos se vienen detectando la presencia de mrulas intraplaquetarias compatibles con E. platys (hoy, A. platys) en sangre de perros de nuestro pas. Por tcnicas serolgicas como la inmunofluorescencia indirecta y el Westerblot se ha confirmado la presencia de anticuerpos anti-A. platys en perros de Espaa (Sainz et al, 1999b). En relacin con la posible patogenicidad de este agente en Espaa, perros seropositivos a A. platys no tratados no han desarrollado signos de enfermedad compatible con ehrlichiosis (Sainz et al, 1999b). No obstante, recientemente se ha conseguido identificar y caracterizar genticamente este agente en un perro con sintomatologa clnica de ehrlichiosis (Aguirre et al, 2004a) Tambin parece ser frecuente la presencia conjunta de E. canis y A. platys en el mismo perro. De hecho, un estudio serolgico realizado sobre un total de 47 sueros de perros con trombocitopenia residentes en Espaa ha mostrado que 15 de ellos eran positivos slo a E. canis, 6 slo a A. platys y 10 a ambas especies, por lo que la presencia de E. platys en Espaa parece ser ms importante de lo que en principio se crea (Sainz et al, 1999b).
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Adems, se han detectado en sangre de perro anticuerpos frente a otras especies ehrlichiales como E. ewingii, N. risticii y A. phagocytophilum (Sainz et al, 1999a; Morales, 2000; Sainz et al, 2000b; Aguirre et al, 2003) Por otro lado, se han observado concurrencia de ehrlichiosis con otras infecciones. La leishmaniosis canina es la patologa que ms frecuentemente se encuentra asociada a ehrlichiosis en nuestro pas. As, en perros diagnosticados de leishmaniosis y tratados especficamente frente a ella, cuando la respuesta teraputica no es suficientemente buena y el proteinograma no termina de normalizarse, se debe descartar la presencia de ehrlichiosis (Sainz et al, 1999b). Tampoco es raro, debido a la coincidencia de vectores encontrar perros con ehrlichiosis y babesiosis y/o hepatozoonosis (Sainz et al, 1999b; Prieto, 2003) En cuanto a la ehrlichiosis felina en Espaa, diferentes estudios serolgicos han mostrado la presencia en gatos de anticuerpos frente a diferentes especies de Ehrlichia (Tesouro et al, 1998; Aguirre et al, 2004b), si bien en ningn caso el anlisis mediante PCR ha arrojado resultados positivos (Aguirre et al, 2004b). En rumiantes, tambin se han descrito infecciones por
Anaplasma
phagocytophylum, concretamente en ovejas y vacas en el norte de Espaa (Juste et al, 1989; Garcia-Prez et al, 2003) En cuanto a la posible existencia de ehrlichiosis humana en nuestro pas, la informacin clnica se limita a la descripcin de un caso de ehrlichiosis monoctica humana en Soria (Saz et al, 1994) y otro de ehrlichiosis granuloctica humana descrito en el Hospital de la Rioja en agosto de 1999 (Oteo et al, 2000; Oteo et al, 2001).
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Transmisin por garrapatas
2.5. TRANSMISIN POR GARRAPATAS DE LAS EHRLICHIOSIS HUMANAS Y ANIMALES
Como ya ha sido sealado, la ehrlichiosis o enfermedad ehrlichial comprende las enfermedades producidas en animales superiores por agentes infecciosos pertenecientes a los gneros Ehrlichia, Anaplasma y Neorrickettsia. La transmisin de estos agentes se produce a travs de agentes vectores, garrapatas en el caso de Ehrlichia y Anaplasma y nematodos y trematodos en el caso de Neorricketsia. Las garrapatas son parsitos externos pertenecientes taxonmicamente al suborden Metastigmata, orden Parasitiformes, subclase Acari, clase Arachnida, subphylum Chelicerata, phylum Artropoda. Existen dos familias: Ixodidae o garrapatas duras y Argasidae o garrapatas blandas (Hoskins y Cupp, 1988; Cupp, 1991). Las garrapatas son uno de los principales grupos de artrpodos que afectan la salud animal, ejerciendo una accin patgena directa, derivada de su efecto expoliatriz, mecnico y txico, (Murnaghan y ORourke, 1978; Quiroz, 1984) y una accin patgena indirecta, derivada de su capacidad de vehiculizar agentes patgenos (Hoogstraal, 1985). Cuando las garrapatas vehiculizan agentes patgenos con potencial zoontico, la salud humana tambin se encuentra involucrada (Hoogstraal, 1977). Se considera que las garrapatas estn slo por detrs de los mosquitos como vectores de enfermedades humanas en el mundo (Parola y Raoult, 2001). Uno de los principales grupos de agentes patgenos, de conocido potencial zoontico, de los que las garrapatas son vectores son los agentes
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ehrlichiales. Siendo las garrapatas de la familia Ixodiade las principalmente relacionadas con la transmisin de estas enfermedades (Kidd y Breitschwerdt, 2003). Las garrapatas se encuentran distribuidas mundialmente aunque existe una distribucin geogrfica particular para cada una de las especies, a su vez cada especie de garrapata es vector de diferentes agentes patgenos. La existencia de las enfermedades transmitidas por garrapatas en un rea geogrfica est condicionada a la existencia de la garrapata vector. La identificacin de las especies de garrapatas es un factor importante en la deteccin y diagnstico de las enfermedades transmitidas por garrapatas y es un prerrequisito para su control y posible erradicacin (Cupp, 1991). Rhipicephalus sanguineus o garrapata marrn del perro se encuentra distribuida mundialmente, es vector entre otros agentes de Ehrlichia canis y Anaplasma platys, por ello la ehrlichiosis canina es una enfermedad de distribucin mundial. Las garrapatas vectores de Ehrlichia ruminantium pertenecen a diversas especies de Amblyoma que slo se encuentran en frica, de ah que la enfermedad del corazn de agua de los rumiantes se encuentre limitada a ese rea geogrfica (Bezuidenhout, 1987; Walker y Olwage, 1987; Camus y Barre, 1987; Deem, 1998). Ehrlichia ewingii y E. chaffeensis son transmitidas por Amblyomma americana, garrapata originaria del continente americano (Anziani et al, 1991; Murphy et al, 1998). Ixodes ricinus es la garrapata vector de Anaplasma phagocytophilum distribuida tanto en el continente americano como el europeo (Cupp, 1991). Las garrapatas son ectoparsitos hematfagos obligados, cada uno de sus estadios evolutivos necesitan sangre como fuente nutritiva y en los adultos es necesaria para la produccin de esperma y huevos (Cupp, 1991). Las garrapatas presentan cuatro estados evolutivos en su ciclo vital: huevo, larva hexpoda, ninfa octpoda y adulto, las dos ltimas son las ms importantes como vectores de enfermedad (Kidd y Breitschwerdt, 2003). La transformacin entre un estado evolutivo y otro requiere de una o ms mudas y puede necesitar de uno, dos o ms huspedes, esto tiene su importancia a la hora de su funcin como vector de enfermedades.
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Las garrapatas inciden la piel del hospedador con el par de quelceros y posteriormente insertan el hipostoma en la herida y lo hacen penetrar en la piel hasta llegar a los capilares sanguneos que laceran produciendo un pequeo hematoma desde el que se alimentan (Cupp, 1991). El anclaje de la garrapata al hospedador depende de sus partes bucales, stas son ms o menos grandes dependiendo de la especie, en general las garrapatas con partes bucales ms pequeas producen una sustancia cementante que ancla estrechamente la garrapata al hospedador (Binnington y Kemp, 1980). Las garrapatas inyectan secreciones salivares que contienen sustancias que ayudan a penetrar en la piel del husped adems de alterar localmente la hemostasia y producir una reaccin inflamatoria local que facilita la nutricin de la garrapata desde la lesin producida (Tatchell y Moorhouse, 1970; Balashov, 1972; Ribeiro et al, 1985; Ribeiro, 1987). Algunas garrapatas pueden inocular componentes txicos como el responsable de la parlisis flcida (Gothe et al, 1979; Stone, 1988; Stone et al, 1989). Tambin es a travs de la saliva como las garrapatas inoculan agentes patgenos al hospedador. La accin quimiotctica de las secreciones salivares, atrae a la zona clulas inflamatorias factibles de ser infectadas por los patgenos inoculados (Berenberg et al, 1972), y puede producir una inmunosupresin local que facilitara el establecimiento de los patgenos transmitidos en el hospedador (Kopecky et al, 1999). La garrapata ingresa los patgenos en su organismo al alimentarse de un hospedador infectado, stos llegan al epitelio intestinal y penetran en la cavidad corporal de la garrapata (el hemocele) acompaados del agua y de los iones en exceso que son aprovechados por las glndulas salivares para formar la saliva que ser de nuevo inoculada, en ese o en otro hospedador, permitiendo la transmisin de los agentes infecciosos ingeridos con la comida (Tatchell, 1967; Tatchell, 1969; Sauer et al, 1986). Existe una transmisin transestadial de los patgenos vehiculizados por las garrapatas, de tal manera que una infeccin adquirida en el estadio de ninfa se mantendr hasta el adulto, pudiendo infectar a ms de un husped a lo largo de su desarrollo (Cupp,
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1991). La transmisin transovrica, desde la garrapata hembra a su progenie, no parece jugar un papel importante en la transmisin natural de las enfermedades ehrlichiales. As, mientras Donatien y Lestoquard en 1937 indicaban la existencia de transmisin transestadial y transovrica de E. canis en R. sanguineus, estudios posteriores demuestran que la transmisin es exclusivamente transestadial (Groves et al, 1975; Smith et al, 1976). Los gneros de garrapatas de la familia Ixodidae de mayor importancia mdica, por su capacidad de transmisin de patgenos, son: Rhipicephalus, Dermacentor, Ixodes, Boophilus, Amblyoma y Haemaphysalis. El espectro de hospedadores suele ser amplio, no estando limitado a un hospedador especfico, aunque suelen existir preferencias. Esta caracterstica y la transmisin transestadial de patgenos, determinan la posibilidad de transmisin de la enfermedad entre distintas especies (Hoskins, 1991). Las garrapatas son longevas y son capaces de mantenerse vivas, sin alimentarse, por periodos prolongados en cualquiera de sus estadios de desarrollo. En general el desarrollo de las garrapatas viene favorecido por climas clidos, ya que no son capaces de soportar condiciones extremas de fro o humedad, sin embargo pueden buscar proteccin en casas, madrigueras, perreras, etc., pudiendo sobrevivir en climas fros (Kidd y Breitschwerdt, 2003). La longevidad de las garrapatas, su potencial reproductivo y la posible transmisin transovrica de algunos patgenos hace que las garrapatas no slo puedan actuar como vectores de enfermedades, sino tambin como reservorios de patgenos. (Cupp, 1991). La ehrlichiosis canina es una enfermedad de distribucin mundial acorde a la distribucin de su vector: Rhipicephalus sanguineus (Cordero del Campillo, 1980; Hoskins, 1991). Esta garrapata es adems capaz de vehiculizar otros agentes patgenos como: Ehrlichia platys, Hepatozoon canis, Anaplasma phagocytophylum, Babesia canis y Haemobartonella canis, por lo que no es raro encontrar ms de una enfermedad asociada
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en el mismo animal (Hoskins y Cupp, 1988; Woody y Hoskins, 1991; Simpson et al, 1991; Breitschwerdt, 2002). Rhipicephalus sanguineus es tambin capaz de producir enfermedad paralizante en perros. En el perro las garrapatas adultas se encuentran fundamentalmente en las orejas, a lo largo de la nuca y en los espacios interdigitales. Las larvas y ninfas se suelen encontrar en las reas de pelo largo del cuello y en infecciones masivas se pueden encontrar todos los estadios evolutivos en la mayora de las regiones corporales (Hoskins, 1991). Rhipicephalus sanguineus es una garrapata de tres hospedadores, en zonas tropicales y subtropicales, la garrapata se puede encontrar durante todo el ao. En climas mediterrneos su actividad se inicia en primavera perdurando hasta el otoo. En invierno no se encuentran sobre los animales y en clima fro no son capaces de sobrevivir, sin embargo pueden encontrar refugio en casas, pajares, perreras, lo que les permite su supervivencia (Cupp, 1991). Los adultos de R. sanguineus son capaces de sobrevivir sin alimentarse hasta 568 das y pueden transmitir E. canis hasta 155 das tras haberla ingerido (Lewis et al, 1977), lo que nos muestra su gran potencial, aunque no exista transmisin transovrica del patgeno, tanto como vector tanto como reservorio (Woody y Hoskins, 1991). Por ello, el control de las poblaciones de garrapatas sobre el animal y el medio ambiente es fundamental en la lucha y prevencin de las enfermedades ehrlichiales (Keefe et al, 1982, Garris, 1991). En Espaa se encuentran las siguientes especies de garrapatas: Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor reticulatus, Rhipicephalus turanicus, Ixodes ricinus, Ixodes hexagonus (Estrada, 2003a; Estrada, 2003b).
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Dermacentor reticulatus predomina en las zonas hmedas y frescas del norte peninsular, mientras que Rhipicephalus sanguineus prefiere un ambiente ms clido que encuentra en el resto del territorio espaol (Estrada-Pea, 2003a). En las zonas Mediterrneas y del interior las infestaciones por garrapatas (R. sanguineus) tienen un ciclo de actividad primaveral y estival. Mientras que existe una amplia franja que abarca toda la cornisa Cantbrica, Galicia, Navarra y parte del norte de Castilla en que se aprecia un incremento de las infestaciones por garrapatas en periodo invernal (D. reticulatus). Poblaciones de Ixodes ricinus se encuentran en el norte de Espaa, manifestando una actividad uni o bimodal en distintas reas segn las condiciones ambientales. Esta garrapata prefiere reas de elevacin media con veranos templados y con lluvia de moderada a elevada a lo largo del ao, por lo que su principal rea geogrfica es el norte de Espaa, estando ampliamente distribuida en el Pas Vasco (Moreno y Estrada-Pea, 1997; Estrada-Pea, 2001)
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Inmunopatogenia
2.6. INMUNOPATOGENIA
El cuadro clnico y las lesiones generadas en el curso de la ehrlichiosis son consecuencia directa tanto de la propia infeccin bacteriana, como de la respuesta inmune desencadenada por el hospedador. La excesiva produccin de anticuerpos en presencia de una respuesta celular disminuida tiene un papel fundamental en la patogenia de la enfermedad (Burghen et al, 1971; Reardon y Pierce, 1981; Harrus et al, 1999). Con el fin de facilitar la comprensin de la patogenia de la enfermedad, claramente definida por la respuesta inmune inducida en el organismo hospedador, realizaremos una breve descripcin de cada uno de los mecanismos del sistema inmune de los animales superiores y su influencia en la resistencia frente a la infeccin por organismos ehrlichiales. Todo organismo animal est provisto de mecanismos defensivos frente a las agresiones por patgenos externos y el sistema inmune es el encargado de su puesta en marcha. Aunque, todos los mecanismos inmunolgicos estn estrechamente relacionados se puede hablar de dos tipos de inmunidad: la inmunidad innata y la inmunidad adquirida. La inmunidad innata se corresponde con aquellos mecanismos desencadenados de manera intrnseca una vez que el agente patgeno entra en contacto con el organismo. Se trata de mecanismos inespecficos que no requieren la identificacin del patgeno. Si el agente patgeno no es destruido por estos mecanismos, se desarrollan otros ms sofisticados y especficos para la destruccin del agente. Estos ltimos constituyen la
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llamada inmunidad adquirida que necesita de un contacto previo con el patgeno para su puesta en marcha (Roitt, 1998a).
2.6.1. INMUNIDAD INNATA Los mecanismos defensivos desarrollados por la inmunidad innata son: la fagocitosis, el sistema del complemento, las clulas natural killer (NK) y las citoquinas. A continuacin se revisarn diferentes aspectos de la importancia de estos mecanismos en la infeccin por Ehrlichia spp. La fagocitosis consiste en la ingestin y destruccin de agentes patgenos o de clulas infectadas o degeneradas y la realizan clulas especializadas que forman parte del llamado sistema fagocitario. El sistema fagocitario est formado por los polimorfonucleares neutrfilos (PMN) y por las clulas del sistema mononuclear fagocitario (SMF). Las clulas del SMF derivan de los promielocitos de la mdula sea que tras su diferenciacin en monocitos sanguneos se asientan en los tejidos como macrfagos maduros. (Roitt, 1998a) Para activarse el mecanismo de la fagocitosis, es necesario que el patgeno entre en contacto con la clula y se adhiera a su superficie. Para ello existen protenas de superficie que actan como receptores celulares para los ligandos bacterianos de Ehrlichia spp. (Messick y Rikihisa, 1993). Uno de los receptores de adherencia ms importante es el complemento receptor tipo III (CR3: CD11b/CD18) que promueve, entre otros mecanismos, la fagocitosis y la combustin respiratoria (Dib, 2000). Tanto el Interferon-gamma (IFN-), como la integrina 2: CD11b/CD18 median la activacin celular y parece ser que juegan un papel fundamental en la eliminacin de la infeccin al limitar la replicacin ehrlichial (Borjesson et al, 2002).
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Inmunopatogenia
La adhesin bacteriana produce una activacin de la membrana celular y se inicia la fagocitosis con la formacin de un fagosoma en el que se internaliza el agente bacteriano. Los lisosomas celulares, vacuolas celulares en cuyo interior se encuentran una gran variedad de enzimas y molculas antimicrobianas preformadas, se fusionan al fagosoma y se produce la digestin del patgeno (Roitt, 1998a). La destruccin de la clula fagocitaria provocara la liberacin de agentes bacterianos, enzimas lisosmicas y metabolitos txicos capaces de producir una destruccin tisular crnica con inflamacin. Las Ehrlichias son bacterias cocoides, Gram negativas, de vida intracelular obligada con tropismo, segn la especie implicada, por monocitos/macrfagos o granulocitos, pero no por ambas clulas a la vez (Rikihisa, 1991a). Las bacterias intracelulares obligadas, como Ehrlichia spp., necesitan para sobrevivir, ser internalizadas por clulas; por ello, no slo han desarrollado mecanismos defensivos que eviten su destruccin en el interior de las clulas sino tambin, y de manera paradjica, mecanismos que estimulan el proceso de fagocitosis. Estas bacterias son capaces de replicarse en el interior de fagosomas del citoplasma de las clulas infectadas (Rikihisa 1991a). Las Ehrlichias pierden su capacidad infectiva a las horas de hacerse extracelulares (Park and Rikihisa 1991); es por ello que, al contrario que otros patgenos, estas bacterias desarrollan propiedades que les facilitan la penetracin al interior de las clulas, favoreciendo la fagocitosis. La patogenia de la enfermedad est relacionada con la habilidad del organismo de replicarse en el interior de los macrfagos (Park y Rikihisa, 1991). Una vez favorecida la fagocitosis, el siguiente objetivo de la ehrlichia, para sobrevivir y multiplicarse, es evitar la fusin de los lisosomas al fagosoma de inclusin (Wells y Rikihisa, 1988; Petrovec, 1997; Gokce y Woldehiwet, 1999). Si el hospedador es capaz de inhibir la actividad metablica ehrlichial, se producir la fusin de los lisosomas con la membrana de inclusin ehrlichial (Messick y Rikihisa, 1994) y la destruccin de la bacteria. El tratamiento con oxitetraciclinas se basa en este efecto, es decir, en destruir a la bacteria al favorecer esta fusin (Wells y Rikihisa 1988).
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La infeccin por Ehrlichia spp. se produce tras la picadura del hospedador por una garrapata hematfaga. La propia picadura provoca inflamacin y liberacin de mediadores qumicos que, a su vez, producen una quimiotaxis positiva de clulas inflamatorias. Este efecto inflamatorio favorece la infeccin por Ehrlichia spp., ya que cuanto mayor sea el nmero de granulocitos o monocitos/macrfagos en el punto de inoculacin, mayor probabilidad de infectar estas clulas (Theis y Budwiser, 1997; Rikihisa, 1991). Tras un periodo de incubacin que, segn diversos estudios, puede variar de ocho a veinte das (Ewing y Buckner, 1965; Hibler et al, 1986), se produce la diseminacin de los agentes ehrlichiales por la circulacin sangunea y linftica (Huxsoll et al, 1970; Buhles et al, 1974). El potencial patognico del organismo se ve favorecido por la movilidad de los macrfagos que pueden diseminar la infeccin por todo el organismo. Las inclusiones ehrlichiales intracitoplasmticas se suelen observar en sangre durante 2 semanas, aunque en algunos animales se pueden ver hasta 52 das post-infeccin (Whist et al, 2002). Debido a que las ehrlichias son cocos muy pequeos y adems son muy pocos los organismos fagocitados por cada macrfago (Park y Rikihisa, 1991), el nmero de clulas infectadas que presentan inclusiones ehrlichiales, al microscopio ptico, es menor de un 10% (Bakken et al, 1996). Sin embargo, se ha comprobado in vitro que, a las 3 horas de la infeccin, prcticamente el 100% de los macrfagos son positivos a antgenos de Ehrlichia risticii en su citoplasma. En 48 horas los antgenos desaparecan en un 50-70% de las clulas, volviendo a aparecer nuevamente en el 100% de las clulas a los 4-6 das postinfeccin (Messick y Rikihisa, 1993) A la vista de los resultados, los autores plantearon tres hiptesis: 1) Se desarrollan ehrlichias viables, no viables y restos ehrlichiales. Todo ello es fagocitado, si bien slo las ehrlichias viables evitan la fusin fagosoma-lisosoma y entran en multiplicacin; el resto de antgenos erhlichiales son digeridos por las enzimas lisosomales y desaparecen.
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2) Las ehrlichias, como las clamidias (Moulder, 1991), presentan formas infectivas y replicativas; ambas formas son fagocitadas, pero slo una es capaz de sobrevivir y replicarse en los macrfagos. 3) Las clulas son inicialmente capaces de matar las ehrlichias viables, pero luego son agotadas por la infeccin. Finalmente los autores consideraron como ms probable la primera hiptesis. La elaboracin de radicales libres de oxgeno y de nitrgeno es otro de los mecanismos a travs del cual los macrfagos o clulas fagocitarias son capaces de destruir agentes infecciosos. Los patgenos intracelulares desarrollan mecanismos para contrarrestar los efectos de estos radicales, posibilitando su supervivencia en los macrfagos. Se ha demostrado experimentalmente que N. risticii puede penetrar en los macrfagos sin estimular una combustin respiratoria (Williams et al, 1994); sin embargo, en caso de exposicin previa al agente s se estimula este proceso de combustin (Williams et al, 1994). De este modo, la produccin de una respuesta especfica puede eliminar la infeccin por N. risticii siendo este fenmeno mediado por los radicales libres de oxgeno producidos por los macrfagos (Williams et al, 1994). Otros estudios demuestran que la infeccin con A. phagocytophilum produce una disminucin de la combustin respiratoria que perdura aproximadamente 3 semanas (Batungbacal, 1995; Banerjee et al, 2000; Whist et al, 2002). La combustin oxidativa necesita para su funcin la activacin de la integrina 2 (CD11b/CD18), relacionada con la destruccin intracelular y la eliminacin de la infeccin (Berton et al, 1996; Dib, 2000). En infecciones experimentales, la falta de clulas CD11b/CD18 permite la replicacin de las ehrlichias (Borjesson et al, 2002), lo que sugiere la importancia de este mecanismo en la patogenia de la enfermedad.
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Este bloqueo de la unin de fagosomalisosoma como de la combustin respiratoria, que tiene lugar en el curso de la ehrlichiosis, se produce tan slo frente a Ehrlichias spp., es decir, estos mecanismos funcionan correctamente frente a otros agentes que pudieran estar infectando simultneamente al mismo animal (Lilliehk et al, 1999). El sistema del complemento participa en la inmunidad innata favoreciendo que las clulas fagocitarias se aproximen a las bacterias. El complemento es un sistema complejo que media la respuesta innata a travs de una cascada de reacciones enzimticas cuyo fin ltimo es la lesin de la membrana celular externa y la lisis de la clula diana. Son escasos los estudios al respecto, si bien parece ser que el sistema del complemento no es fundamental en la resistencia frente a infecciones por Ehrlichia spp. (Feng y Walker, 2004) Las clulas natural Killer (NK) son linfocitos granulares grandes (LGG) que reconocen glucoprotenas de alto peso molecular presentes en la superficie de clulas infectadas y ejercen su accin defensiva induciendo la apoptosis de la clula diana. Se trata de una accin citotxica producida de manera innata. Las clulas NK son linfocitos no T, no B que tambin intervienen en la inmunidad adquirida de tipo celular (McDonough y Moore, 2000). Producen IFN- que participa en la activacin de los macrfagos (Park y Rikihisa, 1992) y las clulas NK presentes en hgado tambin contribuyen a respuestas antivirales, tumoricidas e inflamatorias patognicas (Wiltrout, 2000). Todas las clulas implicadas en el proceso infeccioso son capaces de secretar sustancias que intervienen activamente en los procesos inmunes. Estas sustancias se denominan citoquinas y son importantes mediadores de la activacin leucocitaria y de la quimiotaxis en numerosas condiciones infecciosas e inflamatorias, compartiendo la habilidad de activar y de dirigir la migracin de los diferentes tipos de leucocitos (Charley y Blecha, 1991; Roitt, 1998a). El Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-) combinado con el IFN-, producido por los linfocitos T y las clulas NK, son indispensables en la proteccin frente a infecciones ehrlichiales (Akkonyulu y Fikrig, 2000; Feng y Walker, 2004).
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En casos de ehrlichiosis crnica, la presencia de Ehrlichia spp. en los macrfagos puede modular la respuesta inflamatoria a travs de citoquinas que potencialmente causaran efectos perjudiciales al hospedador, habindose sugerido que mucha de la sintomatologa de la ehrlichiosis es ms bien debida a la perturbacin de los macrfagos que a los efectos directos de Ehrlichia spp. (Rikihisa et al 1985). Las citoquinas pueden tener un importante papel patognico en la infeccin por Ehrlichia spp. (Klein et al, 2000). Se ha demostrado que las clulas infectadas por el agente de la ehrlichiosis granuloctica humana, producen citoquinas que actan como potentes inhibidores de la proliferacin de clulas madre de la mdula sea y pueden contribuir a las citopenias observadas en el curso de la infeccin (Broxmeyer et al, 1990; Adams y Lloyd, 1997; Klein et al, 2000). Adems, las ehrlichias son capaces de reducir la produccin de citoquinas de tipo inflamatorio (interleuquina 1 (IL-1), interleuquina 6 (IL-6) y TNF-) y de aumentar la produccin de citoquinas de tipo supresor: (acrophage Inflamatory Protein (MIP-1), Monocyte Chemotactic Protein (MCP-1) e Interleuquina 8 (IL-8)) (Mansueto et al, 1997; Klein et al, 2000).
2.6.2. INMUNIDAD ADQUIRIDA Hemos descrito anteriormente cmo Ehrlichia spp. sobrevive en el interior de las clulas fagocitarias al alterar los mecanismos destructores innatos de estas clulas. Sin embargo, las clulas fagocitarias son capaces de procesar pequeos fragmentos antignicos y colocarlos en la superficie de la clula hospedadora (Charley y Blecha, 1991). Esto permite su interaccin con clulas encargadas de la inmunidad adquirida, que representan la inmunidad especfica frente a Ehrlichia spp. Existen dos tipos de inmunidad adquirida: la inmunidad humoral y la inmunidad celular.
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2.6.2.1 Inmunidad humoral La inmunidad humoral est mediada por linfocitos B, llamados as porque se diferencian en la mdula sea (en ingls, bone marrow) (Roitt, 1998a). Estos linfocitos elaboran unas molculas tetrapeptdicas formadas por dos cadenas pesadas y dos ligeras denominadas anticuerpos. De manera bsica podramos representar a los anticuerpos como una estructura espacial de tres brazos, en forma de Y. Cada uno de estos brazos actan como regiones principales, dos de ellas capaces de comunicarse con el sistema del complemento y los fagocitos (funciones biolgicas) y otra capaz de reconocer y fijarse a un microorganismo individual (funcin de reconocimiento externo). Cada anticuerpo es especfico para un antgeno, necesitando una porcin de reconocimiento especial, mientras que las regiones de funcin biolgica pueden mantenerse constantes (Roitt, 1998b). Cada linfocito B est programado para elaborar un nico tipo de anticuerpo, que coloca en su superficie externa para que acte como receptor. Cuando un antgeno penetra en el organismo, se unir a aquellos receptores (anticuerpos) en los que encaje bien. Los linfocitos B, cuyos receptores han fijado antgeno, reciben una seal y se convierten en clulas plasmticas, capaces de producir numerosos anticuerpos idnticos a aquel que portaban en su superficie. A su vez, los linfocitos B sufren un proceso de expansin clonal, multiplicndose en elevado nmero para elaborar anticuerpos especficos para ese antgeno en suficiente cantidad (Roitt, 1998b). Los anticuerpos pueden inactivar antgenos extracelulares o recubrir patgenos bacterianos marcndolos para su posterior destruccin por clulas del tipo NK. La vida intracelular de las bacterias es un mecanismo protector frente a los anticuerpos, que carecen de poder de penetracin al interior de las clulas. (Prez et al, 1996). Por ello la respuesta inmune de tipo celular es el mecanismo defensivo por excelencia, aunque no exclusivo, frente a bacterias intracelulares obligadas, como Ehrlichia spp. (Roitt, 1998a). Tradicionalmente no se ha considerado que los anticuerpos jueguen un papel importante en la defensa frente a la infeccin por Ehrlichia spp. Sin embargo, se ha
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observado que pueden ejercer una accin protectora al inicio de la infeccin (Kaylor et al, 1991). Los anticuerpos podran intervenir en la proteccin frente a infecciones ehrlichiales a tres niveles: Facilitando la citolisis de organismos ehrlichiales por las vas clsicas de deposicin del complemento y/o opsonizacin (Messick y Rikihisa, 1994; Byrom et al, 1993), previniendo la unin e internalizacin en la clula hospedadora (Messick y Rikihisa, 1994; Byrom et al, 1993) mediando la citolisis de los macrfagos infectados (Winslow et al, 2000).
Una vez que la infeccin se ha establecido en los tejidos, los anticuerpos ejercen su accin (Kaylor et al, 1991). Esta respuesta de anticuerpos, independiente de los linfocitos T, produce un control de la enfermedad en los primeros estados de infeccin, antes del desarrollo de una respuesta celular completa (Winslow et al, 2000). En cualquier caso es necesaria la accin de la inmunidad celular para producir la resolucin completa de la infeccin, hecho que los anticuerpos por s solos no son capaces de producir. La respuesta humoral desencadenada en el curso de la infeccin por Ehrlichia spp. se mantiene a lo largo de toda la infeccin e incluso mucho tiempo despus del tratamiento (Reardon y Pierce, 1981; Bartsch y Greene, 1996; Harrus et al, 1999). Esta exagerada respuesta humoral, lejos de resolver la infeccin, produce graves complicaciones en el organismo (Burghen et al, 1971; Reardon y Pierce, 1981; Harrus et al, 1999). La dinmica de la produccin de anticuerpos en la infeccin por Ehrlichia spp. ha sido ampliamente estudiada. Se han detectado anticuerpos especficos antiehrlichia a partir de los 7 das postinfeccin (Weisiger et al, 1975; Waner et al, 1996), aunque en la mayora de los casos no se desarrollan hasta la segunda o tercera semana postinfeccin. Estas diferencias pueden estar en funcin de la dosis infectiva (Rikihisa et al, 1992). La cota mxima de anticuerpos se alcanza al mes de la fase de ehrlichiemia, persistiendo durante
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largos periodos de tiempo ttulos elevados en el curso de la infeccin (Bartsch y Greene, 1996; Burghen et al, 1971; Harrus et al, 1997). La existencia de cantidades elevadas de anticuerpos circulantes predispone a la aparicin de inmunocomplejos circulantes que pueden causar graves lesiones en el organismo tales como glomerulonefritis, poliartritis y uveitis, especialmente durante la fase crnica (Codner y Maslin, 1992; Ristic y Holland, 1993; Harrus et al en 2001). Esta intensa respuesta humoral desencadenada durante la ehrlichiosis es muy amplia y no slo se restringe a la produccin de anticuerpos antiehrlichiales (Reardon y Pierce, 1981). As, se han observado anticuerpos plaquetarios (Waner et al, 1995; Harrus et al, 1996; Waner et al, 2000a) y antieritrocitarios (Ristic y Holland, 1993; Frank y Breitschwerdt, 1999) en el curso de esta enfermedad. Por el contrario, no se ha detectado la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA) (Harrus et al, 2001), siendo estos anticuerpos ms frecuentes en cuadros de autoinmunidad primaria idioptica que en el curso de autoinmunidad secundaria a una infeccin crnica. Muchos patgenos bacterianos y protozooarios transmitidos por vectores son capaces de evitar la respuesta inmune del hospedador mediante la produccin de variaciones antignicas de sus protenas de superficie (Deitsch et al, 1997). Una de las causas de la intensa respuesta humoral generada por las distintas especies ehrlichiales podra ser esta capacidad de recombinacin gnica, que permitira al agente causal variar los epitopos superficiales inmunognicos para evitar las defensas del hospedador e inducir la produccin de numerosos anticuerpos y la persistencia de la infeccin (Reddy et al, 1998; Brown et al, 2003).
2.6.2.2. Inmunidad celular Las clulas T, las citoquinas solubles y las clulas NK son los principales responsables de la proteccin frente a las infecciones por patgenos intracelulares. La respuesta inmunomediada de tipo celular juega un papel decisivo en la infeccin por
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Ehrlichia spp., tanto en la recuperacin de los animales de la infeccin como en la resistencia a la reinfeccin (Nyindo et al 1980; Rikihisa, 1991; Ristic et al 1993; Williams et al, 1994). La denominacin de linfocitos T deriva del lugar donde maduran: el parnquima tmico. Los linfocitos T estn especializados en la destruccin de clulas infectadas por microorganismos intracelulares. Para su activacin necesitan contactar con el antgeno que portan las clulas presentadoras de antgeno (monocitos y macrfagos) en su superficie. Para ello tiene un receptor antgeno-especfico (TCR) como parte integrante de su membrana celular. El TCR se encuentra ntimamente vinculado a un complejo de pptidos transmembranosos denominado CD3. Una vez que el receptor TCR se liga al antgeno, el CD3 es el encargado de activar a la clula. El CD3 slo se encuentra presente en los linfocitos T y es la molcula empleada para su identificacin (Roitt, 1998b). Para reconocer el antgeno, los linfocitos T necesitan que ste sea presentado en la superficie de una clula acompaado de un marcador de superficie celular que informa al linfocito T de estar haciendo contacto con dicha clula. Estos marcadores celulares pertenecen a un importante grupo de molculas conocido como Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) (McDevitt, 2000). Existen dos tipos principales de CMH: el CMH de clase I y el de clase II. El CMH de clase I est presente prcticamente en todas las clulas nucleadas del organismo e interviene en el reconocimiento de los antgenos por parte de los llamados linfocitos T citotxicos Tc (linfocitos CD3+,CD8+) (Jondal et al, 1996). Las molculas del CMH de tipo II se encuentran en los linfocitos B y en las clulas presentadoras de antgeno (APC), que son los macrfagos o clulas del SMF. Las clulas endoteliales y las clulas epiteliales cuando son inducidas por el IFN- tambin pueden actuar como clulas presentadoras de antgeno. Los linfocitos T cooperadores Th (linfocitos CD3+, CD4+) son activados al reconocer el antgeno en la superficie de las APC, asociado al CMH de tipo II (Williams, 1997).
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Los agentes ehrlichiales son capaces de afectar al procesado y presentacin de antgenos por las APC, en un intento de perpetuar la infeccin y evitar la respuesta inmune de tipo celular (Messick y Rikihisa, 1992). El TCR se encuentra unido a la membrana celular por dos cadenas necesarias para la especificidad antignica. Existen dos tipos de TCR atendiendo al tipo de cadenas que lo componen: TCR y TCR (Caldwell et al, 1995; De Rosa et al, 2004). La cantidad de linfocitos de uno u otro tipo vara con la especie animal. Mientras que en rumiantes los linfocitos T representan del 30 al 80 % de los linfocitos T sanguneos (Hein y MacKay, 1991; Hayday, 2000), en humanos y en cnidos estas clulas son minoritarias, representando tan slo de un 0,5 a un 15 % de las clulas T en sangre de perros sanos (Roitt, 1998a; McDonough y Moore, 2000). En ndulos linfticos, bazo y timo este tipo de linfocitos tambin son escasos, siendo, en general, ms predominantes en epitelio intestinal y en piel (Goodman y Lefrancoi, 1988; Bucy et al, 1988; Hein y Mackay, 1991; Deush et al, 1991, Roitt, 1998a). Otros autores han constatado la existencia de linfocitos T esplnicos en proporciones elevadas, hallndose en zonas de circulacin celular y no en las reas convencionales de presencia de linfocitos T (McDonough y Moore, 2000). Los linfocitos T parecen ejercer una funcin citotxica frente a clulas tumorales y clulas autlogas infectadas por patgenos intracelulares (Caldwell et al, 1995). Sin embargo existen todava muchas incgnitas en cuanto a su funcin y a los mecanismos por los que reconocen antgenos (Hayday, 2000; De Rosa, 2004) Otras importantes molculas de superficie de los linfocitos T son las molculas CD4 y CD8. La mayora de los linfocitos T son linfocitos que carecen de ambas molculas, es decir son linfocitos T CD4 y CD8 negativos. Mientras que dentro de los linfocitos T podemos diferenciar:
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Los linfocitos T citotxicos Tc que expresan en su superficie el antgeno CD8 y reconocen antgenos exgenos asociados a molculas de histocompatibilidad de tipo I (Jondal et al, 1996).
Los linfocitos T cooperadores Th (en ingles, helper) que presentan el antgeno CD4 en su superficie y reconocen los antgenos asociados al complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II (Williams, 1997).
Los linfocitos Tc (CD3+ CD8+) contribuyen a la resistencia frente a infecciones intracelulares por virus, protozoos y patgenos bacterianos a travs de diferentes mecanismos (Harty et al, 2000). As, los linfocitos Tc secretan perforinas que crean poros en la membrana basal de las clulas diana y transfieren enzimas almacenadas en grnulos citoplasmticos (granzimas) que inducen la apoptosis de las clulas diana (Smyth y Trapini, 1995). Estos linfocitos tambin participan en los mecanismos inmunitarios con la produccin de citoquinas como IFN- y TNF- (Harty et al, 2000). Tambin pueden actuar como potentes clulas desencadenantes de una respuesta memoria tras la infeccin, segn se ha podido constatar en modelos humanos y murinos de leishmaniosis (Mller et al, 1993; Mller et al, 1994; Mendonca et al 1995). Los linfocitos Th (CD3+ CD4+), dependiendo de las citoquinas que elaboran, son capaces, bien de inducir una respuesta de tipo humoral estimulando la produccin de anticuerpos por las clulas B, o bien de inducir una respuesta de tipo celular activando macrfagos y clulas citotxicas para la destruccin de los patgenos intracelulares. Los linfocitos T cooperadores en base a la produccin de estas citoquinas se subclasifican en Th1 y Th2: Los linfocitos Th1 producen interleuquina 2 (IL2) e interferon- (IFN- ) entre otras citoquinas e inducen una respuesta inmune de tipo celular, importante en la eliminacin de patgenos intracelulares. (Akkonyunlu y Fikrig, 2000).
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Los linfocitos Th2 producen interleuquina 4 (IL4) e interleuquina 5 (IL5) entre otras citoquinas e inducen una respuesta inmune de tipo humoral, ms orientada a la lucha frente a patgenos extracelulares (Roitt, 1998a).
Las poblaciones de linfocitos T y B son poblaciones independientemente reguladas, de modo que la ausencia de una de estas poblaciones no se compensa por el aumento de la otra. Algo similar ocurre entre las poblaciones de linfocitos T de tipo y . Sin embargo, dentro de los linfocitos T las poblaciones CD4+ y CD8+ son correguladas, es decir, una disminucin en el nmero de una de ellas suele producir un incremento en el nmero de las otras de tal manera que el nmero total de clulas se mantiene relativamente constante (Rocha et al, 1989; Freitas y Rocha, 2000). Morfolgicamente, se ha observado la presencia de linfocitos grandes granulares (LGL), cuya cantidad aumenta considerablemente en ciertos procesos patolgicos, fundamentalmente relacionados con neoplasias y estmulos antignicos crnicos. El anlisis inmunofenotpico de estos linfocitos divide a stos en dos lneas: 1) Linfocitos granulares grandes CD3-, que no expresan el receptor de clulas T (TCR), estaran representados por las clulas NK (McDonough y Moore, 2000). 2) Linfocitos granulares grandes CD3+, que expresan el receptor de clulas T (TCR) y representan clulas T citotxicas activadas (Loughran et al, 1988; Scott y Richards, 1992). Suelen ser CD4-, pero pueden ser CD8+ CD8- (Wellman et al, 1989). Los linfocitos granulares grandes CD3+, CD4-, CD8- suelen ser linfocitos T de tipo . Aunque existe poca informacin sobre los linfocitos granulares grandes en perros normales, se estima que esta poblacin puede comprender del 0 al 10% de la poblacin de linfocitos circulantes (McDonough y Moore, 2000).
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Poco se ha estudiado sobre la respuesta inmune de tipo celular en casos de ehrlichiosis canina y de otras especies. Parte de este hecho se ha debido a la dificultad en obtener anticuerpos monoclonales (MAbs) especficos para linfocitos caninos (Byrne et al, 2000). Actualmente el desarrollo de MAbs especficos para la diferenciacin de antgenos leucocitarios en perros ha ayudado enormemente al estudio de la respuesta celular as como al anlisis detallado y a la clasificacin histopatolgica de las enfermedades linfoproliferativas (Dumler et al, 2000). Aunque existe poco conocimiento de la inmunopatogenia de la ehrlichiosis en cuanto a la respuesta celular, se ha observado que individuos infectados por Ehrlichia pueden ser capaces de superar la infeccin tras la fase aguda de la enfermedad, ya que una respuesta inmune adecuada, de tipo celular, llevara a una recuperacin espontnea y a la disminucin o incluso a la negativizacin del ttulo de anticuerpos (Madigan et al, 1990; Artursson et al 1999). Sin embargo, sin tratamiento y si la respuesta inmune no es la adecuada, la infeccin se suele mantener latente establecindose un estado de portador prolongado (Reddy et al, 1998). Uno de los mecanismos por los que no se activa una respuesta celular efectiva puede ser la capacidad de las ehrlichias de producir variaciones antignicas en epitopos superficiales que dificultaran su reconocimiento por los linfocitos T (Brown et al, 2003). En el curso de la infeccin experimental se ha observado que la respuesta inmune de tipo celular disminuye con el tiempo y desaparece sobre el da 147 post-inoculacin, mientras que el ttulo de anticuerpos humorales aumenta con el tiempo y se mantiene en una elevada concentracin (Nyindo et al, 1980). Por el contrario, la recuperacin del animal frente a la infeccin se ha asociado a la existencia de linfocitosis T (Everett et al, 1994, Caldwell et al, 1995). La falta de respuesta inmune adecuada conduce a la cronicidad de la infeccin y sta, al agotamiento del organismo, provocando la aparicin de un cuadro clnico y lesional tan grave que puede conducir a la muerte del individuo. En estos casos los ttulos de anticuerpos especficos anti-Ehrlichia se mantienen elevados a lo
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largo de toda la enfermedad, por lo que se intent establecer, sin xito, una medida de la respuesta celular en base a su correlacin con el ttulo de anticuerpos (Nyindo et al, 1980). En el curso de la infecciones ehrlichiales se ha observado la presencia de leucopenia con neutropenia y linfopenia en los primeros das de la infeccin experimental, retornando los recuentos a la normalidad hacia el da 13-16 post-infeccin (Woldehiwet, 1991). La linfopenia se caracterizaba por una disminucin en el nmero de linfocitos B y T y un aumento en el nmero de clulas NK (Woldehiwet, 1991). Otro estudio reafirma la importancia de la respuesta celular como proteccin frente a la ehrlichiosis, al observar una infeccin ms grave en Pastores Alemanes que en Beagles, relacionada con la respuesta celular disminuida caracterstica de los primeros (Nyindo et al, 1980). En cuanto a las subpoblaciones de linfocitos T, en el curso de la ehrlichiosis se ha observado una inversin del ndice linfocitario CD4/CD8, debido a un incremento de los linfocitos T CD8+ y una disminucin de los linfocitos CD4+ (Woldehiwet, 1991; Heeb et al, 2003). La inversin del ndice CD4/CD8 sugiere una inmunoincompetencia que puede predisponer a los animales infectados a padecer otras enfermedades y, a su vez, otras enfermedades pueden hacerlos susceptibles al desarrollo de la fase crnica de la enfermedad (Woldehiwet y Scott, 1982b; Woldehiwet, 1991; Larsen et al, 1994; Frank y Breitschwerdt, 1999; Gokce y Woldehiwet, 1999). En el mismo sentido, recientemente se ha demostrado la importancia de linfocitos T CD4 y CD8 en la proteccin frente a la infeccin por Ehrlichia muris en ratones. Concretamente los linfocitos T citotxicos son fundamentales en la proteccin inmune frente a Ehrlichia spp. (Feng y Walker, 2004). Estudios anteriores ya haban sugerido un probable aumento de la citotoxidad mediada por clulas consecutiva a un incremento en linfocitos Tc y NK en el curso de las infecciones ehrlichiales (Weiser et al, 1991). La contribucin de los linfocitos T cooperadores en la inmunidad frente a esta infeccin es fundamentalmente a travs de la secrecin de IFN-, unido a su papel en el desarrollo de la
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inmunidad humoral y en la proliferacin de linfocitos T citotxicos (Feng y Walker, 2004). El IFN- produce la activacin de los macrfagos y su consecuente produccin de molculas txicas como el NO (Park y Rikihisa, 1992; Akkoyunlu y Fikrig, 2000; Banerjee et al, 2000) para la eliminacin de los patgenos intracelulares. En dos casos de ehrlichiosis canina, se ha encontrado la existencia de linfocitos T dobles positivos CD4+ CD8+, hasta representar un 18% de las clulas T (Heeb et al, 2003). La funcin de estos linfocitos T CD4+ CD8+ dobles positivos no se conoce, pero pueden representar una proliferacin clonal secundaria a inflamaciones crnicas como es el caso de la ehrlichiosis (Heeb et al, 2003). Se ha observado una base celular en la patogenia de la trombocitopenia dependiente de linfocitos T, que a su vez ejercen una accin citotxica sobre monocitos autlogos infectados por ehrlichias, aunque el mecanismo exacto debe ser determinado (Kakoma et al, 1977). Los linfocitos granulares grandes parecen participar tambin en la inmunopatogenia de la ehrlichiosis (Weiser et al, 1991; Heeb et al, 2003), ya que se ha descrito la posible aparicin de linfocitosis granular de tipo prolongada en el curso de la ehrlichiosis canina crnica (McDonough y Moore, 2000). La proliferacin de linfocitos grandes granulares de tipo , poblacin normalmente minoritaria , se observa tambin en personas tratadas de ehrlichiosis (Caldwell et al, 1995). En perros adems de en ehrlichiosis, la linfocitosis granular se ha descrito en procesos neoplsicos como la leucemia linfoctica crnica y la leucemia linfoblstica aguda (Weiser et al, 1991; Heeb et al, 2003). La mayora de los linfocitos granulares grandes circulantes en el hombre son CD3(Richards y Scott, 1992), es decir, clulas NK. Sin embargo, la mayora de los casos de linfocitosis granular en humanos se debe a la proliferacin de linfocitos T CD3+, con una
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escasa proporcin de clulas NK (Pandolfi et al, 1992). Esta misma observacin se ha detectado en perros afectados de linfocitosis granular (McDonough y Moore, 2000). Para finalizar este captulo, pasamos a realizar una breve descripcin de la patogenia de la enfermedad en relacin a las tres fases de la misma (aguda, subclnica y crnica). Tras la entrada y replicacin de E. canis en el interior de las clulas del SMF, se produce su diseminacin por el organismo va sangunea y linftica. Esto coincide con la fase aguda de la enfermedad, que suele durar de 2 a 4 semanas (Huxsoll et al, 1970; Buhles et al, 1974). La infeccin por Ehrlichia spp. produce una hiperplasia del sistema linforreticular que se manifiesta a nivel de los rganos linfoides, por una activacin de los centros germinales con incremento de la poblacin blstica. Esta transformacin se observa tanto a nivel del bazo como de los ndulos linfticos, producindose una disminucin de poblacin linfocitaria madura y un aumento de la poblacin linfoblstica. Esta actividad hiperplsica afecta tanto a los linfocitos T como a los B durante la fase aguda de la infeccin (Reardon y Pierce, 1981). La hiperplasia linforreticular conduce a una esplenomegalia que favorece el secuestro de plaquetas y eritrocitos, lo que contribuye a la presentacin de anemia y a la trombocitopenia observada. Adems, el bazo como gran productor de anticuerpos contribuye a la patogenia y gravedad de la enfermedad a travs de la inefectiva sobreproduccin de anticuerpos y como fuente de macrfagos (Harrus et al, 1997; Harrus et al, 1999). Se ha observado que, en la ehrlichiosis granuloctica, infecta
Ehrlichia
predominantemente clulas precursoras mieloides en rganos hematopoyticos que podran representar el foco primario de infeccin desde el cual los neutrfilos maduros infectados emergen a la sangre (Klein et al, 1997; Bunnell et al, 1999). Tanto las clulas progenitoras de lneas monocticas como granulocticas en la mdula sea son susceptibles de ser
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infectadas (Klein, 1997). Sin embargo, menos de un 10% de las clulas maduras circulantes se ven infectadas en el curso de la infeccin (Bakken et al, 1996). Algunos autores sugieren que la infeccin se propagara por liberacin de clulas de la mdula sea infectadas (Bunnell et al, 1999). Se especula la posibilidad de un secuestro duradero de los agentes infecciosos en rganos como mdula sea, bazo o pulmn (Bunnell et al, 1999). En los primeros estados de las infecciones ehrlichiales se observa un incremento en la actividad de la mdula sea (Buhles et al, 1975; Reardon y Pierce, 1981) aunque esto no repercute en un incremento en la produccin de clulas sanguneas maduras (Reardon y Pierce, 1981). El sistema linforreticular en su conjunto tiene un papel multifactorial en la infeccin aguda por E. canis y las lesiones histolgicas que afectan a las clulas del sistema hemtico y linforreticular reflejan una reaccin exagerada del hospedador en un intento de compensar una respuesta inmune ineficaz (Reardon y Pierce, 1981; De Castro et al, 2004). En este sentido, se ha observado un incremento del nmero de linfocitos tanto en ndulos linfticos como en bazo en esta fase aguda. Concretamente, en ndulos linfticos esta poblacin est integrada por un gran nmero de linfocitos CD8+ que pueden inducir un dao tisular por la eliminacin a travs de citolisis de las clulas infectadas, contribuyendo as a la patogenia de la enfermedad (De Castro et al, 2004). Tras la fase aguda de la ehrlichiosis, los animales pasan a un estado subclnico que puede establecerse durante aos y en el que, en ausencia de sintomatologa clnica, el agente permanece en rganos como bazo y mdula sea. La fase subclnica de la enfermedad aparece a las 6-9 semanas de la infeccin y puede durar de 1 mes a 5 aos (Buhles et al, 1974; Codner et al, 1986). Esta fase se caracteriza por ausencia de sintomatologa con o sin presencia de alteraciones hematolgicas (como anemia, trombocitopenia y leucopenia) y por ttulos elevados de anticuerpos humorales (Greene y Harvey, 1984; Codner et al, 1986). Durante esta fase pueden ocurrir tres supuestos: 1. los animales se recuperan espontneamente (Greene y Harvey, 1984; Hibler et al, 1986; Madigan et al, 1990; Artursson et al 1999),
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2. son tratados y eliminan la infeccin (Greene y Harvey, 1984; Hibler et al, 1986; Madigan et al, 1990; Artursson et al 1999) o 3. pasan a la fase crnica de la enfermedad (Buhles et al, 1974; Greene y Harvey, 1984; Reddy et al, 1998). Se debe dar gran importancia a la identificacin de los individuos en fase subclnica de la infeccin, con el fin de evitar que la enfermedad progrese hacia la fase crnica (Harrus et al, 1998b; Harrus et al, 1999). Las condiciones por las que se desarrolla la fase crnica de la infeccin son desconocidas y pueden estar relacionadas con la raza, el estado inmunitario del individuo, condiciones de estrs, coinfeccin con otros parsitos o reinfecciones persistentes (Harrus et al, 1997; Breitschwerdt et al, 1998b). Factores individuales del paciente asociados con la resistencia o susceptibilidad a la enfermedad clnica, probablemente relacionados con su sistema inmune, deben ser determinados todava (Wong y Thomas, 1998). En cuanto a la patogenia de la fase crnica de la enfermedad, poco se sabe (Harrus et al, 1999). La existencia de una disrregulacin previa del sistema inmune, bien por autoinmunidad o por infeccin con otros agentes, predispone a los pacientes al desarrollo de enfermedad clnica en el curso de la infeccin por Ehrlichia spp. (Wong y Thomas, 1998). Parece ser que situaciones de estrs o de inmunosupresin son capaces de desencadenar un cuadro clnico tras una prolongada fase subclnica (Codner y FarrisSmith, 1986). Sin embargo, en el curso de infecciones experimentales y durante la fase aguda de la enfermedad, un estado de inmunosupresin ni previene ni modifica significativamente las manifestaciones clnicas de la ehrlichiosis (Reardon y Pierce, 1981). La participacin de mecanismos inmunomediados en la patogenia de la enfermedad es, si cabe, ms acusado en la fase crnica de la misma (Harrus et al, 1999). La gravedad de la fase crnica se ha asociado a la trombocitopenia y al grado de aplasia medular
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(Hildebrant et al, 1973; Buhles et al, 1974; Codner y Farris-Smith, 1986). La hipoplasia de mdula sea observada en fases crnicas puede ser el resultado de la infeccin persistente que promueve el fallo o supresin de las clulas madre pluripotenciales y puede estar inmunolgicamente mediada (Huxsoll, 1990), habindose observado infiltrados plasmocitarios en la mdula sea (Frank y Breitschwerdt, 1999). Tambin se propone la existencia de un factor esplnico supresor de la hematopoyesis cuya produccin se encuentra inducida por la infeccin por Ehrlichia spp. Es posible que este factor juegue un papel en la supresin de la mdula sea que aparece en la fase crnica de la enfermedad (Harrus et al, 1997). Durante esta fase crnica se observa tambin infiltracin extensiva de los rganos parenquimatosos por clulas plasmticas y acmulos perivasculares de estas clulas en pulmones, riones, bazo, meninges y ojos, principalmente (Reardon y Pierce, 1981). Se ha asociado a la enfermedad el desarrollo de glomerulonefritis y nefropata con prdida de protenas en la fase crnica de la enfermedad por depsitos de inmunocomplejos circulantes (Frank y Breitschwerdt, 1999). La infiltracin por clulas plasmticas de las meninges est relacionada con la aparicin de signos neurolgicos asociados a la ehrlichiosis crnica (Woody y Hoskins, 1991, Frank y Breitschwerdt, 1999). En resumen, aunque no del todo conocida, est bien documentada la existencia de una respuesta inmune aberrante en el curso de la ehrlichiosis (Burghen et al, 1971; Reardon y Pierce, 1981; Harrus et al, 1999), la cual influye enormemente en la patogenia de la enfermedad. De hecho, como acabamos de exponer, un gran nmero de alteraciones, lesiones y signos clnicos se pueden explicar desde un punto de vista inmunolgico. (Hildebrandt et al, 1973; Woody y Hoskins, 1991; Ristic y Holland, 1993; Waner et al, 1995; Harrus et al, 1999).
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2.7. CUADRO CLNICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

La sintomatologa asociada a la ehrlichiosis canina es muy inespecfica, habindose llegado a identificar ms de 50 signos clnicos diferentes asociados a esta patologa (Sainz, 1996). Se distinguen tres fases en esta enfermedad tanto a nivel del cuadro clnico como de la patogenia, si bien clnicamente no siempre es sencillo conocer la fase de la enfermedad. Este hecho se debe a que, aunque para cada una de estas fases se describe un cuadro clnico con predominio de una sintomatologa concreta, una gran variedad de signos clnicos pueden aparecer tanto en la fase aguda como en la crnica (Huxoll et al, 1970; Troy y Forrester, 1990; Woody y Hoskins, 1991). La fase subclnica es probablemente la ms sencilla de identificar puesto que se caracteriza por la ausencia de sintomatologa, apareciendo nicamente alteraciones biopatolgicas (Woody y Hoskins, 1991; Sainz et al, 1996). Una vez que se ha producido la entrada de Ehrlichia spp. en el organismo, el periodo de incubacin de la enfermedad viene a durar de 9 a 14 das, tras los cuales comienzan a aparecer las primeras manifestaciones de la enfermedad que se corresponden en el tiempo con la fase aguda de la enfermedad. sta suele durar de 4 a 7 semanas. La presencia de garrapatas debera observarse en esta fase; sin embargo, no es un signo constante y slo se ha constatado en un 40% de los animales afectados (Troy et al 1980; Greene et al, 1985). Por supuesto el contacto con garrapatas es imprescindible para el desarrollo de la enfermedad, por lo que en zonas endmicas realizar una buena anamnesis
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Cuadro clnico
demandando informacin sobre el contacto con los vectores es fundamental (Woody y Hoskins, 1991; Breitschwerdt, 2003). Tras la fase aguda se presenta la fase subclnica, caracterizada por la ausencia de sintomatologa. Su duracin en infecciones naturales puede ser de hasta 5 aos (Codner y Farris-Smith, 1986). Durante la misma el animal puede superar la enfermedad (Greene y Harvey, 1984; Hibler et al, 1986) o progresar en un momento dado hacia la fase crnica (Buhles et al 1974; Greene y Harvey, 1984), que puede conducirle a la muerte (Bhules et al, 1974). La virulencia de la cepa de E. canis, la duracin del proceso, el grado de respuesta del perro afectado, su edad y raza son factores que determinan la evolucin de la enfermedad, as como la presentacin de un mayor o menor nmero de manifestaciones clnicas (Nyindo et al, 1980; Greene y Harvey, 1984). El cuadro clnico ms frecuente (en el 75% de los casos) es la aparicin de sintomatologa general inespecfica (Sainz et al, 1996). Entre los signos generales se puede detectar fiebre, apata, decaimiento, anorexia o apetito caprichoso, prdida de peso, linfadenomegalia, esplenomegalia (Huxsoll et al 1970; Troy et al, 1980; Greene y Harvey, 1984; Kuehn y Gaunt, 1985; Greene et al, 1985; Breitschwerdt et al, 1987; Waddle y Littman, 1988; Sainz et al, 1996). Tambin puede aparecer edema de extremidades o de escroto (Huxsoll et al, 1970; Woody y Hoskins, 1991; Breitschwerdt, 1995). Estas son las manifestaciones clnicas ms frecuentes en la fase aguda, aunque tambin suelen aparecer con bastante frecuencia en las formas leves de la fase crnica (Troy et al, 1980; Hibler et al, 1986). Las manifestaciones respiratorias, oculares y cutneas son las siguientes en frecuencia de presentacin, apareciendo en un 35- 40% de los casos (Sainz, 1996). Estos signos suelen ser ms habituales en la fase crnica, aunque tambin se han descrito en la fase aguda (Huxsoll et al, 1970; Codner et al, 1985; Gelatt, 1991).
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El cuadro respiratorio se caracteriza por la presentacin de exudado mucopurulento acompaado en ocasiones de disnea y tos (Huxsoll et al, 1970; Codner et al, 1985; Kuehn y Gaunt, 1985; Sainz, 1996). La disnea puede tambin ser debida a la existencia de anemia severa (Sainz, 1996). Los signos oftalmolgicos suelen ser ms frecuentes en la fase crnica de la enfermedad, habindose descrito uveitis anterior, fotofobia, conjuntivitis, opacidad corneal e hipema. Ms raramente se puede presentar retinitis difusa, desprendimiento de retina, hemorragia subretiniana y neuritis ptica (Troy et al, 1980; Hoskins et al, 1983, Troy y Forrester, 1990). Se ha descrito tambin la aparicin de ceguera aguda en casos de ehrlichiosis monoctica canina (Harrus et al, 1998d; Gould et al, 2000). Estos cuadros oftalmolgicos graves parecen estar asociados a la hiperviscosidad sangunea secundaria a la gammapata monoclonal presente en algunos casos de ehrlichiosis (Harrus et al, 1998c). Si bien la nica sintomatologa cutnea relacionada con la ehrlichiosis hasta hace poco tiempo era la aparicin de equimosis y petequias (Troy et al, 1980; Waddle y Littman, 1988; Perille y Matus, 1991), Sainz en 1996 describe una incidencia relativamente elevada de problemas cutneos asociados a la ehrlichiosis, que pueden variar desde la mala calidad del pelo hasta la aparicin de dermatitis alopcicas con eritema y descamacin que remiten tras el tratamiento; lesiones semejantes han sido descritas por otros autores ( Price et al, 1987; Sagredo et al, 1994) La frecuencia de presentacin de hemorragias se estima en un 35% (Kuehn y Gaunt, 1985; Waddle y Littman, 1988; Sainz et al, 1996), si bien algunos estudios refieren incidencias ms altas (Troy et al, 1980) y otros, ms bajas (Price et al, 1987). El signo hemorrgico ms frecuente (en el 70% de los casos con hemorragias) es la epistaxis (Price et al, 1987; Troy y Forrester, 1990; Sainz et al, 1996). Otros signos hemorrgicos que pueden aparecer son petequias, equimosis, hematoquecia, hematuria o hemorragia subconjuntival. Tambin ha sido descrita la aparicin de hematomas tras la extraccin sangunea o la inyeccin de frmacos (Troy et al, 1980).
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Cuadro clnico
Otros sntomas que se pueden presentar, con menor frecuencia y especialmente en fase crnica, son de tipo neurolgico, digestivo, locomotor, urinario y reproductor. A nivel neurolgico se ha observado la aparicin de episodios de ataxia, sndromes de neurona motora superior e inferior, hiperestesia generalizada, polineuropata perifrica, e incluso convulsiones (Troy et al, 1980; Greene et Harvey, 1984; Hibler et al, 1986; Maretzki et al, 1994; Meinkoth et al, 1998; Sainz, 1996; Hernndez et al, 2003) En cuanto al sistema locomotor se ha descrito la aparicin de cojeras intermitentes debidas a poliartritis (Bellah et al, 1986; Cowell et al, 1988) y polimiositis (Buoro et al, 1990). Los signos digestivos suelen ser infrecuentes, limitndose a la aparicin de hematemesis y de sangre en heces en animales con tendencias hemorrgicas (Hildebrant et al, 1973; Woody y Hoskins, 1991), aunque ms recientemente se han descrito procesos diarreicos de intestino grueso (Sainz, 1996). En fases crnicas se puede desarrollar una glomerulopata inmunomediada que produce una insuficiencia renal la cual no suele responder al tratamiento. En estos casos la sintomatologa asociada es la clsica de una insuficiencia renal crnica: poliuria, polidipsia, anorexia, vmitos o lceras orales (Troy et al, 1980; Codner y Maslin, 1992). La patologa a nivel reproductor es muy poco frecuente, habindose descrito hemorragias petequiales en mucosa genital y edema de escroto. En hembras se ha asociado con ehrlichiosis la presencia de sangrado prolongado durante el proestro y el post-parto, infertilidad, abortos y muerte neonatal (Woody y Hoskins, 1991; Garca-Prez et al, 2003). Tal y como se acaba de referir, la sintomatologa de esta enfermedad es muy variada e incluso recientemente se ha descrito un caso de trombosis de la aorta y de la vena porta en un perro con ehrlichiosis (Bressler et al, 2003).
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2.8. ALTERACIONES LABORATORIALES EN EL CURSO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

A continuacin vamos a analizar las principales alteraciones laboratoriales observadas en la ehrlichiosis.
2.8.1 ALTERACIONES HEMATOLGICAS La trombocitopenia es casi un factor constante en la infeccin por Ehrlichia, apareciendo a los 15-20 das post-infeccin y pudiendo persistir durante todas las fases de la enfermedad (Troy et al, 1980; Greene et al, 1985; Kuehn y Gaunt, 1985; Codner y Farris-Smith, 1986; Breitschwerdt et al, 1987; Waddle y Littman, 1988; Davoust et al, 1991a; Harrus et al, 1997). Sin embargo, se han descrito casos de ehrlichiosis sin trombocitopenias (Woody y Hoskins, 1991; Frank y Breitschwerdt, 1999). La patogenia de la trombocitopenia es compleja y multifactorial, participando mecanismos inmunolgicos y no inmunolgicos que producen una disminucin de la produccin y un aumento de la destruccin de plaquetas (Weisiger et al, 1975; Harrus et al, 1996b; Grindem et al, 1999) Uno de los mecanismos inmunolgicos que intervienen en la trombocitopenia por ehrlichiosis es la produccin de anticuerpos antiplaquetarios. Estos anticuerpos se han encontrado en elevadas cantidades tanto en perros tras la infeccin experimental o natural, (Harrus et al, 1996b; Buhles et al, 1974; Lewis et al, 1975; Waner et al, 1995; Grindem et al, 1999; Waner et al, 2000a) como en personas afectadas por ehrlichiosis (Wong y Thomas, 1998). En el perro estos anticuerpos se encuentran en unos niveles elevados a partir del sptimo da post-infeccin, luego comienzan a disminuir hacia el da 29,
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Alteraciones laboratoriales
desapareciendo en el da 75 (Grindem et al, 1999). Para otros autores la trombocitopenia llega a su mxima expresin sobre el da 30 y posteriormente comienza a recuperarse (Reardon y Pierce, 1981). La trombocitopenia en la fase aguda de la infeccin podra ser debida fundamentalmente a una destruccin plaquetaria inducida por la presencia de estos anticuerpos. Se han sugerido diversos mecanismos por los que los anticuerpos antiplaquetarios participan en la gnesis de la trombocitopenia: favorecen el secuestro de plaquetas recubiertas de anticuerpos por el bazo y otros tejidos linfoides; favorecen la destruccin plaquetaria prematura por fijacin del complemento o fagocitosis; inducen disfuncin plaquetaria que conduce al sangrado, an con la presencia de un nmero normal de plaquetas; afectan el ritmo de produccin plaquetaria (Kakoma et al, 1977; Harrus et al, 1996b; Frank y Breitschwerdt, 1999; Grindem et al, 1999). Adems, se han descrito otros mecanismos que intervienen en la patogenia de la trombocitopenia como la existencia de un factor supresor de la migracin plaquetaria sintetizado por los linfocitos B (Abeygunawardena, 1988; Ristic y Holland, 1993). De todo ello se deduce que en la fase aguda de la infeccin, la trombocitopenia es generada por una disminucin de la vida media plaquetaria ms que por un descenso en la produccin de plaquetas (Reardon y Pierce, 1981). En esta fase llega incluso a observarse un incremento de la trombopoyesis (Waner et al, 1995), mientras que, en la fase crnica de la enfermedad, la principal causa de trombocitopenia sera la hipoplasia de mdula sea (Woody y Hoskins, 1991). La fase aguda de la ehrlichiosis puede cursar con anemia producida por la destruccin acelerada de eritrocitos por mecanismos inmunolgicos (Buhles et al, 1974; Reardon y Pierce, 1981). En esta fase la anemia normalmente es regenerativa (Woody y Hoskins, 1991) ya que la mdula sea suele ser hipercelular (Buhles et al, 1975). Un elevado nmero de perros con anemia regenerativa sern positivos al test de Coombs, lo cual debe ser tenido en cuenta para no incurrir en errores diagnsticos (Greene et al, 1985). Durante la fase subclnica, el recuento de eritrocitos generalmente se normaliza (Buhles et al, 1974), aunque se pueden encontrar casos con ausencia de sintomatologa clnica y
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presencia de alteraciones hematolgicas (Codner y Farris-Smith, 1986). En la fase crnica, la anemia ser no regenerativa debido a la destruccin continuada de eritrocitos, la prdida crnica de sangre y la existencia de hipoplasia o aplasia medular (Hildebrant et al, 1973; Buhles et al, 1974; Woody y Hoskins, 1991; Makinde y Bobade, 1994). El recuento de leucocitos en sangre es variable, encontrando inicialmente una ligera leucopenia (Buhles et al, 1974; Reardon y Pierce, 1981) debida al secuestro de leucocitos motivado por procesos inmunolgicos e inflamatorios (Ristic, 1976). Esta leucopenia puede transformarse posteriormente en leucocitosis (Hibler et al, 1986). Se ha descrito una inversin de la formula leucocitaria en perros con ehrlichiosis, con presentacin de una neutropenia y una linfocitosis relativa (Sainz, 1996), tambin se ha reseado la existencia de linfocitosis granular (Weiser et al, 1991; Heeb et al, 2003) Estas citopenias (anemia, leucopenia, trombocitopenia) son mucho ms graves en la fase crnica y se suelen asociar a una hipoplasia medular; habindose observado incluso la aparicin de aplasia medular completa con cuadro severo de pancitopenia que desemboca en la muerte del perro (Hildebrant et al, 1973; Buhles et al, 1974; Waddle y Littman, 1988; Makinde y Bobade, 1994). Otros procesos inmunolgicos, adems de la produccin de citoquinas participan en estas citopenias de fase crnica. No obstante, en la fase crnica de la enfermedad suele observarse una plasmocitosis debida al estmulo antignico crnico (Hildebrandt et al, 1973; Weisiger et al, 1975; Kuehn y Gaunt, 1985). La leucopenia observada en el curso de la ehrlichiosis, motivada por una deplecin del nmero de neutrfilos, se puede presentar con un aumento de clulas inmaduras que carecen de capacidad fagocitaria y de combustin respiratoria ptima lo que incrementa la susceptibilidad de estos pacientes a otras infecciones (Taylor et al, 1941; Woldehiwet, 1987; Whist et al, 2002; Whist et al, 2003). La funcin de los leucocitos tambin puede verse alterada, as, los linfocitos de perros con ehrlichiosis pueden producir un factor con efecto citotxico sobre monocitos autlogos (Kakoma et al, 1977).
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2.8.2. ALTERACIONES BIOQUMICAS Hiperproteinemia con hipoalbuminemia, hiperglobulinemia e
hipergammaglobulinemia son las alteraciones bioqumicas predominantes en perros infectados por E. canis (Weisiger et al, 1975; Harrus et al, 1996a). La exacerbada produccin de anticuerpos presente en ehrlichiosis canina se traduce en la existencia de hiperproteinemia, (Burghen et al, 1971; Troy et al, 1980; Kuehn y Gaunt, 1985; Weiser et al, 1991), caracterizada por una hipergammaglobulinemia principalmente policlonal (Burghen et al, 1971; Buhles et al, 1974; Ristic y Holland, 1993). No obstante, tambin se ha observado hipergammaglobulinemia monoclonal (Hoskins et al, 1983; Breitschwerdt et al, 1987). La concentracin de gamma-globulinas aumenta durante la fase febril de la ehrlichiosis canina y persiste durante las fases subclnica y crnica de la enfermedad (Ristic y Holland, 1993). Los niveles de hipergammaglobulinemia y de actividad de anticuerpos especficos no guardan correlacin, indicando que la mayora de las globulinas responsables de la elevacin de las gammaglobulinas no son anticuerpos frente E. canis (Reardon y Pierce, 1981). La hipergammaglobulinemia monoclonal produce un aumento de la viscosidad de la sangre que puede exacerbar la tendencia hemorrgica de la enfermedad y tener consecuencias oftalmolgicas como hemorragias intraoculares, desprendimiento de retina e incluso ceguera aguda (Harrus et al, 1998b; Martin, 1999; Gould et al, 2000) La hipoalbuminemia comienza a presentarse hacia el da 14 y se recupera a partir del da 35 sin llegar a los valores normales iniciales (Reardon y Pierce, 1981). La hipoalbuminemia, que se observa en la primera fase de la infeccin, puede ser consecuencia tanto de la prdida perifrica de albmina a fluidos edematosos por el incremento de permeabilidad vascular, prdida de sangre o disminucin de la produccin de protena debida a una enfermedad heptica concurrente (Reardon y Pierce, 1981). La hipoalbuminemia tambin podra mantenerse como mecanismo compensatorio de la hiperglobulinemia, para as contrarrestar un incremento de la presin onctica y prevenir el
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aumento de viscosidad de la sangre (Woody y Hoskins, 1991). En fases ms crnicas, la glomerulopata y la vasculitis podran ser las causas de la hipoalbuminemia (Woody y Hoskins, 1991; Codner y Maslin, 1992). Aunque en perros con ehrlichiosis se suelen encontrar valores normales de los parmetros laboratoriales indicadores tanto de la funcionalidad heptica como de la renal (Greene, 1995), se han descrito aumentos de la ALT y de la fosfatasa alcalina, fundamentalmente en fase aguda, que pueden tambin acompaarse de hiperbilirrubinemia (Troy y Forrester, 1990). Estos valores suelen disminuir hasta niveles fisiolgicos con la instauracin de una terapia apropiada, excepto en aquellos animales en los que, como consecuencia de la ehrlichiosis, se ha producido una lesin heptica o renal irreversible (Woody y Hoskins, 1991) Los aumentos en la urea y la creatinina por encima de los valores fisiolgicos de referencia pueden tener un origen prerrenal (deshidratacin) o renal, habindose observado casos de uremia asociados a glomerulonefritis y a plasmocitosis intersticial renal (Troy et al, 1980; Breitschwerdt et al, 1987). La proteinuria y la hematuria, con o sin uremia, se han detectado en infecciones experimentales durante la fase aguda de ehrlichiosis. La prdida mxima de protenas se detecta a las 3-4 semanas post-infeccin y es debida a una nefropata motivada por la existencia de lesiones ultraestructurales a nivel glomerular (Codner y Maslin, 1992). Esta proteinuria desaparece durante la fase subclnica, al igual que ocurre con la hipoalbuminemia. En fases crnicas la aparicin de proteinuria y hematuria, con o sin uremia (Troy et al, 1980), est relacionada con la existencia de lesiones gromerulares inmunomediadas (Troy y Forrester, 1990; Breitschwerdt, 1995). Tambin se ha detectado proteinuria en perros con gammapata monoclonal; en estos casos, el perfil electrofortico de las protenas de la orina presenta un paralelismo con las sricas, apareciendo un claro aumento de las IgG (Breitschwerdt et al, 1987).
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En caso de aparicin de problemas hemorrgicos, se suelen observar tiempos de hemorragia y de retraccin del cogulo prolongados debido a la existencia de trombocitopenia o trombocitopata (Kuehn y Gaunt, 1985; Hibler et al, 1986). El tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial activada y los productos de degradacin del fibringeno suelen ser normales (Kuehn y Gaunt, 1985), excepto en el caso de que se haya instaurado un cuadro de coagulacin intravascular diseminada (Hibler et al, 1986). El anlisis del lquido cefalorraqudeo de perros con sintomatologa neurolgica muestra elevados niveles de protenas y pleocitosis mononuclear con gran nmero de linfocitos y clulas plasmticas (Greene et al, 1985) En casos con artritis, el lquido sinovial suele presentar una coloracin amarillenta con aumento de la concentracin de protenas y del recuento celular, con predominancia de neutrfilos maduros (75%) y con algunos macrfagos y linfocitos.
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2.9. DIAGNSTICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

En cualquier proceso patolgico para llegar al diagnstico es necesario previamente presuponer la compatibilidad del proceso con el diagnstico (Scott et al, 2001). Un mismo cuadro clnico puede ser compatible con varias enfermedades y una misma enfermedad puede tener presentaciones clnicas diversas; por ello, habitualmente se realiza una primera aproximacin a los posibles diagnsticos diferenciales en base a las caractersticas clnicas del proceso y posteriormente se confirman o descartan estos diagnsticos con pruebas laboratoriales. En el captulo de diagnstico de la ehrlichiosis canina, hay que tener en cuenta, por un lado, las caractersticas clnicas y laboratoriales compatibles con ehrlichiosis y, por otro lado, aquellas pruebas que determinan directa o indirectamente la presencia del agente patgeno en el animal.
2.9.1. DIAGNSTICO CLNICO: Tal y como se ha abordado previamente, el cuadro clnico de la ehrlichiosis canina es totalmente inespecfico: depresin, letargia, prdida de peso, anorexia, fiebre, linfadenomegalia (Huxsoll et al 1970; Greene y Harvey, 1984; Breitschwerdt et al, 1987; Waddle y Littman, 1988; Troy et al, 1980; Khuen y Gaunt, 1985; Greene et al, 1985; Sainz, 1996). Estos signos clnicos pueden aparecer en numerosas enfermedades y no siempre aparecen conjuntamente en el curso de la ehrlichiosis canina. Por otro lado, el cuadro clnico de la ehrlichiosis tambin vara en funcin del animal y de la fase de la enfermedad.
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Diagnstico
La aparicin de cuadros hemorrgicos como epistaxis, petequias en piel o mucosas, melena, hematuria, hipema o hemartrosis hacen ms probable la inclusin de la ehrlichiosis en un listado de diagnsticos diferenciales; sin embargo, esta sintomatologa hemorrgica se presenta en menos de la mitad de los perros con ehrlichiosis (Troy y Forrester, 1990). La deteccin de garrapatas en la exploracin o el conocimiento de una infestacin previa en un animal enfermo, o incluso sano, es suficiente para sugerir una probable infeccin por Ehrlichia spp, en especial, en reas con una alta tasa de prevalencia (Keefe et al, 1982; Garris, 1991; Woody y Hoskins, 1991). As pues, el cuadro clnico puede sugerir la presencia de ehrlichiosis, si bien no existen signos patognomnicos de la enfermedad. En cualquier caso, el anlisis de la sintomatologa clnica es fundamental para, en su caso, poner en marcha las pruebas encaminadas al diagnstico de esta enfermedad.
2.9.2. DIAGNSTICO DIFERENCIAL Debido a la gran variedad de signos clnicos con los que cursa la ehrlichiosis, el diagnstico diferencial debe incluir numerosas patologas. Sin embargo, la leishmaniosis, en reas geogrficas como la nuestra, es la enfermedad con la que ms frecuentemente se puede confundir, debido a la similitud de muchos de sus signos: hemorragias, apata, prdida de peso, linfadenopata, uveitis, hiperproteinemia con hiperglobulinemia, artritis, etc. (Sainz, 1996). Tambin se debe diferenciar de otras enfermedades transmitidas por garrapatas como la babesiosis o la hepatozoonosis. Otra patologa con sintomatologa y alteraciones en la analtica sangunea similares es el lupus eritematoso sistmico (Kelly et al, 1994a). En ehrlichiosis, a pesar de la gran cantidad de autoanticuerpos producidos no se han encontrado anticuerpos antinucleares, caractersticos del lupus eritematoso sistmico (Harrus et al, 2001).
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La presencia de linfocitosis granular o la afectacin de la mdula sea podra confundirla con procesos neoplsicos como el mieloma, la leucemia linfoblstica aguda o la leucemia linfoctica crnica (Weiser et al, 1991; Heeb et al, 2003).
2.9.3. DIAGNSTICO LABORATORIAL 2.9.3.1 Pruebas laboratoriales inespecficas Los resultados de pruebas como la hematologa y la bioqumica sangunea pueden ayudar al diagnstico de ehrlichiosis canina. Entre los hallazgos que nos pueden hacer sospechar de la presencia de esta enfermedad se encuentra la trombocitopenia. Es ste el hallazgo ms frecuente en perros con ehrlichiosis canina, apareciendo a los 15-20 das postinfeccin y pudiendo perdurar durante todas las fases de la enfermedad (Troy et al, 1980; Greene et al, 1985; Codner y Farris-Smith, 1986; Breitschwerdt et al, 1987; Waddle y Littman, 1988; Davoust et al, 1991a). El recuento plaquetario no siempre se correlaciona con la presencia y gravedad de cuadros hemorrgicos (Troy et al, 1980), pudindose encontrar trombocitopenia en ausencia de hemorragia y hemorragias en ausencia de trombocitopenia (Kuehn y Gaunt, 1985; Codner et al, 1985; Woody y Hoskins, 1991; Perille y Matus, 1991) La hiperproteinemia debida a una hiperglobulinemia es un hallazgo tambin frecuente en el curso de la ehrlichiosis canina, debido al estmulo antignico crnico (Burghen et al, 1971; Buhles et al, 1974; Weisiger et al, 1975; Troy et al, 1980; Codner et al, 1985; Greene et al, 1985; Kuehn y Gaunt, 1985; Codner y Farris-Smith, 1986; Breitschwerdt et al, 1987; Davoust et al, 1991b; Weiser et al, 1991). El aumento de las globulinas no est tan relacionado con la cantidad de anticuerpos producidos frente a E. canis como con la duracin de la enfermedad y la produccin de autoanticuerpos (Burghen et al, 1971; Ristic et al, 1972; Weisiger et al, 1975; Reardon y Pierce, 1981).
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Diagnstico
La hiperglobulinemia suele corresponder a una gammapata policlonal, como se puede apreciar por electroforesis (Kuehn y Gaunt, 1985; Ghorbel et al, 1993b). Ocasionalmente se puede detectar gammapata monoclonal por aumento de inmunoglobulina G (Hoskins et al, 1983; Codner y Farris-Smith, 1986; Breitschwerdt et al, 1987; Matus et al, 1987). Acompaando a la hiperglobulinemia se suele encontrar una hipoalbuminemia, producida por diferentes causas como el agotamiento de la albmina en el proceso inflamatorio y el catabolismo proteico asociado a la enfermedad (Burghen et al, 1971; Hibler et al, 1986; Woody y Hoskins, 1991; Davoust et al, 1993). Adems, se ha observado una relacin inversamente proporcional entre la cantidad de protena perdida en orina y la concentracin srica de albmina, por lo que la presencia de proteinuria es un indicador importante de la disminucin de la albmina (Codner y Maslin, 1992). Tambin pueden encontrarse en el curso de la ehrlichiosis canina otras alteraciones laboratoriales, menos frecuentes, como anemia, leucopenia, elevacin de la fosfatasa alcalina o de la alanina transaminasa (Waddle et al, 1988; Troy et al, 1980; Frank y Breitschwerdt, 1999).
2.9.3.2. Pruebas laboratoriales especficas 2.9.3.2.1 Examen microscpico del agente etiolgico La observacin de mrulas o inclusiones intracelulares compatibles con E. canis en el interior de monocitos y/o linfocitos de sangre circulante es diagnstico de la infeccin (Elias, 1991; Mylonakis et al, 2003). Sin embargo, es difcil la observacin de estas formas debido a su pequeo tamao y a que el total de clulas mononucleares infectadas suele ser inferior al 1%; este porcentaje se va reduciendo a medida que evoluciona la enfermedad (French y Harvey, 1983; Cowell et al, 1988). La probabilidad de encontrar las formas intracelulares aumenta durante la fase de infeccin aguda, especialmente en perros leucopnicos, si previamente se realiza una leucoconcentracin de la muestra sangunea y se realiza una extensin de la capa de glbulos blancos (Ewing, 1969; Hibler et al, 1986;
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Beaufils y Legroux, 1992) o si se realiza una fina extensin de sangre perifrica obtenida del pabelln auricular (Ewing, 1969; Greene y Harvey, 1984; Hibler et al, 1986). Tambin se han observado estas mrulas en leucocitos procedentes de lquido cefalorraqudeo, lquido articular y de lavado prosttico (Bellah et al, 1986; Cowell et al, 1988; Maretzki et al, 1994; Meinkoth et al, 1998). La observacin de las mrulas, si bien indica infeccin, no identifica el tipo de agente ehrlichial responsable de la misma. Las mrulas tambin pueden detectarse a partir de cultivos celulares a partir de sangre de perros infectados. Sin embargo, esta tcnica no tiene utilidad clnica puesto que pueden pasar hasta 8 semanas en obtenerse cultivos positivos. Adems, son costosos econmicamente, slo suelen estar disponibles en laboratorios especializados y no siempre se consigue el aislamiento; en todo caso, los cultivos son una importante herramienta de investigacin (Neer et al, 2002).
2.9.3.2.2Diagnstico serolgico Las tcnicas serolgicas son las pruebas diagnsticas ms utilizadas ante una infeccin ehrlichial. Estas tcnicas no detectan el organismo causal, sino anticuerpos producidos frente a ste. Los ttulos elevados de anticuerpos se pueden observar tras la exposicin al agente, durante la fase aguda, subclnica y crnica de la infeccin e incluso despus de un tratamiento efectivo. Por ello es importante entender que un diagnstico serolgico positivo puede indicar infeccin activa, o simplemente exposicin al agente, y que la interpretacin de los resultados de estas pruebas siempre debe realizarse en el contexto del caso clnico y no de forma aislada (Cohn, 2003).
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Diagnstico
En fases iniciales de la infeccin aguda y en animales moribundos se pueden encontrar ttulos negativos, en los primeros por no haber dado tiempo a la produccin de una respuesta humoral y en los segundos por agotamiento de la produccin de anticuerpos (Weisiger et al, 1975; Waner et al, 2001; Cohn, 2003). En el suero se detectan anticuerpos antiehrlichia del tipo inmunoglobulina G entre los 7 y los 28 das post-infeccin (Ristic et al, 1972; Buhles et al, 1974), si bien a los 20 das casi todos los perros suelen ser seropositivos, alcanzando valores mximos del ttulo de anticuerpos a los 80 das despus de la infeccin (Buhles et al, 1974; Maeda et al, 1987). El ttulo de anticuerpos antiehrlichia persiste elevado mientras la infeccin perdure (Ristic et al, 1972; Buhles et al, 1974; Weisiger et al, 1975). Como ocurre con otras enfermedades infecciosas, los altos ttulos de anticuerpos no confieren inmunidad protectora por lo que una nueva exposicin al agente causal podr originar de nuevo el cuadro de ehrlichiosis, aunque suele cursar de un modo menos grave (Buhles et al, 1974; Weisiger et al, 1975). Son dos las tcnicas serolgicas ms empleadas para el diagnstico de ehrlichiosis canina: la inmunofluroescencia indirecta y las tcnicas de enzimoinmunoensayo. La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la tcnica ms empleada tanto en medicina veterinaria como en medicina humana y presenta una alta sensibilidad y especificidad para el diagnstico de E. canis (Ristic et al, 1972; Ristic y Holland, 1993; Waner et al, 2000b). En la actualidad, la IFI se sigue considerando la tcnica diagnstica de referencia (Neer et al, 2002). Emplea como antgeno cultivos celulares infectados (Dawson et al, 1991). En relacin con su especificidad, se ha comprobado la ausencia de reacciones cruzadas con un gran nmero de agentes: Leptospira canicola, Brucella canis, herpesvirus canino, virus de la parainfluenza, Borrelia burgdorferi y diversas Rickettsias como R. tsutsugamushi, R. canada, R. burnetti, R. mooseri, R. akari (Ristic et al, 1972; Magnarelli y Anderson, 1993).
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Se ha sealado la existencia de reacciones cruzadas entre diferentes especies de la familia Ehrlichiaceae, siendo stas ms intensas entre las especies del mismo gnero, aunque los ttulos son siempre ms elevados para el agente que est causando la infeccin (Woody y Hoskins, 1991). Existe una fuerte reaccin cruzada entre E. canis y N. sennetsu (Ristic et al, 1981), E. chaffeensis (Anderson et al, 1991; Dawson et al, 1991), E. ruminantium (Kelly et al, 1994b; Matthewman et al, 1994a) y ms ligeramente con N. helminthoeca (Rikihisa et al, 1991). Es importante sealar la ausencia de reaccin cruzada entre E. canis y E. platys (Greene y Harvey, 1984) y entre E. canis y A. phagocytophilum (Ristic et al, 1976). Recientemente se han comercializado pruebas serolgicas de muestreo que emplean la tecnologa ELISA, para su empleo rpido en la propia clnica veterinaria, con un valor cualitativo y no cuantitativo. Se ha observado una buena correlacin entre los resultados de estas tcnicas de ELISA y la inmunofluorescencia indirecta con una sensibilidad igual o superior al 71% y una especificidad que puede llegar al 100%. La sensibilidad de estas pruebas disminuye para valores del ttulo de anticuerpos menores de 1:320 (Waner et al 2000b; Harrus et al, 2002), por lo que en caso de sintomatologa compatible y resultado negativo, sera aconsejable repetir la prueba en una o dos semanas, para dar tiempo a un aumento significativo del ttulo de anticuerpos en el caso de infecciones agudas. Estas pruebas rpidas pretenden, ante todo, tener un valor orientativo, siendo la especificidad y sensibilidad superior en el caso de la IFI (Waner et al, 2000b; Harrus et al, 2002). Tambin se han utilizado, aunque con menos frecuencia, otras tcnicas diagnsticas como el inmunoblot, con el que se puede detectar una banda polipeptdica de 25-kd en las fases precoces de la enfermedad (Nyindo et al, 1991). Con las tcnicas de inmunoblot se puede tipificar con ms precisin el agente causal, diferenciando entre las diferentes especies ehrlichiales que pueden dar una reaccin serolgica cruzada (Greene, 1995). Existen otros mtodos tiles para la realizacin de muestreos amplios como la aglutinacin
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Diagnstico
en placa de ltex, si bien los resultados deben confirmarse posteriormente con la inmunofluorescencia indirecta.
3.9.3.2.3. Diagnstico molecular La reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction o PCR) es una tcnica molecular basada en las propiedades bioqumicas del ADN, asociadas a la composicin y secuencia de nucletidos. La PCR emplea segmentos cortos y simples de nucletidos, llamados cebadores, cuyas secuencias son complementarias de las secuencias del ADN del organismo que se investiga. La amplificacin de los cebadores permite la identificacin del ADN bacteriano. Los cebadores y otros reactivos necesarios para que se produzca la reaccin en cadena de la polimerasa se aaden a un volumen de solucin que contiene ADN representativo de la muestra de estudio, incluido ADN del hospedador y del microorganismo que se busca. La muestra puede ser cualquier tejido del hospedador que pueda portar al agente investigado (Sellon, 2003). Los cebadores empleados para la deteccin de agentes ehrlichiales pueden ser genricos o especie-especficos. Los laboratorios de diagnstico suelen emplear cebadores genricos y, cuando el resultado es positivo, emplean cebadores especie-especficos (Cohn, 2003). Existen variaciones de la tcnica segn los cebadores empleados, la concentracin de los reactivos, la temperatura y/o la duracin de cada ciclo. El protocolo a utilizar no est consensuado a nivel general para todos los laboratorios, debindose en cualquier caso optimizar y homogeneizar las condiciones de la tcnica en cada laboratorio (Kakoma et al, 2000; Cohn et al, 2003) Si bien en principio, el diagnstico molecular parece el ms especfico y fiable en cuanto a la deteccin de organismos, tiene tambin sus limitaciones. As la extremada sensibilidad de estas pruebas, puede conducir con facilidad a resultados falsos positivos por contaminacin. Por otro lado, tras la muerte del microorganismo investigado, sus cidos nucleicos pueden permanecer en el hospedador, sin que el periodo de permanencia de los mismos se conozca en la actualidad (Sellon, 2003).
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Aunque es menos probable, se pueden observar falsos negativos debido a la presencia en la muestra de inhibidores de la PCR, como la heparina. Tambin la eleccin de la muestra puede condicionar los resultados. Las ehrlichias y fundamentalmente Ehrlichia canis podran permanecer secuestradas en clulas de tejidos del sistema mononuclear fagocitario (bazo, mdula sea); generalmente las muestras empleadas en el diagnstico rutinario proceden de sangre del paciente, por lo que se podra obtener resultados negativos en sangre y existir Ehrlichia canis secuestrada en otros tejidos (Harrus et al, 1998a) Al comparar la PCR con otras tcnicas diagnsticas, se observa que su sensibilidad para la deteccin de E. canis tanto en sangre como en otros tejidos, parece ser similar o ligeramente inferior a la de otras tcnicas de uso habitual como la IFI o el ELISA (Iqbal et al, 1994b; Iqbal y Rikihisa, 1994), por lo que las pruebas de diagnstico molecular no deben suplir a las pruebas serolgicas en el diagnstico de la ehrlichiosis y deben considerarse pruebas complementarias a las tradicionalmente empleadas (Kakoma et al, 2000; Sellon, 2003). El Grupo de Estudio de Enfermedades Infecciosas del Colegio Americano de Medicina Interna Veterinaria recomienda que el empleo de tcnicas de PCR para el diagnstico de ehrlichiosis canina debe ir siempre acompaado de la realizacin de pruebas serolgicas (Neer et al, 2002).
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Tratamiento
2.10. TRATAMIENTO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA
A lo largo de la historia y desde las primeras descripciones de la ehrlichiosis canina, se han empleado en el tratamiento de la ehrlichiosis un gran nmero de frmacos como el tripn azul, acaprina, gonacrina, sales orgnicas de antimonio y de arsnico y solucin salina formolada, aunque con todos ellos, la respuesta fue decepcionante (Ewing, 1969; Ghorbel et al, 1993a). Algunos antimicrobianos como la sulfametacina, sulfameracina, sulfonamida y penicilina tampoco tuvieron xito en el tratamiento de esta enfermedad (Ewing, 1969; Breitschwerdt, 1995). La tetraciclina y los antibiticos de su familia han sido tradicionalmente los frmacos efectivos empleados para el tratamiento de la ehrlichiosis (Huxsoll et al, 1970; Bhules et al, 1974). Aunque la tetraciclina y la oxitetraciclina siguen manteniendo su eficacia, son la doxiciclina y la minociclina los frmacos de este grupo ms empleados en la actualidad, debido a su excelente absorcin y a su sencilla administracin una vez al da (Shaw y Rubin, 1986; Troy y Forrester, 1990; Neer et al, 2002), en comparacin con la dosificacin de las otras tetraciclinas cada 8 horas y en ayunas. Adems, la oxitetraciclina puede ser nefrotxica, mientras que la baja toxicidad renal de la doxiciclina hace recomendable su empleo en perros con insuficiencia renal (Van Heerden e Immelman, 1979). Hay que tener en cuenta que cualquiera de los frmacos incluidos en este grupo de antibiticos produce decoloracin dental en cachorros. La doxiciclina acta favoreciendo la fusin entre los fagosomas, donde se encuentran las ehrlichias, y los lisosomas. Tambin posee actividad bacteriosttica, se implanta en los ribosomas de la bacteria e inhibe, de este modo, la sntesis de protena bacteriana (Brouqui y Raoult, 1990). Se han empleado diversos protocolos de tratamiento con la doxiciclina (Van Heerden e Immelman, 1979; Green y Harvey, 1984), aunque
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actualmente se aconseja administrar la doxiciclina en dosis diaria de 10mg/kg (Sainz et al, 2000c; Neer et al, 2002). En cuanto a la duracin del tratamiento, si en un principio se recomendaron tratamientos de 7 a 14 das (Neer, 1998; Breitschwerdt 1998a, Breitschwerdt, 1998b), la recomendacin actual es la de mantener el tratamiento durante 28 das (Breitschwerdt, 1998b; Sainz et al, 2000c; Neer et al, 2002). Los protocolos de tratamiento ms cortos pueden dar lugar a una mejora inicial del paciente, pero los sntomas suelen volver a aparecer (Sainz et al, 2000c). El cloranfenicol se ha venido empleando en cachorros, para evitar la coloracin dental que se producira al emplear tetraciclinas a esa edad, y en hembras gestantes o lactantes (Troy y Forrester, 1990; Woody y Hoskins, 1991). Los protocolos utilizados varan de los 15 a los 50 mg/kg cada 8 horas durante 14 das, va oral, intravenosa o subcutnea (Troy y Forrester, 1990; Woody y Hoskins, 1991). Su efectividad es cada vez ms controvertida (Brouqui y Raoult, 1992, Troy y Forrester, 1990) y ello, unido a su toxicidad sobre la mdula sea, hacen que no sea un frmaco de primera eleccin, sobretodo en perros anmicos y/o trombocitopnicos (Troy y Forrester, 1990). Recientemente y tambin con el fin de evitar la coloracin dental producida por la doxiciclina en nios, se ha empleado con xito la rifampicina en el tratamiento de la ehrlichiosis granuloctica humana (Krause et al, 2003). Hasta el momento no se han encontrado estudios sobre el empleo de este antibitico en el tratamiento de la ehrlichiosis canina. El dipropionato de imidocarb es una diamidina que ha mostrado gran actividad tanto curativa como profilctica en babesiosis canina (Kuttler, 1980). Durante ms de 20 aos, ste frmaco ha mostrado ser un efectivo tratamiento frente a la ehrlichiosis canina en dos dosis separadas de 5-7 mg/kg, va intramuscular o subcutnea, cada 15 das (Matthewman et al, 1994b; Sainz et al, 2000c). Este frmaco es clnicamente tan eficaz como la doxiciclina, respondiendo favorablemente los perros al tratamiento en 24-72 horas, en el caso de formas agudas o crnicas leves. No obstante, se ha observado una
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Tratamiento
normalizacin ms lenta, tanto del recuento plaquetario como del proteinograma, en aquellos casos tratados con dipropionato de imidocarb (Sainz et al, 2000c). Con relativa frecuencia se presentan, tras la administracin de dipropionato de imidocarb, efectos secundarios como disnea, sialorrea, diarrea, exudado nasal, taquicardia y temblores (Woody y Hoskins, 1991), que parecen ser debidos a un efecto anticolinesterasa provocado por el frmaco (Ogunkoya et al, 1981; Adenyanju y Aliu, 1982). Estos signos remiten tras la administracin de sulfato de atropina a dosis de 0.05mg/kg (Ogunkoya et al, 1981).
Se han empleado protocolos que emplean conjuntamente doxiciclina y dipropionato de imidocarb; sin embargo, su administracin conjunta no parece aportar beneficio por lo que no es aconsejable (Sainz et al, 2000c). La enrofloxacina para el tratamiento de la ehrlichiosis canina se ha empleado a dosis de 5 mg/kg cada 24 horas durante 15 das (Kontos y Athanasiou, 1998). Sin embargo, estudios posteriores demostraron la falta de respuesta a este frmaco de perros con ehrlichiosis (Neer et al, 1999). El empleo de ciprofloxacina para el tratamiento de la ehrlichiosis humana tampoco ha sido efectivo (Brouqui y Raoult, 1992). No suele ser necesario instaurar un tratamiento de apoyo en el curso de la ehrlichiosis canina ya que la terapia especfica por s sola suele conseguir una buena respuesta. No obstante, segn la gravedad del proceso pueden ser necesarios algunos tratamientos de soporte como fluidoterapia o transfusiones (Woody y Hoskins, 1991; Neer et al, 1998). Adems, en ocasiones se necesita instaurar un tratamiento especfico frente a determinadas complicaciones (como la glomerulonefritis) asociadas a una infeccin crnica por E. canis (Cohn, 2003). En general, se recomienda evitar el uso de glucocorticoides, a no ser en caso de trombocitopenias o anemias graves que puedan condicionar la vida del animal, en las que
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su empleo puede disminuir la destruccin inmunomediada de plaquetas o eritrocitos asociada a la infeccin (Grindem et al, 1999). La dificultad que, en ocasiones, existe para diferenciar la ehrlichiosis de otras anemias y/o trombocitopenias inmunomediadas o autoinmunes, tambin puede justificar, el empleo de glucocorticoides, a la espera de los resultados serolgicos (Troy y Forrester, 1990; Neer et al, 1998; Frank y Breitschwerdt, 1999). Los glucocorticoides tambin pueden estar indicados en el curso de poliartritis, vasculitis o meningitis asociadas a la infeccin (Maretzki et al, 1994; Neer et al, 1998; Meinkoth et al, 1998). En todo caso, los corticoides se deben emplear siempre asociados al tratamiento especfico frente a la ehrlichiosis ya que, de otra manera, podran agravar la infeccin (Breitschwerdt, 2003).
2.10.1 EVOLUCIN POST-TRATAMIENTO La evolucin de la eficacia teraputica debe abordar el estudio de diferentes aspectos. La mejora clnica precede en el tiempo a la normalizacin de la analtica. En este sentido, a las 24-48 horas de iniciado el tratamiento suele apreciarse una mejora clnica importante en perros en fase aguda o fase crnica leve de la enfermedad (Breitschwerdt et al, 1998b). Sin embargo, la eficacia clnica del tratamiento se puede retrasar incluso 6 semanas, en formas crnicas (Woody y Hoskins, 1991; Sainz, 1996). Los parmetros laboratoriales que ms rpidamente se normalizan son los recuentos de eritrocitos y de plaquetas, normalizndose habitualmente a los 14 das de tratamiento (Neer et al, 1998; Frank y Breitschwerdt, 1999; Neer et al, 2002). Incluso en casos crnicos, si el cuadro clnico y los parmetros hematolgicos no mejoran en una o dos semanas desde el inicio del tratamiento, se debera reevaluar el diagnstico, ya que la falta de mejora puede ser debida a una infeccin crnica grave o a la existencia de coinfeccin con otro microorganismo o de una concurrencia con una enfermedad no infecciosa (Cohn, 2003). La mayora de los casos que no responden al tratamiento, en ausencia de otra infeccin, presentan insuficiencia renal y/o aplasia medular severa (Sainz et al, 2000c). El proteinograma tarda en normalizarse entre 3 y 9 meses, siendo empleado
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Tratamiento
rutinariamente para confirmar la presencia de una buena respuesta al tratamiento a largo plazo. El seguimiento de la evolucin de la enfermedad en base a una monitorizacin serolgica se ve dificultada por el hecho de que, si bien los ttulos de anticuerpos suelen empezar a disminuir entre 3 y 9 meses tras el tratamiento de la enfermedad, muchas veces pueden mantenerse elevados durante largos periodos de tiempo, incluso varios aos, sin ninguna otra alteracin clnica ni laboratorial (Perille y Matus, 1991; Bartsch y Greene, 1996; Harrus et al, 1998c; Frank y Breitschwerdt, 1999; Sainz et al, 2000c). An queda por determinar el significado real de esta persistencia en el ttulo de anticuerpos. En teora, un buen mtodo de eleccin para evaluar la persistencia de una infeccin por Ehrlichia sera la realizacin de PCR de un aspirado esplnico; otros tejidos que pueden emplearse para el PCR seran mdula sea o sangre, pero la sensibilidad de la tcnica es inferior (Iqbal et al, 1994; Breitschwerdt et al, 1998b; Harrus et al, 1998a). La PCR debera negativizarse tras el tratamiento de la enfermedad; sin embargo no se han encontrado estudios que verifiquen esta afirmacin. Se desconoce el tiempo de permanencia del ADN de Ehrlichia canis, tras un tratamiento eficaz, en el hospedador. Sin embargo, algunos autores aconsejan volver a tratar con igual o diferente protocolo aquellos animales tratados correctamente en los que la PCR sea positiva y no se observe una resolucin clnica y laboratorial (Cohn, 2003).
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2.11. PROFILAXIS
La transmisin obligada de la ehrlichiosis a travs de garrapatas, exceptuando la transmisin por transfusin sangunea, hace que la profilaxis de la infeccin est dirigida al control de garrapatas. Para evitar la transmisin, es necesario impedir la alimentacin de la garrapata, ya que es en ese periodo cuando se producir la transmisin. Las medidas profilcticas tambin deben aplicarse a aquellos animales diagnosticados de ehrlichiosis debido al riesgo de reinfecciones que estos animales tienen, ya que normalmente el medio en el que residen contina siendo el mismo y hay que romper la cadena epidemiolgica. Se han llevado a cabo diferentes estudios para valorar el tiempo necesario para la adquisicin y transmisin de agentes infecciosos por garrapatas durante la alimentacin de las mismas. En general esta transmisin es improbable para tiempos inferiores a 24 horas de permanencia de la garrapata fijada al hospedador, a partir de las 48 horas la transmisin es muy factible y el porcentaje de transmisin aumenta enormemente a partir de las 72 horas (Piesman y Spielman, 1980; Sood et al, 1997; Katavolos et al, 1998; Hodzic et al, 1998; Des Vignes et al, 2001). Estos estudios se han realizado sobre la transmisin de diferentes agentes ricketsiales, borrelias, babesias y Anaplasma phagocytophilum. Parece ser que el tiempo necesario para la transmisin de A. phagocytophylum puede ser ligeramente inferior al de otros agentes (Katavolos et al, 1998; Hodzic et al, 1998). Se han observado tambin variaciones en los tiempos de transmisin segn la especie de garrapata y hospedador y segn el estadio evolutivo de la garrapata (Kidd y Breitschwerdt, 2003). A conocimiento del autor no existen estudios realizados sobre los tiempos de transmisin de E. canis por Rhipicephalus sanguineus, aunque los resultados anteriores podran ser extrapolables.
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Profilaxis
Rhipicephalus sanguineus, tambin conocida como garrapata marrn del perro, es el vector de E. canis, por lo que nos centraremos en esta garrapata para investigar los posibles tratamientos profilcticos. El principal objetivo del tratamiento profilctico debe ir encaminado a evitar la alimentacin de la garrapata, bien a travs de un efecto repelente, un efecto letal instantneo o un efecto que permita la separacin de la garrapata del hospedador antes del tiempo necesario para la transmisin del agente infeccioso, es decir, antes de 24 horas. A este principal objetivo ha de sumarse la obtencin de un producto cuyo efecto perdure sobre el animal y carezca de toxicidad. El nico producto comercializado para perros que posee efecto anti-picadura y efecto activador de la separacin de la garrapata del hospedador, unido a un efecto prolongado y un elevado margen de seguridad es el collar de amitraz (Folz et al, 1986; Elfassy et al, 2001; Bourdeau, 2002). Con los piretroides y con el propoxur se observa un efecto knock down o de muerte rpida (Bourdeau, 1999). Los nicos productos comercializados con estos principios activos carecen de efecto residual sobre el animal, exceptuando dos productos con permetrinas (Defendog de laboratorios Virbac y Exspot de laboratorios Shering Plough). Sin embargo, no existen estudios, en conocimiento del autor, sobre la eficacia de estos productos comerciales en la prevencin de infestaciones por R. sanguineus. Se han llevado a cabo diversos estudios para determinar la eficacia de distintos productos, comercializados en veterinaria, a la hora de repeler o matar rpidamente garrapatas que entran en contacto con perros. Muchos de estos estudios realizan una comparacin de la eficacia de dos productos, aunque no siempre es fcil comparar los resultados de distintos trabajos, al existir una gran variacin en los mtodos y materiales (Kidd y Breitschwerdt, 2003). Segn estos estudios los collares de amitraz, el fipronil, y la asociacin de permetrina e imidacloprid seran eficaces en el control de infestaciones por R. sanguineus al menos en un 90% hasta 3 semanas despus de la aplicacin del primer
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tratamiento (Hunter, 1997; Estrada-Pea y Ascher, 1999; Ahn et al, 2000; Young et al, 2003; Cruthers et al, 2003). El tiempo empleado por estos productos para matar las garrapatas se estima inferior a 24 horas. Se ha observado que los collares con deltametrina poseen tambin actividad garrapaticida; sin embargo su eficacia es inferior a la de los collares con amitraz (EstradaPea y Ascher, 1999). La evaluacin comparada entre la aplicacin de fipronil en spot-on y un collar de amitraz, muestra tambin un mayor efecto garrapaticida en los perros a los que se les aplic amitraz (Gil et al, 1998). Hasta el momento slo se ha realizado un estudio de campo que haya investigado la eficacia de un producto en la prevencin de la transmisin de E. canis por R. sanguineus. Los autores de este trabajo afirman que el empleo mensual de fipronil es efectivo en la prevencin de la ehrlichiosis canina monoctica (Davoust et al, 2002). Otro punto importante en la profilaxis de las infecciones transmitidas por garrapatas sera la actuacin a nivel del medio ambiente y un buen medio para ello sera conseguir romper el ciclo biolgico. As el empleo de inhibidores de formas juveniles como el piriproxifeno en unin a un adulticida permitira la inhibicin de los huevos producidos por las garrapatas supervivientes (Bourdeau, 2002).
Finalmente, algunos autores han sealado la posibilidad de administrar con fines preventivos tetraciclinas a dosis bajas en zonas endmicas, con la controversia que estas medidas ocasionan debido a la posibilidad de crear resistencias (Neer et al, 2002)
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Citometra de flujo
2.12. CITOMETRA DE FLUJO

La citometra de flujo es un poderoso mtodo analtico que permite detectar y cuantificar estructuras y funciones de clulas individuales o partculas biolgicas aisladas, a elevada velocidad y siguiendo una aproximacin multiparamtrica (Stewart, 1997). Estas caractersticas la convierten en una tcnica especialmente valiosa para caracterizar poblaciones celulares heterogneas a travs de un amplio rango de propiedades biolgicas (Rosell, 2002). Esta tcnica tiene aplicacin tanto cualitativa (presencia o no de un determinado tipo celular) como cuantitativa. Actualmente son los estudios cuantitativos los que ms inters suscitan. Su aplicacin en medicina humana se encuentra dirigida a la identificacin de inmunodeficiencias, caracterizacin de la respuesta inmunitaria frente a distintas enfermedades, monitorizacin de la condicin clnica de pacientes con SIDA, caracterizacin del inmunofenotipo de leucemias y linfomas y monitorizacin de la respuesta en transplante de rganos, (Knapp, 1992; Keren, 1994; Grindem, 1996; Shanahan, 1997). En medicina veterinaria su empleo se ha desarrollado considerablemente en la ltima dcada (Culmsee y Nolte, 2002) y de manera semejante a su aplicacin en medicina humana, se ha empleado en el estudio de infecciones por los virus de la leucemia felina (FeLV) y de la inmunodeficiencia felina (FIV), en la evaluacin de la respuesta al transplante de rganos en modelos caninos y en la caracterizacin del inmunofenotipo en linfomas y en distintas infecciones (Bucci et al, 1998; Fuller et al, 1994; Chabanne et al, 2000; Bourdoiseau et al, 1997; Caswell et al, 1997; Culmsee et al, 2001; Weiss, 2001a; Weiss, 2001b; Weiss, 2001c; Weiss, 2002; Winnicka et al, 2002; Guglielmino et al, 2004).
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Debido al creciente nmero de parmetros biolgicos analizables y al desarrollo de citmetros de coste accesible, dotados de sistemas informticos, a la vez de uso relativamente sencillo y de alta capacidad operativa, la citometra de flujo tiene en la actualidad un amplio abanico de aplicaciones en muchos campos bsicos y clnicos, donde se requiera identificar clulas o partculas biolgicas, caracterizar sus propiedades o respuestas funcionales y, en algunos casos, separarlas fsicamente (Rosell, 2002). La citometra de flujo permite realizar un estudio inmunofenotpico de diferentes poblaciones celulares (Stewart, 1997). El objetivo del estudio inmunofenotpico de clulas sanguneas es enumerar (identificar y contar) los diferentes tipos de leucocitos. La sangre se obtiene por puncin venosa en tubos con el anticoagulante apropiado. Se realizan alicuotas de esta sangre en diferentes tubos y se enfrenta a diferentes combinaciones de anticuerpos monoclonales conjugados con colorantes fluorescentes (fluorocromos). Se procede a la eritrolisis de las muestras y la suspensin celular atraviesa el citmetro de flujo, en flujo continuo, clula a clula (Calvelli et al, 1993). Las clulas y los fluorocromos que llevan adheridos interactan con la luz lser cuando pasan a travs de la misma. La emisin fluorescente y la luz dispersada por las clulas es recogida y convertida en seales electrnicas en el citmetro de flujo (McKoy, 1994). Durante el estudio inmunofenotpico por citometra de flujo se identifican de 4 a 5 caractersticas diferentes de cada clula al tiempo que sta fluye a travs del haz de luz lser. La luz dispersada es recogida desde dos ngulos: uno a 0 en la misma direccin del haz de luz, llamado dispersin frontal de luz lser (FS) y otro a 90 del haz, llamado dispersin lateral de luz lser (SS). La informacin electrnica es digitalizada para su anlisis inmediato o almacenada en forma de lista de datos que puede ser analizada posteriormente con un programa de anlisis de datos (Grindem, 1996; Stewart, 1997). Esta tcnica es capaz de llevar a cabo la identificacin de clulas gracias a la combinacin de sus propiedades de dispersin de la luz y a sus antgenos de superficie unidos a anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos (Shanahan, 1997).
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Citometra de flujo
Todos los componentes del citmetro de flujo requieren ser evaluados por un adecuado programa de control de calidad. El citmetro de flujo emplea una luz lser monocromtica, con una nica longitud de onda, altamente focalizada y polarizada. La morfologa celular se determina por la observacin de las diferencias en la dispersin de la luz entre las clulas. Tambin realiza una lectura de la intensidad de fluorescencia celular, permitiendo una medida cuantitativa de la tincin celular. Con esta tecnologa se pueden analizar un gran nmero de clulas, aproximadamente 1000 clulas al segundo. El estudio inmunofenotpico por citometra de flujo sigue los siguientes pasos: 1. Las clulas son identificadas por sus propiedades de dispersin de la luz. 2. A continuacin son definidas por su unin a anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos. El poder de esta tcnica reside en su capacidad de anlisis multiparamtrico de cada clula. Combinando las propiedades de dispersin de la luz y la emisin de fluorescencia sobre todas y cada una de las clulas, las poblaciones celulares con caractersticas comunes pueden ser identificadas y cuantificadas (Shanahan, 1997). La dispersin de la luz se emplea para diferenciar las clulas por tamao, contorno o complejidad interior (granularidad). La combinacin de la dispersin frontal y lateral de la luz se recoge y analiza en cada clula (McKoy, 1994). La dispersin frontal de la luz se encuentra relacionada con el tamao celular, mientras que la dispersin lateral de la luz corresponde al contorno y complejidad celular interna (McKoy, 1994). Los linfocitos dispersan poca luz frontal y lateralmente, ya que son pequeos, de contornos suaves y de escasa granularidad. Los granulocitos son grandes y tienen ncleos multilobulados y numerosos grnulos intracitoplasmticos por lo que dispersan gran cantidad de luz tanto en direccin frontal como lateral. Los monocitos se
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encuentran entre medias de ambas poblaciones, son ms grandes que los linfocitos y menos complejos internamente que los granulocitos (Grficos 2 y 3). El registro de dispersin de luz coloca cada uno de los ngulos de dispersin en un eje de coordenadas, siendo indiferente su disposicin (Stewart, 1997). Los datos pueden ser emitidos como histogramas monoparamtricos o biparamtricos. Los histogramas monoparamtricos son curvas de probabilidad en los que el nmero de clulas o eventos son punteados segn la intensidad de la seal. Los histogramas biparamtricos muestran la relacin entre dos caractersticas celulares independientes (Owens y Locken, 2002).
2.12.1.
DETECCIN
DE
ANTGENOS
DE
SUPERFICIE
POR
INMUNOFLUORESCENCIA
Diferentes determinantes celulares de superficie de origen proteico, lipdico o glucdico pueden ser empleados para identificar tipos celulares especficos. Los anticuerpos monoclonales vienen definidos por su capacidad de unin especfica a esos determinantes. Los anticuerpos monoclonales son conjugados con fluorocromos que permiten su identificacin a travs de la emisin de fluorescencia (Keren, 1994; Stewart, 1997). La excitacin de los fluorocromos por una fuente de luz monocromtica produce la emisin de luz en un espectro caracterstico, identificable en un citmetro de flujo o en un microscopio de fluorescencia. Cada clula es analizada en base a la existencia o ausencia de emisin de fluorescencia, lo que est relacionado con sus caractersticas de membrana. Los fluorocromos ms habituales para estudios de inmunofluorescencia de dos colores son el Isotiocianato de fluorescena (FITC) y la ficoeritrina (PE). El fluorocromo FITC emite luz verde y el PE, luz roja, cuando son excitados por el haz de luz lser del citmetro de flujo.
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Citometra de flujo
La Fluorescena es una pequea molcula que puede ser fcilmente conjugada con protenas gracias a un grupo isotiocianato. Es excitable a 488nm (lser de argn) y la emisin mxima de fluorescencia se produce a 530nm, por lo que esta fluorescencia es verde para el ojo. Sin embargo, tambin es emitida por esta molcula cierta cantidad de luz amarilla y naranja. Es muy estable en pH neutro, pero en condiciones cidas su fluorescencia se reduce (Owens y Loken, 2002). La Ficoeritrina - es una molcula grande (ms grande que la IgG) que aparece de forma natural como parte del aparato fotosinttico de bacterias, algas y plantas. Es excitable a 488nm y su espectro de emisin mxima de fluorescencia se sita en los 575nm. La conjugacin de ficoeritrina a anticuerpos es mucho ms compleja que la de fluorescena. Sus propiedades fluorescentes son bastante independientes del pH, aunque un pH extremo puede disociarla (Owens y Loken, 2002). La emisin del espectro de luz de la fluorescena y la ficoeritrina son diferenciables y el pico de emisin se encuentra claramente distanciado por lo que estos fluorocromos pueden emplearse conjuntamente. En la pgina siguiente podemos observar un grfico ilustrativo de los espectros de emisin de tres fluorocromos diferentes.
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500-570
570-590
700
800
Grfico 2.12.1.- Espectro de emisin de tres fluorocromos tras la excitacin con el lser de 488 nm. (FITC = isotiocianato de fluorescena; PE = ficoeritrina; ECD = energy coupled dye).
2.12.2 COMPONENTES DEL CITMETRO DE FLUJO
Los componentes de un citmetro de flujo que, con mayor o menor complejidad tcnica, se encuentran en la mayora de los instrumentos actuales se representan en el dibujo 2 y son:
2.12.2.1. Sistema ptico La ptica del citmetro de flujo enfoca la iluminacin de las partculas, detecta la luz dispersada por ellas y selecciona la fluorescencia emitida, a medida que las partculas atraviesan el haz luminoso (Owens y Loken, 2002). El sistema ptico incluye tanto los componentes para la manipulacin del haz de luz lser para la iluminacin de las clulas como las lentes de recoleccin de luz, los filtros
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Citometra de flujo
y los detectores empleados para recoger las seales procedentes de las clulas (Stewart, 1997) .
2.12.2.2. Sistema de iluminacin Produce un haz de luz que ilumina la muestra. La mayora de los citmetros utilizan luz lser, por ser coherente, monocromtica, polarizada, estrecha, estable y de intensidad conocida, aunque hay sistemas que disponen de lmparas de mercurio (Owens y Loken, 2002). El citmetro puede disponer de un solo haz de luz lser (en ese caso su longitud de onda es de 488nm) o tener ms de un haz de luz lser, lo que permite emplear fluorocromos excitables a longitudes de onda diferentes de 488nm.
2.12.2.3. Sistema hidrulico Rodea la suspensin celular en flujo con una vaina externa, formada por un fluido libre de partculas, que mueve la muestra a velocidad constante, a travs de la zona de deteccin (cmara de flujo), donde las clulas son expuestas una a una al haz iluminador (Owens y Loken, 2002).
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AGUJA
FLUORESCENCIA
FOCO DEL LASER
GRFICO 2.12.2- Esquema que ilustra el paso de clulas por el sistema hidrulico en forma de flujo individual y la incidencia del haz de lser sobre cada una de estas clulas.
2.12.2.4. Sistema electrnico Procesa las seales procedentes de los fotodetectores, es decir, se encarga de la deteccin y amplificacin de la seal en forma analgica y la posterior transformacin de la seal analgica en digital. El sistema electrnico tambin controla el proceso de separacin celular (Cell Sorting). Existen dos tipos de fotodetectores empleados en los citmetros de flujo: los fotodiodos y los tubos fotomultiplicadores.
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Citometra de flujo
Los fotodiodos son empleados como detectores de dispersin de luz frontal, ya que su baja sensibilidad es compensada por la intensidad de la luz lser.
Los tubos fotomultiplicadores (PMT) son detectores de alta sensibilidad y se emplean como detectores de dispersin lateral de luz y detectores de fluorescencia.
Los fotodetectores convierten los fotones recibidos por el detector en impulsos elctricos proporcionales en magnitud al nmero de fotones recibidos. Cada fotodetector medir una caracterstica celular distinta, por lo que se emplearn tantos fotodetectores como caractersticas celulares se quieran analizar en cada protocolo (Stewart, 1997). La transformacin de la seal analgica en digital se lleva a cabo por un conversor analgico-digital.
2.12.2.5. Sistema de adquisicin y anlisis de datos Permite la adquisicin multiparamtrica de datos y el anlisis en tiempo real y en modo lista, as como el anlisis restringido a subpoblaciones seleccionadas (gating). Los datos se presentan en forma de histogramas monoparamtricos o representaciones biparamtricas de la distribucin, junto con informacin estadstica de las distribuciones (Owens y Loken, 2002). La mayora de los citmetros son compatibles con ordenadores y sistemas operativos comunes (plataformas MS-DOS, Windows y McIntosh).
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2.12.3 GRFICOS ANEXOS DE CITOMETRA DE FLUJO (Grficos e imgenes cedidos por Coulter-Beckman )
GRFICO
2.12.3.en
Representacin funcin de la
GRFICO
2.12.4.de la
Representacin fluorescencia
biparamtrica
biparamtrica
dispersin frontal y lateral, anlisis morfolgico celulares. de las poblaciones
emitida por la poblacin sesgada de linfocitos.
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Citometra de flujo
DIBUJO 2.12.5.- Esquema de un citmetro de flujo. En l se representan los diferentes componentes del citmetro: Sistema de iluminacin: foco de luz lser (Air-cooled argon ion laser). Sistema hidralico (high sensitivity quarz flow cell). Sistema ptico: filtros, fotodiodos o receptores de dispersin frontal de luz laser (Forward scatter = FS), fotomultiplicadores o detectores de dispersin lateral de luz laser (Side scatter = SS) y de fluorescencia. Existen diferentes fotomultiplicadores para la deteccin de fluorescencia, del FL1 al FL4; cada uno de ellos recibe la dispersin procedente de diferentes longitudes de onda emitida por los diferentes fluorocromos empleados. El FL1 recibe fluorescencia entre 500 y 550 y se emplea para la recepcin de fluorescencia procedente de la fluorescena; y el FL2 entre 550 y 600 y se emplea para la deteccin de fluorescencia procedente de la ficoeritrina.
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FOTO 2.12.1.- Imagen de los componentes de un citmetro de flujo.
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MATERIAL Y MTODOS
Material y mtodos
3. MATERIAL Y MTODOS
3.1. PLAN DE TRABAJO

Ante los objetivos planteados en la introduccin de este estudio nos propusimos el siguiente plan de trabajo:
Seleccin de poblaciones caninas mantenidas en condiciones similares a partir de las cuales se pudiesen localizar individuos con ehrlichiosis e individuos sanos y sobre los cuales se pudiese aplicar el tratamiento previsto en este estudio.
Inclusin y exclusin de los individuos objeto del estudio en base al examen clnico general, resultados de la serologa por inmunofluorescencia indirecta frente a Ehrlichia canis y los criterios de seleccin detallados en el apartado siguiente.
Organizacin de un plan de trabajo encaminado a la realizacin del tratamiento y de los sucesivos controles incluyendo las extracciones de sangre pertinentes a los animales para el procesamiento simultneo de la sangre para hematologa y citometra de flujo.
Estudio comparativo de datos hematolgicos y de la distribucin de las poblaciones linfocitarias en animales sanos y animales con ehrlichiosis, as como el anlisis de las posibles correlaciones entre los distintos parmetros biopatolgicos investigados.
Estudio analtico sobre la evolucin de datos hematolgicos y de las poblaciones linfocitarias en animales con ehrlichiosis tras la instauracin de un tratamiento con dipropionato de imidocarb.
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Material y mtodos
3.2. SELECCIN DE LOS ANIMALES
Todos los animales incluidos en el estudio se seleccionaron de dos protectoras de la provincia de Valencia: Protectora Jaime Ortola en el trmino Municipal de Torrent (Valencia), la cual contaba con 133 animales. Las condiciones de los animales eran similares entre s, encontrndose alojados la mitad de ellos en jaulas colectivas con terreno de campo y zona de descanso cementada y la otra mitad alojados en vivienda y terreno circundante en rgimen de libertad. Sociedad Valenciana Protectora de Animales y Plantas (SVPAP) ubicada en el trmino Municipal de Paterna (Valencia), la cual contaba con 250 perros acogidos, alojados todos ellos en jaulas colectivas pavimentadas con cemento. Se cont con el consentimiento informado de los responsables de ambas colectividades para la realizacin de todo este estudio. Los animales fueron incluidos en dos grupos, atendiendo a los siguientes criterios: 1. Grupo 1 o grupo Control de animales sanos. Los criterios de inclusin de animales para el grupo 1 fueron: Los perros deban presentar un ttulo de anticuerpos determinado por inmunofluorescencia indirecta (IFI) frente a Ehrlichia canis negativo. Tambin deban presentar un ttulo de anticuerpos por IFI frente a Leishmania infantum negativo. Deban estar libres de sintomatologa clnica. Su exploracin fsica general deba ser normal. En los frotis sanguneos no se deban observar parsitos hemticos.
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Material y mtodos
2. Grupo 2 o grupo con Ehrlichiosis, constituido por perros afectados en fase subclnica y que seran objeto de tratamiento con dipropionato de imidocarb. Los criterios de inclusin de animales para el grupo 2 fueron: Los animales deberan presentar un ttulo de anticuerpos por IFI frente a Ehrlichia canis superior a la dilucin 1/80. Deberan presentar un ttulo de anticuerpos por IFI frente a Leishmania infantum inferior a la dilucin 1/100. En los frotis de sangre no se deba observar la presencia de parsitos hemticos. Se incluiran en este grupo animales libres de sintomatologa, que llevaran ms de 9 meses en la protectora y que no hubieran sido tratados anteriormente frente a ehrlichiosis. Con el fin de clasificar a los perros en estos 2 grupos, se llev a cabo una anamnesis detallada a los responsables de las colectividades, as como una exploracin fsica completa y una analtica sangunea a todos los perros de las protectoras. El estudio se llev a cabo en dos aos consecutivos, inicindose en ambas protectoras a finales del mes de septiembre. Concretamente, el estudio se comenz en la protectora Jaime Ortola, analizando un total de 117 perros, y al ao siguiente se repiti el mismo trabajo en la SVPAP donde se estudiaron 43 animales. Finalmente, el nmero de perros incluidos en el grupo con ehrlichiosis fue de 38 (25 de la protectora Jaime Ortola y 13 de la SVPAP), mientras que en el grupo control se incluyeron 18 (12 de la protectora Jaime Ortola y 6 de la SVPAP). Estas protectoras carecan inicialmente de programas profilcticos intensivos frente a infestaciones por garrapatas, debido a la escasez de recursos econmicos con que cuentan, la gran colectividad de la que se trata y el trnsito continuo de animales. En todos los animales residentes en las colectividades se realiz una profilaxis intensiva encaminada a eliminar la infestacin por garrapatas que padecan as como a evitar la posible existencia de nuevas infestaciones por garrapatas durante el estudio. El objetivo de estas medidas era
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Material y mtodos
intentar evitar reinfecciones por Ehrlichia canis. El tratamiento profilctico consisti en la aplicacin mensual de un spray de flumetrina al 0,3% y en la colocacin de un collar antiparasitario de amitraz (Kiltix) o de deltametrina (Scalibor) a todos los animales incluidos en la investigacin.
3.3. TRATAMIENTO
Los animales incluidos en el Grupo 1 no recibieron tratamiento alguno. Sin embargo, los perros del Grupo 2 fueron tratados con dos inyecciones subcutneas de dipropionato de imidocarb (Imizol) separadas por 15 das a dosis de 5mg/kg. El primer da de inoculacin del producto al animal se consider el da 0 del estudio en ese animal. Para paliar el dolor que se produce por la inyeccin de este frmaco, se diluy en suero fisiolgico al 50% y se aadieron 0,5 ml de lidocana por inyeccin.
3.4. PLANIFICACIN DE LOS CONTROLES

Todos los animales incluidos en el estudio fueron sometidos a unos controles programados, en los cuales, adems de realizar una exploracin fsica completa, se recogan muestras de sangre habitualmente de la vena yugular, si bien en aquellos animales en los que este procedimiento se vea dificultado, la extraccin se hizo de la vena ceflica.
En cada control se realizaba una hematologa completa, protenas totales, albmina, globulinas y serologa frente a Ehrlichia canis y frente a Leishmania infantum por IFI. Adems, se llevaba a cabo un estudio de las poblaciones linfocitarias mediante citometra de flujo.
En los animales incluidos en el Grupo 1 (grupo control) se realiz una sola extraccin de sangre). En los perros pertenecientes al Grupo 2 (grupo de tratamiento) se
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Material y mtodos
planificaron unos controles programados que estuvieron sujetos a algunas pequeas variaciones, en funcin de la disponibilidad tanto de los responsables de las colectividades caninas como de los propios perros. Concretamente, en estos animales del grupo 2, se llevaron a cabo 5 controles a lo largo del estudio: T0 (da 0): control realizado previamente a la primera inyeccin de dipropionato de imidocarb. T1: control realizado a los 15 das despus de la primera inyeccin de dipropionato de imidocarb T2: control realizado en torno de los 30 das despus de la primera inyeccin de dipropionato de imidocarb. T3: control realizado aproximadamente a los 90 das despus de la primera inyeccin de dipropionato de imidocarb. T4: control realizado haca los 180 das despus de la primera inyeccin de dipropionato de imidocarb.
3.5. RECOLECCIN DE LA SANGRE

La sangre, una vez extrada, se distribua en tres tubos, dos con anticoagulante EDTA (tetra-acetato de etilenediamina) y otro para extraccin de suero con gel que facilitaba la separacin del mismo. Las muestras con EDTA eran mantenidas a temperatura ambiente y en posicin horizontal hasta su procesamiento en el laboratorio. Una de las muestras en EDTA se emple para la realizacin de la hematologa completa y la otra, para citometra de flujo. La muestra para hematologa se procesaba siempre antes que la de citometra de flujo, pudiendo existir una variacin mxima entre ambos anlisis de +/- 3 horas. Desde su extraccin hasta el procesamiento pasaban un mximo de 6 horas (Calvelli et al, 1993).
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Material y mtodos
La muestra para separacin del suero se transportaba en posicin vertical y a temperatura ambiente hasta la llegada al laboratorio donde se proceda a centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos. Una vez extrado el suero, se realizaban dos alicuotas y se congelaban a 80C hasta su procesamiento para serologa y bioqumica.
3.6. HEMATOLOGA COMPLETA

Para la realizacin de la hematologa completa se emple un analizador hematolgico automtico (Sysmex F-820). Los parmetros medidos por el analizador fueron: Recuento de hemates Hematocrito Hemoglobina Volumen corpuscular medio (VCM) Hemoglobina corpuscular media (HCM) Concentracin media de la hemoglobina corpuscular (CMHC) Recuento de leucocitos Recuento plaquetario Para el recuento diferencial de blancos se procedi a la realizacin de extensiones sanguneas a partir de la sangre conservada en EDTA a la llegada al laboratorio. Una vez realizada la extensin sangunea se proceda a fijarla y teirla con tincin panptica. Una vez teidas las extensiones se montaban con Acrytol y se conservaban hasta su lectura. Se realizaba estudio microscpico del frotis sanguneo, llevando a cabo un recuento celular de 100 clulas nucleadas, obteniendo el recuento diferencial de las poblaciones leucocitarias: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos, monocitos y basfilos.
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Material y mtodos
3.7. BIOQUMICA SANGUNEA

Se valoraron, en muestras sricas, protenas totales, albmina, globulinas y cociente Albmina/Globulinas. La determinacin de las protenas totales y la albmina en suero se realiz por bioqumica hmeda medida en un espectofotmetro heios (Thermo Espectronic). Se emplearon reactivos para protenas totales y albmina de la marca Spinract . Una vez obtenidos los valores de protenas totales y albmina, las globulinas se obtuvieron por diferencia entre protenas totales y albmina. Posteriormente, se proceda al clculo del cociente Albmina/ Globulinas.
3.8. DIAGNSTICO INMUNOLGICO: INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

El diagnstico inmunolgico fue realizado por el Servicio de Diagnstico de Ehrlichiosis y Leishmaniosis Canina de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. La tcnica empleada tanto para el diagnstico de ehrlichiosis como de leishmaniosis fue la inmunofluorescencia indirecta (IFI). Su fundamento est basado en el empleo de la fluorescena como sustancia fluorescente que se puede unir a anticuerpos sin variar su especifidad. En el desarrollo de dicha tcnica, se enfrenta en una primera fase el suero problema con el antgeno. En el caso de que en el suero problema se encuentren anticuerpos especficos, estos se visualizarn tras aadir un suero antiglobulina especfica, conjugado con un fluorocromo (Coligan et al, 1992)
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Material y mtodos
3.8.1. ANTGENO EMPLEADO Para el diagnstico serolgico de Ehrlichia canis, se ha empleado como antgeno sobrenadante de la lnea celular DH-82 infectada por E. canis (Dawson et al, 1991). El porcentaje de clulas infectadas en el cultivo era de, aproximadamente, el 60% del total. Para el diagnstico serolgico de Leishmania infantum, se han utilizado promastigotes en cultivo NNN. El protocolo de fijacin del antgeno en los portas y de la propia tcnica de IFI es el mismo, independientemente del antgeno empleado. Inicialmente, se purifican los antgenos para evitar reacciones con antgenos solubles, mediante centrifugacin (a 500 g durante 5 minutos) y lavados sucesivos en PBS hasta la obtencin de un sobrenadante limpio. La suspensin celular se coloca en portas especiales esmerilados de
inmunofluorescencia de 18 pocillos de 4 mm de dimetro (Cultek). En cada pocillo se depositan 5 microlitros del antgeno en suspensin y se dejan secar al aire. Las preparaciones, una vez secas, se almacenan congeladas a -20C. En el momento de su uso, los portas se descongelan y se dejan secar en estufa a 37C durante 15 minutos.
3.8.2. TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA La tcnica incluye los dos tiempos de reaccin clsicos: un primer tiempo en el que se ponen en contacto el antgeno con los sueros problema y un segundo tiempo en el cual se aade la anti-inmunoglobulina canina conjugada con el marcador fluorescente (Coligan et al, 1992)
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Material y mtodos
-Primer tiempo de reaccin En las microplacas los sueros problema se diluyen en tampn fosfato (PBS) a pH de 7,2. Las diluciones empleadas para Ehrlichia canis fueron de 1:40, 1:80 y 1: 320. El punto de corte se encuentra en 1:40 (Sainz, 1996). En el caso de Leishmania infantum, las diluciones empleadas fueron 1:50, 1:100 y 1:400. El punto de corte para el diagnstico de leishmaniosis canina en el laboratorio de la Facultad de Veterinaria de Madrid se encuentra en 1:100 (Tesouro, 1984). En todo momento se incluyeron controles positivos y negativos, previamente contrastados, propiedad del Servicio de Diagnstico de Ehrlichiosis y Lesihmaniosis Canina de la UCM. A continuacin, los portaobjetos se introducan en cmara hmeda en estufa a 37C durante 30 minutos. Tras esta fase de incubacin, los portas se sometan a tres lavados de 5 minutos en PBS en agitacin, cambiando la solucin de PBS entre cada lavado. Posteriormente, los portas se secaban con aire fro. -Segundo tiempo de reaccin: Tras su secado, se aadan a cada pocillo 25 microlitros de conjugado; este conjugado est constituido por una anti-Ig de perro obtenida en conejo y marcada con isotiocianato de fluorescena (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.) a una dilucin de 1:100 en PBS a pH=7,2. A continuacin y al igual que en el primer tiempo de reaccin, se introducan los portas en cmara hmeda en estufa a 37C durante 30 minutos. Tras tres lavados en PBS y su correspondiente secado, las preparaciones se montaban para su lectura, colocando 3 gotas de glicerina tamponada especial para inmunofluorescencia (Fluoprep, Biomrieux) y, sobre ellas, un cubreobjetos.
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Material y mtodos
-Lectura La lectura se realiza con un microscopio de epifluorescencia (Olympus B-H2 ) con filtro azul, empleando el objetivo de x40 aumentos. Se comienza observando los pocillos controles para comprobar su positividad o negatividad; a continuacin se leen los sueros problemas. El ttulo de anticuerpos es la mxima dilucin del suero a la cual se detecta una fuerte fluorescencia.
3.9. CITOMETRA DE FLUJO

La citometra de flujo fue realizada por el Servicio de Citometra de flujo de la Facultad de Medicina de Valencia. Las muestras fueron analizadas en un citmetro de flujo EPICS XL-MCL con cargador automtico de muestras. Los parmetros del anlisis incluyen: 1. Dispersin frontal de luz lser (FS): es proporcional al tamao de la partcula analizada. Es recogida y amplificada por un fotodetector dotado de un filtro de densidad neutra (NDI). 2. Dispersin lateral de luz lser (SS): es proporcional a la granularidad o complejidad de la partcula analizada. Es recogida y amplificada en direccin perpendicular al haz de lser mediante un fotomultiplicador provisto de los filtros: 488DC + 488BP. 3. Fluorescencia verde (Log FL1): es proporcional a los antgenos revelados con un anticuerpo monoclonal conjugado con fluorescena (FITC) o a la fluorescencia inespecfica de un isotipo adecuado. Es recogida y amplificada en modo logartmico mediante un fotomultiplicador provisto de los filtros 550DC + 525BP.
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Material y mtodos
4. Fluorescencia amarilla-anaranjada (Log FL2): es proporcional a los antgenos revelados con un anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina (PE) o a la fluorescencia inespecfica de un isotipo adecuado. Es recogida y amplificada en modo logartmico mediante un fotomultiplicador provisto de los filtros: 575DC + 550BP Las seales de dispersin luminosa y de intensidad de fluorescencia son calibradas diariamente en los fotomultiplicadores logartmicos, utilizando microesferas (Flow-Check Beckman-Coulter, Hialeah, FL). Los datos fueron adquiridos en forma de histogramas (mono y biparamtricos) y en modo lista. La adquisicin en modo lista permite el anlisis posterior de los datos utilizando el software System II (Beckman-Coulter, Hialeah FL), en el cual es posible recombinar los parmetros obtenidos y redefinir diferentes regiones de seleccin. Mediante el ordenador del citmetro (programa System II v. 3.0) se define un protocolo de adquisicin de datos que incluye los siguientes histogramas:
Fig. 3.9.1.- Histograma biparamtrico de FS frente a SS.
Fig. 3.9.2.- Acotamiento de la ventana de linfocitos sobre el histograma morfolgico.
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Material y mtodos
Fig. 3.9.3 y 3.9.4.- Histogramas biparamtricos de SS frente a CD3 y CD21 que muestran como las clulas positivas a CD3 y CD21 se corresponden morfolgicamente con linfocitos.
-, +
CD3+ CD4+
CD3+ CD4-
Fig. 3.9.5.-
Histograma biparamtrico de CD4 frente a CD3, se incluyen
nicamente las clulas acotadas en la regin de linfocitos.
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Material y mtodos
+/-
+/+
+/-
+/+
-/-/+ +/+ -/+
Fig. 3.9.6.- Histograma biparamtrico de CD8 frente a CD3, se incluyen nicamente las clulas acotadas en la regin de linfocitos.
Fig. 3.9.7.-Histograma biparamtrico de CD21 frente a CD3, se incluyen nicamente las clulas acotadas en la regin de linfocitos.
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Material y mtodos
La adquisicin fue como mnimo de 10.000 eventos sobre el histograma de leucocitos, utilizando los distintos anticuerpos monoclonales siempre combinados con el anticuerpo monoclonal CD3. Los parmetros citomtricos se analizaron a partir de ficheros almacenados en forma de matriz multidimensional (modo lista), que permite reproducir de forma rpida y en tiempo diferido el proceso de anlisis, as como modificar, en caso necesario, las regiones acotadas inicialmente. La visualizacin y el anlisis de los datos, se realiza en programas de anlisis celular compatibles con la configuracin de los citmetros empleados (Cytologic, XL Worxs station). En nuestro caso se realizaba una primera clasificacin segn la dispersin luminosa. La seccin donde se disponan los linfocitos se delimitaba para crear unos mrgenes de la mxima confianza y con los datos de esa ventana se estudiaba la fluorescencia emitida (Loken et al, 1990).
3.10. ANTICUERPOS MONOCLONALES (MAB)

Los anticuerpos monoclonales (Mab) caninos empleados en este estudio (antiCD3, antiCD4, antiCD8 y antiCD21) fueron proporcionados por el Dr. Peter F. Moore del College of Veterinary Medicine de la Universidad de Davis (California). Estos anticuerpos monoclonales fueron sintetizados en su propio laboratorio. Concretamente, los anticuerpos monoclonales empleados en este estudio fueron el 2A12; 1E4#3; JD3 y 1D6#12 que reconocen los antgenos CD3, CD4, CD8 y CD21 respectivamente. Las especificidades de estos anticuerpos se establecen por inmunoprecipitacin antignica, por inmunohistoqumica realizada en tejidos linfoides y por citometra de flujo realizada en clulas derivadas de rganos linfoides centrales y perifricos y estudios funcionales de subpoblaciones perifricas de clulas T definidas por estos anticuerpos (Moore et al, 1992).
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Material y mtodos
En la siguiente tabla, se incluyen los clones concretos de anticuerpos monoclonales empleados, as como su especificidad, isotipos y fluorocromos con los que estaban marcados.
Monoclonal CD3 CD4
Especificidad Linfocitos T Linfocitos T auxiliares Linfocitos T citotxicos Linfocitos B
Clon CA 17.2A12 CA 13.1E4#3
Isotipo Ig G1 Ig G1
Fluorocromo FITC PE
CD8 CD21
CA9.JD3 CA2.1D6#12
Ig G2a Ig G1
PE PE
Tabla 3.10.1: Monoclonales empleados en el estudio
Se emple el antiCD3 como marcador de linfocitos T (Weiss 2001c), el antiCD21 como marcador de linfocitos B, y el antiCD4 y antiCD8 para diferenciar subpoblaciones de linfocitos T, segn sean portadoras de CD4 (linfocitos T cooperadores o Th) o de CD8 (linfocitos T citotxicos o Tc).
Nuestro plan de trabajo consisti en enfrentar el antiCD3 a cada uno de los otros anticuerpos monoclonales, por lo que necesitbamos marcarlos con dos fluorocromos diferentes. As se emple isotiocianato de fluorescena (FITC) como conjugado para los antiCD3 y Ficoeritrina (PE) para los antiCD4, antiCD8 y antiCD21. Los anticuerpos monoclonales tambin fueron conjugados con sus fluorocromos en el laboratorio del Dr. Peter F. Moore.
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Material y mtodos
La FITC emite fluorescencia verde y la PE fluorescencia naranja, lo que permite diferenciar un anticuerpo monoclonal de otro cuando son empleados simultneamente. De esta manera, se realizaron combinaciones de anticuerpos monoclonales de 2 en 2, estando presente en cada combinacin siempre el anti-CD3.
N tubo 1 2 3
Monoclonales CD3 / CD4 CD3 / CD8 CD3 / CD21
Tabla 3.10.2: Panel empleado en el estudio
De cada muestra sangunea conservada en EDTA se preparaban tres tubos en los que se combinaba: 100 l de sangre, 1 l de conjugado CD3- FITC y 1 l de conjugado CD4- PE 100 l de sangre, 1 l de conjugado CD3- FITC y 1 l de conjugado CD8- PE 100 l de sangre, 1 l de conjugado CD3- FITC y 1 l de conjugado CD21- PE Estos tubos se dejaban incubar durante 10 minutos tras ser bien homogeneizados. Tras este tiempo la muestra se introduca en una estacin semiautomtica de preparacin de muestras, Sistemas EPILS Multi Q-PREP de Coulter, donde se realizaba el lisado eritrocitario, fijado y estabilizacin de la muestra de sangre entera con el fin de destruir los hemates y trabajar nicamente con leucocitos en suspensin. El lquido de hemlisis empleado fue solucin de lisis OptiLyse C (Immunotech, Marsella, Francia). Tras este proceso, las muestras estaban listas para su procesamiento en el citmetro de flujo.
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Material y mtodos
3.11. POBLACIONES LEUCOCITARIAS E INMUNOFENOTIPO

A continuacin se describen cada una de las poblaciones linfocitarias estudiadas y su procedencia en relacin con los marcadores empleados en el estudio citomtrico de flujo: Los linfocitos B estn representados por las clulas marcadas como CD3-CD21+ en la ventana de los linfocitos. Los linfocitos T, en nuestro estudio, estn representados por las clulas marcadas como CD3+CD21- en la ventana de los linfocitos. Existen otras frmulas descritas en la literatura para hallar el valor de linfocitos T. As, Calvelli indica que el total de linfocitos T CD3+ es la media de los porcentajes obtenidos para las clulas CD3+ en todos los tubos en que se incluya el CD3 (Calvelli, 1993). Otros autores sugieren que el total de linfocitos T vendra dado tambin por la siguiente frmula: la poblacin de CD3+CD4+ ms la poblacin de CD3+CD8+ sera igual al total de clulas CD3+ ms/menos un 10%, puesto que los linfocitos T CD4-CD8representan un mnimo porcentaje (NCCSL, 1992). En nuestro estudio, tambin hemos realizado los clculos aplicando estas frmulas, comprobndose que se correlacionan estrechamente con los valores aplicados en el estudio. Los linfocitos T cooperadores estn representados, en nuestro trabajo, por los CD3+CD4+. Los linfocitos T citotxicos estn representados, en nuestra investigacin, por los CD3+CD8+. Los linfocitos T no cooperadores, ni citotxicos o linfocitos , son los linfocitos CD3+, CD4-, CD8-. Esta poblacin tambin se ha hallado siguiendo tres frmulas
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Material y mtodos
diferentes, no existiendo diferencias significativas en un intervalo de confianza del 99% entre los valores obtenidos en cada una de ellas. Las frmulas aplicadas han sido: Linfocitos T = Linfocitos T (Linfocitos Th + Linfocitos Tc). (Linfocitos CD3+ menos Linfocitos (CD3+CD4+) + Linfocitos (CD3+CD8+). Linfocitos T = Linfocitos (CD3+CD8-) Linfocitos Th. (Sustraccin de los linfocitos CD3+CD8- menos los linfocitos CD3+CD4+). Linfocitos T = Linfocitos (CD3+CD4-) Linfocitos Tc. (Sustraccin de los linfocitos CD3+CD4- menos los linfocitos CD3+CD8+). Los valores de linfocitos T expresados como porcentaje de linfocitos T se han obtenido por las siguientes frmulas, obteniendo valores iguales en ambos casos: 1. (100 (%Th + %Tc referidos a poblacin T)) x %linfocitos T = referido a poblacin linfocitaria. 2. (% linfocitos T % linfocitos T ) * 100 Los linfocitos no T no B seran las clulas Natural Killer (McDonough y Moore, 2000) y corresponden a los linfocitos CD3-CD21- (Sakai et al, 2003). En nuestro estudio no existen CD3+CD21+ por incompatibilidad de definicin. Los CD3-CD4+ seran neutrfilos o monocitos (Moore et al, 1992), pero no apareceran en la ventana de las caractersticas morfolgicas de los linfocitos, aunque puede aportar informacin indirecta sobre la pureza del anlisis.
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Material y mtodos
Una vez obtenidos los porcentajes de cada una de las estirpes linfocitarias determinadas inmunofenotpicamente, stos se deben dar en relacin al nmero total de glbulos blancos presentes en la muestra. Estos porcentajes de estirpes linfocitarias se emplean para calcular el nmero absoluto de linfocitos pertenecientes a cada subpoblacin por la frmula: recuento de glbulos blancos x porcentaje linfocitos x porcentaje estirpe linfocitaria = nmero de linfocitos inmunofenotpicamente iguales (Calvelli et al, 1993). As pues, y en resumen, dentro de la poblacin leucocitaria se valoraron las siguientes poblaciones: Recuento diferencial de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos, monocitos expresados en porcentaje de glbulos blancos (tal y como hemos explicado en el apartado de hematologa) y en valor absoluto. Recuento diferencial de subpoblaciones linfocitarias: linfocitos T, linfocitos B, linfocitos Natural Killer, expresado en nmeros absolutos y en porcentaje de glbulos blancos. Recuento diferencial de subpoblaciones de linfocitos T: linfocitos Th, linfocitos Tc, linfocitos T expresadas en valores absolutos, como porcentaje de glbulos blancos y como porcentaje de linfocitos T.
3.12. ESTUDIO ESTADSTICO

Todos los resultados obtenidos fueron analizados mediante estudio estadstico bsico, test de t de student, test de Wilcoxon, anlisis de varianza (ANOVA), Test de Kruskal-Walis, clculo de coeficientes de correlacin y anlisis de Regresin Lineal utilizando los programas estadsticos Statgraphics plus y Statistica 6.0. Los grficos
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Material y mtodos
derivados del estudio estadstico fueron realizados con el programa Statistica 6.0. Las diferencias se consideraron estadsticamente significativas cuando p<0,05.
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RESULTADOS
Resultados
4.- RESULTADOS
Los resultados se han dividido en varias secciones. En primer lugar, se presentan los resultados de seroprevalencia de ehrlichiosis y leishmaniosis en los colectivos caninos estudiados. La realizacin de estos anlisis serolgicos fue necesaria para seleccionar los animales para nuestro estudio de acuerdo con los criterios sealados en el captulo de materiales y mtodos. Una vez establecidos los dos grupos de estudio, Grupo 1 o grupo Control (formado 18 perros clnicamente sanos y seronegativos a ehrlichiosis y leishmaniosis) y Grupo 2 o grupo con Ehrlichiosis (formado por 38 perros afectados de forma natural de ehrlichiosis en fase subclnica), se procedi a la determinacin de los valores hematolgicos, las protenas sricas y del inmunofenotipo de estos 56 animales. Los resultados de estos anlisis se exponen en segundo lugar, presentando por un lado los resultados de los estadsticos bsicos de todas las variables medidas en el grupo Control y en el grupo con Ehrlichiosis, y por otro lado se presentan los resultados del anlisis de correlacin entre los resultados del inmunofenotipo y el resto de las variables analticas determinadas en cada uno de los grupos. A continuacin, se presentan los resultados del estudio comparativo entre la poblacin sana y de la poblacin afectada para cada una de las variables estudiadas Por ltimo, se recogen los resultados obtenidos en los estadsticos bsicos de todas las variables medidas en el grupo de animales con Ehrlichiosis en los 5 tiempos de evaluacin y se expone el anlisis estadstico de la evolucin post-teraputica de estos mismos parmetros.
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Resultados
4.1 SEROPREVALENCIA DE EHRLICHIOSIS EN LOS COLECTIVOS ESTUDIADOS

Como se coment en materiales y mtodos, la seleccin de los animales objeto del estudio se realiz entre un total de 160 animales procedentes de dos protectoras de Valencia. En una de ellas se estudi un total de 117 perros y en la otra protectora 43 animales. Se realiz un estudio serolgico de los niveles de anticuerpos frente a Ehrlichia canis y Leishmania infantum, cuyos resultados se detallan en la tabla siguiente:
LEISHMANIA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO
EHRLICHIA NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO
NMERO PERROS 39 76 10 35
PORCENTAJE 24,37 47,5 6,25 21,87
TABLA 4.1.1.- Resultados de la serologa frente a Ehrlichia canis y Leishmania infantum de perros procedentes de las protectoras valencianas muestreadas para la presente investigacin. El total de perros con ttulo positivo de anticuerpos anti-Ehrlichia canis fue de 111, por lo que la prevalencia de ehrlichiosis en estas protectoras de Valencia es del 69,37% (con un ttulo de anticuerpos antiehrlichia por encima de la dilucin 1/80). La prevalencia de leishmaniosis canina en estas colectividades es del 28,12%, encontrndose 45 animales con un ttulo de anticuerpos antileishmania por encima de la dilucin 1/100. Se observa una concurrencia de ambas infecciones en el 21,87% de los perros de las colectividades (35 casos).
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Resultados
4.2 ESTADSTICOS BSICOS DEL GRUPO CONTROL

Los estadsticos bsicos de los 18 perros que constituan el grupo Control se resumen en las tablas 4.2.1 a 4.2.5. 4.2.1 HEMATOLOGA: ERITROGRAMA E NDICES ERITROCITARIOS.
ANIMALES CONTROL
HB (g/dl) GR (106/l) HTC (%) VCM (fl) HCM (pg) CHCM (g/dl)
Valor mnimo Valor mximo Media
15,20 18,00 16,77
5,85 7,94 6,77
42,30 59,00 52,31
66,70 83,00 77,64
21,90 27,90 24,82
29,40 34,90 31,63
Desviacin 0,90 0,50 4,27 4,08 1,46 1,37 estndar Error 0,23 0,13 1,04 1,05 0,39 0,37 estndar Test distr. p = 0,18 p = 0,74 P = 0,68 p = 0,50 p = 0,71 p = 0,07 Normal TABLA 4.2.1.-Estadsticos bsicos de las variables hematolgicas de la serie roja del grupo Control (HGB= hemoglobina; GR= glbulos rojos; HTC= hematocrito; VCM= volumen corpuscular medio; HCM= hemoglobina corpuscular media; CHCM= concentracin de hemoglobina corpuscular media)
4.2.2 PLAQUETAS
El recuento plaquetario en el grupo Control mostr un valor medio de 394.200 24.489 plaquetas por microlitro, pudiendo ajustarse su distribucin a una distribucin normal (p= 0,29). El valor mnimo en el nmero de plaquetas en la poblacin control del estudio fue de 238.000 plaquetas por microlitro y el mximo de 587.000 plaquetas por microlitro. La desviacin estndar fue de 94.845.
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Resultados
4.2.3 PROTENAS SRICAS
ANIMALES CONTROL
PT (g/dl) Albmina (g/dl) Globulina (g/dl) A/G
Valor mnimo Valor mximo Media Desviacin estndar Error estndar Test distr. Normal
5,20 8,60 6,73 1,12 0,31 p = 0,69
2,58 4,51 3,35 0,60 0,17 p = 0,28
2,22 4,72 3,38 0,74 0,21 p = 0,75
0,75 1,45 1,02 0,23 0,06 p = 0,67
TABLA 4.2.2.- Estadsticos bsicos de las protenas sricas en la poblacin Control (PT = protenas totales; A/G = cociente albmina/globulinas)
4.2.4 RECUENTO LEUCOCITARIO E INMUNOFENOTIPO

Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 2807,00 661,60 p = 0,65 6000 16400 10155,60 7037,67 1834,87 529,68 4964 10875 336,42 419,78 121,18 0 1450 83,50 80,74 23,31 0 280 2525,87 1034,08 258,52 p = 0,82 1080 5180 494,94 375,23 93,81 p = 0,02 144 1699 1815,37 682,02 170,51 p = 0,50 876 3155 177,56 78,33 19,58 p = 0,34 54 341 832,25 278,13 69,53 p = 0,35 316 1277 619,44 336,42 84,11 p = 0,10 193 1550 364,12 275,30 68,82 p = 0,12 0 995
GRUPO CONTROL LEUCOCITOS /l NEUTRFILOS/l EOSINFILOS/l MONOCITOS/l LINFOCITOS/l LINFOCITOS B/l LINFOCITOS T/l LINFOCITOS NK/l LINFOCITOS Th/l LINFOCITOS Tc/l LINFOCITOS T/l
TABLA 4.2.3.- Estadsticos bsicos de los valores absolutos de cada una de las poblaciones leucocitarias y del inmunofenotipo en el grupo de perros sanos del estudio.
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Resultados
GRUPO CONTROL NEUTRFILOS % EOSINFILOS % MONOCITOS % LINFOCITOS % LINFOCITOS B % LINFOCITOS T % LINFOCITOS NK % LINFOCITOS Th % LINFOCITOS Tc % LINFOCITOST %
Valor Valor mnimo mximo 57,00 83,00 0,00 10,00 0,00 2,00 14,00 37,00 7,22 32,80 60,90 84,60 3,78 13,70 23,81 42,45 14,53 35,32 0,00 33,96
Media 70,83 3,00 0,75 25,25 18,41 72,87 7,30 33,92 24,59 14,39
Desv. estnd. 8,33 3,16 0,62 7,46 6,29 6,04 2,63 5,83 7,04 9,48
Test distr. Error N estnd. 2,40 0,91 0,18 1,86 p = 0,56 1,57 p = 0,38 1,51 p = 0,75 0,67 p = 0,76 1,46 p = 0,69 1,76 p = 0,53 2,37 p = 0,14
TABLA 4.2.4.- Estadsticos bsicos de los valores porcentuales de cada una de las poblaciones leucocitarias y del inmunofenotipo en el grupo de perros sanos del estudio. Se hall el ndice neutrfilos/linfocitos cuya media result ser 3,190,40, siendo el valor mnimo 1,54, el mximo 5,36 y la desviacin estndar 1,39, pudiendo ser ajustada la distribucin a una normal (p = 0,72). Los valores relativos de las subpoblaciones de los linfocitos T, tambin fueron calculados en relacin con las clulas T, tal y como se reflejan en la tabla 4.2.5.
Porcentaje referido a linfocitos T en animales control

Valor mn. Linfocitos Th Linfocitos Tc Linfocitos T 34,99 18,94 0,00 Valor Desv. Media mximo estnd. 58,01 50,53 43,71 46,52 33,89 19,61 7,15 9,88 12,59 Error Test estndar distr. N 1,79 p = 0,34 2,47 P = 0,68 3,15 P = 0,10
TABLA 4.2.5.- Estadsticos bsicos de las subpoblaciones de linfocitos T expresados como porcentaje de clulas T, en la poblacin del grupo Control del estudio.
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Resultados
Por ltimo dentro de este apartado de resultados, se hall el ndice de linfocitos TCD4+ / linfocitos TCD8+, siendo la media de este ndice en la poblacin control del estudio de 1,48 0,11. El valor mnimo de este ndice fue de 0,80 y el mximo de 2,40. La desviacin estndar fue 0,45 y se comprob que su distribucin poda ser ajustada a una normal (p = 0.48). Atendiendo a los resultados obtenidos en el grupo Control, se comprueba como la gran mayora de las distribuciones de las variables estudiadas presentaban una distribucin que poda ser ajustada a una distribucin normal, para un 95% de mrgenes de confianza. As, todos los valores del eritograma y de las protenas sricas han permitido este ajuste. Adems, tanto del nmero absoluto como relativo, de las distintos tipos de leucocitos e inmunofenotipos de linfocitos, con excepcin de la distribucin del nmero absoluto de linfocitos B, pueden ser ajustadas a una distribucin normal. Las distribuciones del nmero absoluto y relativo de neutrfilos, eosinfilos y monocitos no pudieron ser evaluadas. Realizando un anlisis pormenorizado de los resultados obtenidos en las distintas variables en cada uno de los perros del grupo Control, se puede comprobar como la prctica totalidad de los valores obtenidos quedan englobados dentro de los mrgenes fisiolgicos y slo un nmero muy reducido de los mismos se sitan ligeramente fuera de los mismos. Este es el caso de dos perros con una ligera hiperproteinemia, un perro con ligera eosinofilia y otro con una ligera linfocitosis.
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Resultados
4.3 ESTADSTICOS BSICOS DEL GRUPO CON EHRLICHIOSIS

Los resultados de las variables hematolgicas, protenas totales y del inmunofenotipo de los 38 perros infectados de manera natural con Ehrlichia canis obtenidos en el momento del diagnstico se recogen en este apartado.
4.3.1. HEMATOLOGA: ERITROGRAMA E NDICES ERITROCITARIOS
ANIMALES CON EHRLICHIOSIS

11,70 19,60 15,74
4,57 8,83 6,92
35,00 68,60 52,06
64,60 81,30 75,22
14,50 27,50 22,94
19,10 39,00 30,61
Desviacin 1,73 0,93 7,76 4,34 2,40 3,66 estndar Error 0,29 0,16 1,29 0,72 0,40 0,61 estndar Test distr. p = 0,62 p = 0,74 P = 0,90 p = 0,10 p = 0,81 p = 0,01 Normal TABLA 4.3.1.- Estadsticos bsicos de las variables hematolgicas de la serie roja del grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico.
En el anlisis pormenorizado de los resultados obtenidos en cada uno de los perros afectados por Ehrlichiosis respecto a las variables del eritrograma, se comprueba que slo un perro presentan una ligera anemia, siendo precisamente el caso que refleja los valores mnimos observados en la concentracin de hemoglobina y el recuento de glbulos rojos.
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Resultados
4.3.2 PLAQUETAS
El recuento plaquetario en el grupo de perros con Ehrlichiosis mostr un valor medio de 259,78 20.65 plaquetas por microlitro, pudiendo ajustarse su distribucin a una distribucin normal (p= 0,22). El valor mnimo en el nmero de plaquetas en este grupo afectado del estudio fue de 64.000 plaquetas por microlitro y el mximo de 510.000 plaquetas por microlitro. La desviacin estndar fue de 123.883. De todos los perros con Ehrlichiosis, el 36% presentaban un recuento plaquetario por debajo de 200.000 trombocitos por microlitro, y slo en dos de stos la trombocitopenia se situ por debajo de las 100.000 plaquetas por microlito.
ANIMALES CON EHRLICHIOSIS

4,70 13,00 8,08 1,81 0,32 p = 0,05
1,50 4,07 2,75 0,64 0,11 p = 0,59
2,03 9,70 5,21 1,79 0,32 p = 0,91
0,26 1,33 0,60 0,28 0,05 p = 0,01
TABLA 4.3.2.- Estadsticos bsicos de los valores de protenas sricas en perros del grupo con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico.
De todas las variables estudiadas en los perros con Ehrlichiosis, los parmetros relativos a las protenas sricas son las que muestran unas mayores alteraciones. As, la
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Resultados
disproteinemia se comprueba en una gran mayora de los casos (aproximadamente en el 75%), mostrando 13 animales un cociente Albmina/Globulina por debajo de 0,5. Slo en tres perros se recogieron unos valores de ligera hipoproteinemia. Por el contrario fue predominante la hiperproteinemia (en torno a un 40% de los casos), alcanzndose cifras de protenas sricas totales superiores a 10 g/dl en 4 perros. Los valores observados en la concentracin de albmina y globulinas se encuentran en concordancia con los resultados anteriores, obtenindose en torno a un 50% de los perros unas cifras de hiperglobulinemia (en 4 de ellos con cantidades de globulinas sricas superiores a los 7 g/dl) y en torno a un 40% de los animales hipoalbuminemia (en dos de ellos por debajo de 2g/dl de albmina srica).
4.3.4 RECUENTO LEUCOCITARIO E INMUNOFENOTIPO A continuacin se detallan los recuentos leucocitarios y del inmunofenotipo obtenidos en perros con ehrlichiosis en el momento del diagnstico.
GRUPO CON EHRLICHIOSIS LEUCOCITOS /l NEUTRFILOS/l EOSINFILOS/l MONOCITOS/l LINFOCITOS/l LINFOCITOS B/l LINFOCITOS T/l LINFOCITOS NK/l LINFOCITOS Th/l LINFOCITOS Tc/l LINFOCITOS T/l
Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 7000 24200 11467,60 3801,10 624,90 p = 0,01 3276 17908 6270,22 2790,38 493,27 p = 0,01 0 1624 301,50 378,61 66,93 p = 0,01 0 609 114,41 153,95 27,21 p = 0,01 803 10620 4615,24 2074,07 340,97 p = 0,55 100 1299 504,81 371,91 61,98 p < 0,01 435 9250 3923,61 1861,92 310,32 p = 0,86 49 478 164,25 98,33 16,39 p = 0,01 99 2708 1243,11 606,59 101,10 p = 0,73 141 7034 2153,47 1548,13 258,02 p = 0,07 0 2275 518,47 572,53 95,42 p < 0,01
TABLA 4.3.3.- Estadsticos bsicos de los valores absolutos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias de los animales infectados por Ehrlichia canis en el momento del diagnstico.
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Resultados
GRUPO CON EHRLICHIOSIS NEUTRFILOS % EOSINFILOS % MONOCITOS % LINFOCITOS % LINFOCITOS B % LINFOCITOS T % LINFOCITOS NK % LINFOCITOS Th % LINFOCITOS Tc % LINFOCITOST %
Media 55,22 2,50 0,94 39,76 12,06 81,83 3,84 27,05 42,63 11,82
Desv. estnd. 12,47 2,64 1,01 13,25 8,32 10,26 2,19 9,51 19,51 11,88
Test distr. Error N estnd. 2,21 p = 0,82 0,47 p < 0,01 0,18 p = 0,01 2,15 p = 0,59 1,39 p < 0,01 1,71 p = 0,08 0,36 p = 0,12 1,58 p = 0,42 3,25 p = 0,01 1,98 p < 0,01
TABLA 4.3.4.- Estadsticos bsicos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias en el da previo al tratamiento de los animales infectados por Ehrlichia canis en el momento del diagnstico. En el momento del diagnstico, el ndice neutrfilos/linfocitos tuvo de media 1,490,14. El valor mnimo fue 0,44, el mximo 3,76 y la desviacin estndar 0,80, pudiendo ser ajustada la distribucin a una normal (p = 0,29). Respecto a las alteraciones observadas en la serie blanca en los perros con Ehrlichiosis, se observa como un porcentaje elevado de casos muestran cifras absolutas y relativas de linfocitosis (en torno a un 40%), mientras que slo uno de ellos present una ligera linfopenia. No obstante, estas linfocitosis no fueron tan elevadas para llegar a producir cifras de leucocitosis; la que se observo slo en tres casos, una de ellas provocada por el nico caso que presentaba una ligera neutrofilia. Igualmente con excepcin de un perro que presentaba una ligera eosinofilia, el resto de los casos presentaron unos recuentos de eosinfilos como de monocitos dentro de los mrgenes fisiolgicos.
La siguiente tabla muestra los estadsticos bsicos del valor porcentual de las subpoblaciones T-linfocitarias referido a la poblacin de linfocitos T del grupo de perros con Ehrlichiosis.
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Resultados
Porcentaje referido a linfocitos T en animales con Ehrlichiosis

Valor mn. Linfocitos Th Linfocitos Tc Linfocitos T 10,38 17,14 0,00 Valor Desv. Media mximo estnd. 65,63 89,37 51,59 33,87 51,33 14,80 13,41 19,35 14,75 Error Test estndar distr. N 2,23 p = 0,27 3,22 P = 0,71 2,46 P < 0,01
TABLA 4.3.5.- Estadsticos bsicos de las subpoblaciones de linfocitos T expresados como porcentaje de clulas T, en la poblacin del grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico.
Por ltimo dentro de este apartado de resultados, se hall el ndice de linfocitos TCD4+ / linfocitos TCD8+, siendo la media de este ndice en la poblacin afectada con erhlichiosis del estudio de 0,90 0,13. El valor mnimo de este ndice fue de 0,12 y el mximo de 3,54. La desviacin estndar fue 0,77 y se comprob que su distribucin no poda ser ajustada a una normal (p < 0.01).
En relacin a la forma de distribucin de las distintas variables en el grupo con Ehrlichiosis, se comprueba como una gran mayora pueden ser ajustadas a una distribucin normal (para un 95% de mrgenes de confianza). No obstante, es conveniente destacar como algunas de las variables que en el grupo control se ajustaban a una distribucin normal pierden esta forma de distribucin, como consecuencia de las alteraciones biopatolgicas que se producen en el curso de la Ehrlichiosis. Este es el caso de las protenas sricas totales y el cociente Albmina/Globulina, como de alguna variable de la serie leucocitaria y del inmunofenotipo.
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Resultados
4.4 CORRELACIONES ENTRE LOS DISTINTOS PARAMETROS BIOPATOLOGICOS

Nos pareci interesante conocer si existan asociaciones cuantitativas (dos a dos) entre los parmetros biopatolgicos estudiados, en especial las que podran presentarse con las subpoblaciones linfocitarias. Por ello se calcularon los coeficientes de correlacin (r) entre las variables tanto en el grupo Control como en el grupo de perros con Ehrlichiosis, considerando el nivel de significacin para un intervalo de confianza de al menos un 95% (p<0,05), teniendo en cuenta el tamao de cada una de las muestras. Indudablemente muchas de las ausencias de asociacin entre variables que esperbamos obtener, as como de las correlaciones significativas entre las distintas variables son obvias, debido a su propia naturaleza de vinculacin (como por ejemplo parmetros de la serie roja y del proteinograma). No obstante queramos comprobar que si la ausencia o la presencia de correlaciones significativas se presentaban en los dos grupos, o por el contrario la infeccin por ehrlichia podra modificar estas asociaciones. En las siguientes tablas se recogen los resultados de los coeficientes de correlacin (r) entre las distintas variables, en primer lugar los obtenidos en el grupo control destacando en negrilla aquellas que mostraban una asociacin estadsticamente significativa (p<0,05), y en segundo lugar para el grupo de perros con Ehrlichiosis, destacando igualmente en negrilla las asociaciones significativas y en color rojo cuando se produca algn cambio en la significacin estadstica del coeficiente de correlacin respecto al grupo Control.
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Resultados
4.4.1 CORRELACIONES ENTRE LAS DISTINTAS VARIABLES EN EL GRUPO CONTROL
Las siguientes tablas recogen los coeficientes de correlacin entre los distintos parmetros biopatlogicos analizados en el grupo Control (n = 18).
GR HB HTO VCM HCM CHCM PLT
GR 0,61 0,86 -0,36 -0,65 -0,58 -0,13 HB 0,78 0,11 0,19 0,05 -0,16 HTO 0,15 -0,33 -0,58 -0,19 VCM 0,67 0.09 -0,59 HCM 0,80 -0,30 CHCM 0,07 PLT
TABLA 4.4.1.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre diferentes variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) entre las variables.
GR HB HTO VCM HCM CHCM PLT Variables
0,09 0,40 0,41 0,65 0,40 -0,01 -0,15 PT
0,41 0,38 0,23 0,40 0,29 0,20 0,20 ALB
0,24 0,29 0,41 0,69 0,35 -0,17 -0,38 GLOB
0,19 0,06 -0,15 -0,38 -0,17 0,26 0,47 A/G
TABLA 4.4.2.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las diferentes variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) y las protenas sricas del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) entre las variables.
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Resultados
GB %Neu Neu N %Eos Eos N %Mon Mon N %Linf Linf N Variables
0,55 -0,22 0,06 0,14 0,25 -0,12 -0,03 -0,06 0,31 GR
0,32 -0,05 0,27 0,10 0,19 -0,12 -0,04 0,14 0,08 HB
0,12 -0,05 0,10 -0,09 -0,03 -0,29 -0,20 -0,11 0,13 HTC
-0,13 0,44 0,23 -0,27 -0,22 -0,28 -0,19 -0,26 -0,26 VCM
-0,31 0,22 0,23 -0,14 -0,13 0,04 0,02 -0,11 -0,30 HCM
-0,16 0,06 0,21 0,21 0,20 0,29 0,24 -0,14 -0,24 CHCM
0,30 -0,37 -0,11 0,28 0,21 0,37 0,36 0,17 0,36 PLT
TABLA 4.4.3.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre variables del recuento leucocitario y otras variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) entre las variables.
%B Linf B % NK Linf NK % Linf T % Th Linf Th % Tc Linf Tc %T Linf T CD4/CD8 Variables
0,29 0,30 -0,39 -0,18 -0,12 0,32 -0,21 0,32 -0,09 0,10 0,15 0,34 0,14 GR
0,06 0,03 0,11 0,13 0,14 0,12 0,25 0,27 0,30 0,20 -0,32 -0,19 -0,01 HB
0,06 0,09 0,26 -0,14 0,14 0,18 -0,12 0,15 0,17 0,16 0,03 0,11 -0,06 HTC
-0,39 -0,33 -0,04 -0,32 0,48 -0,16 0,15 -0,28 0,45 0,10 -0,15 -0,23 -0,29 VCM
-0,47 -0,35 0,58 0,34 0,34 -0,25 0,53 -0,10 0,35 0,05 -0,44 -0,55 -0,13 HCM
-0,27 -0,20 0,52 0,30 0,08 -0,26 0,48 -0,08 0,02 -0,11 -0,30 -0,41 0,12 CHCM
0,56 0,52 -0,21 0,09 -0,56 0,22 -0,05 0,38 -0,56 -0,06 0,12 0,23 0,47 PLT
TABLA 4.4.4.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre diferentes variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) y las variables de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
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Resultados
Entre las asociaciones encontradas entre los parmetros de la serie roja y el resto de las variables en el grupo Control, cabe destacar como los resultados reflejan una correlacin estadsticamente significativa en relacin directa entre el volumen corpuscular medio y las concentraciones de globulinas y de protenas sricas totales, as como entre la concentracin de hemoglobina media y los porcentajes de linfocitos NK y linfocitos Th en relacin directa y con el nmero absoluto de linfocitos T en relacin inversa. En relacin con el recuentro plaquetario, el nmero de trombocitos se encuentra relacionado directamente tanto con el nmero absoluto como relativo de linfocitos B e inversamente al porcentaje de linfocitos T y Tc, en el grupo Control.
PT ALB GLOB A/G PT 0,79 0,87 -0,23 ALB 0,38 0,41 GLOB -0,67 A/G
TABLA 4.4.5.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables de protenas sricas del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
GB %Neu Neu N %Eos Eos N %Mon Mon N %Linf Linf N Variables -0,20 0,52 0,07 -0,21 -0,20 -0,62 -0,51 -0,38 -0,44 PT -0,36 0,12 -0,32 -0,16 -0,23 -0,39 -0,35 -0,04 -0,22 ALB -0,01 0,69 0,36 -0,20 -0,12 -0,62 -0,49 -0,54 -0,48 GLOB -0,26 -0,55 -0,60 0,06 -0,07 0,30 0,19 0,46 0,29 A/G
TABLA 4.4.6.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables de protenas sricas y las de la frmula leucocitaria del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
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Resultados
-0,13 -0,24 -0,03 -0,43 0,22 -0,44 0,48 -0,28 0,10 -0,32 -0,31 -0,49 0,04 PT
0,23 0,01 -0,37 -0,52 -0,08 -0,28 0,38 -0,07 -0,20 -0,31 -0,10 -0,26 0,47 ALB
-0,39 -0,45 0,26 -0,22 0,40 -0,43 0,41 -0,36 0,40 -0,22 -0,38 -0,53 -0,06 GLOB
0,61 0,47 -0,60 -0,25 -0,51 0,16 -0,20 0,21 -0,63 -0,04 0,34 0,35 0,37 A/G
TABLA 4.4.7.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables de protenas sricas y las de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
En cuanto a la relacin entre los parmetros de las protenas sricas y el resto de la variables en el grupo Control, se comprueba como la concentracin de globulinas sricas se encuentra correlacionada directamente con el porcentaje de neutrfilos e inversamente con los porcentajes de monocitos y linfocitos y con el nmero absoluto de linfocitos T. gualmente cabe destacar como el cociente Albmina/Globulina presenta una relacin directa con el porcentaje de linfocitos B e inversa proporcional a los porcentajes de neutrfilos, linfocitos NK y linfocitos Tc.
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Resultados
GB %Neu Neu N %Eos Eos N %Mon Mon N %Linf Linf N
GB -0,12 0,86 0,53 0,70 0,63 0,76 -0,08 0,59 %Neu 0,38 -0,15 -0,11 -0,68 -0,61 -0,91 -0,85 NeuN 0,44 0,59 0,25 0,38 -0,58 -0,02 %Eos 0,97 0,46 0,47 -0,27 0,03 EosN 0,46 0,52 -0,30 0,07 %Mon 0,96 0,43 0,77 MonN 0,36 0,79 % Linf 0,73 Linf N
TABLA 4.4.8.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables del recuento leucocitario del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05). Como era de esperar, en el grupo Control el nmero absoluto de cualquier poblacin leucocitaria se encuentra directamente relacionado con el recuento total de glbulos blancos. Sin embargo en este grupo Control, las mayores asociaciones estadsticas entre las variables del recuento leucocitario se observan entre el porcentaje de neutrfilos y el nmero absoluto y relativo de linfocitos, en ambos casos en relacin inversa. Del mismo modo destaca, en este caso en relacin directa, unas correlaciones altamente significativas entre el nmero absoluto de linfocitos y los valores, absoluto y relativo, de monocitos.
% Linf %B % NK %T % Th % Tc % T CD4/CD8
%Linf 0,48 -0,30 -0,43 -0,40 -0,18 0,11 -0,05 %B -0,49 -0,91 -0,52 -0,25 -0,08 -0,06 % NK 0,14 0,51 0,55 -0,64 -0,28 %T 0,43 0,11 0,29 0,17 % Th 0,12 -0,42 0,39 % Tc -0,75 -0,83 % T 0,49 CD4/CD8
TABLA 4.4.9.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre los valores porcentuales de las variables linfocitarias del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
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Resultados
En relacin a los recuentos porcentuales de las variables linfocitarias en el grupo Control se comprueba una relacin inversa y altamente significativa entre los valores de linfocitos B y linfocitos T. Llama la atencin como el porcentaje de linfocitos NK se muestra relacionado con los porcentajes de las tres subpoblaciones linfocitarias, de forma directa con los linfocitos Th y Tc, e inversamente con los linfocitos T. Por ltimo, en relacin con los porcentajes linfocitarios, cabe destacar como el cociente CD4/CD8 en la poblacin sana se encuentra clara e inversamente relacionado con el porcentaje de linfocitos Tc y no con el porcentaje de linfocitos Th.
Linf Linf B NK Linf T Linf Th Linf Tc Linf T CD4/CD8
Linf 0,85 0,54 0,96 0,86 0,81 0,52 -0,12 Linf B 0,28 0,67 0,57 0,64 0,30 -0,15 NK 0,56 0,65 0,66 -0,08 -0,32 Linf T 0,90 0,79 0,60 -0,06 Linf Th 0,66 0,41 0,15 Linf Tc 0,06 -0,60 Linf T -0,43 CD4/CD8
TABLA 4.4.10.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre los valores absolutos de las variables linfocitarias del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05). Cuando se analizan las relaciones de los recuentos linfocitarios expresados en valores absolutos se comprueba un mayor nmero de relaciones estadsticamente significativas que en forma porcentual. En concreto el nmero total de linfocitos se encuentra directamente relacionado con todas y cada una las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias, en relacin directa. Por otra parte llama la atencin no slo la relacin directa entre el nmero de linfocitos T con el nmero de linfocitos Th y Tc como era de esperar, sino tambin con el nmero de la subpoblacin de linfocitos T. Adems este nmero de linfocitos T se
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Resultados
encuentra asociado al nmero absoluto de otras poblaciones linfocitarias, linfocitos B y linfocitos NK. Una vez ms se comprueba que en la poblacin sana el cociente CD4/CD8 se encuentra relacionado con el nmero total de linfocitos Tc y no con el de los linfocitos Th.
0,49 0,84 -0,06 0,26 0,21 0,25 0,15 %B -0,26 -0,39 0,64 -0,22 -0,02 0,06 -0,62 % NK -0,43 -0,76 -0,18 -0,18 -0,17 -0,25 0,04 %T -0,43 -0,55 0,08 -0,32 0,06 -0,32 -0,46 % Th -0,02 -0,11 0,40 0,01 -0,02 0,54 -0,62 % Tc 0,01 -0,06 0,47 0,08 -0,13 -0,37 0,78 % T
N Linf NLinf B NLinf NK NLinf T NLinf Th NLinf Tc NLinf T Variables
0,73 0,64 0,42 0,68 0,61 0,55 0,41 %Linf
TABLA 4.4.11.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre los valores porcentuales y absolutos de las variables linfocitarias del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05). Cuando se analizan las posibles asociaciones cruzando los valores absolutos y relativos de las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias en el grupo Control, lo primero que llama la atencin es que no existe una correlacin entre los valores absolutos y relativos para todos y cada uno de los tipos de linfocitos. Concretamente ni en los linfocitos T y dentro de stos, ni en los linfocitos Th, se comprueba una asociacin directa entre sus valores absolutos y relativos, como sucede con el resto de variables linfocitarias. Por otra parte se repiten las asociaciones inversas observadas entre los porcentajes de linfocitos T y linfocitos Th, con los linfocitos B anteriormente sealadas cuando stos eran expresados igualmente en porcentajes, slo que en este caso se comprueba igualmente con valores absolutos de linfocitos B.
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Resultados
GB %Neu Neu N %Eos Eos N %Mon Mon N Variables
0,09 -0,48 -0,30 0,03 0,03 0,26 0,28 %B
0,42 -0,72 -0,07 0,08 0,10 0,64 0,70 Linf B
0,10 0,34 0,61 0,35 -0,45 -0,04 0,01 % NK
0,41 -0,47 0,32 0,25 0,33 0,53 0,54 Linf NK
-0,12 0,42 0,11 -0,17 -0,15 -0,30 -0,34 %T
0,61 -0,81 -0,02 -0,03 0,01 0,72 0,72 Linf T
TABLA 4.4.12.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables del recuento leucocitario (excluyendo los linfocitos) y las de poblacin linfocitaria del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
-0,06 0,43 0,05 0,13 0,10 -0,39 -0,39 % Th
0,61 -0,81 -0,06 0,09 0,11 0,65 0,65 Linf Th
0,16 0,26 0,61 0,11 0,30 -0,04 0,12 %Tc
0,49 -0,61 0,25 0,08 0,17 0,65 0,74 Linf Tc
-0,17 -0,25 -0,51 -0,43 -0,50 0,11 -0,02 %T
0,30 -0,57 -0,42 -0,35 -0,38 0,39 0,24 Linf T
-0,02 0,03 -0,44 -0,15 -0,23 -0,21 -0,33 CD4/CD8
TABLA 4.4.13.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables del recuento leucocitario (excluyendo los linfocitos) y las de subpoblaciones linfocitarias del grupo Control, en negrilla aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05). Por ltimo nos pareci interesante comprobar la posible existencia de asociaciones entre las poblaciones y subpoblaciones de linfocitos con otras poblaciones leucocitarias. En este anlisis comprobamos como en el grupo Control se establecen una serie de relaciones estadsticamente significativas entre las que destacamos una relacin directa entre el recuento total de leucocitos y el nmero de linfocitos T, y dentro de stos los linfocitos Th. Asociaciones semejantes suceden entre los valores de esta poblacin de linfocitos T y de las subpoblaciones linfocitarias Th y Tc con el valor absoluto y relativos de monocitos.
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Resultados
Por otra parte el porcentaje de neutrfilos muestra una relacin inversa tanto con los valores absolutos de linfocitos B y linfocitos T, como con los valores absolutos de las tres subpoblaciones linfocitarias Th, Tc y T; y sin embargo el recuento absoluto de neutrfilos se encuentra exclusivamente asociado y en relacin directa al porcentaje de linfocitos NK y linfocitos Tc.
4.4.2 CORRELACIONES ENTRE LAS DISTINTAS VARIABLES EN EL GRUPO DE PERROS CON EHRLICHIOSIS Las siguientes tablas recogen los coeficientes de correlacin entre los distintos parmetros biopatlogicos analizados en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico (n = 38).
GR HB HTO VCM HCM CHCM PLT
GR 0,58 0,92 0,05 -0,65 -0,59 0,15 HB 0,56 0,11 0,24 0,16 0,02 HTO 0,43 -0,60 -0,71 0,05 VCM 0,04 -0.47 -0,20 HCM 0,86 -0,18 CHCM -0,07 PLT
TABLA 4.4.14.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre diferentes variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) entre las variables y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
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Resultados
GR HB HTO VCM HCM CHCM PLT Variables
-0,10 -0,03 -0,18 -0,26 0,10 0,20 0,37 PT
0,35 0,19 0,41 0,27 -0,23 -0,33 0,42 ALB
-0,18 -0,06 -0,30 -0,39 0,17 0,33 0,22 GLOB
0,19 0,19 0,32 0,44 -0,21 -0,39 0,04 A/G
TABLA 4.4.15.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las diferentes variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) y las protenas sricas obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) entre las variables y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
-0,14 -0,05 -0,12 0,13 0,02 0,17 0,05 0,02 -0,09 GR
-0,02 -0,26 -0,11 0,10 0,05 0,29 0,17 0,22 0,14 HB
-0,15 0,02 -0,08 0,21 0,11 0,18 0,08 -0,03 -0,14 HTC
-0,07 0,19 0,07 0,24 0,24 0,08 0,08 0,29 -0,16 VCM
0,16 -0,22 0,03 -0,11 -0,01 0,03 0,06 0,22 0,29 HCM
0,17 0,28 -0,01 -0,21 -0,13 -0,02 0,01 0,28 0,34 CHCM
0,04 0,12 0,02 -0,03 -0,03 0,05 -0,02 -0,16 -0,05 PLT
TABLA 4.4.16.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre variables del recuento leucocitario y otras variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) entre las variables y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
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Resultados
-0,03 -0,01 0,11 0,11 0,06 -0,11 0,25 0,01 -0,08 -0,13 -0,02 -0,02 0,15 GR
-0,08 0,07 -0,12 0,07 0,09 0,16 0,10 0,14 -0,07 0,05 0,09 0,18 0,03 HB
0,08 0,10 0,04 -0,01 -0,07 0,17 0,30 0,04 -0,15 -0,19 -0,07 -0,08 0,17 HTC
0,29 0,29 -0,17 -0,30 -0,31 -0,17 0,19 0,06 -0,18 -0,18 -0,16 -0,16 0,09 VCM
-0,08 -0,06 -0,26 -0,04 0,06 0,34 -0,21 0,15 0,08 0,26 0,07 0,18 -0,14 HCM
-0,23 -0,10 -0,15 0,12 0,22 0,39 -0,28 0,11 0,18 0,33 0,13 0,23 -0,18 CHCM
0,09 0,09 0,32 0,21 -0,13 -0,09 -0,23 -0,20 -0,12 -0,11 0,29 0,24 -0,01 PLT
TABLA 4.4.17.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre diferentes variables hematolgicas (serie roja y recuento plaquetario) y las variables de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa. Al estudiar las posibles relaciones entre los parmetros biopatolgicos en el grupo de perros con Ehrlichiosis valorados en el momento del diagnstico, lo primero que debemos sealar es que se comprueba un mayor nmero de correlaciones estadsticamente significativas que las obtenidas en el grupo Control. Parte de estas correlaciones se deben a que el tamao de la muestra del grupo de perros con Ehrlichiosis es mayor y por tanto se requiere un menor valor del coeficiente de correlacin para alcanzar una relacin significativa. Algunas de estas relaciones podan quedar sugeridas en el grupo Control si bien no podan ser admitidas como significativas. Por otra parte, y teniendo en cuenta que en el curso de la Ehrlichiosis se producen alteraciones en mltiples parmetros biopatolgicos, era de esperar que en el grupo de
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Resultados
perros afectados del estudio, aunque en fase subclnica, estas alteraciones estuvieran presentes. Estas modificaciones en los distintos parmetros pueden conducir a establecer nuevas relaciones entre los mismos o pueden conducir a la prdida de algunas relaciones observadas en la poblacin sana del grupo Control. Sin entrar en el estudio de los cambios que pueden presentar los distintos parmetros en el grupo de perros con Ehrlichiosis con respecto al grupo Control que ser abordado ms tarde, y que podran explicar algunas de las correlaciones observadas, pensamos como sumamente interesante en un primer anlisis de este apartado la constatacin de relaciones altamente significativas entre distintas variables, ya que podra ser transformada una variable en indicador de otra. Este hecho, en nuestra opinin, puede ser muy til cuando la valoracin de una variable puede ser difcil y complicada, de tal forma que a partir de otra variable con la que se encuentra correlacionada y fcilmente evaluable podemos obtener informacin de la primera. En este sentido, en el grupo de perros con Ehrlichiosis, entre las asociaciones en encontradas entre los parmetros de la serie roja y el recuento plaquetario con el resto de las variables, cabe destacar las correlaciones estadsticamente significativas en relacin directa entre la concentracin de albmina con el hematocrito y con el recuento plaquetario, y de este ltimo con las protenas sricas totales.
PT ALB GLOB A/G
PT 0,39 0,90 -0,51 ALB 0,05 0,42 GLOB -0,79 A/G
TABLA 4.4.18.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables de protenas sricas obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05).
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Resultados
-0,07 -0,36 -0,29 -0,25 -0,17 0,08 0,02 0,35 0,24 PT
0,09 -0,08 -0,01 0,25 0,31 0,35 0,34 -0,04 0,04 ALB
-0,05 -0,44 -0,29 0,32 -0,26 -0,04 -0,08 0,46 0,31 GLOB
0,05 0,38 0,23 0,44 0,40 0,23 0,24 -0,45 -0,28 A/G
TABLA 4.4.19.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables de protenas sricas y las de la frmula leucocitaria obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
-0,18 0,04 -0,04 0,22 0,06 0,26 -0,27 0,03 0,21 0,32 -0,04 -0,01 -0,23 PT
0,44 0,57 0,31 0,30 -0,49 -0,06 0,06 0,14 -0,22 -0,09 -0,11 -0,10 0,01 ALB
-0,43 -0,20 -0,25 0,19 0,35 0,37 -0,20 0,08 0,34 0,43 -0,06 -0,01 -0,20 GLOB
0,64 0,39 0,45 -0,06 -0,60 -0,40 0,10 -0,08 -0,39 -0,43 0,02 -0,01 0,14 A/G
TABLA 4.4.20.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables de protenas sricas y las de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
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Resultados
En cuanto a la relacin entre los parmetros de las protenas sricas y el resto de las variables en el grupo con ehrlichiosis, nos parecen como datos ms relevantes la constatacin de: que la concentracin de globulinas sricas, se encuentra correlacionada directamente con el porcentaje y nmero de linfocitos T y el porcentaje y nmeros de linfocitos Tc. que igualmente el cociente Albmina/Globulina presenta una relacin significativa con los linfocitos T y Tc, slo que en este caso en relacin inversa. Y que adems dicho cociente se encuentra correlacionado directamente, al igual que la concentracin de albmina, con el porcentaje y nmero de linfocitos B.
GB %Neu Neu N %Eos Eos N %Mon Mon N %Linf Linf N
GB -0,09 0,85 0,15 0,55 0,18 0,55 0,06 0,64 %Neu 0,42 0,05 0,08 0,34 0,25 -0,97 -0,75 NeuN 0,19 0,54 0,33 0,63 -0,46 0,15 %Eos 0,86 0,46 0,50 -0,28 -0,15 EosN 0,54 0,75 -0,29 0,09 %Mon 0,88 -0,50 -0,26 MonN 0,41 0,01 % Linf 0,77 Linf N
TABLA 4.4.21.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables del recuento leucocitario obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
Como era de esperar, y al igual que lo que se comprob en el grupo Control, en los perros con Ehrlichiosis el nmero absoluto de cualquier poblacin leucocitaria se encuentra directamente relacionado con el recuento total de glbulos blancos. Sin embargo en este grupo 2, aunque se mantienen algunas de las relaciones observadas en el grupo control, aparecen otras nuevas y incluso otras desaparecen o cambian de signo, como
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Resultados
sucede la prdida de correlaciones entre el nmero absoluto de linfocitos y los valores, absoluto y relativo, de monocitos, para establecerse unas nuevas relaciones directas entre el nmero absoluto de monocitos tanto con el nmero absoluto de neutrfilos como de eosinfilos.
% Linf %B % NK %T % Th % Tc % T CD4/CD8
%Linf -0,66 -0,53 0,64 -0,29 0,63 -0,23 -0,56 %B 0,31 -0,96 0,24 -0,69 0,10 0,45 % NK -0,44 -0,01 -0,32 0,17 0,19 %T -0,16 0,64 -0,07 -0,38 % Th -0,52 -0,12 0,77 % Tc -0,62 -0,77 % T 0,28 CD4/CD8
TABLA 4.4.22.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre los valores porcentuales de las variables linfocitarias obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
En relacin a los recuentos porcentuales de las variables linfocitarias en el grupo de perros con Enrlichiosis se comprueba una relacin inversa y altamente significativa entre los valores de linfocitos B y linfocitos T, al igual que suceda con el grupo Control. Adems en esta poblacin afectada se comprueba como el porcentaje de linfocitos B igualmente est relacionado inversamente con el porcentaje de linfocitos Tc. Del mismo modo llama la atencin como el porcentaje de linfocitos se encuentra relacionado con las tres poblaciones linfocitarias, mostrando una relacin inversa con el porcentaje de linfocitos B y linfocitos NK, y directa con el porcentaje de linfocitos T, y dentro de este ltimo con los linfocitos Tc. Esta ltima relacin explica como igualmente el porcentaje de linfocitos se encuentra inversamente relacionado con el cociente CD4/CD8 en los perros con Ehrlichiosis.
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Resultados
Por ltimo, en relacin con los porcentajes linfocitarios, cabe destacar como el cociente CD4/CD8 en la poblacin afectada se encuentra clara e inversamente relacionado con el porcentaje de linfocitos Tc como suceda en el grupo Control, slo que a diferencia con ste, en los perros con Ehrlichiosis tambin se comprueba una relacin del cociente CD4/CD8 directa con el porcentaje de linfocitos Th y linfocitos B e inversa con el porcentaje de linfocitos T.
Linf Linf B NK Linf T Linf Th Linf Tc Linf T CD4/CD8
Linf 0,27 0,47 0,97 0,71 0,82 0,20 -0,36 Linf B 0,19 0,05 0,45 -0,17 0,13 0,28 NK 0,42 0,34 0,29 0,25 -0,16 Linf T 0,64 0,89 0,19 -0,43 Linf Th 0,37 0,02 -0,08 Linf Tc -0,17 -0,60 Linf T 0,09 CD4/CD8
TABLA 4.4.23.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre los valores absolutos de las variables linfocitarias obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
Cuando se analizan las relaciones de los recuentos linfocitarios expresados en valores absolutos se comprueba como algunas de las relaciones estadsticamente significativas que se observaban en la poblacin sana, han desaparecido en la poblacin con Ehrlichiosis. En concreto algunas de las relaciones entre el nmero linfocitos B desaparecen, mantenindose slo su relacin directa con el nmero de linfocitos Th. Igualmente las relaciones entre el nmero de linfocitos NK y el nmero de linfocitos Tc y entre el nmero de linfocitos T y el nmero de linfocitos T desaparecen. Al considerar el nmero absoluto de linfocitos en lugar del porcentaje de todas las asociaciones sealadas entre el cociente CD4/CD8 y los distintos tipos de linfocitos, slo
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Resultados
persisten aquellas que mostraban una relacin inversa, es decir nmero de linfocitos, nmero de linfocitos T y nmero de linfocitos Tc.
-0,15 0,26 -0,09 -0,21 0,51 -0,38 -0,20 % Th -0,16 0,04 0,06 -0,16 -0,25 -0,45 0,90 % T
N Linf NLinf B NLinf NK NLinf T NLinf Th NLinf Tc NLinf T Variables
0,77 -0,14 0,20 0,82 0,41 0,80 0,05 %Linf
-0,38 0,70 -0,10 -0,56 -0,09 -0,62 -0,03 %B
-0,38 -0,05 0,51 -0,41 -0,32 -0,37 0,01 % NK
0,37 -0,64 0,01 0,55 0,14 0,58 0,07 %T
0,38 -0,47 0,03 0,51 -0,02 0,80 -0,44 % Tc
TABLA 4.4.24.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre los valores porcentuales y absolutos de las variables linfocitarias obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
Cuando se analizan las posibles asociaciones cruzando los valores absolutos y relativos de las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias en el grupo de perros con Ehrlichiosis, lo primero que llama la atencin es que si existe una correlacin entre los valores absolutos y relativos para todos y cada uno de los tipos de linfocitos, hecho que no se produca en el grupo Control. Por otra parte en comparacin con lo observado en la poblacin sana aparecen numerosas y nuevas asociaciones y un nmero reducido dejan de producirse. Por otra parte en la poblacin afectada se repiten las asociaciones inversas observadas entre los porcentajes de linfocitos T y linfocitos Tc, con los linfocitos B anteriormente sealadas cuando stos eran expresados igualmente en porcentajes, slo que en este caso se comprueba igualmente con valores absolutos de linfocitos T y Tc. Tambin destaca como el nmero de linfocitos, el nmero de linfocitos T y el nmero de linfocitos Tc muestran unas relaciones inversas con los porcentajes de linfocitos
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Resultados
B y linfocitos NK. Adems como dato ms relevante de los resultados de la tabla 4.4.24 constatar como el nmero de linfocitos Tc se encuentra igualmente asociado con el resto de los porcentajes de linfocitos, directamente con el porcentaje de linfocitos y linfocitos T e inversamente con los porcentajes de las otras dos subpoblaciones linfocitarias Th y T .
0,18 0,63 0,46 0,33 0,39 0,49 0,47 %B
0,65 0,07 0,62 0,35 0,60 0,34 0,55 Linf B
-0,04 0,50 0,20 0,03 0,03 0,18 0,13 % NK
0,49 -0,25 0,32 -0,09 0,12 -0,05 0,15 Linf NK
-0,15 -0,60 -0,40 -0,25 -0,31 -0,45 -0,41 %T
0,50 -0,77 0,01 -0,28 -0,07 -0,35 -0,13 Linf T
TABLA 4.4.25.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables del recuento leucocitario (excluyendo los linfocitos) y las de poblacin linfocitaria obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
GB %Neu Neu N %Eos Eos N %Mon Mon N Variables 0,19 0,19 0,38 0,31 0,39 0,29 0,36 % Th 0,67 -0,39 0,42 0,07 0,39 -0,02 0,28 Linf Th -0,14 -0,49 -0,40 -0,48 -0,50 -0,57 -0,51 %Tc 0,26 -0,72 -0,16 -0,45 -0,33 -0,47 -0,32 Linf Tc -0,02 0,05 -0,06 0,29 0,20 0,25 0,13 %T 0,22 -0,21 0,05 0,22 0,25 0,13 0,14 Linf T 0,10 0,40 0,40 0,33 0,38 0,47 0,44 CD4/CD8
TABLA 4.4.26.- Asociaciones (coeficientes de correlacin = r) entre las variables del recuento leucocitario (excluyendo los linfocitos) y las de subpoblaciones linfocitarias obtenidas en el grupo de perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico, en negrilla roja aquellos coeficientes que sealan una relacin significativa (p<0,05) y en color rojo aquellos coeficientes que expresan un cambio con los obtenidos en el grupo Control, bien por perder, alcanzar o cambiar de signo la relacin estadsticamente significativa.
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Resultados
Por ltimo, al igual que con el grupo Control, nos pareci interesante comprobar la posible existencia de asociaciones entre las poblaciones y subpoblaciones de linfocitos con otras poblaciones leucocitarias en el grupo de perros con Ehrlichiosis. En este anlisis comprobamos como en el grupo de perros afectados se establecen un mayor nmero de relaciones estadsticamente significativas entre las que destacamos: una relacin directa entre el recuento total de leucocitos y el nmero de linfocitos B, linfocitos NK y linfocitos T, y dentro de stos los linfocitos Th, pero no con el nmero de linfocitos Tc, ni con el nmero de linfocitos T .
-
unas asociaciones entre los valores relativos y absolutos de neutrfilos, eosinfilos y monocitos en relacin directa con el cociente CD4/CD8 y el porcentaje y nmero de linfocitos B (salvo con el porcentaje de neutrfilos) y en relacin inversa con el porcentaje y nmero de linfocitos Tc (salvo con el nmero de neutrfilos). Muchas de estas asociaciones no haban sido constatadas en el grupo Control, o bien de presentarse lo hacan con otro signo.
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Resultados
4.5 ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE DATOS OBTENIDOS DE POBLACIN SANA Y DE POBLACIN CANINA INFECTADA CON Ehrlichia canis ANTES DEL TRATAMIENTO
En este apartado se analizan comparativamente los valores obtenidos en el grupo Control para cada una de las variables frente a los valores obtenidos en el grupo de perros con Ehrlichiosis para la misma variable en el momento del diagnstico. En aquellas variables cuyos resultados pueden ser ajustados a una distribucin normal en ambos grupos se ha empleado la prueba estadstica de t de student no pareada, mientras que cuando la variable no segua una distribucin Gaussiana, la comparacin se ha realizado a travs del test estadstico de Wilcoxon no pareado. El nivel de significacin se consider para un margen superior del 95% (p < 0,05) en ambas pruebas estadsticas.
4.5.1. HEMATOLOGA: ERITROGRAMA E NDICES ERITROCITARIOS De la tabla 4.5.1 a la 4.5.6, se detalla el anlisis comparativo entre los valores obtenidos en perros sanos y perros con Ehrlichiosis para las variables correspondientes a la serie roja sangunea:
t-student Hemoglobina g/dl t = 2,18
Grupo Control Media 16,77 DE 0,90 p = 0,0344
Grupo con Ehrlichiosis Media 15,74 DE 1,73
TABLA 4.5.1.- Resultados del Test de t-student en la comparacin de la concentracin de hemoglobina.
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Resultados
En el presente estudio, los valores de hemoglobina entre las poblaciones de perros sanos y de perros con Ehrlichiosis muestran diferencias estadsticamente significativas, observndose una disminucin del valor de hemoglobina en los perros con Ehrlichiosis.
t-student GR 106 /l t= -0,582
Grupo Control Media 6,77 DE 0,50
p = 0,5630
TABLA 4.5.2.- Resultados del Test de t -student en la comparacin del recuento de glbulos rojos (GR). El anlisis comparativo del recuento de glbulos rojos entre las poblaciones de perros sanos y perros con Ehrlichiosis del estudio, no muestra diferencias estadsticamente significativas.
t-student Hematocrito % T= 0,123
p = 0,9028
TABLA 4.5.3.- Resultados del Test de t-student en la comparacin del hematocrito. No se aprecian diferencias estadsticamente significativas entre los valores del hematocrito de perros sanos y con Ehrlichiosis, observndose un valor medio similar del valor de hematocrito en los dos grupos.
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Resultados
t-student HCM pg t= 2,726
TABLA 4.5.4.- Resultados del Test de t-student en la comparacin de la hemoglobina corpuscular media (HCM). El anlisis comparativo de hemoglobina corpuscular media entre perros sanos y perros con Ehrlichiosis muestra diferencias estadsticamente significativas, observndose una disminucin de la misma en los perros con Ehrlichiosis.
t-student VCM fl t= 1,482
TABLA 4.5.5.- Resultados del Test de t-student en la comparacin del volumen corpuscular medio (VCM).
Aunque se observa un valor del volumen corpuscular medio en los perros con Ehrlichiosis ligeramente inferior al obtenido en los perros sanos, esta diferencia no alcanza ser estadsticamente significativa.
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Resultados
Wilcoxon CHCM g/dl
Grupo Control Rango 31,61 z = 1,85 p = 0,0647
Grupo con Ehrlichiosis Rango 23,12
TABLA 4.5.6.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de la concentracin hemoglobina corpuscular media (CHCM). Del mismo modo, aunque se observan diferencias en la concentracin de hemoglobina corpuscular media entre los grupos de perros sanos y perros con Ehrlichiosis, comprobndose unos valores ms bajos en los perros con Ehrlichiosis, estas diferencias slo pueden considerarse estadsticamente como casi significativas.
4.5.2 PLAQUETAS La siguiente tabla muestra el anlisis comparativo del recuento plaquetario entre perros sanos y perros con Ehrlichiosis en el momento del diagnstico.
t-student Plaquetas /l t= 3,760
Grupo Control Media 394.200 DE 94.846 p = 0,0005
Grupo con Ehrlichiosis Media 259.778 DE 123.883
TABLA 4.5.7.- Resultados del Test de t-student en la comparacin del recuento de plaquetas.
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Resultados
Entre las poblaciones de perros sanos y con Ehrlichiosis de nuestro estudio, se aprecian diferencias estadsticamente significativas en el nmero de plaquetas circulantes, observndose una importante disminucin del valor medio de las mismas en el grupo de perros con Ehrlichiosis.
El anlisis comparativo de las protenas sricas se muestra en las tablas 4.5.8 a 4.5.11.
Wilcoxon Protenas totales g/dl
Grupo Control Rango 15,27 p = 0,0118
z = -2,52
TABLA 4.5.8.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de las protenas sricas totales.
Se comprueba la existencia de diferencias estadsticamente significativas entre los valores de protenas totales en suero de perros sanos y perros con Ehrlichiosis. En esta investigacin, los valores de protenas totales se encuentran aumentados en los animales con Ehrlichiosis, lo que provoca en este grupo una perdida de la distribucin normal de esta variable con respecto al grupo control.
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Resultados
t-student
Grupo Control Media DE 0,60 p = 0,0056
Albmina g/dl t= 2,916
3,35
TABLA 4.5.9.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores sricos de albmina. En el presente estudio, existe una disminucin estadsticamente significativa de los valores de albmina srica en los perros con Ehrlichiosis con respecto al grupo Control.
t-student Globulinas g/dl t= -3,548
p = 0,0010
TABLA 4.5.10.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores sricos de globulinas. Se observan diferencias estadsticamente significativas entre los valores de globulinas sricas de perros sanos y con Ehrlichiosis; este valor se encuentra aumentado en los animales con Ehrlichiosis.
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Resultados
Wilcoxon
Grupo Control Rango
Cociente A/G z = 4,03
35,38 p = 0,0001
TABLA 4.5.11.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del cociente albmina/globulina en suero. En la presente investigacin, se aprecia una disminucin estadsticamente significativa de los valores del cociente albmina/globulinas en perros con Ehrlichiosis, lo que provoca en este grupo una perdida de la distribucin normal de esta variable con respecto al grupo control.
4.5.4 RECUENTO LEUCOCITARIO Y POBLACIONES LEUCOCITARIAS Las tablas 4.5.12 a la 4.5.21 muestran el anlisis comparativo del nmero de leucocitos y de los valores de las poblaciones leucocitarias entre perros sanos y perros con Ehrlichiosis. Los valores relativos estn referidos a poblacin leucocitaria.
Wilcoxon GB x 103/l
Grupo Control Rango 24,14 z = -1,25
Grupo con Ehrlichiosis Rango 29,88 p = 0,21
TABLA 4.5.12.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del recuento leucocitario (GB).
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Resultados
En el presente estudio, no se aprecian diferencias estadsticamente significativas en el valor medio del recuento de glbulos blancos entre perros sanos y perros con Ehrlichiosis.
Wilcoxon Neutrfilos %
TABLA 4.5.13.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del porcentaje de neutrfilos en sangre perifrica.
Wilcoxon Neutrfilos/l
TABLA 4.5.14.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del nmero absoluto de neutrfilos circulantes. Se observan diferencias estadsticamente significativas en el porcentaje medio de neutrfilos circulantes entre perros sanos y perros con Ehrlichiosis; comprobndose una disminucin de estos valores en los animales afectados con Ehrlichiosis. Sin embargo estas diferencias no alcanzar a ser estadsticamente significativas cuando se comparan los valores absolutos del nmero de neutrfilos circulantes en perros sanos y en perros con
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Resultados
Ehrlichiosis. No obstante estos resultados sealan un ligero descenso en el recuento absoluto de neutrfilos en la poblacin afectada.
Wilcoxon Eosinfilos %
Grupo Control Rango 24,04 z= 0,49 p= 0,6259
TABLA 4.5.15.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del porcentaje de eosinfilos circulantes.
Wilcoxon Eosinfilos /l
TABLA 4.5.16.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores absolutos de eosinfilos circulantes. Entre las poblaciones caninas estudiadas, sana y con ehrlichiosis, no se aprecian diferencias estadsticamente significativas ni en el nmero relativo ni absoluto de eosinfilos circulantes.
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Resultados
Wilcoxon Monocitos %
Grupo Control Rango 21,71 z= -0,25 p= 0,8323
TABLA 4.5.17.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores relativos de monocitos circulantes.
Wilcoxon Monocitos /l
TABLA 4.5.18.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores absolutos de monocitos circulantes.
Tanto el valor relativo como absoluto de monocitos circulantes no presenta diferencias estadsticamente significativas entre las poblaciones caninas estudiadas.
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Resultados
t-student-test Linfocitos %
t = -4,121
p = 0,0001
TABLA 4.5.19.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores relativos de linfocitos circulantes.
t-student-test Linfocitos / l
t = -3,815
p = 0,0004
TABLA 4.5.20.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores absolutos de linfocitos circulantes. En el presente estudio, se aprecia un notable incremento estadsticamente significativo tanto en el recuento porcentual como absoluto de linfocitos circulantes en los perros con Ehrlichiosis con respecto al grupo Control. Este aumento observado en los valores de linfocitos no modifica la distribucin normal de esta variable, alcanzndose en torno a un 40% de los casos del grupo de perros con Ehrlichiosis cifras indicativas de linfocitosis. Este hecho provoca que el valor medio de linfocitos en trminos absolutos y relativos sea ms de 1,5 veces mayor en la poblacin afectada con respecto a la poblacin sana.
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Resultados
t-test ndice neutrfilos/linfocitos t = 5,033
Grupo Control Media 3,19 DE 1,39 p < 0,0001
TABLA 4.5.21.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores del ndice neutrfilos/linfocitos.
Los menores valores en el nmero de neutrfilos junto con el marcado aumento del nmero de linfocitos observado en la poblacin afectada por Ehrlichiosis, produce unas diferencias estadsticamente significativas entre el ndice neutrfilos/linfocitos en perros con y sin Ehrlichiosis, observndose una marcada disminucin del mismo en los perros afectados, superior al 50%, con respecto al grupo Control.
4.5.5 POBLACIONES LINFOCITARIAS En la tablas 4.5.22 a 4.5.27 se analizan estadsticamente los valores de las poblaciones linfocitarias de perros sanos y perros con Ehrlichiosis en el tiempo cero de la investigacin. Los valores relativos estn referidos a porcentaje sobre poblacin linfocitaria.
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Resultados
Wilcoxon % Linfocitos T
TABLA 4.5.22.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores porcentuales de linfocitos T circulantes.
t-student Linfocitos T/ l
t = -4,380
p = 0,0001
TABLA 4.5.23.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores absolutos de linfocitos T circulantes.
Segn los resultados de este estudio se comprueba como el aumento observado en los linfocitos circulantes en los perros afectados con Ehrlichiosis en principio obedece a un aumento altamente significativo de la poblacin de linfocitos T, tanto expresada en valor relativo como absoluto.
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Resultados
Wilcoxon % Linfocitos B
TABLA 4.5.24.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores porcentuales de linfocitos B.
Wilcoxon Linfocitos / l
TABLA 4.5.25.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores absolutos de linfocitos B. Aunque se aprecian diferencias estadsticamente significativas en el nmero relativo de linfocitos B entre ambas poblaciones de la investigacin, cuando estos recuentos se expresan en valores absolutos las diferencias observadas son mnimas admitiendo que no existe variacin entre las mismas.
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Resultados
t-student-test
Grupo Control Media DE 2,70 p < 0,0001
% NK 7,30 t = 4,887
TABLA 4.5.26.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores relativos de linfocitos NK (Natural Killer).
Wilcoxon / l
TABLA 4.5.27.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores absolutos de linfocitos NK (Natural killer).
En lo que respecta a los valores de linfocitos NK sanguneos, se comprueba una reduccin claramente significativa en su porcentaje en perros con Ehrlichiosis respecto a la poblacin del grupo Control. Sin embargo cuando se comparan los valores absolutos de linfocitos NK circulantes no se observan variaciones significativas entre las dos poblaciones objeto de estudio.
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Resultados
4.5.6. SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS Las tablas 4.5.28 a 4.5.34 reflejan los anlisis comparativos de los valores de las subpoblaciones linfocitarias entre poblacin sana y afectada de Ehrlichiosis.
t-student
Grupo Control Media DE 5,83 p = 0,0103
% Linfocitos Th 33,92 t = 2,67
TABLA 4.5.28.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores relativos de linfocitos Th (referidos al total de linfocitos).
t-student Linfocitos Th/ l
t = -2,58
p = 0,0128
TABLA 4.5.29.- Resultados del Test t-student en la comparacin de los valores absolutos de linfocitos Th circulantes. Si bien el grupo Control presenta un porcentaje medio de linfocitos Th significativamente mayor que el del grupo de perros con ehrlichiosis, el anlisis de los valores absolutos de linfocitos Th demuestra que es el grupo de perros con ehrlichiosis el que muestra un nmero medio superior y estadsticamente significativo de esta
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Resultados
subpoblacin linfocitaria. Esta observacin se explica porque los perros afectados con ehrlichiosis presentan un mayor nmero de linfocitos T circulantes con respecto a la poblacin sana, como anteriormente ha sido sealado.
Wilcoxon
Grupo Control Rango
% Linfocitos Tc 17,00 z = -3,01 p = 0,0026
TABLA 4.5.30.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores porcentuales de linfocitos Tc (referidos al total de linfocitos).
Wilcoxon Linfocitos Tc/ l
Grupo Control Rango 13,31 z = -4,38 p < 0,0001
TABLA 4.5.31.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin de los valores absolutos de linfocitos Tc. En el presente estudio, se observan diferencias estadsticamente significativas tanto en el porcentaje como en el nmero absoluto de linfocitos Tc entre los perros sanos y perros con Ehrlichiosis, existiendo unos marcados incrementos de los mismos en animales con Ehrlichiosis; alcanzndose un valor de ms de 3 veces superior entre el promedio de linfocitos Tc de los perros con Ehrlichiosis con respecto al promedio de los perros sanos.
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Resultados
Estos resultados demuestran que el mayor nmero de linfocitos y linfocitos T observado en los perros con Ehrlichiosis viene motivado especialmente por un aumento de la subpoblacin de linfocitos Tc.
Wilcoxon % Linfocitos
TABLA 4.5.32.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del porcentaje de linfocitos (referidos al total de linfocitos).
Wilcoxon Linfocitos T/l
Grupo Control Rango 26,06 z = -0,14 p = 0,8896
TABLA 4.5.33.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del nmero de linfocitos . No se apreciaron diferencias estadsticamente significativas ni en el porcentaje ni en el nmero de linfocitos entre ambas poblaciones del estudio.
- 175 -
Resultados
Wilcoxon test
Grupo Control Rango
ndice CD4/CD8 37,78 z = 0,58 p = 0,0003
TABLA 4.5.34.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del ndice linfocitario CD4/CD8.
Dado que la magnitud en el aumento del nmero de linfocitos Tc es netamente superior a la que se produce en los linfocitos Th en la poblacin con Ehrlichiosis era lgico esperar que el ndice linfocitario CD4/CD8 se encuentra claramente disminuido en la poblacin con Ehrlichiosis con respecto al grupo Control del estudio. El descenso es tan marcado en algunos casos con Ehrlichiosis que provoca el desajuste de esta variable a la distribucin normal, tal y como se muestra en la poblacin sana. El promedio de este ndice en el grupo de perros afectados sufre un descenso en torno al 60% respecto al promedio observado en el grupo Control.
En las siguientes tablas (4.5.35 - 4.5.37) se realiza un anlisis comparativo, entre perros sanos y perros con ehrlichiosis, de los valores porcentuales de linfocitos Th, Tc y referidos a la poblacin de linfocitos T. Como era previsible el anlisis estadstico arroja unos resultados similares a los obtenidos al comparar estas mismas variables cuando sus porcentajes eran referidos a la poblacin linfocitaria.
- 176 -
Resultados
t-student Linfocitos Th % de Linf T t = 3,54
TABLA 4.5.35. Resultados del Test t-student en la comparacin del porcentaje de linfocitos Th referido a linfocitos T.
t-student Linfocitos Tc % de Linf T t = -3,40
p = 0,0013
TABLA 4.5.36.- Resultados del Test t-student en la comparacin del porcentaje de linfocitos Tc referido a linfocitos T.
Wilcoxon Linfocitos T % de Linf T
TABLA 4.5.37.- Resultados del Test de Wilcoxon en la comparacin del porcentaje de linfocitos referido a linfocitos T.
- 177 -
Resultados
En el caso de los linfocitos Tc al ser expresados en funcin de los linfocitos T, la distribucin de los valores en el grupo de perros con Ehrlichiosis se ajusta a una distribucin normal, cosa que no suceda cuando los porcentajes eran referidos respecto al total de linfocitos. Por ello se ha podido emplear en la comparacin el test de t-student, en lugar del test de Wilcoxon. No obstante por ambos tests se obtienen resultados similares, ratificando un mayor promedio en el porcentaje de linfocitos Tc en la poblacin afectada frente a la poblacin sana.
- 178 -
Resultados
4.6
EVOLUCIN
POST-TERAPUTICA
DE
PARMETROS
ESTUDIADOS EN PERROS CON EHRLICHIOSIS

A continuacin se expone un anlisis evolutivo de los valores de cada una de las variables, en cada uno de los tiempos de la investigacin, en los perros con ehrlichiosis tras la administracin del dipropionato de imidocarb, tal y como se indica en el captulo de materiales y mtodos. En cada apartado en primer lugar se recogen los valores obtenidos para cada una de las variables en cada uno de los controles programados. A continuacin se analizan la posible existencia de cambios en los valores de las variables tras el tratamiento con dipropionato de imidocarb. Para ello se comparan los valores obtenidos antes del tratamiento (T0) y en los diferentes tiempos post-tratamiento: 2 semanas (T1), 1 mes (T2), 3 meses (T3) y 6 meses despus del tratamiento (T4), utilizando los tests estadsticos ANOVA y Kruskal-Walis. Adems, cuando los resultados de estos test reflejaron diferencias estadsticamente significativas (o prximas a la significacin) se procedi a comparar los resultados entre los distintos controles (tomados dos a dos) mediante el test de t-student o el test de Wilcoxon, con el fin de precisar entre que tiempos se encontraban estas diferencias (p<0,05). En todos los grficos se destaca con un asterisco rojo (*) aquellos valores que presentan diferencias significativas (al menos para una p<0,05) respecto a los valores en el tiempo inicial (T0) del estudio, momento del diagnstico.
4.6.1 HEMATOLOGA: ERITROGRAMA E NDICES ERITROCITARIOS En las siguientes tablas (tablas de la 4.6.1 a la 4.6.5) se detallan los resultados estadsticos bsicos de las variables de la serie roja a lo largo de los diferentes tiempos del estudio
- 179 -
Resultados
ANIMALES CON EHRLICHIOSIS T0

11,70 19,60 15,74
4,57 8,83 6,92
35,00 68,60 52,06
64,60 81,30 75,22
14,50 27,50 22,94
19,10 39,00 30,61
Desviacin 1,73 0,93 7,76 4,34 2,40 3,66 estndar Error 0,29 0,16 1,29 0,72 0,40 0,61 estndar Test distr. p = 0,62 P = 0,74 P = 0,90 p = 0,10 p = 0,81 p = 0,01 Normal TABLA 4.6.1.- Estadsticos bsicos de las variables del eritrograma e ndices volumtricos del grupo de perros con Ehrlichiosis antes de la aplicacin del tratamiento.

9,10 20,90 15,49
3,95 8,93 6,44
31,70 60,60 47,50
65,10 81,20 74,17
21,00 26,50 24,13
28,70 36,70 32,66
Desviacin 2,89 1,19 7,54 5,03 1,30 2,40 estndar Error 0,72 0,30 1,88 1,22 0,31 0,58 estndar Test distr. P = 0,78 P = 0,75 P = 0,62 p = 0,37 p = 0,63 p = 0,68 Normal TABLA 4.6.2.- Estadsticos bsicos de las variables del eritrograma e ndices eritrocitarios del grupo de perros con Ehrlichiosis obtenidos a las dos semanas tras la aplicacin del tratamiento.
- 180 -
Resultados

13,30 19,60 16,31
5,18 11,02 7,23
37,30 59,40 49,34
62,60 87,50 72,57
19,20 30,10 23,61
28,10 37,00 32,54
Desviacin 1,84 1,48 5,99 5,54 2,32 2,40 estndar Error 0,35 0,28 1,20 1,09 0,45 0,47 estndar Test distr. P = 0,78 p = 0,32 P = 0,28 p = 0,66 p = 0,22 p = 0,93 Normal TABLA 4.6.3.- Estadsticos bsicos de las variables del eritrograma e ndices eritrocitarios del grupo de perros con Ehrlichiosis obtenidos en el primer mes posttratamiento.

Tamao muestral Valor mnimo Valor mximo Media
19 13,40 19,80 16,36
19 5,48 9,30 6,84
19 37,90 62,90 49,47
19 65,50 78,30 72,43
19 20,20 26,40 24,00
19 29,80 37,90 33,23
Desviacin 1,75 0,89 6,01 3,89 1,39 2,54 estndar Error 0,40 0,20 1,38 0,89 0,32 0,58 estndar Test distr. P = 0,54 p = 0,83 P = 0,69 p = 0,77 p = 0,70 p = 0,28 Normal TABLA 4.6.4.- Estadsticos bsicos de las variables del eritrograma e ndices eritrocitarios del grupo de perros con Ehrlichiosis el da 90 del estudio.
- 181 -
Resultados

Tamao muestral Valor mnimo Valor mximo Media
26 12,20 20,40 16,85
26 5,55 8,87 6,95
26 40,30 61,70 50,48
26 67,80 80,80 72,36
26 20,80 26,10 24,20
26 29,20 36,30 33,48
Desviaci 1,88 0,76 5,59 3,13 1,31 1,97 n estndar Error 0,37 0,15 1,10 0,61 0,26 0,39 estndar Test distr. P = 0,16 P = 0,28 P = 0,65 p = 0,69 p = 0,75 p = 0,19 Normal TABLA 4.6.5.- Estadsticos bsicos de las variables del eritrograma e ndices eritrocitarios del grupo de perros con Ehrlichiosis a los 6 meses post-tratamiento. A continuacin se detallan grficamente la evolucin de las variables del eritrograma a lo largo de los diferentes tiempos del estudio, incluyendo en el pie de grfico los resultados de los tests estadsticos aplicados (grficos del 4.6.1 al 4.6.6).
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL RECUENTO DE HEMATES

Barras verticales expresan el intervalo de confianza CI = 95%
8,5 8,0
10 6/ l
7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.1.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de hemates en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,37 p= 0,25. Test Kruskal-Walis: Ht = 3,44 p= 0,49.
- 182 -
Resultados
No se aprecian diferencias significativas en el recuento de hemates en perros con Ehrlichiosis en los distintos tiempos del estudio.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE LA HEMOGLOBINA

Barras verticales indican el intervalo de confianza CI = 95%
18,0 17,5 17,0 16,5 16,0 15,5 15,0 14,5 14,0 T0 T1 T2 Tiempo T3 T4
Grfico 4.6.2.- Evolucin a lo largo del tiempo del valor de hemoglobina en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,75 p= 0,14. Test Kruskal-Walis: Ht= 5,65 p= 0,23. Aunque el ANOVA no aprecia diferencias estadsticamente significativas en los valores de hemoglobina a lo largo del tiempo, se observa un ligero incremento progresivo de este parmetro a partir del tiempo T1, comprobndose un valor medio de hemoglobina ms alto en ltimo control T4 (a partir de los 4 meses de tratamiento), que difiere estadsticamente con el valor inicial T0 (Test de t student: t = 2,40; p = 0,02 y Test Wilcoxon: z = 2,08; p = 0,04).
g/dl
- 183 -
Resultados
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL HTC

54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43 T0 T1 T2 Tiempo T3 T4
Grfico 4.6.3.- Evolucin a lo largo del tiempo del valor del hematocrito en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,51 p= 0,20. Test Kruskal-Walis: Ht= 4,65 p= 0,32. Aunque los valores medios del hematocrito presentan ligeras oscilaciones, no se observan variaciones estadsticamente significativas a lo largo del tiempo del estudio en perros con ehrlichiosis.
%
fl
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL VCM

78 77 76 75 74 73 72 71 70 69 T0 T1 T2
T3
T4
Tiempo
Grfico 4.6.4.- Evolucin a lo largo del tiempo del VCM en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 2,44 p= 0,05. Test Kruskal-Walis: Ht= 10,47 p= 0,03.
- 184 -
Resultados
Se observa una disminucin estadsticamente significativa en los valores del volumen corpuscular medio (VCM) a partir del tiempo T2 con respecto al valor inicial T0 (Test de t student: t = 2,11; p= 0,04 y Test Wilcoxon: z = 2,10; p = 0,04), para mantenerse prcticamente constante en los tiempos T3 y T4.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE CMH

Barras verticales indican el intervalo de confianza CI = 95%
26,0 25,5 25,0 24,5 24,0 23,5 23,0 22,5 22,0 21,5 T0 T1 T2 T3
pg
T4
Tiempo
Grfico 4.6.5.- Evolucin a lo largo del tiempo de la CMH en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 2,16 p= 0,08. Test Kruskal-Walis: Ht= 8,01 p= 0,09.
En relacin a la concentracin media de hemoglobina (CMH), con respecto al valor inicial (T0) se produce un aumento estadsticamente casi significativo en el tiempo T1(Test t student: t = 1,90; p = 0,06 y Test Wilcoxon: z = 2,05; p = 0,04), para mantenerse a partir de este momento con unos valores con ligeras oscilaciones sin que se obtengan diferencias significativas entre ellos (T1, T2, T3 y T4) y alcanzando una diferencia estadsticamente significativa en el T4 con respecto al valor inicial T0 (Test t student: t = 2,45; p= 0,02 y Test Wilcoxon: z = 2,47; p = 0,01).
- 185 -
Resultados
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE CMHC

36 35 34 33 32 31 30 29 28 T0
g/dl
T1
T2
Tiempo
T3
T4
Grfico 4.6.6.- Evolucin a lo largo del tiempo de la CMHC en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 5,13 p= 0,001. Test Kruskal-Walis: Ht= 19,06 p<0,001. Los valores de la concentracin media de hemoglobina corpuscular (CMCH) sufren una evolucin similar al parmetro CMH, observndose un incremento estadsticamente significativo de los valores de CMCH a partir del tiempo T1 de la investigacin con respecto al valor inicial T0 (Test t student: t = 2.01; p = 0,04 y Test de Wilcoxon: z = 2,41; p = 0,02). A partir de este momento los valores medios de CMCH permanecen prcticamente constantes y se mantienen las diferencias significativas con respecto al tiempo T0.
4.6.2 PLAQUETAS En el siguiente tabla se recogen los valores plaquetarios en perros con ehrlichiosis a lo largo del tiempo.
- 186 -
Resultados
PLAQUETAS 103 / l Valor mn. Ehrlichiosis T0 Ehrlichiosis T1 Ehrlichiosis T2 Ehrlichiosis T3 Ehrlichiosis T4 64 135 43 37 33 Valor Media mximo 510 474 571 384 472 259,78 246,82 242,75 224,84 227,79 Desv. estndar 123,88 89,47 102,44 88,15 109,24 Error estndar 20,65 21,70 19,36 20,22 20,64 Test distr. Normal 0,22 0,59 0,14 0,24 0,98
TABLA 4.6.6.- Estadsticos bsicos de los valores plaquetarios en el grupo de perros con Ehrlichiosis del estudio en funcin de los periodos de control.
En el siguiente grfico se representa la evolucin de los valores plaquetarios en perros con ehrlichiosis a lo largo del tiempo.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE PLAQUETAS

320 300 280
10 3/ l
260 240 220 200 180 160 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.7.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de plaquetas en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,50 p= 0,73. Test Kruskal-Walis: Ht= 0,58 p= 0,96.
- 187 -
Resultados
El anlisis estadstico revela que no existen diferencias significativas entre los recuentos medios plaquetarios en los diferentes tiempos de control tras el tratamiento con respecto al valor inicial T0, ni entre ellos.
4.6.3 PROTENAS SRICAS En las siguientes tablas (tablas de la 4.6.7 a la 4.6.11) se recogen los resultados de las protenas totales, albmina, globulinas e ndice albmina/globulinas sricas obtenidos en los perros con ehrlichiosis antes y despus del tratamiento, en cada uno de los controles efectuados.

4,70 13,00 8,08 1,81 0,32 p = 0,05
1,50 4,07 2,75 0,64 0,11 p = 0,59
2,03 9,70 5,21 1,79 0,32 p = 0,91
0,26 1,33 0,60 0,28 0,05 p = 0,01
TABLA 4.6.7.- Estadsticos bsicos de los valores de protenas sricas en perros del Grupo 2 en el tiempo previo al tratamiento (T0).
- 188 -
Resultados

6,80 10,90 9,15 1,25 0,32 p = 0,50
1,85 3,42 2,81 0,43 0,11 p = 0,80
2,44 8,47 6,18 1,64 0,42 p = 0,80
0,23 1,40 0,51 0,27 0,07 p < 0,01
TABLA 4.6.8.- Estadsticos bsicos de los valores de protenas sricas en perros del Grupo 2 en el tiempo T1 del estudio.

4,37 11,46 7,58 2,07 0,40 p = 0,34
1,39 3,78 2,78 0,64 0,12 p = 0,54
1,69 7,69 4,80 1,75 0,34 p = 0,38
0,28 1,64 0,67 0,33 0,06 p < 0,01
TABLA 4.6.9.- Estadsticos bsicos de los valores de protenas sricas en perros del Grupo 2 en el tiempo T2 de la investigacin.
- 189 -
Resultados

4,30 7,80 6,77 0,87 0,20 p = 0,65
1,60 3,41 2,29 0,49 0,11 p = 0,90
2,30 5,77 4,36 0,98 0,22 p = 0,46
0,29 1,27 0,57 0,26 0,06 p = 0,04
TABLA 4.6.10.- Estadsticos bsicos de los valores de protenas sricas en perros del Grupo 2 a los 90 das del tratamiento (T3).

6,50 11,00 8,72 1,30 0,25 p = 0,91
2,00 4,27 2,86 0,61 0,12 P = 0,21
3,72 8,00 5,86 1,24 0,24 p = 0,88
0,27 0,99 0,51 0,17 0,03 p = 0,67
TABLA 4.6.11.- Estadsticos bsicos de los valores de protenas sricas en perros del Grupo 2 en el tiempo T4 del estudio.
- 190 -
Resultados
Los grficos 4.6.8 al 4.6.11 nos muestran la evolucin en el tiempo de las siguientes variables: protenas totales, albmina, globulinas e ndice albmina / globulinas en suero de perros con Ehrlichiosis antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE PROTENAS TOTALES

Barras verticales indican intervalo de confianza CI = 95%
10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 T0
* *
g/dl
T1
T2 Tiempo
T3
T4
Grfico 4.6.8.- Evolucin a lo largo del tiempo de protenas sricas totales en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 6,61 p<0,01. Test Kruskal-Walis: Ht = 26,76 p<0,001.
Tras producirse un incremento significativo de la concentracin media de protenas sricas totales en el tiempo T1 del estudio con respecto al valor inicial T0 (Test t student: t = 2,07; p = 0,04 y Test Wilcoxon z = 2,56; p = 0,01), comienza un descenso de las mismas claramente significativo en el tiempo T2 y T3, para volver a presentar un incremento en su concentracin en el tiempo T4 en relacin con el control anterior T3 (Test t student: t = 5,68; p<0,001 y Test Wilcoxon: z = 4,47; p<0,001).
- 191 -
Resultados
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE LA ALBMINA SRICA

Barras verticales indican intervalo de confianza CI = 95%
3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 T0 T1 T2 T3
g/dl
T4
Tiempo
Grfico 4.6.9.- Evolucin a lo largo del tiempo de la albmina srica en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 3,04 p= 0,02. Test Kruskal-Walis: Ht= 11,58 p= 0,02. Los resultados del estudio demuestran que el valor medio de la albmina srica se mantienen constantes en los diferentes tiempos de la investigacin; con excepcin del valor obtenido en el tiempo T3 que refleja una fluctuacin estadsticamente significativa a la baja en relacin con el momento inicial del estudio T0 (Test t student: t = 2,69; p = 0,01 y Test Wilcoxon: z = 2,42; p = 0,02) y con el resto de los tiempos de control.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE LAS GLOBULINAS SRICAS

Barras verticales representan el intervalo de confianza CI = 95%
7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 T0 T1
g/dl
T2
T3
T4
Tiempo
Grfico 4.6.10.- Evolucin a lo largo del tiempo de la concentracin de globulinas sricas en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 4,65 p= 0,002. Test Kruskal-Walis: Ht= 18,72 p<0,001.
- 192 -
Resultados
La evolucin de la concentracin media de las globulinas sricas discurre en paralelo a la observada en las protenas sricas totales. Tras producirse un incremento casi significativo de la concentracin media de globulinas sricas en el tiempo T1 del estudio con respecto al valor inicial T0 (Test t student: t= 1,78; p= 0,08 y Test Wilcoxon: z = 2,06; p= 0,04), comienza un descenso de las mismas claramente significativo en el tiempo T2 y T3, para volver a presentar un incremento en su concentracin en el tiempo T4 en relacin con el control anterior T3 (Test t student: t = 4,38; p<0,001 y Test Wilcoxon: z = 3,64; p<0,001).
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL COCIENTE ALBMINA /GLOBULINA

Barras verticales representan el intervalo de confianza CI = 95%
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.11.- Evolucin a lo largo del tiempo del cociente albmina / globulina srica en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,43 p= 0,23. Test Kruskal-Walis: Ht = 5,4 p = 0,24. Aunque se observan ligeras oscilaciones, relacionadas con los cambios en la concentracin de albmina y de las globulinas sricas anteriormente sealados, los valores medios del cociente albmina/globulina srica no presentan variaciones significativas en los diferentes tiempos del estudio.
- 193 -
Resultados
4.6.4 RECUENTO LEUCOCITARIO E INMUNOFENOTIPO En las tablas siguientes se recogen los resultados de distintas variables relativas a los recuentos leucocitarios y del inmunofenotipo en los distintos tiempo de estudio del grupo de perros con ehrlichiosis, primero expresados en valores absolutos (tablas 4.6.12- 4.6.16) y a continuacin en valores relativos (tablas 4.6.17-4.6.21)
T0 LEUCOCITOS /l NEUTRFILOS/l EOSINFILOS/l MONOCITOS/l LINFOCITOS/l LINFOCITOS B/l LINFOCITOS T/l LINFOCITOS NK/l LINFOCITOS Th/l LINFOCITOS Tc/l LINFOCITOS T/l Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 7000 24200 11467,60 3801,10 624,90 p = 0,01 3276 17908 6270,22 2790,38 493,27 p = 0,01 0 1624 301,50 378,61 66,93 p = 0,01 0 609 114,41 153,95 27,21 p = 0,01 803 10620 4615,24 2074,07 340,97 p = 0,55 100 1299 504,81 371,91 61,98 p < 0,01 435 9250 3923,61 1861,92 310,32 p = 0,86 49 478 164,25 98,33 16,39 p = 0,01 99 2708 1243,11 606,59 101,10 p = 0,73 141 7034 2153,47 1548,13 258,02 p = 0,07 0 2275 518,47 572,53 95,42 p < 0,01
TABLA 4.6.12.- Estadsticos bsicos de los valores absolutos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias en el da previo al tratamiento (T0) de los animales infectados por Ehrlichia canis.
Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 6200 18300 10864,70 3481,90 844,50 p = 0,35 2769 11005 5383,18 2178,26 528,30 p = 0,17 0 1040 304,18 311,75 75,61 p < 0,01 0 238 59,65 83,50 20,25 p < 0,01 1674 13359 5117,71 2951,91 715,94 p < 0,01 89 1230 475,54 376,98 91,43 p = 0,01 1169 11783 4232,88 2732,16 662,65 p = 0,13 96 1009 362,92 243,68 59,11 p = 0,02 150 2816 1166,97 694,28 168,39 p = 0,39 420 7520 2690,37 1986,99 481,92 p = 0,17 0 1457 376,09 346,89 84,13 p = 0,02
T1 LEUCOCITOS /l NEUTRFILOS/l EOSINFILOS/l MONOCITOS/l LINFOCITOS/l LINFOCITOS B/l LINFOCITOS T/l LINFOCITOS NK/l LINFOCITOS Th/l LINFOCITOS Tc/l LINFOCITOS T/l
TABLA 4.6.13.- Estadsticos bsicos de los valores absolutos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias de los perros infectados por Ehrlichia canis, en el primer control (T1) del estudio tras el tratamiento.
- 194 -
Resultados
Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 5800 15600 10734,70 2525,20 469,30 p = 0,42 1859 9450 6101,50 2153,03 406,88 p = 0,14 0 1729 329,53 468,08 88,46 p = 0,11 0 375 67,53 103,17 19,49 p = 0,08 1209 11154 4254,28 2372,18 448,30 p = 0,24 167 979 388,85 236,09 45,43 p < 0,01 733 9012 3438,18 2153,06 414,36 p = 0,12 59 1127 345,81 289,09 55,63 p < 0,01 197 3595 1161,88 742,67 142,93 p = 0,21 183 5940 1902,19 1461,28 281,22 p = 0,09 0 1544 371,81 329,93 63,43 p = 0,05
TABLA 4.6.14- Estadsticos bsicos de los valores absolutos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias en perros con Ehrlichiosis en el segundo control post-tratamiento (T2).
Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 3300 16900 9968,40 3645,90 836,40 p = 0,31 1400 12337 5658,53 3194,37 732,84 p = 0,64 0 1071 264,10 293,81 67,40 p = 0,04 0 106 28,63 40,56 9,31 p < 0,01 1513 7050 4017,16 1904,92 437,02 p = 0,30 152 1008 453,08 255,45 58,60 p = 0,11 979 6148 3287,91 1790,68 410,81 p = 0,32 98 711 226,30 143,68 32,96 p = 0,04 262 2301 1084,68 578,87 136,44 p = 0,38 170 4713 1832,25 1354,70 310,79 p = 0,04 0 1658 398,78 396,45 93,41 p = 0,01
TABLA 4.6.15.- Estadsticos bsicos de los valores absolutos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias en perros con Ehrlichiosis en el tercer control post-tratamiento, el tiempo T3 del estudio.
- 195 -
Resultados
Test distr. Valor Valor Desv. Error Media N mnimo mximo estndar estndar 4000 15400 9853,60 3215,10 607,60 p = 0,71 1170 9800 4813,39 2481,35 517,40 p = 0,94 0 1133 391,87 324,27 67,61 p = 0,12 0 140 28,24 49,51 10,80 p < 0,01 1440 9027 4264,25 2135,72 403,61 p = 0,08 107 1358 329,13 249,06 48,85 p < 0,01 1027 8612 3672,83 2100,85 412,01 p = 0,32 8 2388 241,55 446,23 87,51 p < 0,01 259 2583 1122,31 539,87 105,88 p = 0,69 210 6028 2155,32 1779,99 344,69 p < 0,01 0 1002 307,52 250,74 50,15 p = 0,09
TABLA 4.6.16.- Estadsticos bsicos de las poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias expresadas en valores absolutos en perros con Ehrlichiosis a los 180 das post-tratamiento (T4).
T0 NEUTRFILOS % EOSINFILOS % MONOCITOS % LINFOCITOS % LINFOCITOS B % LINFOCITOS T % LINFOCITOS NK % LINFOCITOS Th % LINFOCITOS Tc % LINFOCITOST %
Media 55,22 2,50 0,94 39,76 12,06 81,83 3,84 27,05 42,63 11,82
Desv. estnd. 12,47 2,64 1,01 13,25 8,32 10,26 2,19 9,51 19,51 11,88
Test distr. Error N estnd. 2,21 p = 0,82 0,47 p < 0,01 0,18 p = 0,01 2,15 p = 0,59 1,39 p < 0,01 1,71 p = 0,08 0,36 p = 0,12 1,58 p = 0,42 3,25 p = 0,01 1,98 p < 0,01
TABLA 4.6.17.- Estadsticos bsicos de las poblaciones leucocitarias expresados en valores relativos de leucocitos y de las subpoblaciones linfocitarias expresados valores relativos de linfocitos en el da previo al tratamiento de los animales infectados por Ehrlichia canis.
- 196 -
Resultados
Media 50,76 3,00 0,53 45,71 11,38 79,99 7,69 23,76 49,06 7,17
Desv. estnd. 15,61 3,74 0,72 16,08 9,24 12,00 3,85 10,93 17,91 3,71
Test distr. Error N estnd. 3,78 p = 0,10 0,91 p < 0,01 0,17 p < 0,01 3,90 p = 0,36 2,24 p = 0,03 2,91 p = 0,09 0,93 p = 0,94 2,65 p = 0,27 4,34 p = 0,60 0,90 p = 0,74
TABLA 4.6.18.- Estadsticos bsicos de las poblaciones leucocitarias expresados en valores relativos de leucocitos y de las subpoblaciones linfocitarias expresados valores relativos de linfocitos en el tiempo T1 del estudio (da 15 post-tratamiento) de los perros infectados por Ehrlichia canis.
Media 57,03 2,86 0,68 38,71 11,47 78,84 8,54 28,46 40,66 9,61
Desv. estnd. 15,92 3,70 0,98 17,20 7,14 9,20 5,34 8,67 15,55 5,82
Test distr. Error N estnd. 3,01 p = 0,21 0,70 p = 0,06 0,18 p = 0,02 3,25 p = 0,83 1,37 p = 0,01 1,77 p = 0,56 1,03 p = 0,17 1,67 p = 0,37 2,99 p = 0,26 1,12 p = 0,78
TABLA 4.6.19.- Estadsticos bsicos de los valores relativos de las poblaciones leucocitarias expresados en valores relativos de leucocitos y de las subpoblaciones linfocitarias expresados en valores relativos de linfocitos en perros con Ehrlichiosis en el da 30 post-tratamiento, segundo control (T2).
- 197 -
Resultados
Media 54,10 3,32 0,47 42,10 13,49 78,70 6,41 26,48 40,61 10,71
Desv. estnd. 17,32 3,54 0,70 16,26 7,44 9,10 3,41 8,08 16,39 9,12
Test distr. Error N estnd. 3,97 p = 0,40 0,81 p = 0,04 0,16 p < 0,01 3,73 p = 0,73 1,71 p = 0,85 2,09 p = 0,64 0,78 p = 0,11 1,90 p = 0,54 3,76 p = 0,40 2,15 p = 0,06
TABLA 4.6.20.- Estadsticos bsicos de las poblaciones leucocitarias expresados en valores relativos de leucocitos y de las subpoblaciones linfocitarias expresados en valores relativos de linfocitos en perros con Ehrlichiosis en el tiempo T3 del estudio (90 das post-tratamiento).
Media 49,09 4,00 0,39 44,11 9,66 82,25 5,59 27,80 45,98 8,70
Desv. estnd. 14,71 3,06 0,58 17,67 7,27 9,34 6,60 9,35 18,60 6,51
Test distr. Error N estnd. 3,07 p = 0,69 0,64 p = 0,08 0,12 p = 0,11 3,34 p = 0,90 1,42 p = 0,01 1,83 p = 0,03 1,29 p = 0,09 1,83 p = 0,22 3,65 p = 0,52 1,28 p = 0,18
TABLA 4.6.21.- Estadsticos bsicos de las poblaciones leucocitarias expresados en valores relativos de leucocitos y de las subpoblaciones linfocitarias expresados en valores relativos de linfocitos en perros con Ehrlichiosis a los 180 das tras iniciar el tratamiento (T4).
- 198 -
Resultados
Las dos siguientes tablas muestran, para todos los tiempos del grupo de perros con Ehrlichiosis, los estadsticos bsicos del ndice neutrfilos/linfocitos y del ndice linfocitario CD4/CD8.
ndice Neutrfilos/Linfocitos
Valor mn. Ehrlichiosis T0 Ehrlichiosis T1 Ehrlichiosis T2 Ehrlichiosis T3 Ehrlichiosis T4 0,44 0,32 0,17 0,29 0,19 Valor mximo 3,76 3,95 5,85 5,07 3,04 Media 1,49 1,42 2,03 1,77 1,30 Desv. Error Test estnd. estndar distr. N 0,80 0,99 1,42 1,43 0,80 0,14 p = 0,29 0,24 p = 0,01 0,27 p = 0,14 0,33 p < 0,01 0,17 p = 0,03
TABLA 4.6.22.- Estadsticos bsicos del ndice Neutrfilos/Linfocitos en todos los tiempos del estudio del Grupo 2.
ndice CD4/CD8
Valor mn. Ehrlichiosis T0 Ehrlichiosis T1 Ehrlichiosis T2 Ehrlichiosis T3 Ehrlichiosis T4 0,12 0,13 0,18 0,19 0,20 Valor mximo 3,54 2,63 2,94 1,66 3,64 Media 0,90 0,68 0,92 0,74 0,84 Desv. Error Test estnd. estndar distr. N 0,77 0,67 0,71 0,43 0,76 0,13 p < 0,01 0,16 p < 0,01 0,14 p = 0,03 0,10 p = 0,02 0,15 p = 0,05
TABLA 4.6.23.- Estadsticos bsicos del ndice linfocitario CD4/CD8 en todos los tiempos del estudio del Grupo 2.
- 199 -
Resultados
En los siguientes grficos se representan la evolucin, a lo largo de los diferentes tiempos del estudio, de las variables referentes a poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias, en primer lugar en valores absolutos (grficos 4.6.12 al 4.6.22), en segundo lugar en valores relativos (grficos 4.6.23 al 4.6.32) y en tercer lugar la evolucin de los ndices neutrfilos/linfocitos y CD4/CD8 (grficos 4.6.33 y 4.6.34).
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL RECUENTO LEUCOCITARIO

14 13 12
10 3/ l
11 10 9 8 7 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.12.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de leucocitos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F= 1,16; p= 0,33. Test Kruskal-Walis: Ht= 2,54; p= 0,64. En los valores del recuento leucocitario no se observan diferencias significativas a lo largo de los diferentes tiempos del estudio.
- 200 -
Resultados
EVOLUCIN DEL NMERO DE NEUTRFILOS EN FUNCIN DEL TIEMPO

8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 T0 T1 T2 T3
n/ l
T4
Tiempo
Grfico 4.6.13.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de neutrfilos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F= 1,30 p= 0,27. Test Kruskal-Walis: Ht= 6,96 p= 0,14. En perros con ehrlichiosis, el nmero de neutrfilos circulantes no mostr variaciones significativas a lo largo del estudio cuando se analiza globalmente, sin embargo el valor medio de neutrfilos en el tiempo T4 difiere de forma significativa del T0, (t student t= 2,99 p= 0,05, test de Wicoxon z= 2,32 p= 0,02), obtenindose el valor medio ms bajo de todos los controles efectuados.
EVOLUCIN DEL NMERO DE EOSINFILOS EN FUNCIN DEL TIEMPO

600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.14- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de eosinfilos en perros con ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,35 p= 0,84. Test Kruskal-Walis: Ht= 3,08 p= 0,54.
- 201 -
Resultados
En los perros con ehrlichiosis, no se apreciaron diferencias en el nmero de eosinfilos circulantes en los diferentes tiempos del estudio.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL NMERO DE MONOCITOS

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -40 T0 T1 T2 T3
n/ l
*
T4
Tiempo
Grfico 4.6.15.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de monocitos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 3,05 p= 0,02. Test Kruskal-Walis: Ht= 8,25 p= 0,08. Existen diferencias estadsticamente significativas en el nmero de monocitos circulantes antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb, observndose una disminucin progresiva de su nmero, que es significativa a partir del tiempo T3 de la investigacin con respecto al tiempo T0 (Test t student: t = 2,37; p = 0,02 y Test Wilcoxon z = -2,19 p= 0,02).
- 202 -
Resultados
EVOLUCIN DEL RECUENTO LINFOCITARIO EN FUNCIN DEL TIEMPO

Barras verticales expresan intervalo de confianza CI = 95%
7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 T0 T1 T2 T3 T4
n/ l
Tiempo
Grfico 4.6.16.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de linfocitos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,69 p= 0,60. Test Kruskal-Walis: Ht= 2,39 p= 0,66. A lo largo del tiempo del estudio, no se aprecian diferencias estadsticamente significativas en el recuento absoluto de linfocitos en perros con ehrlichiosis tras la administracin del tratamiento.
EVOLUCIN DE LINFOCITOS B EN EL TIEMPO

700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 T0 T1 T2 T3 T4
n/ l
Tiempo
Grfico 4.6.17.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de linfocitos B en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,48 p= 0,21. Test Kruskal-Walis: Ht= 4,93 p= 0,29.
- 203 -
Resultados
Aunque se observa una disminucin en el nmero absoluto de linfocitos B en el tiempo T4 con respecto a los valores previos al tratamiento (Test t student: t = 2,01; p = 0,04 y Test Wicoxon: z = 1,81; p = 0,07), los resultados del ANOVA y el test de KruskalWalis no detectan diferencias estadsticamente significativas entre los valores del recuento absoluto de linfocitos B a lo largo del tiempo.
EVOLUCIN DEL NMERO DE LINFOCITOS T EN EL TIEMPO

6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 T0 T1 T2 T3 T4
n/ l
Tiempo
Grfico 4.6.18.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento absoluto de linfocitos T en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,66 p= 0,62. Test Kruskal-Walis: Ht= 2,87 p= 0,58. El nmero de linfocitos T circulantes, en perros con ehrlichiosis, no sufre variaciones significativas tras la administracin del dipropionato de imidocarb a lo largo de la investigacin.
- 204 -
Resultados
EVOLUCIN DE LOS LINFOCITOS NK EN EL TIEMPO

550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 T0
n/ l
T1
T2
T3
T4
Tiempo
Grfico 4.6.19.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de linfocitos NK en perros con Ehrlichiosis ANOVA: F = 2,41 p= 0,04. Test Kruskal-Walis: Ht= 23,22 p<0,001. Existe un incremento estadsticamente significativo del nmero de linfocitos NK inmediatamente despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb (test de Wilcoxon nmero de linfocitos NK en el tiempo T0 frente al tiempo T1 z = 3,67 p< 0,001) que decrece progresivamente y significativamente hasta alcanzar valores similares a los iniciales a partir del tiempo T3.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL NMERO DE LINFOCITOS Th

1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 T0 T1 T2 T3 T4
n/ l
Tiempo
Grfico 4.6.20.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de linfocitos Th en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,24 p= 0,92. Test Kruskal-Walis: Ht= 1,41 p= 0,84.
- 205 -
Resultados
El nmero absoluto de linfocitos Th circulantes se muestran con unos valores medios prcticamente constantes en todo el tiempo del estudio, sin que se aprecien ninguna variacin significativa en perros con ehrlichiosis tras el tratamiento.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL NMERO DE LINFOCITOS Tc

4000 3500 3000
n/ l
2500 2000 1500 1000 500 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.21.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de linfocitos Tc en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,84 p= 0,50. Test Kruskal-Walis: Ht= 2,37 p= 0,67. Igualmente, los valores absolutos de linfocitos Tc en sangre de perros con ehrlichiosis no sufren variaciones significativas a lo largo de los tiempos de estudio.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL NMERO DE LINFOCITOS T

700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 T0 T1 T2 T3 T4
n/ l
Tiempo
Grfico 4.6.22.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento de linfocitos T en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,08 p= 0,37. Test Kruskal-Walis: Ht= 0,89 p= 0,93.
- 206 -
Resultados
Del mismo modo que para las anteriores subpoblaciones linfocitarias, no existen diferencias estadsticamente significativas en el nmero absoluto de linfocitos T en los diferentes tiempos de la investigacin. La evolucin y el anlisis estadstico de los valores de las distintas variables relativas a los recuentos leucocitarios e inmunofenotipo cuando son expresados en valores relativos (%), arroja unos resultados similares a los obtenidos con sus valores absolutos.
EVOLUCIN DEL PORCENTAJE DE NEUTRFILOS EN FUNCIN DEL TIEMPO

70 65 60 55 50 % 45 40 35 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.23.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de neutrfilos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,13 p = 0,34. Test Kruskal-Walis: Ht = 4,64 p = 0,33. El recuento porcentual de neutrfilos no experiment modificaciones significativas a lo largo del estudio en perros con ehrlichiosis.
- 207 -
Resultados
EVOLUCION DEL PORCENTAJE DE EOSINFILOS EN FUNCIN DEL TIEMPO

Barras verticales expresan el intervalo de confianza CI = 95 %
6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.24.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de eosinfilos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,75 p = 0,56. Test Kruskal-Walis: Ht = 4,67 p = 0,32. El recuento porcentual de eosinfilos no muestra diferencias significativas en los perros con ehrlichiosis a lo largo del tiempo.
EVOLUCIN DEL PORCENTAJE DE MONOCITOS EN EL TIEMPO

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 % 0,2 0,0 -0,2 T0 T1 T2 T3
T4
Tiempo
Grfico 4.6.25.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de monocitos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,74 p = 0,15. Test Kruskal-Walis: Ht = 5,61 p = 0,23.
- 208 -
Resultados
El recuento porcentual de monocitos muestra una disminucin progresiva a lo largo del tiempo, existiendo diferencias significativas entre el tiempo T0 y el T4 de la investigacin (Test t student: t = 2,3; p = 0,02 y Test Wicoxon: z = 1,94; p = 0,05). No obstante, el anlisis estadstico no arroja globalmente diferencias significativas en esta variable a lo largo del tiempo.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL PORCENTAJE LINFOCITARIO

60 55 50 45 40 35 30 25 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.26.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,78 p = 0,54. Test Kruskal-Walis: Ht = 2,70 p = 0,61. No se aprecian diferencias estadsticamente significativas en el recuento porcentual de linfocitos, en perros con ehrlichiosis antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb.
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Resultados
EVOLUCIN DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS B EN EL TIEMPO

20 18 16 14
12 10 8 6 4 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.27.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos B en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,62 p = 0,65. Test Kruskal-Walis: Ht = 3,07 p = 0,54. El anlisis evolutivo del recuento porcentual de linfocitos B, aunque muestra un descenso en el valor obtenido en el T4, no ofrece variaciones significativas en los animales con ehrlichiosis de nuestro estudio.
EVOLUCIN DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS T EN EL TIEMPO

88 86 84 82 80 78 76 74 72 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.28.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos T en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,72 p = 0,58. Test Kruskal-Walis: Ht = 3,38 p = 0,49. El estudio del recuento porcentual de linfocitos T circulantes, antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb, no ofrece diferencias estadsticamente significativas.
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Resultados
EVOLUCIN DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS NK EN EL TIEMPO

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 T0 T1
* *
T2
T3
T4
Tiempo
Grfico 4.6.29.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos NK en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 4,86 p = 0,01. Test Kruskal-Walis: Ht = 29,02 p < 0,0001. Existen diferencias estadsticamente significativas en el recuento porcentual de linfocitos NK, en los perros con ehrlichiosis antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb. Este incremento es significativo para los tiempos T1, T2 y T3 con respecto al T0, en el tiempo 4 el incremento observado no es estadsticamente significativo.
En los grficos del 4.6.30 al 4.6.32 se muestra la evolucin en el tiempo de los valores de las diferentes subpoblaciones linfocitarias. Los valores relativos de estas variables se refieren a poblacin linfocitaria.
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Resultados
EVOLUCIN DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS Th EN EL TIEMPO

34 32 30 28
26 24 22 20 18 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.30.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos Th en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,74 p = 0,37. Test Kruskal-Walis: Ht = 2,99 p = 0,56. No existen diferencias estadsticamente significativas en el recuento porcentual de linfocitos Th, antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS Tc

60 55 50
45 40 35 30 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.31.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos Tc en perros con ehrlichiosis ANOVA: F = 0,85 p = 0,49. Test Kruskal-Walis: Ht = 3,46 p = 0,48.
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Resultados
A lo largo del tiempo estudiado no se observan variaciones estadsticamente significativas en el valor relativo de los linfocitos Tc circulantes de animales con ehrlichiosis.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS T

16 14 12 10
8 6 4 2 0 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.32.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos T en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,08 p= 0,37. Test Kruskal-Walis: Ht = 1,75 p = 0,78. No se aprecian variaciones estadsticamente significativas en el recuento porcentual de linfocitos T en los periodos previo y posteriores al tratamiento con dipropionato de imidocarb.
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Resultados
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL NDICE NEUTRFILOS/LINFOCITOS

Barras verticales indican intervlo de confianza CI = 95% 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 T0 T1
ndice
T2 Tiempo
T3
T4
Grfico 4.6.33.- Evolucin a lo largo del tiempo del ndice neutrfilos/linfocitos en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 1,75 p = 0,14. Test Kruskal-Walis: Ht = 4,10 p = 0,39. Aunque los tests estadsticos no revelan diferencias estadsticamente significativas en la evolucin global del ndice neutrfilos/linfocitos tras el tratamiento con dipropionato de imidocarb, cuando los valores medios se comparan dos a dos se observa un aumento significativo del ndice neutrfilos/linfocitos en el tiempo T2 de la investigacin, con respecto al valor inicial T0 (Test t student: t = 2,19; p = 0,003 y Test de Wilcoxon: z = 1,73; p = 0,08).
La siguiente grfica muestra la evolucin en el tiempo de los valores del ndice CD4/CD8 en perros con ehrlichiosis.
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Resultados
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL NDICE LINFOCITARIO CD4/CD8

Barras verticales expresan el intervalo de confianza CI >= 95%
1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 T0 T1 T2 T3 T4
ndice
Tiempo
Grfico 4.6.34.- Evolucin a lo largo del tiempo del valor del ndice linfocitario CD4/CD8 (Th/Tc) en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,46 p = 0,76. Test Kruskal-Walis: Ht = 3,90 p = 0,42. En los animales con ehrlichiosis estudiados, no existen diferencias estadsticamente significativas en el valor del ndice CD4/CD8 antes y despus del tratamiento con dipropionato de imidocarb.
4.6.5 SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS REFERIDAS A LA POBLACIN DE LINFOCITOS T
Las tablas 4.6.24- 4.6.26 muestran los estadsticos bsicos del valor porcentual de las subpoblaciones T-linfocitarias referido a la poblacin de linfocitos T. Se muestran los resultados en los cinco tiempos del estudio en el grupo de perros con Ehrlichiosis. A continuacin, se detalla grficamente la evolucin en el tiempo de estos valores de las subpoblaciones linfocitarias expresadas como porcentaje de linfocitos T (grficas de la 4.6.35 a la 4.6.37).
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Resultados
Linfocitos Th como % de linfocitos T

Valor mn. Ehrlichiosis T0 Ehrlichiosis T1 Ehrlichiosis T2 Ehrlichiosis T3 Ehrlichiosis T4 10,38 10,70 12,90 14,80 15,90 Valor mximo 65,63 63,20 56,00 52,10 71,30 Media 33,87 30,80 36,73 33,83 34,81 Desv. estnd. 13,41 16,08 11,91 11,56 14,32 Error estndar 2,23 3,90 2,29 2,72 2,80 Test distr. N p = 0,27 p = 0,08 p = 0,84 p = 0,31 p = 0,27
TABLA 4.6.24.- Estadsticos bsicos de la poblacin de linfocitos T auxiliares expresados como porcentaje de clulas T en todos los tiempos del estudio del grupo de perros con Ehrlichiosis.
Linfocitos Tc como % de linfocitos T

Valor mn. Ehrlichiosis T0 Ehrlichiosis T1 Ehrlichiosis T2 Ehrlichiosis T3 Ehrlichiosis T4 17,14 24,10 18,40 14,74 19,60 Valor mximo 89,37 84,80 76,60 76,66 83,50 Media 51,33 60,01 50,66 50,32 54,22 Desv. estnd. 19,35 17,24 16,00 16,42 17,30 Error estndar 3,22 4,18 3,05 3,77 3,39 Test distr. N p = 0,71 p = 0,21 p = 0,53 p = 0,28 p = 0,99
TABLA 4.6.25.- Estadsticos bsicos de la poblacin de linfocitos T citotxicos expresados como porcentaje de clulas T en todos los tiempos del estudio del grupo de perros con Ehrlichiosis.
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Resultados
Linfocitos T como % de linfocitos T

Valor mn. Ehrlichiosis T0 Ehrlichiosis T1 Ehrlichiosis T2 Ehrlichiosis T3 Ehrlichiosis T4 0 0 0 0 0 Valor mximo 51,59 16,4 27,5 42,61 32,60 Media 14,80 9,21 12,60 13,16 11,01 Desv. estnd. 14,75 4,75 7,93 11,77 8,52 Error estndar 2,46 1,15 1,53 2,70 1,67 Test distr. N p < 0,01 p = 0,27 p = 0,89 p = 0,19 p = 0,07
TABLA 4.6.26.- Estadsticos bsicos de las subpoblaciones de linfocitos T expresados como porcentaje de clulas T en todos los tiempos del estudio del grupo de perros con Ehrlichiosis.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS Th EN RELACIN A LOS LINFOCITOS T

Barras verticales expresan el intervalo de confianza CI = 95% 44 42 40 38 36 34 32 30 % 28 26 24 22 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.35.- Evolucin a lo largo del tiempo del recuento porcentual de linfocitos Th referido a linfocitos T en perros con Ehrlichiosis. ANOVA: F = 0,53 p = 0,73. Test Kruskal-Walis: Ht = 3,78 p = 0,44. A lo largo del tiempo, no existen diferencias estadsticamente significativas en el valor de los recuentos de linfocitos Th, expresado como porcentaje de linfocitos T.
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Resultados
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS Tc EN RELACIN A LINFOCITOS T

Barras verticales espresan el intervalo de confianza CI = 95%
75 70 65 60 55 50 45 40 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.36.- Evolucin a lo largo del tiempo del valor de linfocitos Tc expresado como porcentaje de linfocitos T en perros con ehrlichiosis ANOVA: F = 1,02 p = 0,40. Test Kruskal-Walis: Ht = 4,74 p = 0,31. El valor de la poblacin de linfocitos Tc, expresado como porcentaje de linfocitos T, no sufre variaciones significativas a lo largo del tiempo del estudio.
EVOLUCIN EN EL TIEMPO DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS T REFERIDO A LINFOCITOS T

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.37.- Evolucin a lo largo del tiempo del valor de linfocitos T expresado como porcentaje de linfocitos T en perros con ehrlichiosis ANOVA: F = 0,95 p = 0,44. Test Kruskal-Walis: Ht = 1,66 p = 0,80. Al igual que las subpoblaciones anteriores, en la evolucin de los animales con ehrlichiosis, no se observan variaciones estadsticamente significativas en el valor del recuento de linfocitos T, expresado como porcentaje de linfocitos T.
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Resultados
A continuacin, y a modo de resumen, recogemos los parmetros biopatolgicos en los que hemos encontrado diferencias estadsticamente significativas entre los resultados obtenidos en los distintos controles tras la administracin del tratamiento. De los parmetros biopatolgicos investigados, debemos sealar que durante el seguimiento pocos son los que sufren modificaciones significativas y, cuando stas se producen en general son de una intensidad moderada. En principio, era previsible que los parmetros biopatolgicos que se encontraban alterados en los perros con Ehrlichiosis con respecto al grupo Control sufrieran las mayores modificaciones con una tendencia a su normalidad. Sin embargo este hecho no se comprob en todas las variables. Dentro de los parmetros de la serie roja se comprueba un incremento significativo post-tratamiento de la concentracin de hemoglobina que a su vez provoca ligeros incrementos de los ndices de concentracin media de hemoglobina (CMH) y concentracin media corpuscular de hemoglobina (CMCH). El valor medio del recuento plaquetario no sufre variaciones significativas, obtenindose durante todos los controles de seguimiento unas cifras similares. No obstante, en el estudio pormenorizado de los casos comprobamos como a los 6 meses posttratamiento slo 4 perros presentan una marcada trombocitopenia (por debajo de 100.000 plaquetas por microlito) y slo dos de estos perros han presentado una trombocitopenia persistente en todos los controles efectuados. Los parmetros del proteinograma en los perros con ehrlichiosis obtenidos en el momento del diagnstico eran los que presentaban mayores alteraciones y diferencias significativas con respecto al grupo Control, y por ello era previsible modificaciones en el curso del seguimiento. Sin embargo, aunque se observan algunas modificaciones en la evolucin de las protenas totales y globulinas sricas al alza en el primer control posttratamiento y una tendencia a la baja en los siguientes controles, ni en estas variables ni en
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Resultados
la concentracin de albmina ni en el cociente Albmina/Globulina se constatan cambios definitivos a los 6 meses post-tratamiento con respecto a los valores iniciales. En el grfico 4.6.38 se representa la evolucin en el tiempo de los valores de tres variables proteicas (protenas totales, albmina y globulinas) en la poblacin con ehrlichiosis objeto de estudio. No obstante estudiando pormenorizadamente los casos a los 6 meses posttratamiento se comprueba que si bien la disproteinemia persiste en la mayora de ellos, no se observa ninguna hipoalbuminemia por debajo de los 2 g/dl ni ninguna hiperglobulinemia por encima de los 8 g/dl, permaneciendo los valores de las protenas totales sricas por encima de los 6 g/dl en todos los casos. Es decir los casos iniciales con hipoproteinemia haban desaparecido si bien persisten los casos de hiperproteinemia, aunque algunos de ellos con cifras ms moderadas.
EVOLUCIN DE PT, ALB Y GLOB EN EL TIEMPO

11 10 9 8 7 p < 0,001 p = 0,02 GLOB p = 0,002
PT ALB
* * *
g/dl
6 5 4 3
*
2 1 T0 T1 T2 T3 T4
Tiempo
Grfico 4.6.38.- Representacin grfica conjunta de las diferentes concentraciones de protenas sricas a lo largo del tiempo en el grupo de perros con Ehrlichiosis tras la administracin del tratamiento.
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Resultados
En relacin a la serie leucocitaria y las distintas poblaciones y subpoblaciones linfocitarias, llama la atencin la prctica ausencia de modificaciones en todas ellas a lo largo de la evolucin post-tratamiento, y con excepcin del valor medio del recuento de los linfocitos B, de los monocitos y en menor medida de los neutrfilos, los que sufren un descenso en sus valores, el resto de los parmetros no presentan modificaciones significativas a los 6 meses post-tratamiento con respecto a los valores iniciales.
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DISCUSIN
Discusin
5. DISCUSIN
5.1 PREVALENCIA DE EHRLICHIOSIS CANINA EN LAS
POBLACIONES INCLUIDAS EN EL ESTUDIO

Hasta la fecha y a conocimiento del autor, existen pocos estudios epidemiolgicos realizados sobre ehrlichiosis en Espaa, si bien todos ellos, revelan una alta prevalencia de la enfermedad. Un estudio del ao 2000 sita la tasa de seroprevalencia de ehrlichiosis canina en la provincia de Valencia en el 13,7% (Gonzlez et al, 2000). Tal y como se refleja en el captulo de resultados, en las protectoras incluidas en el estudio, encontramos una seroprevalencia de ehrlichiosis canina del 69,37%. Esta prevalencia tan elevada parece responder ms a las peculiaridades de la poblacin estudiada, que a la realidad de la poblacin canina en la provincia de Valencia. Otros autores ya han sealado que el hbitat y la aptitud influyen en el riesgo a padecer la infeccin, habiendo observado prevalencias del 60-70% en perros de colectividades (Tesouro et al, 2001). En cualquier caso, la prevalencia tan alta encontrada en nuestra poblacin canina es indicativa de la importancia en la zona y de la capacidad infectiva del agente vector, Rhipicephalus sanguineus, as como del riesgo real de la enfermedad en esta rea geogrfica y la necesidad de aplicar medidas profilcticas adecuadas que impidan la transmisin del agente infeccioso, en especial en este tipo de poblacin. Por otra parte, el hecho de que en una zona endmica de leishmaniosis, la seroprevalencia frente a esta enfermedad (28,12%) sea mucho menor que la encontrada
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Discusin
frente a ehrlichiosis, pone an ms de manifiesto la importancia de esta enfermedad rickettsial en esta rea geogrfica. Si bien la ehrlichiosis puede considerarse en lneas generales una enfermedad menos grave, su alta prevalencia hace necesario incidir en la toma de medidas profilcticas frente a ella. La presencia de concurrencias de ehrlichiosis y leishmaniosis en las colectividades de procedencia de nuestra poblacin se presenta en el 21,87%, lo que muestra que la gran mayora de perros seropositivos a leishmaniosis, 7 de cada 9, tambin son positivos a ehrlichiosis en esta poblacin. Las alteraciones inmunolgicas presentes tanto en el curso de la ehrlichiosis como de la leishmaniosis, pueden condicionar la presencia simultnea de ambas enfermedades en un mismo animal. De hecho, algunos autores afirman que la existencia de una de estas infecciones favorece el desarrollo de la otra, as como el desarrollo de otros procesos infecciosos concurrentes (Abranches et al, 1991). En este sentido, aunque no se han realizado estudios de prevalencia, en las colectividades caninas estudiadas tambin se ha observado concurrencia de ehrlichiosis y hepatozoonosis canina.
5.2 POBLACIN CONTROL

La poblacin control en la presente investigacin, se caracteriz por la ausencia de anticuerpos circulantes frente a Ehrlichia canis y Leishmania infantum, as como por presentar un estado saludable a la exploracin fsica general. En esta poblacin se realiz un estudio hematolgico completo y un estudio de protenas sricas, que complementaron el chequeo clnico destinado a la confirmacin de encontrarnos ante una poblacin sana. Se estudiaron tambin las caractersticas inmunofenotpicas de sus poblaciones linfocitarias, como referente comparativo para el estudio realizado sobre perros con ehrlichiosis.
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Discusin
5.2.1 HEMATOLOGA: ERITROGRAMA, INDICES ERITROCITARIOS Y PLAQUETAS Los valores obtenidos para nuestra poblacin control se encontraron dentro de los rangos fisiolgicos para cada una de las variables estudiadas. Nuestra poblacin es un reflejo a pequea escala de las caractersticas hematolgicas de perros sanos (Meinkoth, 2000) y es un buen referente para el ulterior anlisis comparativo entre perros con y sin ehrlichiosis.
5.2.2 PROTENAS SRICAS Los valores de protenas sricas de nuestra poblacin control se ajustan a los rangos fisiolgicos descritos en perros (Tesouro et al, 1995). Estos datos nos permiten el posterior estudio comparativo entre poblacin sana y con ehrlichiosis. nicamente se encontraron 2 animales con una ligera hiperproteinemia por hiperglobulinemia y dado que se acompaaban igualmente de una ligera hiperalbuminemia podemos admitir que posiblemente estos animales presentaran un cierto grado de deshidratacin.
5.2.3 RECUENTO LEUCOCITARIO Y RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS Tal y como se describi en resultados tan slo se observ un animal con ligera eosinofilia (1450 eosinfilos/l) y otro con ligera linfocitosis (5180 linfocitos/l), el resto de los resultados del recuento leucocitario y diferencial en la poblacin control de nuestra investigacin se encuentran dentro del rango fisiolgico descrito para perros sanos (Meinkoth, 2000), lo que es compatible con la percepcin de una poblacin clnicamente saludable.
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Discusin
5.2.4 POBLACIONES LINFOCITARIAS: INMUNOFENOTIPO La citometra de flujo y el empleo de anticuerpos monoclonales de manera pareada nos ha permitido caracterizar cada una de las estirpes linfocitarias en los perros objeto de esta investigacin. Para poder evaluar ms correctamente los resultados obtenidos en el inmunofenotipo de los perros con ehrlichiosis, se realiz el mismo estudio en 18 animales sanos, exentos de ehrlichiosis y leishmaniosis y que compartan las mismas condiciones de alojamiento y manejo que los animales enfermos. Estos resultados sirven de referencia para poder evaluar los cambios producidos en las poblaciones linfocitarias de los perros con ehrlichiosis incluidos en este estudio. Existen pocos estudios en los que se describa el inmunofenotipo de perros sanos. Tras la bsqueda bibliogrfica llevada a cabo para localizar fuentes que pudieran indicar los valores de las distintas poblaciones linfocitarias en perro sano, se han encontrado slo dos estudios con este objetivo (Byrne et al, 2000; Faldyna et al, 2001). En ambas investigaciones las diferentes poblaciones linfocitarias estudiadas eran caracterizadas por marcacin con un nico anticuerpo monoclonal. Existen en la bibliografa otros trabajos que describen poblaciones linfocitarias en sangre perifrica de perros sanos, si bien en estas investigaciones estos valores eran empleados como referencia para discutir los resultados de la propia investigacin. Las lneas de investigacin de cada uno de esos estudios son muy diversas. Algunos trabajos comparan el inmunofenotipo de sangre perifrica de perros sanos con el de diferentes tejidos de esos mismos animales, como lquido cefalorraqudeo (Duque et al, 2002), hgado (Sakai et al, 2003) o lavado bronquial (Dirscherl et al, 1995), mientras que otros lo comparan con el inmunofenotipo de sangre perifrica en perros con diferentes patologas: pioderma del pastor alemn (Chabanne et al, 1995), leishmaniosis (Bourdoiseau et al, 1997), demodicosis (Caswell et al, 1997) o linfoma (Winnicka et al, 2002).
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Discusin
El nmero de animales control empleados en estos estudios es muy variable: de 5 (Caswell et al, 1997) a 54 individuos (Faldyna et al, 2001). En nuestro trabajo hemos caracterizado el inmunofenotipo en 18 perros sanos, siendo este nmero superior al registrado en la mayora de los estudios recopilados. Se ha descrito que la raza y la edad influyen en la distribucin de los linfocitos circulantes en perros (Greeley et al, 1996; Faldyna et al, 2001). En los diferentes trabajos consultados no existe homogeneidad en cuanto a las caractersticas etarias y raciales de los perros incluidos en los diferentes estudios, habiendo trabajos realizados en Beagle (Dirschell et al, 1995; Gebhard y Carter, 1992; Sakai et al, 2003; Otani et al, 2002) o en perros de distintas razas (Rivas, 1995; Caswell, 1997; Bourdoiseau et al, 1997; Winnicka et al, 2002; Guarga et al, 2000; Faldyna et al, 2001; Duque et al, 2002). Los perros incluidos en nuestro estudio pertenecan a distintas razas y edades, aunque todos eran adultos. A la hora de comparar los resultados de las referencias consultadas y de nuestro estudio, hay que considerar que nuestra investigacin es nica en el sentido de que estudia una poblacin canina procedente de protectoras, poblacin que, a conocimiento del autor, no ha sido estudiada inmunofenotpicamente con anterioridad. Los diferentes estudios recopilados emplean, al igual que el nuestro, los siguientes anticuerpos monoclonales para la identificacin de las diferentes estirpes linfocitarias: antiCD5 o anti-CD3 como marcador de clulas T; anti-CD8 como marcador de linfocitos Tc, anti-CD4 como marcador de linfocitos Th; anti-CD21 como marcador de linfocitos B. En la mayora de estos estudios los anticuerpos monoclonales provenan, incluso, de la misma fuente que en nuestra investigacin (Laboratorio del Dr.P.F. Moore en UC Davis, California). Sin embargo, en nuestra investigacin, las poblaciones linfocitarias se describen en funcin de su marcaje simultneo con dos de estos anticuerpos monoclonales, mientras que en todas las investigaciones recopiladas, con la excepcin de dos de ellas, se identifican
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Discusin
por marcaje con un slo anticuerpo monoclonal. Consideramos, al igual que otros autores (Grindem, 1996), que es recomendable el empleo de dos o ms marcadores simultneos por cada poblacin linfocitaria para garantizar la pureza de las mismas. En las tablas siguientes se detallan los valores recopilados de los distintos estudios publicados; en la ltima lnea de cada tabla se muestran los valores obtenidos en la presente investigacin.
5.2.4.1 Poblaciones linfocitarias LINFOCITOS T Ac monoclonales empleados CD5 CD5 CD5 CD5 CD3 CD3 CD3+ CD21CD3+ CD2112 12 28 24 54 11 30 18 84,10 71,00 83,30 61,56 80.00 85,40 85,10 72,87 9,50 10,40 3,50 3,04 7,40 6,50 6,80 6,04 Chabanne et al, 1995 Dirscherl et al, 1995 Byrne et al, 2000 Winnicka et al, 2002 Faldyna et al, 2001 Sakai et al, 2002 Otani et al, 2003 Tesis presentada N MEDIA DS REFERENCIA
TABLA 5.2.1.- Detalle de estadsticos bsicos de los valores porcentuales de linfocitos T definidos en siete referencias y en la tesis presentada, as como la marcacin con anticuerpos monoclonales empleada en cada estudio. Se puede observar una similitud en los valores de linfocitos T obtenidos en los diferentes estudios, si bien podemos apreciar un valor porcentual menor en nuestro estudio
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Discusin
que en la mayora de ellos. Tan slo dos investigadores obtuvieron valores inferiores a los encontrados en nuestro trabajo.
LINFOCITOS B Ac monoclonales empleados CD21 CD21 CD21 CD21 CD21 CD21 CD3-CD21+ CD3-CD21+ 12 5 28 54 23 24 11 18 12,20 28,70 12,90 14,40 18,80 5,12 9,30 18,41 3,90 5,90 9,10 0,20 6,10 6,29 6,00 Chabanne et al, 1995 Caswell et al, 1997 Byrne et al, 2000 Faldyna et al, 2001 Duque et al, 2002 Winnicka et al, 2002 Sakai et al, 2003 Tesis presentada N MEDIA DS REFERENCIA
TABLA 5.2.2.- Detalle de los estadsticos bsicos de los valores porcentuales de linfocitos B definidos en siete referencias y en la tesis presentada, as como la marcacin con anticuerpos monoclonales empleada en cada estudio. Aunque existe una cierta variabilidad en los valores obtenidos para los linfocitos B circulantes en sangre perifrica de perros sanos segn los diferente autores, podemos considerar que nuestros resultados se ajustan a los valores referenciados en la bibliografa consultada y sealados en la tabla 5.2.2.
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Discusin
LINFOCITOS NK Ac monoclonales empleados CD3-CD21CD3-CD21CD3-CD2130 11 18 2,9 5,3 7,30 1,1 1,8 2,63 Otani et al, 2002 Sakai et al, 2003 Tesis presentada N MEDIA DS REFERENCIA
TABLA 5.2.3.- Detalle de los estadsticos bsicos de los valores porcentuales de linfocitos NK definidos en dos referencias y en la tesis presentada, as como la marcacin con anticuerpos monoclonales empleada en cada estudio. Los linfocitos no T no B son considerados linfocitos Natural Killer (NK) (McDonough y Moore, 2000). Hasta el momento actual no se ha encontrado marcador para los linfocitos NK caninos. En el hombre se ha identificado el CD56 (Sakai et al, 2003, Otani et al, 2002) como marcador para estas clulas; sin embargo el empleo de este marcador en perros slo ha demostrado su expresin en linfocitos T CD3+ (Otani et al, 2002). En nuestro estudio, tal y como han sugerido otros autores (Sakai et al, 2003), equiparamos la poblacin de linfocitos CD3-CD21-, no T no B, a la poblacin de linfocitos Natural Killer. Los valores obtenidos para esta poblacin en nuestra investigacin son superiores a los observados por otros autores. Los escasos estudios al respecto y la variacin existente entre ellos, impiden precisar si estos resultados son debidos a las caractersticas peculiares de nuestra poblacin y/o a la heterogeneidad de las poblaciones de los diferentes estudios publicados hasta la fecha. Concluimos que, en la poblacin canina sana objeto de nuestro estudio, la disminucin en el valor relativo de los linfocitos T se ve compensada por una elevacin en el porcentaje de los linfocitos NK. En los anteriores estudios referenciados no se expresan
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los valores en trminos absolutos por lo que no podemos comparar lo que ocurre en nuestra poblacin en nmeros absolutos en relacin con el resto de poblaciones estudiadas. Sin embargo, el porcentaje de linfocitos en nuestra poblacin canina se encuentra dentro de valores fisiolgicos, por lo que podemos deducir que efectivamente existe un aumento en el nmero de linfocitos NK circulantes que compensa la disminucin en trminos absolutos de linfocitos T, aunque no podemos precisar la significacin del aumento de los linfocitos NK en esta poblacin.
5.2.4.2. Subpoblaciones linfocitarias A continuacin pasamos a comparar en las tablas 4 y 5 los valores relativos de las subpoblaciones de linfocitos T observadas por otros autores y en nuestro estudio.
LINFOCITOS Th Ac monoclonales empleados CD4 CD4 CD4 CD4 CD4/TCR CD4 CD4 CD4 CD4+ CD8CD4+ CD8-
N 12 12 5 28 9 54 23 24 11 18
MEDIA 47,50 40,00 35,00 45,00 39,70 43,20 40,10 40,77 42,30 33,92
DS 8,80 7,50 8,30 4,26 6,90 11,40 2,040 5,90 5,83
REFERENCIA Chabanne et al, 1995 Dirscherl et al, 1995 Caswell et al, 1997 Byrne et al, 2000 Guarga et al, 2000 Faldyna et al, 2001 Duque et al, 2002 Winnicka et al, 2002 Sakai et al, 2003 Tesis presentada
TABLA 5.2.4.- Estadsticos bsicos de los valores de linfocitos Th definidos en nueve referencias y en la tesis presentada, as como la marcacin con anticuerpos monoclonales empleada en cada estudio.
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Podemos observar una cierta homogeneidad entre los porcentajes de linfocitos Th obtenidos en los diferentes estudios referenciados, si bien los valores obtenidos en la tesis presentada son inferiores a los de otros estudios.
LINFOCITOS Tc Ac monoclonales empleados CD8 CD8 CD8 CD8 CD8/TCR CD8 CD8 CD8 CD4-CD8+ CD4-CD8+ 12 12 5 28 9 54 23 24 11 18 19,30 19,00 14,60 28,80 13,40 19,10 19,50 26,44 26,30 24,59 5,60 3,42 5,70 7,90 1,72 3,60 7,04 4,00 3,60 Chabanne et al, 1995 Dirscherl et al, 1995 Caswell et al, 1997 Byrne et al, 2000 Guarga et al, 2000 Faldyna et al, 2001 Duque et al, 2002 Winnicka et al, 2002 Sakai et al, 2003 Tesis presentada N MEDIA DS REFERENCIA
TABLA 5.2.5.- Estadsticos bsicos de los valores relativos de linfocitos Tc definidos en nueve referencias y en la tesis presentada, as como la marcacin con anticuerpos monoclonales empleada en cada estudio. En cuanto al valor porcentual de los linfocitos Tc en sangre perifrica de perros sanos observamos una cierta variabilidad en los datos referidos por distintos autores, con un rango de las medias de 13,4 (Guarga et al, 2000) a 28,8 (Byrne et al, 2000). Nuestros valores se encuentran dentro del rango descrito y comprobamos como el valor medio de los linfocitos Tc obtenidos en los dos nicos estudios en los que se emplea la asociacin de dos anticuerpos monoclonales anti-CD4 y anti-CD8 (Sakai et al, 2003; Tesis presentada) son muy prximos (26,30 y 24,59, respectivamente).
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En relacin con la tercera subpoblacin linfocitaria, hay que destacar la escasez de estudios que evalen la subpoblacin de linfocitos T en perros. En humanos las clulas T representan slo del 0,5 al 15% de los linfocitos T circulantes (Roitt, 1998a; Caldwell et al, 1995), mientras que en rumiantes representan del 30 al 80% (Roitt, 1998a). Un nico estudio publicado refiere, en una poblacin de 12 perros, un valor medio de 2,11,5% de la poblacin linfocitaria (Faldyna et al, 2001), mientras que otras fuentes (Sonea et al, 2000) citan estudios no publicados que estiman unos valores circulantes de linfocitos T en perros sanos del 1 al 4% de los leucocitos totales (trabajos no publicados de Sonea y Moore, citados por Sonea et al, 2000). En nuestra investigacin, el valor porcentual medio para los linfocitos T, referido a poblacin linfocitaria, es del 14,39%, referido a la poblacin de linfocitos T es del 19,61% y referido a la poblacin de leucocitos es del 3,63%. Nuestras observaciones en perros sanos son similares a las de Sonea et al, si bien los porcentajes son muy superiores a los de Faldyna et al. En cuanto a los valores obtenidos en otras especies como humanos y rumiantes, observamos que, segn nuestro estudio, el nmero de linfocitos T se encuentra entre los de ambas especies. Aunque los valores de nuestra poblacin sana son un paso previo imprescindible para el estudio de la influencia de la ehrlichiosis sobre el perfil inmunofenotpico de los animales afectados, sera interesante realizar ms estudios que determinen las distintas poblaciones leucocitarias en animales sanos.
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NDICE LINFOCITARIO CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 CD4/CD8 N 12 12 15 5 28 9 54 29 11 18 MEDIA 2,60 2,20 1,70 2,80 1,87 3,13 2,50 2,14 1,64 1,48 0,36 0,45 0,830 0,90 DS 0,80 0,30 REFERENCIA Chabanne et al, 1995 Dirscherl et al, 1995 Rivas, 1995 Caswell et al, 1997 Byrne et al, 2000 Guarga et al, 2000 Faldyna et al, 2001 Gebhart y Carter,1992 Sakai et al, 2003 Tesis presentada
TABLA 5.2.6.- Estadsticos bsicos de los valores del ndice linfocitario CD4/CD8 definidos en nueve referencias y en la tesis presentada. Los valores obtenidos en nuestro estudio para el ndice linfocitario CD4/CD8 son los ms bajos de todos los encontrados en la bibliografa consultada; este hecho puede explicarse por el valor comparativamente inferior de linfocitos Th (linfocitos CD3+ CD4+) encontrado en nuestro estudio en comparacin con el resto de referencias. Las diferencias observadas en el fenotipo de nuestros perros sanos, en comparacin con otras poblaciones caninas, pueden ser debidas a lo novedoso de nuestra investigacin al trabajar con un tipo de colectividad canina no estudiada en este aspecto hasta la fecha. Las condiciones de vida de nuestra poblacin estn sujetas a condiciones de estrs, hacinamiento y competitividad no existentes en otros colectivos. Del mismo modo que, en otros estudios se han encontrado diferencias etarias y raciales (Greeley et al, 1996; Byrne et al, 2000), las condiciones de vida de los animales podran condicionar el perfil inmunofenotpico (inmunolgico).
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En este sentido, diversos autores han observado la inversin del ndice CD4/CD8 en perros que habitaban en las proximidades de vertederos (Backer et al, 1993). Resumiendo, en nuestra poblacin control de perros sanos encontramos un valor inferior en el porcentaje de linfocitos T comparado con los valores obtenidos por otros investigadores. La reduccin en el porcentaje de esta poblacin linfocitaria se produce por una disminucin de los valores de linfocitos Th en la poblacin estudiada, lo que conlleva a la disminucin del ndice linfocitario CD4/CD8. Si bien el ndice CD4/CD8 se encuentra en valor inferior en la poblacin de nuestro estudio, no existe una inversin del mismo, ya que el valor porcentual de linfocitos Th sigue encontrndose por encima del de linfocitos Tc, por lo que la posibilidad de que exista una disfuncin inmunolgica en esta poblacin es baja. Por otra parte, hemos observado como los valores de las poblaciones linfocitarias de perros sanos son muy variables, dependiendo del estudio consultado. Ante este hecho y la ausencia de la estandarizacin del inmunofenotipo en animales sanos, coincidimos con lo ya apuntado por otros autores (Faldyna et al, 2001) en la necesidad del estudio inmunofenotpico de un grupo control lo ms semejante posible a la poblacin objeto de estudio, previamente a cualquier investigacin.
5.3 POBLACIN CON EHRLICHIOSIS

En nuestro estudio, la poblacin canina con ehrlichiosis se caracteriz por la presencia de un ttulo de anticuerpos frente a E. canis por encima de 1/80 y por la ausencia de sintomatologa detectable a la exploracin. Se sabe que un ttulo elevado de anticuerpos aparece durante la enfermedad, pero que tambin permanece durante tiempo prolongado tras el tratamiento (Perille y Matus, 1991; Bartsch y Greene, 1996; Harrus et al, 1996a; Frank y Breitschwerdt, 1999; Sainz et al, 2000a). En nuestra investigacin, todos los animales llevaban ms de nueve meses en la
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protectora y no haban sido tratados previamente con frmacos frente a ehrlichiosis, por lo que podemos afirmar que los perros objeto de este estudio se encontraban muy probablemente en la fase subclnica de la enfermedad.
5.3.1 HEMATOLOGA: ERITROGRAMA E NDICES ERITROCITARIOS
No existe variacin en el nmero de glbulos rojos ni en el hematocrito en los perros con ehrlichiosis ni respecto a valores fisiolgicos (Meinkoth, 2000), ni respecto a los valores encontrados en la poblacin control. Aunque se pueda apreciar un descenso en los valores medios de la concentracin de hemoglobina y de los ndices eritrocitarios (HCM, VCM y CHCM) en los animales con ehrlichiosis respecto a la poblacin control, estos valores se encuentran dentro de los valores considerados como normales para la poblacin canina. Concluimos que en los perros con ehrlichiosis estudiados, las variables de la serie roja estudiadas se encuentran dentro del rango de la normalidad, an admitiendo que en un solo animal se podra considerar la existencia de una ligera anemia (4,57 x106 GR/l, HB<12, Htc=35). Se ha descrito la existencia frecuente de anemia en animales con ehrlichiosis sintomticos (Troy et al, 1980; Kuehn y Gaunt, 1985; Waddle y Littman, 1988). Otros autores que han incluido en su estudio animales sintomticos y asintomticos reflejan una incidencia de anemia ligeramente inferior (Sainz, 1996). En nuestro trabajo, caracterizado por la inclusin de perros con ehrlichiosis subclnica se comprueba la ausencia de anemia en estos animales, hecho que corrobora los hallazgos de otros autores en ehrlichiosis canina subclnica (Codner y Farris-Smith, 1986). Por otra parte, en tres animales se observaron valores mayores de lo normal en los tres parmetros indicadores de la serie roja, lo que puede estar directamente relacionado con el estado de excitacin de los animales en el momento de la extraccin.
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5.3.2 PLAQUETAS La alteracin hematolgica ms frecuentemente descrita en la ehrlichiosis canina es la trombocitopenia, habiendo sido muy empleada su presencia como dato previo para la sospecha de ehrlichiosis en perros (Woody y Hoskins, 1991). Esto, si cabe, ha hecho que su presentacin haya sido sobreestimada, existiendo estudios en los que se describe trombocitopenia en el 100% de los animales estudiados (Troy et al, 1980). Otros estudios sugieren incidencias del 80% de los casos (Waddle y Littman, 1988; Sainz y Tesouro, 2001). En nuestro estudio hemos observado la existencia de trombocitopenia en torno a un 35% de los animales estudiados, porcentaje muy inferior a lo reseado en estudios anteriores. Concluimos que, admitiendo que la trombocitopenia es la alteracin hematolgica aparecida ms frecuentemente en perros con ehrlichiosis, en la fase subclnica de la enfermedad su presentacin disminuye considerablemente, si bien sigue siendo sta una de las pocas alteraciones que se pueden encontrar en animales con ehrlichiosis en fase subclnica y de hecho podemos comprobar como el valor medio del recuento de trombocitos en grupo el grupo control es un 50% mayor que en el grupo de perros con ehrlichiosis. Por otro lado sealamos la ausencia de sintomatologa hemorrgica en presencia de trombocitopenia, hecho que ya ha sido observado por otros autores y que, unido a la presencia de hemorragia en ausencia de trombocitopenia, sugiere que las principales responsables de esta sintomatologa son alteraciones en la funcionalidad plaquetaria (Kuehn y Gaunt, 1985; Woody y Hoskins, 1991; Sainz y Tesouro, 2001). La nica correlacin encontrada entre los valores plaquetarios y las distintas poblaciones y subpoblaciones leucocitarias en animales con ehrlichiosis subclnica ha sido una relacin inversa con el porcentaje de clulas NK, relacin no existente en el grupo Control. Sin embargo, ello no nos permite definir la trombocitopenia como indicador de alteraciones inmunolgicas en el curso de la ehrlichiosis.
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5.3.3 PROTENAS SRICAS La hiperproteinemia es un hallazgo destacado en casos de ehrlichiosis canina, habindose descrito su presencia en todas las fases de la enfermedad (Burghen et al, 1971; Buhles et al, 1974; Weisiger et al, 1975; Troy et al, 1980; Kuehn y Gaunt, 1985; Codner y Farris-Smith, 1986; Davoust et al, 1991a; Davoust et al, 1991b; Weiser et al, 1991). En nuestro estudio hemos observado hiperproteinemia acompaada de hiperglobulinemia en torno a un 40% de los casos estudiados, porcentaje muy similar al observado en otros estudios que describen frecuencias del 30-40% de los casos (Troy et al, 1980; Kuehn y Gaunt, 1985; Waddle y Littman, 1988). Nuestros resultados confirman que, en la fase subclnica, es frecuente la aparicin de hiperproteinemia por hiperglobulinemia (Ghorbel et al, 1993b, Sainz y Tesouro, 2001). Algo similar ocurre en fases crnicas en las que se ha llegado a observar presencia de hiperglobulinemia en el 100% de los perros infectados (Weiser et al, 1991) debido a la cronicidad de la infeccin. La causa de la hiperglobulinemia puede ser la existencia de una respuesta inmunitaria humoral exacerbada e inefectiva (Woody y Hoskins, 1991). En relacin a esta cita, resulta curioso que no se observen correlaciones directas entre los valores de linfocitos B y la concentracin de globulinas sricas y sin embargo, si aparezca una relacin directa entre stos y la concentracin de albmina srica. Adems, las globulinas sricas en los animales con ehrlichiosis presentan una significativa correlacin directa con los valores tanto absolutos como relativos de linfocitos T y Tc. De esta manera el ndice Albmina/Globulinas se encuentra, de manera paradjica, en relacin indirecta con los valores de linfocitos T y Tc y directa con los valores de linfocitos B. Estas correlaciones no son observables en los perros pertenecientes al grupo Control. Desconocemos la significacin exacta de estos hallazgos, pero consideramos que pueda ser indicativo de la alteracin de los mecanismos inmunitarios en el curso de la ehrlichiosis canina, an a pesar de que la presencia de estas observaciones pueda ser simplemente atribuida al propio curso de la enfermedad, es decir que slo presenten un relacin temporal.
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Slo
en
tres
casos
hemos
observado
hipoproteinemia,
asocindose
hipoalbuminemia. Este hecho concuerda con los resultados de otros autores que describen su aparicin de manera espordica en la fase subclnica de la enfermedad (Kuehn y Gaunt, 1985; Sainz, 1996). La hipoalbuminemia ha sido descrita en fases agudas y crnicas de la infeccin, habindose sugerido su desaparicin en la fase subclnica (Davoust et al, 1991b). Sin embargo, en nuestro estudio, con poblacin incluida en esta fase, hemos observado una prevalencia en torno al 40%. Esta prevalencia ya ha sido registrada por otros autores (Khuen y Gaunt, 1985; Waddle y Littman, 1988) que incluan animales en distintas fases de la infeccin. En los animales del grupo control no se ha observado la existencia de hipoalbuminemia, por lo que este proceso no es una caracterstica del colectivo de procedencia, sino que es una alteracin probablemente condicionada por la infeccin. En nuestro trabajo, por tanto, constatamos que la hipoalbuminemia es una alteracin frecuente en la fase subclnica de la infeccin y que puede ser un indicador de la presencia de patologas renales subclnicas por depsito de inmunocomplejos (Breitschwerdt et al, 1987; Breitschwerdt, 2002). Por ltimo, los resultados sealados respecto a los valores de globulinas y albmina hacen que en torno a un 75% de los animales presenten una alteracin del cociente Albmina/Globulinas. Haciendo que la disprotinemia sea la alteracin biopatolgica ms frecuentemente observada en esta fase de la enfermedad y en este estudio.
5.3.4. RECUENTO DE LEUCOCITOS En nuestro estudio no se observaron diferencias significativas en el nmero de leucocitos en sangre perifrica entre las poblaciones de perros sanos y de perros con ehrlichiosis incluidas en la investigacin.
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El nmero de leucocitos circulantes es considerado uno de los parmetros ms variables en el curso de la ehrlichiosis canina (Hibler et al, 1986; Woody y Hoskins, 1991). As, se ha descrito leucopenia moderada en los estados iniciales de la infeccin (Buhles et al, 1974; Reardon y Pierce, 1981) y ms grave en la fase crnica de la enfermedad (Taylor et al, 1941; Woldehiwet y Scott, 1982a; Woldehiwet y Scott, 1982b; Whist et al, 2002). Tambin se puede presentar leucocitosis posteriormente a la leucopenia de fase aguda (Kuehn y Gaunt, 1985; Hibler et al, 1986; Waddle y Littman, 1988). En nuestro estudio, la mayora de los animales con ehrlichiosis presentaban un recuento leucocitario dentro del rango fisiolgico (slo en 3 perros se detect leucocitosis ligera), lo que coincide con los hallazgos de otros autores (Sainz et al, 2000c). La normalidad del recuento leucocitario en la poblacin de nuestro estudio puede estar relacionada con la afirmacin de que esta poblacin se encuentra en la fase subclnica de la enfermedad.
5.3.5. RECUENTO DIFERENCIAL DE POBLACIONES LEUCOCITARIAS En el curso de la ehrlichiosis canina se ha referido fundamentalmente la existencia de leucopenia con neutropenia y linfopenia. Estas citopenias se han descrito en el curso de la infeccin experimental en los primeros das de la infeccin, producindose a continuacin la recuperacin de los valores normales (Woldehiwet, 1991) o incluso una posterior linfocitosis con presencia de linfocitos granulares grandes (Lilliehk et al, 1998) hacia el da 13-16 post-infeccin. Unos autores describen una mayor frecuencia de presentacin de linfopenia absoluta que de linfocitosis absoluta en perros con ehrlichiosis (Kuehn y Gaunt, 1985; Waddle y Littman, 1988), mientras que otros observan lo contrario (Sainz, 1996). Se considera que la linfopenia es ms caracterstica de las fases crnicas y ms graves de la enfermedad y que es producida por una hipoplasia medular (Hibler et al, 1986). La discrepancia existente entre las diferentes observaciones puede ser debido al estudio de individuos en distintas fases de la enfermedad.
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En la presente investigacin existieron diferencias significativas en el recuento porcentual de neutrfilos entre ambas poblaciones del estudio, producindose una disminucin muy significativa en los valores relativos de neutrfilos, que no en los absolutos, en la poblacin canina con ehrlichiosis. El anlisis estadstico de los valores de los linfocitos indica diferencias muy significativas entre las dos poblaciones estudiadas. La poblacin linfocitaria sufre un importante incremento en la poblacin con ehrlichiosis canina en comparacin con los animales control y este incremento se manifiesta tanto en el recuento relativo como absoluto, tal y como sealan otros autores (Sainz et al, 2000c). El incremento del recuento porcentual de linfocitos y la disminucin del de neutrfilos hacen que en muchos de los perros con ehrlichiosis se encuentren frmulas invertidas, llegndose a observar recuentos linfocitarios de hasta el 68% del total de glbulos blancos. La inversin de la frmula leucocitaria en ausencia de una neutropenia absoluta ya ha sido descrita por otros autores en el curso de la ehrlichiosis canina (Sainz, 1996). Como ya hemos comentado anteriormente, en la bibliografa se describe tanto la presencia de linfopenia y neutropenia como de linfocitosis y recuentos normales de neutrfilos. Teniendo en cuenta las diferentes fases de la enfermedad, podemos decir que nuestros resultados describen el perfil leucocitario en perros con ehrlichiosis en la fase subclnica de la enfermedad. As pues, la fase subclnica de la ehrlichiosis canina se podra caracterizar por la existencia de linfocitosis, neutropenia relativa y por la disminucin del ndice neutrfilos/linfocitos. El hecho de encontrar otros estudios en los que la principal caracterstica de la enfermedad es la presencia de linfopenia nos conduce a pensar que muchos de los casos incluidos en dichos estudios se encuentran en las fases aguda y crnica de la enfermedad.
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Recuentos de neutrfilos y linfocitos

Recuento relativo de neutrfilos y linfocitos en perros con ehrlichiosis
18 16 14 12
Recuento absoluto de neutrfilos y linfocitos en perros con ehrlichiosis

18 16 14 12
LINF NEUT
Frecuencia
LINF NEUT
Frecuencia
10 8 6
10 8 6
4 4 2 2 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
porcentaje
leucocitos/ l
Recuento relativo de neutrfilos y linfocitos en animales sanos

9 8
Recuento absoluto de neutrfilos y linfocitos en perros sanos

8 7 6
7 6
LINF NEUT
Frecuencia
LINF NEUT
Frecuencia
5 4 3 2 1 0
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-1000
1000
3000
5000
7000
9000
11000
13000
porcentaje
leucocitos/ l
GRAFICO. 5.3.5.1 - En estas grficas se observa cmo tanto el recuento de neutrfilos en valores
absolutos como relativos se desplaza hacia la izquierda, es decir, sufre una disminucin en sus valores en los perros con ehrlichiosis al compararlo con los valores en animales sanos. De la misma manera, los valores linfocitarios se desplazan hacia la derecha, es decir, incrementan su valor. Esto supone un solapamiento de ambos valores y una tendencia a la inversin de la frmula leucocitaria.
En la leishmaniosis canina, enfermedad producida por un protozoo intracelular, se estima una mayor resistencia a la infeccin en presencia de una respuesta inmunolgica de tipo celular, apareciendo la enfermedad en caso de que esta respuesta no se genere (Carvalho et al, 1985). En leishmaniosis se ha observado la existencia de linfopenia en el curso de la enfermedad sintomtica, siendo esta linfopenia ms acusada cuanto peor sea la condicin fsica del individuo (Keenan et al, 1984; Martnez-Moreno et al, 1995). Por el contrario, la existencia de linfocitosis se ha descrito en animales asintomticos (Bourdoiseau et al, 1997) y durante el tratamiento de la enfermedad (Caldwell et al, 1995). El hecho de que en nuestro estudio con animales asintomticos con ehrlichiosis destaque la
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existencia de linfocitosis podra sugerir la existencia de un cierto paralelismo en cuanto a la poblacin linfocitaria presente en ehrlichiosis y leishmaniosis. Los valores de monocitos se mantienen estables entre las dos poblaciones objeto de estudio. Su anlisis estadstico no muestra diferencias significativas entre animales sanos y con ehrlichiosis, al contrario de lo mostrado en algunos estudios en los que se describa la existencia de monocitopenias (Kuehn y Gaunt, 1985; Sainz et al, 2000c) y otros en los que se detalla la existencia de monocitosis absolutas (Troy et al, 1980; Waddle y Littman, 1988). Mientras que la mayora de los autores coincide en la existencia de eosinopenia en el curso de la ehrlichiosis canina (Waddle y Littman, 1988; Woody y Hoskins, 1991; Sainz, 1996), en nuestro estudio no se aprecian diferencias significativas en los valores de eosinfilos entre perros con y sin ehrlichiosis, aunque los valores se encuentran ligeramente disminuidos en la poblacin infectada. La presencia de recuentos normales de monocitos y eosinfilos en perros con ehrlichiosis en nuestro estudio puede ser debido a lo ya comentado para las otras poblaciones leucocitarias, es decir, al hecho de encontrarnos ante una poblacin con ehrlichiosis en fase subclnica. En esta fase podran recuperarse los valores fisiolgicos de los recuentos sanguneos, que se encuentran disminuidos tanto en la fase aguda como en la crnica. Otra posible explicacin puede ser que, como es bien sabido, en condiciones normales, las poblaciones de monocitos y eosinfilos presentan valores bajos y, puesto que el recuento se realiza sobre 100 leucocitos, puede ser complicado precisar la existencia de citopenias en estas poblaciones. Tal vez estas observaciones deberan ser valoradas incrementando el nmero de leucocitos sobre los que se realiza la observacin.
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5.3.6. POBLACIONES LINFOCITARIAS: INMUNOFENOTIPO 5.3.6.1. Poblaciones linfocitarias En nuestro estudio se observa un incremento de los valores relativos de linfocitos T en los perros con ehrlichiosis que, acompaado de la linfocitosis presente, hace que el nmero de linfocitos T circulantes manifieste un aumento muy marcado. La leishmaniosis, como hemos comentado previamente, parece presentar semejanzas inmunolgicas con la ehrlichiosis canina. Sin embargo, en el curso de leishmaniosis, diversos autores han constatado la existencia de una disminucin de la poblacin de linfocitos T (Moreno et al, 1999; Bourdoiseau et al, 1997). Si comparamos los resultados de un estudio realizado sobre dos grupos de perros con leishmaniosis, uno asintomtico y otro sintomtico, se observa un incremento en el nmero de linfocitos T (2185915) en los animales asintomticos respecto al grupo Control (1800875), mientras que en el grupo sintomtico se produce una clara disminucin (1130700) (Bourdoiseau et al, 1997). Haciendo un paralelismo con nuestra investigacin y considerando el anlisis de perros en fase subclnica de ehrlichiosis, estos resultados se ajustan a los obtenidos por nosotros y nos inducen a sugerir que la distribucin de las poblaciones linfocitarias a lo largo de las distintas fases de la enfermedad no es constante. En ehrlichiosis tambin se ha asociado una linfocitosis T con el intento de recuperacin de la infeccin (Everett et al, 1994; Caldwell et al, 1995), como parece suceder en los perros con Ehrlichiosis subclnica, como demuestran nuestros resultados. En nuestro estudio, los valores porcentuales de linfocitos B se encuentran marcadamente disminuidos en los animales con ehrlichiosis. Sin embargo, este hecho no se refleja en sus valores absolutos debido a la linfocitosis existente. Podemos afirmar que la disminucin porcentual de linfocitos B obedece ms a un incremento de otras poblaciones
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linfocitarias que a su verdadera reduccin numrica, es decir, se tratara de una disminucin relativa que, sin embargo, mantiene constante el nmero total de linfocitos B circulantes. La gran cantidad de anticuerpos circulantes en el curso de la ehrlichiosis canina y el aumento de las globulinas sricas podra hacer pensar en un incremento del nmero de linfocitos B circulantes, considerndose su disminucin o mantenimiento como un hallazgo paradjico, tal y como otros autores han sugerido en el caso de la leishmaniosis (Keenan et al, 1984; Slappendel, 1988; Pinelli et al, 1994). Sin embargo, en el curso de la leishmaniosis, en la que tambin existe hiperglobulinemia, se ha observado a su vez la disminucin en el valor absoluto de los linfocitos B (Bourdoiseau et al, 1997). La ausencia de un incremento esperado de los linfocitos B en sangre podra explicarse porque: 1.- La produccin de anticuerpos se produce en clulas plasmticas, escasas en sangre circulante, y distribuidas principalmente en ndulos linfticos, placas de Peyer, folculos esplnicos y mdula sea (Keenan et al, 1984). Por ello, no tiene por qu producirse un incremento en la poblacin de linfocitos B circulantes en presencia de hiperglobulinemia. 2.- La produccin de anticuerpos frente a una estimulacin antignica de globulinas obedece a una expansin clonal de linfocitos B, que no tiene por qu producir un incremento en su poblacin total, sino un reajuste en la misma. Ambos supuestos podran explicar la inversin de la correlacin estadstica entre el nmero tanto relativo como absoluto de linfocitos B y las globulinas. Su correlacin directa con la albmina continua sin explicarse, pero tal vez es una asociacin consecutiva a la propia patocronia de la ehrlichiosis ms que a que los mecanismos desencadenantes de uno y otro estn implcitamente involucrados, tal y como apuntbamos en el apartado 5.3.3.
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Segn nuestros resultados, en los perros con ehrlichiosis, los linfocitos NK sufren un descenso porcentual estadsticamente significativo con respecto a la poblacin sana. Aunque este descenso tambin se refleja en los recuentos absolutos, debido a la linfocitosis existente, las diferencias no llegan a ser estadsticamente significativas. Los linfocitos NK son fuente conocida de IFN-, citoquina que interviene en la activacin macrofgica y la destruccin de las ehrlichias intracelulares por los macrfagos (Scharton y Scott, 1993). Tal vez un incremento en esta poblacin reflejara una activacin de los mecanismos macrofgicos de destruccin bacteriana (Park y Rikihisa, 1992), mecanismos defensivos innatos que se ponen en marcha en las primeras fases de un proceso infeccioso. Por ello, en la fase aguda de la enfermedad se podra observar un aumento de esta poblacin que, sin embargo, disminuira posteriormente en la fase subclnica de la enfermedad. Las variaciones observadas en nuestro estudio pueden ser, por tanto, un reflejo de la ineficaz respuesta inmunolgica producida, que no es capaz de inducir la destruccin de las ehrlichias en el interior de los macrfagos. En cualquier caso, a conocimiento del autor, no existen estudios sobre el papel de los linfocitos NK en el curso de la ehrlichiosis. Por otra parte, como ya habamos sealado anteriormente los valores porcentuales de linfocitos NK presentan una relacin directa con los valores plaquetarios, lo que podra interpretarse como que en la fase subclnica de la ehrlichiosis una ausencia de disminucin de los valores relativos de NK es un signo de buen valor pronstico, al igual que lo es la ausencia de trombocitopenia. En la observacin de los frotis sanguneos para la realizacin del recuento diferencial leucocitario, se pudo constatar la existencia de linfocitos de tamao mayor de lo normal, que podramos considerar linfocitos granulares grandes, si bien no se realiz un recuento sistemtico de esta poblacin. No obstante, se constat la existencia de este tipo celular en la mayora de los perros con ehrlichiosis. Esta linfocitosis granular ha sido descrita por otros autores en el curso de la ehrlichiosis canina (Weisser et al, 1991; Heeb et al, 2003). Como ya se describi en el captulo de inmunopatogenia, los linfocitos granulares grandes
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pueden ser clulas NK o linfocitos T. Dado que en nuestro estudio el porcentaje de NK se encuentra disminuido respecto a la poblacin control, cabe deducir que esta poblacin de linfocitos granulares grandes estar representado mayoritariamente por linfocitos CD3+. Los individuos afectados por ehrlichiosis pueden ser capaces de superar la infeccin con una respuesta celular adecuada tras la fase aguda (Madigan et al, 1990). Experimentalmente, se ha demostrado la importancia de la inmunidad celular en la resistencia frente a la ehrlichiosis (Liew, 1989). Cuando la respuesta celular no es adecuada, la enfermedad progresa a la fase subclnica durante la que el organismo intentar desarrollar mecanismos de defensa encaminados a la superacin de la infeccin. De los datos de nuestra investigacin se deduce que la respuesta celular de los perros en fase subclnica puede dar lugar a una linfocitosis como consecuencia del aumento de los linfocitos T circulantes. Por ello, a continuacin pasamos a analizar lo que ocurre a nivel de las subpoblaciones de linfocitos T en esta fase subclnica.
5.3.6.2. Subpoblaciones linfocitarias Si bien los valores porcentuales de linfocitos Th o cooperadores sufren un descenso significativo en perros con ehrlichiosis, sus valores absolutos se ven incrementados, motivados por la linfocitosis que presentan estos animales. Se considera que la incompetencia de la inmunidad celular es consecuencia de una disminucin de los linfocitos Th (Moreno et al, 1999). As, un descenso de la poblacin de linfocitos Th parece representar un estado de inmunosupresin latente en diferentes infecciones no slo bacterianas, sino tambin protozoarias como la leishmaniosis (Guarga et al, 2000; Guarga et al, 2002; Moreno et al, 1999) y vricas como el SIDA en humanos (Williams et al, 1983) o el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) en gatos (Novotney et al, 1990; Tompkins et al, 1991). Tambin se ha sealado recientemente la importancia de los linfocitos Th en la eliminacin de las infecciones ehrlichiales (Ganta et al, 2004).
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En el caso de la leishmaniosis visceral, tanto humana (Cenini et al, 1993) como canina (Bourdoiseau et al, 1997; Moreno et al, 1999; Guarga et al, 2000), se produce una disminucin importante en esta poblacin, observndose que cuanto menor es el recuento de linfocitos Th, mayor es la capacidad infectiva del animal, valorada a travs de xenodiagnstico directo (Guarga et al, 2000). No obstante, el mecanismo responsable de esta disminucin no se ha podido aclarar. Se ha especulado que puede responder a la disminucin de clulas T en zonas primarias de linfocitos T como ndulos linfticos, tonsilas y corteza del timo, que se encuentran infiltradas con macrfagos, muchos de ellos infectados (Carvalho et al, 1985 y Keenan et al, 1984). Otra posibilidad es que la disminucin de linfocitos Th en sangre sea consecuencia de su migracin a otros rganos (Guarga et al, 2000). El tratamiento de la leishmaniosis canina induce una recuperacin de las clulas Th, lo que confirma la importancia de esta subpoblacin linfocitaria en la lucha frente a la enfermedad (Moreno et al, 1999). Por el contrario, la poblacin de linfocitos Tc muestra una distribucin similar antes y despus del tratamiento (Moreno et al, 1999; Guarga et al, 2002). Estas observaciones indican la importancia de la inmunidad celular en la proteccin frente a Leishmania infantum en perros. Por otro lado, y tambin en el caso de la leishmaniosis canina, se ha apreciado que la disminucin en la poblacin de linfocitos Th slo se registra en los animales con sintomatologa y no se produce en animales asintomticos. En estos perros asintomticos incluso se llega a observar un aumento del nmero de linfocitos Th (1210615) respecto de los animales control (975535) (Bourdoiseau et al, 1997). La existencia de una linfocitosis Th absoluta en la fase subclnica de la infeccin por Ehrlichia spp. puede indicar un intento del organismo de superar la infeccin. Observamos un cierto paralelismo entre los resultados de nuestro estudio y los observados por otros autores en el curso de la leishmaniosis, enfermedad en la que las fases asintomticas o de recuperacin de un tratamiento se caracterizan por un incremento en la poblacin linfocitaria. Sin embargo, este dato hay que tomarlo con cautela ya que los valores
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relativos de linfocitos Th en los animales de nuestro estudio se encuentran reducidos (debido al notable incremento de los linfocitos Tc), lo que puede indicar una lucha entre el sistema inmunitario y el agente infeccioso que ms tarde podra desembocar en la recuperacin espontnea o bien en la cronicidad del proceso (Greene y Harvey, 1984; Madigan et al, 1990; Reddy et al, 1998; Artursson et al, 1999). De hecho, en 5 animales el ndice CD4/CD8 est por encima de 1,5 y en 10 est por encima de 1. Tal vez estos animales podran representar la poblacin con capacidad para superar la infeccin de forma espontnea, si bien seran necesarios nuevos estudios en los que se valorara la evolucin de la infeccin a largo plazo, tras la fase subclnica. El incremento de linfocitos Th tambin se esperara observar en la fase de resolucin tras el tratamiento, mientras que en nuestro estudio este incremento ya se constata en la propia fase subclnica, pudiendo indicar la tendencia a la recuperacin que as hemos sugerido. Otro aspecto a considerar en el futuro debe ser el estudio de las subpoblaciones de linfocitos Th y su participacin en los mecanismos inmunitarios desarrollados durante las infecciones ehrlichiales. En nuestro trabajo, el importante incremento de la poblacin de linfocitos Tc podra indicar una respuesta gobernada prioritariamente por la subpoblacin Th1. Los linfocitos Tc experimentan un incremento altamente significativo tanto en su recuento porcentual como absoluto, el doble a nivel relativo y ms del triple de Tc a nivel de nmero total de linfocitos circulantes. Si consideramos las subpoblaciones de linfocitos T en valores porcentuales en relacin a los linfocitos T, observamos la existencia de un marcado aumento de la poblacin de linfocitos Tc a costa de la disminucin de las poblaciones de linfocitos Th y . En leishmaniosis visceral humana se han encontrado valores de linfocitos Tc tanto aumentados (Cillari et al, 1988) como invariables (Cenini et al, 1993) respecto a individuos sanos. En la leishmaniosis canina se ha observado el incremento de esta
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poblacin (Bourdoisseau et al, 1997, Moreno et al, 1999, Guarga et al, 2000), habiendo sugerido diversos autores la participacin de los linfocitos Tc en la proteccin frente a leishmaniosis (Titus et al, 1985; Hill et al, 1989; Mller et al, 1991; Pinelli et al, 1994; Pinelli et al, 1995). Sin embargo, otros autores consideran que los linfocitos Tc no participan en la defensa frente a infeccin por Leishmania infantum (Guarga et al, 2000). Se ha observado in vitro que una disminucin de los linfocitos CD8 no restaura la respuesta frente a Leishmania spp. (Sacks et al, 1987; Carvalho et al, 1985; Moreno et al, 1999). Concluimos que en nuestra investigacin la linfocitosis observada en el curso de la ehrlichiosis subclnica es consecuencia directa de un incremento en la poblacin de linfocitos Tc, lo cual viene refrendado por la existencia de correlaciones directas entre los valores de linfocitos Tc, de linfocitos T y de linfocitos y la correlacin inversa entre porcentaje de linfocitos Tc y de linfocitos B, entre nmero de linfocitos T y Tc y porcentaje de linfocitos B y, por ltimo, entre porcentaje de linfocitos T y Tc y nmero de linfocitos B. Puesto que se desconoce el papel exacto que puede tener esta poblacin en el desarrollo de la enfermedad o en la proteccin frente a la infeccin por ehrlichiosis, sera interesante valorar dicha poblacin linfocitaria en otras fases de la enfermedad. Los linfocitos T, sufren un descenso relativo aunque no significativo respecto a la poblacin control. Deberamos tal vez considerar que la poblacin control de partida presenta valores de linfocitos T superiores a los clsicamente aceptados, por lo que los hallazgos descritos en el curso de la ehrlichiosis por otros autores respecto a esta subpoblacin linfocitaria, debe ser comparado con cautela. Por otra parte la variacin en los porcentajes de esta la poblacin linfocitaria en sangre perifrica puede ser un reflejo de cambios en los rganos perifricos de produccin y/o de alteraciones en el transporte de estas clulas entre sangre y dichos rganos (De Rosa et al, 2004).
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Poco se conoce de las especificidades antignicas y del papel fisiolgico de los linfocitos T (Caldwell et al, 1995), aunque parece que poseen amplia citotoxicidad frente a clulas tumorales y frente a clulas autlogas infectadas con microorganismos intracelulares (Caldwell et al, 1995). Tambin se han asociado con la induccin de respuesta inmune humoral que incluye la secrecin de altos niveles de BCGF (B cell growth factor) y BCDF (B cell differentiation factor) implicados en el crecimiento y diferenciacin de los linfocitos B (Raziuddin et al, 1992). Como ya se ha reseado previamente, se ha descrito la presencia de linfocitos granulares grandes (LGL) junto con linfocitosis en perros con infeccin por E. canis (Weiser et al, 1991) y en personas con infeccin por E. chaffeensis (Caldwell et al, 1995). En ehrlichiosis humana, la linfocitosis se debe bsicamente al aumento de linfocitos T que expresan CD3, pero son negativos a CD4 y CD8 (hasta un 97% de las clulas T) (Caldwell et al, 1995). Un aumento de clulas T CD8-, CD4-, tambin se ha descrito en el curso de la ehrlichiosis en ovejas (Woldehiwet, 1991). Esta elevacin de los linfocitos ha sido descrita por otros autores en el curso de la ehrlichiosis crnica (McDonough y Moore, 2000), as como en leishmaniosis visceral tanto humana (Cenini et al, 1993; Raziuddin et al, 1992; Russo et al, 1993) como canina (Moreno et al, 1999). El aumento de linfocitos T observado por estos autores podra participar en el aumento de la actividad de los linfocitos B orientada a la produccin de anticuerpos especficos anti-Ehrlichia, en ausencia de un incremento en la poblacin de linfocitos B circulantes. Sin embargo, en nuestro estudio no se observa este incremento ni correlacin entre los valores de linfocitos T y linfocitos B, ni con alguno de los valores de protenas sricas, por lo que creemos que, en nuestro caso, podra no existir esta activacin de la respuesta humoral al tratarse de una poblacin en fase subclnica, y tal vez con tendencia a la recuperacin. Como consecuencia del marcado incremento de la poblacin de linfocitos Tc, observamos en nuestro estudio una disminucin importante de ndice CD4/CD8 en la fase
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subclnica de la ehrlichiosis canina. Este hallazgo ha sido descrito por otros autores en el curso de ehrlichiosis (Woldehiwet, 1991; Heeb et al, 2003). Esta inversin del ndice CD4/CD8 tambin ha sido observada en el curso de la leishmaniosis canina (Bourdoiseau et al, 1997; Moreno et al, 1999; Guarga et al, 2000). Las variaciones del ndice CD4/CD8 se han empleado como indicadores de inmunomodulacin o inmunosupresin en diferentes patologas vricas en hombre y gato (Fahey et al, 1984; Novotney et al, 1990). Como se ha referido previamente, la ehrlichiosis produce una respuesta inmune aberrante (Burghen et al, 1971; Reardon y Pierce, 1981; Harrus et al, 1999). Esta alteracin en la respuesta inmunitaria viene caracterizada por la inversin en el ndice CD4/CD8 que, en nuestro caso, observamos que es producida por un incremento en la poblacin de linfocitos Tc. Diversos autores expresan la importancia de la deteccin de los animales en fase subclnica de la infeccin para evitar el grave desenlace de la enfermedad (Harrus et al, 1998b; Harrus et al, 1999). Junto a otras alteraciones biopatolgicas habitualmente halladas (como la trombocitopenia y la hiperproteinemia), este ndice CD4/CD8 podra constituir otro indicador de la presencia de una fase subclnica de ehrlichiosis. A modo de resumen, en base a los hallazgos de nuestro trabajo y los de otros autores, podemos describir la existencia de una linfopenia en la fase aguda de la enfermedad, seguida de una linfocitosis posterior. Los cambios originados en las poblaciones linfocitarias pueden indicar un pulso entre el agente causal y el sistema inmune que podra dar lugar a la resolucin de la enfermedad o a la aparicin de la fase crnica con todos sus efectos deletreos. La elevada proporcin de animales asintomticos en presencia de ehrlichiosis en las colectividades estudiadas puede ser un fiel reflejo de la situacin real, en la que una gran cantidad de animales pueden encontrarse afectados, pero sin signos importantes de enfermedad. Hasta el momento, ningn estudio ha abordado cul es el nmero de animales con ehrlichiosis que pueden ser capaces de superar la enfermedad. Sera interesante la continuidad de esta lnea de investigacin de cara a determinar
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indicadores a nivel del fenotipo inmunitario que pudieran predecir la evolucin de la infeccin.
5.3.6.3. Correlaciones entre las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias con otros parmetros hematolgicos Como se anteriormente ha sido comentado, en nuestra investigacin nos pareci interesante conocer si existan asociaciones cuantitativas (dos a dos) entre los parmetros biopatolgicos estudiados, en especial las que podran presentarse con las poblaciones y subpoblaciones linfocitarias. Por ello se calcularon los coeficientes de correlacin (r) entre las variables tanto en el grupo Control como en el grupo de perros con Ehrlichiosis. Tal y como esperbamos, los resultados de nuestro estudio demostraron un mayor nmero de correlaciones estadsticamente significativas entre los parmetros biopatolgicos en el grupo de perros con Ehrlichiosis (valorados en el momento del diagnstico), que las obtenidas en el grupo Control. Parte de estas correlaciones, como igualmente ha sido sealado, se deben a que el tamao de la muestra del grupo de perros con Ehrlichiosis es mayor y por tanto se requiere un menor valor del coeficiente de correlacin para alcanzar una relacin significativa. Algunas de estas relaciones podan quedar sugeridas en el grupo Control si bien no podan ser admitidas como significativas. Por otra parte, como tambin ha sido comprobado con nuestros resultados, las modificaciones en los distintos parmetros que se presentan en el grupo de perros en fase subclnica de Ehrlichiosis establecen nuevas relaciones entre los mismos o incluso conducen a la prdida o cambio de signo de algunas relaciones observadas en la poblacin sana del grupo Control. Nuestro propsito, ms que entrar en el estudio de estas posibles modificaciones en la correlaciones, muchas de ellas difcil de interpretar, y que parcialmente han podido ser
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explicadas al comparar y discutir los valores de los distintos parmetros obtenidos en el grupo de perros con Ehrlichiosis con respecto al grupo Control, era comprobar la posible existencia de relaciones altamente significativas entre distintas variables y las distintas poblaciones y subpoblaciones linfocitarias, con el fin de obtener posibles indicadores de las mismas, especialmente en el grupo de perros afectados con Ehrlichiosis. En este sentido, y a partir del anlisis de regresin lineal entre distintas variables (entre las que se hubiera constatado una correlacin altamente significativa) nos proponamos obtener la ecuacin que nos permitiera calcular el valor de una poblacin o subpoblacin linfocitaria conociendo el valor de otra variable, tratndose esta ltima de un parmetro biopatolgico fcilmente valorable. Entre todas las ecuaciones calculadas, y que no han sido reflejadas en el captulo de resultados, nos parecen como ms relevantes las obtenidas entre el nmero absoluto de linfocitos para estimar el nmero absoluto de linfocitos T y dentro de estos el nmero de los linfocitos Tc y Th, y que por su aplicacin presentamos en este capitulo de discusin y recogemos en los siguientes tablas.
10000 9000 8000 N_LINFOCITOS_T 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 N_LINFOCITOS
N Linf T = 0,89 (0,04) N Linf 266 (185)
Tabla. 5.3.6.3.1. Regresin lineal entre el nmero de linfocitos y el nmero de linfocitos T en el grupo de perros con Ehrlichiosis.
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8000 7000 6000 N_LINF_TC 5000 4000 3000 2000 1000 0 -1000 0 2000 4000 6000 8000 10000 N_LINFOCITOS
N Linf Tc = 0,63 ( 0,07) N Linf 798 ( 378)
Tabla. 5.3.6.3.2. Regresin lineal entre el nmero de linfocitos y el nmero de linfocitos Tc en el grupo de perros con Ehrlichiosis.
3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 N_LINFOCITOS
N_LINF_TH
N Linf Th = 0,21 ( 0,04) N Linf 251 ( 185)
Tabla. 5.3.6.3.3. Regresin lineal entre el nmero de linfocitos y el nmero de linfocitos Th en el grupo de perros con Ehrlichiosis.
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El valor del nmero de linfocitos puede ser fcilmente determinado a partir de un recuento diferencial leucocitario conociendo el nmero total de glbulos blancos de una muestra de sangre. A partir de este valor y aplicando las formulas sealadas en los tablas anteriores podemos calcular el nmero de linfocitos T, Tc y Th de un perro con ehrlichiosis en fase subclnica. Como hemos sealado, los estudios sobre el inmunofenotipo en el curso de la ehrlichiosis canina son limitados, la informacin disponible sobre las relaciones entre los parmetros biopatlogicos y las poblaciones linfocitarias es prcticamente inexistente y mucho ms la que profundiza en un posible anlisis de regresin. Por ello, consideramos que estos resultados deben considerarse como un punto de partida que deberan ser confirmados y ampliados con nuevos estudios, que por otra permitiran reducir los mrgenes de confianza de los coeficientes de las ecuaciones obtenidas precisando as la estimacin de cada una de las poblaciones linfocitarias calculadas.
5.4. EVOLUCIN EN EL TIEMPO DE LOS PARMETROS ESTUDIADOS EN PERROS CON EHRLICHIOSIS

Los controles realizados tras el tratamiento tenan como objetivo principal poder valorar la posible normalizacin de los parmetros alterados al comienzo de la investigacin en los animales con ehrlichiosis. La normalizacin de estos parmetros servira para afirmar la evolucin favorable tras el tratamiento. Partamos de una poblacin clnicamente sana que a lo largo del periodo de estudio post-tratamiento mantuvo esta condicin. Por tanto, podemos afirmar que durante los 6 meses de duracin del trabajo, ninguno de los animales incluidos en el estudio progres hacia la fase crnica de la enfermedad.
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Los valores hematolgicos, que de manera global se encontraron dentro de la normalidad desde el inicio del estudio, se mantuvieron dentro del rango tras el tratamiento. Tan slo se observaron ligeras fluctuaciones de los ndices eritrocitarios que podran ser debidos al azar. Las alteraciones observadas de partida en nuestra poblacin canina afectada de ehrlichiosis fueron: trombocitopenia (36%), hiperproteinemia (40%), hipoalbuminemia (40%), hiperglobulinemia (50%) y alteracin del cociente albmina/globulinas (75%). En cuanto a la trombocitopenia, no se observaron variaciones significativas en la poblacin a lo largo de los 6 meses post-tratamiento. Se ha descrito la recuperacin de los valores plaquetarios normales durante el 2 trimestre tras el tratamiento, si bien en el caso del dipropionato de imidocarb esta mejora se produce incluso ms tarde (Sainz, 1996). La ausencia de una recuperacin estadstica de la trombocitopenia puede deberse a las peculiaridades del tratamiento con dipropionato de imidocarb, sin que se pueda descartar la imprecisin de los mtodos automticos empleados para el recuento de plaquetas. En nuestro estudio, el tratamiento con dipropionato de imidocarb no produjo variaciones estadsticamente significativas en las alteraciones del perfil del proteinograma en los seis meses que se prolong el trabajo. La mayora de los estudios indican que la normalizacin del cociente albmina/globulinas y de las diferentes fracciones proteicas tiene lugar de un modo progresivo entre los 3 y 9 meses post-tratamiento (Buhles et al, 1974; Greene y Harvey, 1984; Perille y Matus, 1991; Greene, 1995; Sainz, 1996). Tal y como ocurre con el recuento de plaquetas, se ha observado que la normalizacin de los valores proteicos se realiza ms tempranamente en aquellos individuos en los que se emplea doxiciclina o un tratamiento mixto de doxiciclina y dipropionato de imidocarb, que en los tratados exclusivamente con dipropionato de imidocarb (Sainz, 1996). En nuestro caso, no detectamos la normalizacin de estos valores a lo largo de los seis meses de estudio, lo que dificulta la valoracin de este tratamiento e indica que podra ser necesaria una investigacin durante periodos ms prolongados de tiempo para valorar ms
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correctamente si este tratamiento es eficaz pero a ms largo plazo o si, por el contrario, este frmaco no es tan efectivo. En este sentido, los resultados obtenidos con este frmaco son variables ya que, mientras algunos autores constatan su efecto teraputico (Ogunkoya et al, 1981) e incluso lo consideran ms eficaz que la tetraciclina (Van Heerden y Van Hereden, 1981), algunos estudios in vitro dudan de la eficacia de este frmaco (Brouqui y Raoult, 1992). En cualquier caso, la efectividad del tratamiento con imidocarb ha sido clnicamente constatada por diversos autores, si bien se han encontrado resistencias a este tratamiento. Los casos resistentes al tratamiento con imidocarb se han observado hasta en un 16,1% al emplear una nica dosis (Adeyanju y Aliu, 1982) y en un 6% al usar un protocolo con dos dosis (Sainz, 1996), similar al empleado por nosotros. En ambos estudios, estas resistencias aparecan en animales muy deteriorados y en el curso de ehrlichiosis crnica con insuficiencia renal y/o aplasia medular, en los que el pronstico suele ser desfavorable (Greene y Harvey, 1984; Woody y Hoskins, 1991). La eficacia de este tratamiento, demostrada por otros autores, y el tratamiento de la enfermedad en la fase subclnica nos induce a pensar que la no normalizacin de los parmetros estudiados se debe atribuir a la lenta recuperacin de estos valores en el tratamiento con imidocarb. Tras una respuesta efectiva a la terapia esperaramos encontrar una tendencia a la normalizacin del perfil inmunofenotpico, sin embargo, no se han detectado variaciones en la mayora de los valores de las poblaciones y subpoblaciones leucocitarias en animales con ehrlichiosis a lo largo de toda la investigacin. Tan slo se aprecia una disminucin en los linfocitos B en el ltimo periodo del estudio y un incremento en la poblacin de linfocitos NK en el periodo comprendido entre 2-4 semanas en cuanto a valor porcentual y entre 2 semanas y 3 meses en valor absoluto. No hemos encontrado variables que nos puedan indicar la existencia de una recuperacin de la enfermedad a nivel del estudio inmunofenotpico de estos animales, siendo difciles de interpretar las variaciones observadas en linfocitos B y NK, en presencia de la invariabilidad del resto de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias. No obstante, el
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aumento de linfocitos NK post-tratamiento podra ser un indicador favorable, puesto que estos linfocitos son productores de IFN-, citoquina que interviene en la destruccin macrofgica de patgenos intracelulares (Scharton y Scott, 1993). El objetivo de encontrar algn parmetro que pudiese ser empleado como marcador de la recuperacin de la enfermedad tras el tratamiento no ha podido ser logrado por completo. Aunque se han encontrado importantes variaciones en el perfil inmunofenotpico de las poblaciones linfocitarias de los perros afectados por ehrlichiosis subclnica, no hemos podido hallar variaciones significativas en el mismo en el periodo de seis meses post-tratamiento. Este hecho puede deberse a tres supuestos: - que en los casos de ehrlichiosis subclnica se establezca un equilibrio del estado inmunitario que se mantiene en el tiempo y que formara parte de los mecanismos que intervienen en la persistencia del estado latente de la infeccin y/o - que el sistema inmunitario requiera de periodos ms prolongados para su normalizacin y/o - que es el tratamiento con dipropionato de imidocarb el que requiere de estos tiempos ms prolongados tal y como han observado otros autores al evaluar otros parmetros biopatolgicos. La mayor rapidez con que evolucionan estos parmetros en perros tratados con doxiciclina podra deberse no slo a su mayor eficacia directa contra el agente causal sino a las propiedades inmunomoduladoras que ltimamente se atribuyen a este frmaco (Kuzin et al, 2001; Stone et al, 2003). Queda abierta la realizacin de un estudio durante un periodo de tiempo ms prolongado y comparado con el tratamiento con doxiciclina, as como el estudio del perfil inmunofenotpico linfocitario en perros con ehrlichiosis aguda y crnica para ahondar en los mecanismos inmunitarios desencadenados ante la infeccin por Ehrlichia spp.
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CONCLUSIONES
Conclusiones
6. CONCLUSIONES
Tras el anlisis y discusin de los resultados y atendiendo a los objetivos planteados en este trabajo de investigacin podemos extraer las siguientes conclusiones: 1 Para el colectivo de perros, sanos, adultos, de ambos sexos, distintas razas y caracterizados por vivir en un entorno propio de una protectora, podemos establecer los siguientes valores de referencia del inmunofenotipo en sangre circulante (con un margen de confianza del 95%): Un porcentaje medio de Linfocitos B del 18,4 3,1% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 495188 de linfocitos B /l. Un porcentaje medio de Linfocitos NK del 7,31,3% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 17839 de linfocitos NK /l. Un porcentaje medio de Linfocitos T del 72,93,0% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 1815341 de linfocitos T /l. Un porcentaje medio de Linfocitos Th del 33,92,9% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 832139 de Linfocitos Th /l. Un porcentaje medio de Linfocitos Tc del 24,63,5% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 619168 de linfocitos Tc /l. Un porcentaje medio de Linfocitos T del 14,44,7% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 364138 de Linfocitos T /l. Y un valor medio del ndice CD4+/CD8+ de 1,50,2.
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Conclusiones
2 En el curso de la ehrlichiosis subclnica canina se producen importantes cambios en el inmunofenotipo en sangre, destacando el descenso moderado de los porcentajes de los linfocitos B, NK y Th, si bien este ltima subpoblacin linfocitaria presenta un aumento en su nmero absoluto. Adems, en esta fase de la enfermedad se produce un aumento del numero absoluto y relativo linfocitos Tc, lo que provoca no slo una inversin del ndice CD4+/CD8+, sino tambin un aumento del porcentaje y nmero de los linfocitos T. Estas modificaciones estadsticamente significativas con respecto al grupo control nos permiten estimar unos nuevos valores de referencia para la poblacin canina afectada de ehrlichiosis en fase subclnica de: Un porcentaje medio de Linfocitos B del 12,1 2,8% con respecto al total de linfocitos. Un porcentaje medio de Linfocitos NK del 3,840,7% con respecto al total de linfocitos. Un porcentaje medio de Linfocitos T del 81,83,4% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 3924620 de Linfocitos T /l. Un porcentaje medio de Linfocitos Th del 27,13,2% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 1243202 de Linfocitos Th /l. Un porcentaje medio de Linfocitos Tc del 42,66,5% con respecto al total de linfocitos y un valor medio de 2154516 de Linfocitos Tc /l. Y un valor medio del ndice CD4+/CD8+ de 0,90,3.
3 En la fase subclnica de la Ehrlichiosis canina, adems de la linfocitosis observada en ms del 40% de los casos, las alteraciones biopatolgicas ms frecuentes son la trombocitopenia (en torno al 40% de los casos) y la disproteinemia (en aproximadamente el 75% de los casos), estimndose que los valores medios obtenidos en el recuento de plaquetas (259.78041.300/l) y en el cociente albmina/globulinas (0,600,10) difieren significativamente con respecto a los observados en la poblacin sana.
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Conclusiones
4 Las correlaciones altamente significativas observadas en la fase subclnica de la ehrlichiosis entre las distintas poblaciones y subpoblaciones linfocitarias y otros parmetros biopatolgicos, ha permitido a travs de un anlisis de regresin lineal calcular las ecuaciones que nos estiman los valores los linfocitos T, Th y Tc de una sangre a partir del valor del nmero de linfocitos circulantes que sta presente. 5 En perros con ehrlichiosis subclnica, las poblaciones linfocitarias ms modificadas con respecto a la poblacin sana no sufren variaciones significativas durante los 6 meses posteriores a la administracin de 2 inyecciones de dipropionato de imidocarb (con un intervalo de 15 das entre ambas). En el seguimiento realizado, los nicos datos relevantes son un ligero incremento en el nmero de linfocitos NK en el primer mes y un descenso significativo del nmero de linfocitos B a los 6 meses, con respecto a los valores obtenidos antes del tratamiento.
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RESUMEN
Resumen
7.- RESUMEN
En el presente trabajo se han estudiado y comparado los valores hematolgicos, el inmunofenotipo y las protenas sricas de una poblacin de cnidos sanos y otra poblacin de perros seropositivos a Ehrlichia canis, en fase subclnica. Ambas poblaciones procedan de dos protectoras de la provincia de Valencia. La poblacin seropositiva a ehrlichiosis se ha tratado con dipropionato de imidocarb (2 dosis de 5 mg/kg va subcutnea con un intervalo de 15 das entre ambas) y se ha estudiado la evolucin en el tiempo de los valores hematolgicos, el inmunofenotipo y las protenas sricas a lo largo de 6 meses tras el tratamiento. Se ha realizado tambin un estudio de prevalencia de ehrlichiosis y leishmaniosis en estas protectoras. Segn los resultados obtenidos, en estas protectoras el 69,37% de los perros presenta seropositividad frente a Ehrlichia canis y un 28,12% presenta seropositividad frente a Leishmania infantum. En la hematologa de los animales en fase subclnica de ehrlichiosis de este estudio destaca como alteracin laboratorial la elevacin del recuento linfocitario. Otro hallazgo reseable es la presencia de trombocitopenia, si bien se presenta en tan slo un 36% de los animales estudiados. En cuanto a las protenas sricas destaca la existencia de disproteinemia en un 75% de los casos (con un valor medio del cociente Albmina/Globulina de 0,600,05) junto con una hiperproteinemia (en torno al 40%), a pesar de presentar algunos de ellos cifras de hipoalbuminemia (40% de los casos), asociada a hiperglobulinemia (50% de los casos).
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Resumen
A nivel del inmunofenotipo es de resaltar el incremento de los valores tanto relativos como absolutos de linfocitos T en la poblacin con ehrlichiosis al compararlo con la poblacin sana; en cuanto a la poblacin de linfocitos B, sus valores absolutos se mantienen similares a los de los perros control. El importante incremento de la poblacin de linfocitos T es motivado por un destacado aumento en el nmero de linfocitos Tc producindose una inversin del ndice CD4/CD8. La linfocitosis observada en los perros con ehrlichiosis hace que, si bien los valores relativos de linfocitos Th se encuentran disminuidos, sus valores absolutos se encuentran por encima de los valores observados en los animales control. En contra de lo que se esperaba observar, en el estudio de los parmetros analizados a lo largo del tiempo tras el tratamiento con dipropionato de imidocarb, si bien se producen algunas modificaciones en algunos controles, destaca la ausencia de variaciones significativas en la prctica totalidad de los parmetros estudiados a los 6 meses posttratamiento, con excepcin del valor medio del recuento de los linfocitos B, de los monocitos y en menor medida de los neutrfilos, que sufren un descenso con respecto a los valores iniciales. .
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SUMMARY
Summary
8.- SUMMARY
In this work a basal and a comparative study of the haematology, immunophenotype and seric protein values in a group of healthy dogs (Control group) and another group of dogs seropositive to Ehrlichia canis (dogs with subclinical ehrlichiosis) were carried out. Both canine populations came from two animal shelters of Valencia (Spain). Dogs were treated with imidocarb dipropionate (2 doses of 5 mg/kg SQ, with a period of 15 days apart). All the studied parameters were evaluated periodically for 6 months after therapy. For this purpose 4 blood analysis were performed in the dogs during that period of time. A study of ehrlichiosis and leishmaniosis seroprevalence in the kennels was also performed; 69.37% of dogs were seropositive to Ehrlichia canis and 28.12% of the dogs were seropositive to Leishmania infantum. Few haematologic abnormalities were found: thrombocytopenia was found in 36% of the dogs in the Ehrlichiosis group, being lymphocytosis other remarkable finding in this group. On the other hand, alteration of seric protein values was common in the Ehrlichiosis group. Hyperproteinemia was detected in 70% of the dogs, even when many of them presented hypoalbuminemia (44% of dogs) and hyperglobulinemia (50% of animals).
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Summary
The immunophenotype of dogs with subclinical ehrlichiosis was characterized by an increase in the absolute and relative counts of T lymphocytes in comparison with control dogs. However, absolute counts of B lymphocytes in dogs with subclinical ehrlichiosis were similar to those of the control group. The increase in T lymphocyte counts was due to the great rise of Tc lymphocyte counts. CD4/CD8 index was inverted due to this fact and the reduction in Th lymphocytes relative values. Nevertheless, Th lymphocyte absolute counts in the Ehrlichiosis group were increased in comparison with the values in the Control group due to the relevant lymphocytosis present in the group with subclinical ehrlichiosis. No significant changes were found in the different variables studied over the 6 months following the treatment with imidocarb dipropionate. Only slight decreases were detected in the mean values of B lymphocytes, monocytes and neutrophils.
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BIBLIOGRAFA
Bibliografa
9. BIBLIOGRAFA
Abeygunawardena, I.; Kakoma, I., and Smith, R.D. Pathophysiology of canine ehrlichiosis. Ehrlichiosis. Williams, J.C., and Kakoma, I. (Ed). Netherlands.: Kluwer Academic Publishers.; 1990; pp. 79-92. Abranches, P.; Silva-Pereira, M.C.; Conceicao-Silva, F.M.; Santos-Gomes, G.M., and Janz, J.G. Canine leishmaniasis: pathological and ecological factors influencing transmission of infection. J Parasitol. 1991; 77(4):557561. Adams, D.H. and Lloyd, A.R. Chemokines: leukocyte recruitment and activation cytokines. Lancet. 1997; 349:490-495. Adeyanju, B.J. and Aliu, Y.O. Chemotherapy of canine ehrlichiosis and babesiosis with imidocarb propionate. J Am Anim Hosp Assoc. 1982; 18:827-830. Aguirre, E.; Sainz, A.; Amusategui, I.; Rodriguez, F., and Tesouro, M.A. Estudio serolgico de Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophila y Neorickettsia risticii en perros residentes de colectividades de Madrid. Libro de Ponencias y Comunicaciones del 38 Congreso Nacional De AVEPA. Sevilla. 2003; 282. Aguirre, E.; Tesouro, M.A.; Ruiz, L.; Amusategui, I., and Sainz, A. Anaplasma platys in Spain: first molecular characterization in a dog with clinical ehrlichiosis. Proceedings EMOP-IX. Valencia (Espaa). 2004a. Aguirre, E.; Tesouro, M.A.; Amusategui, I.; Rodrguez-Franco, F., and Sainz, A. Assessment of feline ehrlichiosis in Spain, using serology and PCR. Annals of New York Academy of Sciences (En Prensa). 2004b. Ahn, A.; Wallace, D., and Barrick, R.A. A comparative study of Frontline Top Spot and Revolution in the control of flea and tick infestations on dogs. WSAVA/FECAVA. 2000. Akkonyunlu, M. and Fikrig, E. Gamma interferon dominates the murine cytokine response to the agent of human granulocytic ehrlichiosis and helps to control the degree of early rickettsemia. Infect Immun. 2000; 68(4):1827-1833. Allsopp, M.T.E.P. and Allsopp, B.A. Novel Ehrlichia genotype detected in dogs in South Africa. Journal of Clinical Microbiology. 2001; 39(11):4204-4207. Anderson, B.E; Dawson, J.E.; Jones, D.C., and Wilson, K.H. Ehrlichia chaffeensis, a new specie associated with human ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 1991; 29:2838-2842. Anderson, B.E.; Greene, C.E.; Jones, D.C., and Dawson, J.E. Ehrlichia ewingii, sp. nov., the etiologic agent of canine granulocytic ehrlichiosis. Int J Syst Bacteriol. 1992; 42:299-302.
- 279 -
Bibliografa
Anderson, B.E.; Sims, K.G.; Olson, J.G.; Childs, J.E.; Piesman, J.F.; Happ, C.M.; Maupin, G.O., and Johnson, B.J. Amblyomma americanum: a potential vector of human ehrlichiosis. Am J Trop Med Hyg. 1993 Aug;49(2):239-44. 1993; 49(2):239-244. Anthony, S.J.; Dummer, J.S., and Hunter, E. Human ehrlichiosis in a liver transplant recipient. Transplantation. 1995; 60:879-881. Anziani, D.S.; Ewing, S.A., and Barker, R.W. Experimental transmission of a granulocytic form of the tribe Ehrlichieae by Dermacentor variabilis and Amblyomma americanum. Am J Vet Res. 1991; 51:929931. Arraga-Alvarado, C.; Palmar, M.; Parra, O., and Salas, P. Fine structural characterisation of a Rickettsia-like organism in human platelets from patients with symptoms of ehrlichiosis. J. Med. Microbiol. 1999; 48(11):991-997. Artursson, K.; Gunnarsson, A.; Wikstrom, U.B., and Engvall, E.O. A serological and clinical follow-up in horses with confirmed equine granulocytic ehrlichiosis. Equine Vet J. 1999; 31(6):473-477. Backer, L.C.; Grindem, C.B., and Hunter, J.L. Biomarkers in pet dogs - a sentinel for humans health effects from environmental pollution. Proceedings for Health Effects of Hazardous Wastes Symposium. United States Department of Health and Human Services. 1993; 216. Bakken, J.S.; Dumler, J.S.; Chen, S.M.; Eckman, M.R.; Van Etta, L.L., and Walker, D.H. Human granulocytic ehrlichiosis in the upper middwest United States. A new species emerging? J Am Med Assoc. 1994; 272:212-218. Bakken, J.S.; Krueth, J.; Wilson-Nordskog, C.; Tildes, R.L.; Asanovich, K., and Dumler, J.S. Clinical and laboratory characteristics of human granulocytic ehrlichiosis. J Am Med Assoc. 1996; 275:199-205. Bakken, J.S and Dumler, J.S. Human granulocytic ehrlichiosis. Clin Infect Dis. 2000; 31:554-560. Balashov, Y.S. Bloodsucking ticks (Ixodoidea): Vectors of diseases of man and animals. Miscellaneous Publications of the Entomological Society of America. 1972; 8:161. Banerjee, R.; Anguita, J., and Fikrig, E. Granulocytic ehrlichiosis in mice deficient in phagocyte oxidase or inducible nitric oxide synthase. Infect Immun. 2000; 68:4361. Barlough, J.E.; Reubel, G.H.; Madigan, J.E.; Vredevoe, L.K.; Miller, P.E., and Rikihisa, Y. Detection of Ehrlichia risticii, the agent of Potomac horse fever, in freshwater stream snails (Pleuroceridae: Juga spp.) from northern California. Appl Environ Microbiol . 1998; 64:2888-2893. Bartsch, R.C. and Greene, R.T. Post-therapy antibody titers in dogs with ehrlichiosis: follow-up study on 68 patients treated primarily with tetracycline an/or doxycycline. J Vet Intern Med. 1996; 10(4):271274. Batmaz H.; Nevo E.; Waner T.; Senturk S.; Yilmaz Z., and Harrus S. Seroprevalence of Ehrlichia canis antibodies among dogs in Turkey. Vet Rec. 2001; 148(21):665-666. Batungbacal, M.R. Effect of Cytoecetes phagocytophila on phagocytosis by neutrophils in sheep. Vet Mad. 1995; 32:70-76. Beaufils, J.P and Legroux, J.P. Prsence simultane dEhrlichia sp e dHepatozoon canis dans des granulocites de chien: a propos de deux cas. Prat. Md. Chir. Anim. Comp. 1992; 27(1):81-86.
- 280 -
Bibliografa
Bellah, J.R.; Shull, R.M., and Selcer, E.V. Ehrlichia canis - related polyarthritis in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1986; 189(8):922-923. Berenberg, J.F.; Ward, P.A., and Sonenshine, D.E. Tick bite injury: mediation by a complement derived chemotactic factor. J Immunol. 1972; 109:451-456. Berton, G.; Yan, S.R.; Fumagalli, L., and Lowell, C.A. Neutrophil activation by adhesion: mechanisms and pathophysiological implications. Int J Clin Lab Res. 1996; 26(3):160-177. Bezuidenhout, J.D. Natural transmission of heartwater. Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 1987; 54:349-351. Binnington, K.C. and Kemp, D.H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv Parasitol. 1980; 18:315. Bjorsdorff, A.; Svendenius, L., and Owens, J.H. Feline granulocytic ehrlichiosis-a report of a new clinical entity and characterization of the infectious agent. J Small Anim Pract. 1999a; 40(1):20-24. Bjorsdorff, A.; Berglund, I.; Kristiansen, B.E. ; Soderstrom, C., and Eliasson, I. Variable presentation and course in human granulocytic ehrlichiosis: twelve case reports of the new tick -borne zoonosis. Lakartidningen. 1999b; 96:4200-4204. Borjesson D.L.; Simon S.I.; Hodzic E.; Ballantyne C.M., and Barthold S.W. Kinetics of CD11b/CD18 upregulation during infection with the agent of human granulocytic ehrlichiosis in mice. Lab Invest. 2002; 82(3):303-311. Botros, B.A.M.; Elmolla, M.S.; Salib, A.W.; Calamaio, C.A.; Dasch, G.A., and Arthur, R.R. Canine ehrlichiosis in Egypt: sero-epidemiological survey. Onderstepoort J Vet Res. 1995; 62:41-43. Bourdeau, P. The control of ticks in the dog. 16th Annual Meeting of the ESVD-ECVD. Helsinki. 1999; 113116. Bourdeau, P. Acaricides: Topical or systemic? 18th ESVD-ECVD Annual Congress; Nice, France. 2002: 109-115. Bourdoiseau, G.; Bonnefont, C.; Magnol, J.P.; Saint-Andre, I., and Chabanne, L. Lymphocyte subset abnormalities in canine leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol. 1997; 56(3-4):345-351. Breitschwerdt, E.B.; Woody, B.J.; Zerbe, C.A.; De Buysscher, E.V., and Barta, O. Monoclonal gammopathy associated with naturally occurring canine ehrlichiosis. J Vet Intern Med. 1987; 1(1):2-9. Breitschewerdt, E.B. The rickettsiosis. En: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Diseases of the Dog and Cat. Ettinger SV, Feldman EC (Eds). W.B. Saunders. Philadelphia. 1995; 376-383. Breitschwerdt, E.B.; Hegarty, B.C., and Hancock, S.I. Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. J Clin Microbiol. 1998a; 36( 9):2645-2651. Breitschwerdt, E.B.; Hegarty, B.C., and Hancock, S.I. Doxycycline hyclate treatment of experimental canine ehrlichiosis followed by challenge inoculation with two Ehrlichia canis strains. Antimicrob Agents Chemother. 1998b; 42:362-368. Breitschwerdt, E.B. Ehrlichiosis: a new zoonosis? Compendium (Merial). 2002; 24(1):10-14.
- 281 -
Bibliografa
Breitschewerdt, E.B. Canine and feline ehrlichiosis: new developments. 19th Annual Congress of the ESVDECVD. Tenerife, Spain. 2003; 66-71. Brenner, D.J.; O'Connor, S.P.; Winkler, H.H., and Steigerwalt, A.G. Proposals to unify the genera Bartonella and Rochalimaea, with descriptions of Bartonella quintana comb. nov., Bartonella vinsonii comb. nov., Bartonella henselae comb. nov., and Bartonella elizabethae comb. nov., and to remove the family Bartonellaceae from the order Rickettsiales. Int J Syst Bacteriol. 1993; 43(4):777-786. Bressler, C.; Himes, L.C., and Moreau, R.E. Portal vein and aortic thromboses in a Siberian husky with ehrlichiosis and hypothyroidism. J Small Anim Pract. 2003; 44(9):408-410. Brouqui, P. and Raoult, D. In vitro susceptibility of Ehrlichia sennetsu to antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 1990; 34(8):1593-1596. Brouqui, P. and Raoult, D. In vitro antibiotic susceptibility of the newly recognized agent of ehrlichiosis in humans, Ehrlichia chaffeensis. Antimicrob Agents Chemother. 1992; 36(12):2799-2803. Brouqui, P. and Dumler, J.S. Serologic evidence of human monocytic and granulocytic ehrlichiosis in Israel. Emerg Infect Dis. 2000; 6(3):314-315. Brown, G.K.; Martin, A.R.; Roberts, T.K., and Aitken, R.J. Detection of Ehrlichia platys in dogs in Australia. Aust Vet J. 2001; 79(8):554-558. Brown, W.C.; Brayton, K.A.; Styer, C.M., and Palmer, G.H. The hypervariable region of Anaplasma marginale major surface protein 2 (MSP2) contains multiple immunodominant CD4+ T lymphocyte epitopes that elicit variant-specific proliferative and IFN- responses in MSP2 vaccinates. J Immunol. 2003; 170:3790-3798. Broxmeyer, H.E.; Sherry, B.; Lu, L.; Cooper, S.; Oh, K.O.; Tekamp-Olson, P.; Kwon, B.S., and Cerami, A. Enhancing and suppressing effects of recombinant murine macrophage inflammatory proteins on colony formation in vitro by bone marrow myeloid progenitor cells. Blood. 1990; 76(6):1110-1116. Bucci, J.B.; Gebhard, D.H.; Childers, T.A.; English, R.V., and Tompkins, W.A.F. The CD8+ cell phenotype mediating antiviral activity in feline immunodeficiency virus-infected cats is characterized by reduced surface expression of the CD8 chain. J Infect Dis. 1998; 178:968-977. Bucy, P.; Chen, C.L.; Cichak, J.; Losh, V., and Cooper, M. Avian T cells expressing receptors localize in the esplenic sinusoids and the intestinal epithelium. J Immunol. 1988; 141:2200-2205. Buhles, W.C.Jr.; Huxsoll, D.L, and Ristic, M. Tropical canine pancytopenia: clinical, hematologic, and serologic responses of dogs to Ehrlichia canis infection, tetracycline therapy, and challenge inoculation. J Infect Dis. 1974; 130:357-367. Buhles, Jr.W.C.; Huxsoll, D.L., and Hildebrandt, P.K. Tropical canine pancytopenia: Role of aplastic anaemia in the pathogenesis of severe disease. J Comp Path. 1975; 85:85: 511-21, 1975.511-521. Buller, R.S.; Arens, M., and Hmiel, S.P. Ehrlichia ewingii, a newly recognized agent of human ehrlichiosis. N Engl J Med. 1999; 341:148-155. Bunnell, J.E.; Trigiani, E.R.; Srinivas, S.R., and Dumler, J.S. Development and distribution of pathologic lesions are related to immune status and tissue deposition of human granulocytic ehrlichiosis agentinfect cells in a murine model system. J Infect Dis. 1999; 180(2):546-550. Buoro, I.B.J.; Kanui, T.I.; Atwell, R.B.; Njenga, K.M., and Gathumbi, P.K. Polymyositis associated with Ehrlichia canis infection in two dogs. J Small Anim Pract. 1990; 31:624-627.
- 282 -
Bibliografa
Burg, J.G.; Neely, D.M.; Williams, N.M., and Knapp, F.W. Retention and attempted mechanical transmission of Ehrlichia risticii by Stomoxys calcitrans. Med Vet Entomol. 1994; 8(1):43-36. Burghen G.A.; Beisel, W.R.; Walker, J.S.; Nims, R.M.; Huxsoll, D.L., and Hildebrant, P. K. Development of hypergammaglobulinemia in tropical canine pancytopenia. Am J Vet Res. 1971; 32:749-756. Byrne, K.M; Hong Wook Kim; Chew, B.P; Reinhart, G.A., and Hayek, M.G. A standardized gating technique for the generation of flow cytometry data for normal canine and normal feline blood lymphocytes. Vet Immunol Immunopathol. 2000; 73:167-182. Byrom, B.; Mahan, S.M., and Barbet, A.F. The development of antibody to Cowdria ruminantium in mice and its role in heartwater disease. Rev Elev Med Vet Pays Trop. 1993; 46(1-2):197-201. Caldwell, C.W.; Everett, E.D., and McDonald, G. Lymphocytosis of T cells in human ehrlichiosis. Am J Clin Pathol. 1995; 103:761-766. Calvelli, T.T.; Denny, T.N.; Paxton, H.; Gelman, R., and Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: A report from the National Institute of Allergy and Infectious diseases. Division of Aids. Cytometry. 1993; 14:702-715. Camus, E. and Barre, N. Epidemiology of heartwater in Guadeloupe and in the Caribbean. Onderstepoort J Vet Res. 1987; 54(3):419-426. Carpenter, C.F.; Gandhi, T.K.; Kong, L.K.; Corey, G.R.; Chen, S.M.; Walker, D.H.; Dumler, J.S.; Breitschwerdt, E.; Hegarty, B., and Sexton, D.J. The incidence of ehrlichial and rickettsial infection in patients with unexplained fever and recent history of tick bite in central North Carolina. J Infect Dis. 1999; 180(3):900-903. Carvalho, E.M.; Johnson, W.D.; Barreto, E.; Marsden, P.D.; Costa, J.L.; Reed, S., and Rocha, H. Cell mediated immunity in American cutaneous and mucosal leishmaniasis. J Immunol. 1985; 135(6):4144-4148. Caswell, J.L; Yage, J.A; Parker, W.M., and Moore, P.F. A prospective study of the immunophenotype and temporal changes in the histologic lesions of canine demodicosis. Vet Pathol. 1997; 34:279-287. Cenini, P.; Berhe, N.; Hailu, A.; McGinnes, K., and Frommel, D. Mononuclear cell subpopulation and cytokine levels in human visceral leishmaniasis before and after chemotherapy. J Infect Dis. 1993; 168:986-993. Centers for Disease Control and Prevention. Lyme Disease: United States, 1995. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 1996;45:481-484. Chabanne, L.; Marcha, T.; Denerolle, P.; Magnol, J.P.; Fournel, P.; Monier, J.C., and Rigal, D. Lymphocyte subset abnormalities in German shepherd dog pyoderma (GSP). Vet Immunol Immunopathol. 1995; 49:189-198. Chabanne L.; Bonnefont C.; Bernaud J., and Rigal D. Clinical Applications of flow cytometry and cell immunophenotyping to companion animals (dog and cat). Methods Cesll Sci. 2000; 22(2-3):199207. Chae, J.S.; Pusterla, N.; Johnson, E.; Derock, E.; Lawler, S.P., and Madigan, J.E. Infection of aquatic insects with trematode metacercariae carrying Ehrlichia risticii, the cause of Potomac horse fever. J Med Entomol. 2000; 37(4):619-625.
- 283 -
Bibliografa
Chae, J. S.; Kim, M. S., and Madigan , J. Detection of Neorickettsia (Ehrlichia) risticii in tissues of mice experimentally infected with cercariae of trematodes by in situ hybridization . Vet Microbiol. 2002; 88(3):233-43 . Chang, A.C.; Chang, W.L.; Lin, C.T.; Pan, M.J., and Lee, S.C. Canine infectious cyclic thrombocytopenia found in Taiwan. J Vet Med Sci. 1996 May;58(5):473-6. 1996; 58(2):473-476. Charley, B. and Blecha, F. Les cytokines: leur rle dans la rgulation du systme immunitaire, leur utilisation potencielle chez l'animal. Point Vet. 1991; 23(139):71-77. Chen, S.M.; Dumler, J.S.; Bakken, J.S., and Walker, D.H. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. J Clin Microbiol. 1994; 32(3):589-595. Cillari, E.; Liew, F.Y.; Lo Campo, P.; Milano, S.; Mansueto, S., and Salerno, A. Suppression of IL-2 production by cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from patients with active visceral leishmaniasis in Sicily. J Immunol. 1988; 140(8):2721-2726. Codner, E.C.; Roberts, R.E., and Ainsworth, A.G. Atypical findings in 16 cases of canine ehrlichiosis. J Am Vet Med Assoc. 1985; 186(2):166-169. Codner, E.C. and Farris-Smith, L.L. Characterization of the subclinical phase of ehrlichiosis in dogs. J Am Vet Med Ass. 1986; 189:47-50. Codner, E.C. and Maslin, W. Investigation of renal protein loss in dogs with acute experimentally induced Ehrlichia canis infection. Am. J. Vet. Res. 1992; 53(3):264-269. Cohn L.A. Ehrlichiosis and related infections. Vet Clin North Am. Small Anim Pract. 2003; 33:863-884. Coligan, J.E.; Kruisbeek, A.M.; Margulies, D.H.; Shevach, E.M., and Strober, W. Antibody detection and preparation. En: Current protocols in immunology. 1992. John Wiley and sons. New York, unit 2,4. Cordero del Campillo, M. ndice-catlogo de zooparsitos ibricos. Servicio de Publicaciones del Ministerio de Sanidad y Seguridad Social. Madrid. 1980; 489. Cowell, R.L., Tyler, R.D., and Clinkenberad, K.D. Ehrlichiosis and poliarthritis in three dogs. J Am Vet Med Assoc. 1988; 192(8):1093-1095. Cruthers, L.; Slone, R., and Arther, R.G. K9 Advantix (imidacloprid plus permethrin) for controlling ticks and mosquitoes on dogs. Compend Contin Educ Pract Vet. 2003; 25(suppl):15-18. Culmsee, K.; Simon, D.; Mischke, R., and Nolte, I. Possibilities of flow cytometric analysis for immunophenotypic characterization of canine lymphoma. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 2001; 48(4):199-206. Culmsee, K. and Nolte, I. Flow cytometry and its application in small animal oncology. Methods Cell Sci. 2002; 24(1-3):49-54. Cupp, E.W. Biology of ticks: Tick-transmitted diseases. Vet Clin North Am. Small Anim Pract. 1991; 21(1):1-26. Davoust, B.; Parzy, D.; Ott, D., and Hasselot, N. Ehrlichiose canine chronique: intret de la numration plaquettaire. Rev Md Vt. 1991a; 142:287-292. Davoust, B.; Parzy, D.; Vidor, E.; Hasselot, N., and Martet, G. Ehrlichiose canine experimentale: tude clinique et terapeutique. Rev. Md. Vt. 1991b; 167:33-40.
- 284 -
Bibliografa
Davoust, B. Canine ehrlichiosis. Point Vt. 1993; 25(151):43-51. Davoust, B; Marie, J., and Mercier, S. Assay of fipronil efficacy to prevent canine monocytic ehrlichiosis in endemic areas. Vet Parasitol. 2002; 112:91-100. Dawson, J.E.; Anderson, B.E.; Fishbein, D.B.; Snchez, J.L.; Goldsmith, C.S.; Wilson, K.H., and Duntley, C.W. Isolation and characterization of an Ehrlichia sp. from a patient diagnosed with human ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 1991; 29(2741-2745). Dawson, J.E. and Ewing, S.A. Susceptibility of dogs to infection with Ehrlichia chaffeensis, causative agent of human ehrlichiosis. Am J Vet Res. 1992; 53(8):1322-1327. Dawson, J.E.; Stallknecht, D.E.; Howerth, E.W.; Warner, C.; Biggie, K.; Davidson, W.R. ; Lockhart, J.M.; Nettles, V.F.; Olson, J.G., and Childs, J.E. Susceptibility of white-tailed deer (Odocoileus virginianus) to infection with Ehrlichia chaffeensis, the etiologic agent of human ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 1994; 32(1):2725-2728. De Castro, M. B.; Machado, R.Z.; Tomaz de Aquino, L.P.C.; Alessi, A.C., and Costa, M.T. Experimental acute canine monocytic ehrlichiosis: clinicopathological and immunopathological findings. Vet Parasitol. 2004; 119:73-86. De Rosa, S.C.; Andrus, J.P.; Perfetto, S.P.; Mantovani, J.J.; Herzenberg, L.A.; Herzenberg, L.A., and Roederer, M. Ontogeny of T cells in humans. J Immunol. 2004; 172:1637-1645. Deem, S.L. A review of heartwater and the threat of introduction of Cowdria ruminantium and Amblyomma spp. ticks to the American mainland. J Zoo Wild Med. 1998; 29(2):109-113. Deitsch, K.W.; Moxon, E.R., and Wellems, T.E. Shared themes of antigenic variation and virulence in bacterial, protozoal and fungal infections. Microbiol Mol Biol Rev. 1997; 61:281. Des Vignes, F.; Piesman, J., and Heffernan, R. Effect of tick removal on transmission of Borrelia burgdorferi and Ehrlichia phagocytophila by Ixodes scapularis nymps. J Infect Dis. 2001; 183:773-778. Deusch, K.; Luling, F.; Reich, K.; Classen, M.; Wagner, H., and Pfeffer, K.A major fraction of human intraepithelial lymphocytes simultaneously expresses the gamma delta T cell receptor, the CD8 accesory molecule, and preferentially uses the v1 gene segment. Eur J Immunol. 1991; 21:10531059. Dib, K. BETA 2 integrin signalling in leukocytes. Front Biosci. 2000; 5:438-451. Dirscherl, P.; Beisker, W.; Kremmer, E.; Mihalkov, A.; Vossw, C., and Ziessenis, A. Immunophenotyping of canine bronchoalveolar and peripheral blood lymphocytes. Vet Immunol Immunopathol. 1995; 48:1-10. Donatien, A. and Lestoquard, F. Existence en Algrie d'une Rickettsia du chien. Bull Soc Pathol Exot. 1935; 28:418-419. Dumler, J.S.; Asanovich, K.M., and Bakken, J.S. Serologic cross reaction among Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila, and human granulocytic ehrlichia. J Clin Microbiol. 1995; 33( 5):1098-1103. Dumler J.S; Trigiani E.R.; Bakken J.S.; Aguero-Rosenfeld M.E., and Wormser G.P. Serum cytokine responses during acute human granulocytic ehrlichiosis. Clin Diagn Lab Immunol. 2000; 7(1):6-8.
- 285 -
Bibliografa
Dumler J.S; Barbet A.F.; Bekker C.P.J.; Dash G.A.; Palmer G.H.; Ray S.C.; Rikihisa Y., and Rurangirwa F.R. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and "HGE agent" as a subjetive synonyms of Ehrlichia phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2001; 51:2145-2165. Duque, C.; Parent, J., and Bienzle, D. The immunophenotype of blood and cerebrospinal fluid mononuclear cells in dogs. J Vet Intern Med. 2002; 16:714-719. Dutra, F.; Schuch, L.F.; Delucchi, E.; Curcio, B.R.; Coimbra, H.; Raffi, M.B.; Dellagostin, O., and RietCorrea, F. Equine monocytic Ehrlichiosis (Potomac horse fever) in horses in Uruguay and southern Brazil. J Vet Diagn Invest. 2001; 13(5):433-437. Elfassy, O.J.; Goodman, F.W.; Levy, S.A., and Carter, L.L. Efficacy of an amitraz-impregnated collar in preventing transmission of Borrelia burgdorferi by adult Ixodes scapularis to dogs. JAVMA. 2001; 219(2):185-189. Elias, E. Diagnosis of ehrlichiosis from the presence of inclusion bodies or morulae of Ehrlichia canis. J Small Anim Pract. 1991; 33(11):540-543. Eng, T.R.; Harkess, J.R., and Fishbein, D.B. Epidemiologic, clinical and laboratory findings of human ehrlichiosis in the United States, 1988. 1990; 264:2251-2258. Engvall, E.O.; Pettersson, B.; Persson, M.; Artursson, K., and Johansson, K.E. A 16S rRNA-based PCR assay for detection and identification of granulocytic Ehrlichia species in dogs, horses, and cattle. J Clin Microbiol. 1996. 1996; 34(9):2170-2174. Estrada-Pea, A. Las garrapatas en Espaa: introduccin. Consejera De Sanidad y Bienestar Social. Junta de Castilla y Len (Ed). Valladolid. 1994. Estrada-Pea, A. and Ascher, F. Comparison of an amitraz-impregnated collar with topical administration of fipronil for prevention of experimental and natural infestations by the brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus). JAVMA. 1999; 214:1799-1803. Estrada-Pea, A. Distribution, abundance, and habitat preferences of Ixodes ricinus in nothern Spain . J Med Entomol. 2001; 38(3): 361-70. Estrada-Pea, A. Importancia de las garrapatas en Espaa. Argos . 2003a; 48:20-22. Estrada-Pea, A. Las garrapatas del perro y las enfermedades transmitidas en Espaa: una panormica con aspectos zoonsicos. Ed Virbac; 2003b. Everett, E.D.; Evans, K.A.; Henry, B., and McDonald, G. Human ehrlichiosis in adults after tick exposure. Ann Intern Med. 1994; 120:730-735. Ewing, S.A. and Buckner, R.G. Manifestations of babesiosis, ehrlichiosis, and combined infections in the dog. Am J Vet Res. 1965; 26(113):815-828. Ewing, S.A. Canine ehrlichiosis. Adv Vet Sci Comp Med. 1969; 13:331-353. Ewing, S.A; Roberson, W.R.; Buckner, R.G., and Hayat, C.S. A new strain of Ehrlichia canis. J Am Vet Med Assoc. 1971; 159(12):1771-1774.
- 286 -
Bibliografa
Fahey, J.L.; Prince, H.; Weaver, M.; Groopman, J.; Visscher, B.; Schwartz, K., and Detels, R. Quantitative changes in T helper or T-supressor/cytotoxic lymphocyte subsets that distinguish acquired immunodeficiency syndrome from other immune subsets disorders. Am J Med. 1984; 76:95-100. Faldyna, M.; Leva, L.; Knotigova, P., and Toman, M. Lymphocyte subsets in peripheral blood of dogs: a flow cytometric study. Vet Immunol Immunopathol. 2001; 82(1-2):23-37. Feng, H.M. and Walker, D.H. Mechanisms of Immunity to Ehrlichia muris: a Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. Infect Immun. 2004; 72(2):966-971. Fichtenbaum, C.J.; Peterson, L.R., and Weil, G.J. Ehrlichiosis presenting as a life-threatening illness with features of the toxic shock syndrome. Am J Med. 1993; 95:351-357. Fishbein, D.B.; Dawson, J.E., and Robinson, L.E. Human ehrlichiosis in the United States, 1985 to 1990. Ann Intern Med. 1994; 120:736-743. Foley, J.E; Crawford-Miksza, L., and Dumler, J.S. Human granulocytic ehrlichiosis in northern California: two cases description with genetic analysis of the Ehrlichiae. Clin Infect Dis. 1999; 29:388-392. Folz, S.D.; Ash, K.A., and Conder, G.A. Amitraz: A tick and flea repellent and tick detachment drug. J Vet Pharmacol Ther. 1986; 9:150-156. Font, A.; Cair, J., and Calls, A. Ehrlichiosis canina. Clnica Veterinaria De Pequeos Animales. 1988; (8):141-148. Frank, J.R. and Breitschwerdt, E.B. A retrospective study of ehrlichiosis in 62 dogs from North Carolina and Virginia. J Vet Int Med. 1999; 13(3):194-201. Freitas, A.A. and Rocha, B. Population biology of lymphocytes: the flight for survival. Annu Rev Immunol. 2000; 18:83-111. French, T.W. and Harvey, J.W. Serologic diagnosis of infectious cyclic thrombocytopenia in dogs using an indirect fluorescent antibody test. Am J Vet Res. 1983; 44:2407-2411. Fukuda, T. and Yamamoto, S. Neorickettsia-like organism isolated from metacercaria on a fluke, Stellantchasmus falcatus. Jpn J Med Sci Biol. 1981; 34(2):103-107. Fuller, L.; Carreno, M.; Esquenazi, V.; Zucker, K.; Zheng, S.; Roth, D.; Burke, G.; Nery, J. ; Asthana, D., and Olson, L. Characterization of anti-canine cytokine monoclonal antibodies specific for IFN-: effect of anti-IFN- on renal transplant rejection. Tissue Antigens. 1994; 43:163-169. Ganta, R.R.; Chuanmin, Ch.; Wilkerson, M.J., and Chapes, S.K. Delayed clearance of Ehrlichia chaffeensis infection in CD4 + T-cell knockout mice. Infect Immun. 2004; 72 (1):159-167. Garcia-Perez, A.L.; Barandika, J.; Oporto, B.; Povedano, I., and Juste, R.A. Anaplasma phagocytophila as an abortifacient agent in sheep farms from northern Spain. Ann N Y Acad Sci. 2003; 990:429-432. Gardner, S.L.; Holman, R.C.; Krebs, J.W.; Berkelman, R, and Childs, J.E. National surveillance for the human ehrlichiosis en the United States, 1997-2001, and proposed methods for evaluation of data quality. Ann N Y Acad Sci. 2003; 990:80-89. Garris, G.I. Control of ticks. Vet Clin North Am. 1991; 21:173-183. Garrity , G.M.; Winters, M., and Searles, D.B. Taxonomic outline of the procaryotic genera. En Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition, April. 2001; 6 .
- 287 -
Bibliografa
Gebhard, D.H. and Carter, P.B. Identification of canine T-lymphocyte subsets with monoclonal antibodies. Vet Immunol Immunopathol. 1992; 33:187-199. Gelatt, K.N. Canine anterior uvea. En: Veterinary Ophthalmology. Gelatt K.N. (ed). Lea and Febiger. Philadelphia. 1991; 374-375. Gewirtz, A.; Cornbleet, P., and Vugia, D.J. Human granulocytic ehrlichiosis: report of a case in northern California. Clin Infect Dis. 1996; 23:653-654. Ghorbel, A.; Cadore, J. L.; Clerc, B.; Bouattour, A.; Vidor, E., and Sayn, M.J. Efficiency of oxytetracyclin in dog ehrlichiosis treatment. Revue Med. Vet. 1993a; 144(2):109-114. Ghorbel, A.; Clerc, B.; Cador, J.L.; Djaeiim, A., and Sayn, M.J. Ehrlichiosis asymptomatique: etude de l'electrophorese des protines seriques. Recueil De Mdicine Vtrinaire. 1993b; 169:561-566. Gil, R.; Mercier, P.; Snchez, I.; Bled, C; Laugier, S.; Tixier, S., and Ascher, F. Control de la infestacin natural por Rhipicephalus sanguineus en un criadero de perros. Proceedings del 33 Congreso Anual de AVEPA. 1998;38. Gokce, H.I. and Woldehiwet, Z. Lymphocyte responses to mitogens and rickettsial antigens in sheep experimentally infected with Ehrlichia (Cytoecetes) phagocytophila. Vet Parasitol. 1999; 83(1):5564. Goldman, E.E.; Breitschwerdt, E.B., and Grindem, C.B. Granulocytic ehrlichiosis in dogs from North Carolina and Virginia. J Vet Intern Med. 1998; 12(2):61-70. Gonzlez, J. M.; Puig, V.; Collado, E., and Simen, S. Seroprevalencia de ehrlichiosis canina en la provincia de Valencia. Consulta de Difusin Veterinaria. 2000; 76:67-71. Goodman, T. and Lefrancoi, S.L. Expression of the T cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocyte. Nature. 1988; 33:855-858. Goodman, R.A.; Hawkins, E.C.; Olby, N.J; Grindem, C.B.; Hegarty, B., and Breitschwerdt, E.B. Molecular identification of Ehrlichia ewingii infection in dogs: 15 cases (1997-2001). J Am Vet Med Assoc . 2003; 222(8):1102-1107. Gothe, R.; Kunze, K., and Hoogstraal, H. The mechanisms of pathogenicity in the tick paralyses. J Med Entomol. 1979; 16:357. Gould, D.J.; Murphy, K.; Rudorf, H., and Crispin, S.M. Canine monocytic ehrlichiosis presenting as acute blindness 36 months a importation into the UK. J Small Anim Pract. 2000; 68(7):263-265. Greeley, E.H.; Kealy, R.D.; Ballam, J.M.; Lawler, D.F., and Segre, M. The influence of age on the canine immune system. Vet Immunol Immunopathol. 1996; 55:1-10. Greene, C.E. and Harvey, J.W. Canine ehrlichiosis. En: Clinical Microbiology and Infectious Diseases of the Dog and Cat. C.E. Greene (Ed). W.B. Saunders. Philadelphia . 1984; 704-709. Greene, C.E.; Burgdorfer, W.; Cavagnolo, R.; Philip, R.N., and Peacock, M.G. Rocky Mountain spotted fever in dogs and its differentiation from canine ehrlichiosis. J Am Vet Med Assoc. 1985; 186(5):465-472. Greene, R.T. Canine ehrlichiosis: clinical implications for humoral factors. En: Bonagura, J.D., ed. Kirks Current Veterinary Therapy XII. Small Animal Practice. WB Saunders; 1995; pp. 376-383.
- 288 -
Bibliografa
Greig, B.; Asanovich, K.M., and Armstrong, P.J. Geographic, clinical, serologic, and molecular evidence of granulocytic ehrlichiosis, a likely zoonotic disease, in Minnesota and Wisconsin dogs. J Clin Microbiol. 1996; 34(1):44-48. Gribble, D.H. Equine ehrlichiosis. J Am Vet Med Assoc. 1969; 155(2):462-469. Grindem, C.B. Blood cell markers. Vet Clin North Am: Small Anim Pract. 1996; 26(5):1043-1064. Grindem, C.B.; Breitschwerdt, E.B.; Perkins, P.C.; Cullins, L.D.; Thomas, T.J., and Hegarty, B.C. Platelet associated immunoglobulin (antiplatelet antibody) in canine Rocky Mountain spotted fever and ehrlichiosis. J Am Anim Hosp Assoc. 1999; 35(1):56-61. Groves, M.G.; Dennis, G.L.; Amyx, H.L., and Huxsoll, D.L. Transmission of Ehrlichia canis to dogs by ticks (Rhipicephalus sanguineus) . Am J Vet Res. 1975; 36( 7): 937-940. Guarga, J.L; Moreno, J.; Lucientes, J.; Gracia, M.J.; Peribez, M.A; Alvar, J., and Castillo, J.A. Canine leishmaniasis transmission: higher infectivity amongst naturally infected dogs to sand flies is associated with lower proportions of T helper cells. Res Vet Science. 2000; 69:249-253. Guarga, J.L; Moreno, J.; Lucientes, J.; Gracia, M.J.; Peribez, M.A, and Castillo, J.A. Evaluation of a specific immunochemotherapy for the treatment of canine visceral leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol. 2002; 88:13-20. Guglielmino, R.; Miniscalco, B.; Tarducci, A.; Borgarelli, M.; Riondato, F.; Zini, E.; Borrelli, A., and Bussadori, C. Blood lymphocyte subsets in canine idiopathic pericardial effusion. Vet Immunol Immunopathol. 2004; 98:161-173. Harkess, J.R.; Ewing, S.A.; Crutcher, J.M.; Kudlac, J.; McKee, G., and Istre, G.R. Human ehrlichiosis in Oklahoma. J Infect Dis. 1989; 159:576-579. Harkess, J.R. Ehrlichiosis. Infect Dis Clin North Am. 1991; 5:37-51. Harrus, S.; Waner, T.; Avidar, Y.; Bogin, E.; Peh, H., and Bark, H. Serum protein alterations in canine ehrlichiosis. Vet Parasitol. 1996a; 66(3-4):241-249. Harrus, S.; Waner, T.; Weiss, D. J.; Keysary, A., and Bark, H. Kinetics of serum antiplatelet antibodies in experimental acute canine ehrlichiosis. Vet Immunol Immunopathol. 1996b; 51(1-2):13-20. Harrus, S.; Aroch, I.; Lavy, E., and Bark, H. Clinical manifestations of infectious canine cyclic thrombocytopenia. Vet Rec. 1997; 141(10):247-250. Harrus, S.; Waner, T., and Aizenberg, I. Amplification of ehrlichial DNA from dogs 34 months after infection with Ehrlichia canis. J Clin Microbiol. 1998a; 36(1):73-76. Harrus, S.; Waner, T.; Keysary, A.; Voet, I. H., and Bark, H. Investigation of splenic functions in canine monocytic ehrlichiosis. Vet Immunol Immunopathol. 1998b; 62:15-27. Harrus, S.; Ofri, R.; Aizenberg, I., and Waner, T. Acute blindness associated with monoclonal gammopathy induced by Ehrlichia canis infection. Vet Parasitol. 1998c; 78(2):155-160. Harrus, S.; Waner, T.; Bark, H.; Jongejan, F., and Cornelissen, A.W.C.A. Recent advances in determining the pathogenesis of canine monocytic ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 1999; 37(9):2745-2749.
- 289 -
Bibliografa
Harrus, S. ; Day, M.J.; Waner, T., and Bark, H. Presence of immunocomplexes, and absence of antinuclear antibodies in sera of dogs naturally and experimentally infected with Ehrlichia canis. 2001; 83Kluwer Academic Publishers.:343-349. Harrus, S.; Alleman, A.R., and Bark, H.. Comparison of three enzyme-linked immunosorbent assays with the indirect immunofluorescent antibody test for the diagnosis of canine infection with Ehrlichia canis. Vet Microbiol. 2002; 86(4):361-368. Harty, J.T.; Tvinnereim, A. R., and White, D.W. CD8+ T cell effector mechanisms in resistance to infection. Annu Rev Immunol. 2000; 18:275-308. Harvey, J.W. Canine thrombocytic ehrlichiosis. En: Greene, C.G., ed. Infectious diseases of the dog and cat . 2 ed. WB Saunders; 1998; pp. 147-149. Hayday, A.C. cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Annu Rev Immunol. 2000; 18:975-1026. Heeb, H.L.; Wilkerson, M.J.; Chun,R., and Ganta, R.R. Large granular lymphocytosis, lymphocyte subset inversion, thrombocytopenia, dysproteinemia, and positive Ehrlichia serology in a dog. J Am Anim Hosp Assoc. 2003; 39(4):379-384. Hein, W.R. and Mackay, C.R. Prominence of T-cells in the ruminant immune system. Immunol Today. 1991; 12:30-34. Hernndez, A. and Lorente, C. Sndrome cervico-torcico asociado a infeccin por Ehrlichia canis. Proceedings del 38 Congreso de AVEPA. Sevilla. 2003; 321. Herrero, C.; Pelaz, C.; Alvar, J.; Molina, R.; Vazquez, J.; Anda, P.; Casal, J.; and Martin-Bourgon, C. Evidence of the presence of spotted fever group Rickettsiae in dogs and dog ticks of the central provinces in Spain. Eur J Epidemiol. 1992;8(4):575-579. Hibler, S.C.; Hoskins, J.D., and Greene, C. E. Rickettsial infections in dogs: part II. Ehrlichiosis and infectious cyclic thrombocytopenia. Compend Contin Educ Pract Vet . 1986; 106-114. Hildebrant, P.K; Huxsoll, D.L; Walker, J.S; Nims, R.M; Taylor, R., and Andrews, M. Pathology of canine ehrlichiosis (tropical canine pancytopenia). Am J Vet Res. 1973; 34:1309-1320. Hill, J.O.; Awwad, M., and North, R.J. Elimination of CD4+ suppressor T cells from susceptible BALB/c mice releases CD8+ T lymphocytes to mediate protective immunity against Leishmania. J Exp Med. 1989; 169:1819-1827. Hodzic, E.; Fish, D.; Maretzki, C.M.; De Silva, A.M.; Feng, S., and Barthold, S.W. Acquisition and transmission of the agent of human granulocytic ehrlichiosis by Ixodes scapularis ticks. J Clin Microbiol. 1998; 36(12):3574-3578. Holland, C.J.; Weiss, E.; Burgdorfer, W.; Cole, A.I., and Kakoma, I. Ehrlichia risticii sp. nov.: etiological agent of equine monocytic ehrlichiosis (synonym Potomac horse fever). Int J Syst Bacteriol. 1985a; 35:524-526. Holland, C.J.; Ristic, M.; Cole, A.I.; Johnson, P.; Baker, G., and Goetz, T. Isolation, experimental transmission, and characterization of causative agent of Potomac horse fever. Science. 1985b; 227:522-524. Hoogstraal, H. Tickborne diseases of humans: a history of environmental and epidemiological changes. Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene Symposium Proceedings; 1977.
- 290 -
Bibliografa
Hoogstraal, H. Argasid and Nuttalliellid ticks as parasites and vectors. Adv Parasitol. 1985; 24:135. Hoskins, J. D.; Barta, O., and Rothschmitt, J. Serum hyperviscosity syndrome associated with Ehrlichia canis infection in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1983; 183(9):1011-1012. Hoskins, J.D. and Cupp, E.W. Ticks of veterinary importance: Part 1. The Ixodidae family: Identification, behaviour, and associated diseases. Compend Contin Educ Pract Vet. 1988; 10:564. Hoskins, J.D. The brown dog tick. Vet Clin North Am. Small Anim Pract. 1991; 21(1):99-101. Hunter, J.S.I. Efficacy of Frontline spray and Frontline Top Spot. Compend Contin Educ Pract Vet. 1997; 19(suppl):15-16. Huxsoll, D.L.; Hildebrant, P.K.; Nims, R.M., and Walker, J.S. Tropical canine pancytopenia. J Am Vet Med Ass. 1970; 157:1627-1632. Huxsoll,D.L.; Williams J.C., and Kakoma I. Ehrlichiosis. Netherlands. Ed: Kluwer Academic Publishers. 1990: 1-8. Iqbal, Z.; Chaichanasiriwithaya, W., and Rikihisa, Y. Comparison of PCR with other tests for early diagnosis of canine ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 1994; 32(7):1658-1662. Iqbal, Z. and Rikihisa, Y. Application of the polymerase chain reaction for the detection of Ehrlichia canis in tissues of dogs. Vet Microbiol. 1994; 42(4):281-287. Javed, M.Z.; Srivasta, M.; Zhang, S., and Kandathil, M. Concurrent babesiosis and ehrlichiosis in an elderly host. Mayo Clin Proc. 2001; 76(5):563-565. Johansson, K.E.; Pettersson, B.; Uhln, M.; Gunnarsson, A.; Malmqvist, M., and Olsson, E. Identification of the causative agent of granulocytic ehrlichiosis in swedish dogs and horses by direct solid phase sequencing of PCR products from the 16S rRNA gene. Res Vet Science. 1995; 58:109-112. Jondal, M.; Schirmbeck, R., and Reimann, J. MHC class I-restricted CTL responses to exogenous antigens. Immunity. 1996; 5:295-302. Juste, R.A.; Scott, G.R.; Paxton, E.A.; Gelabert, J.L., and Jimenez, S. Presence of phagocytophila in an atypical disease of cattle in Spain. Vet Record. 1989; 124:636. Cytoecetes
Kakoma, I.; Carson, C.A.; Ristic, M.; Huxsoll, D.L.; Stephenson, E.H., and Nyindo, M.B.A. Autologous Lymphocyte-Mediated Cytotoxicity Against Monocytes in Canine Ehrlichiosis. Am J Vet Res. 1977; 38( 10):1557-1559. Kakoma, I.; Hansen, R.; Liu, L.; Fedrigon, S., and Bellamy, K. Serologically atypical canine ehrlichiosis associated with Ehrlichia risticii "infection". J Am Vet Med Assoc. 1991; 199(9):1120. Kakoma, I.; Hansen, R.D.; Anderson, B.E.; Hanley, T.A.; Sims, K.G.; Liu, L.; Bellamy, C.; Long, M.T., and Baek, B.K. Cultural, molecular and immunological characterization of the etiologic agent for atypical canine ehrlichiosis . J. Clin. Microbiol . 1994; 32:170-175. Kakoma, I.; Sainz, A.; Tesouro, M.; Amusategui, I.; Kim, C.H.; Biggerstaff, J.; McPeak, J., and Levy, M.G. Standardization of the diagnostic criteria for canine ehrlichiosis. Towards universal case definition. Ann N Y Acad Sci. 2000; 916:396-403. Katavolos, P; Armstrong, P.M., and Dawson, J.E. Duration of tick attachment required for transmission of granulocytic ehrlichiosis. J Infect Dis. 1998; 177:1422-1425.
- 291 -
Bibliografa
Kawahara, M.; Suto, C.; Rikihisa, Y.; Yamamoto, S, and Tsuboi, Y. Characterization of ehrlichial organisms isolated from a wild mouse. J Clin Microbiol. 1993; 31(1):89-96. Kawahara, M.; Ito, T.; Suto, C.; Shibata, S.; Rikihisa, Y.; Hata, K., and Hirai, K. Comparison of Ehrlichia muris strains isolated from wild mice and ticks and serologic survey of humans and animals with E. muris as antigen. J Clin Microbiol. 1999; 37(4):1123-1129. Kaylor, P.S.; Crawford, T.B.; McElwain, T.F., and Palmer, G.H. Passive transfer of antibody to Ehrlichia risticii protects mice from ehrlichiosis. Infect Immun. 1991; 59(6):2058-2062. Keefe, T.; Holland, C.; Salyer, P.E., and Ristic, M. Distribution of Ehrlichia canis among military working dogs in the world and selected civilian dogs in the United States. JAVMA. 1982; 181:236-238. Keenan, C.M.; Hendricks, L.D.; Lightner, L., and Johnson, A.J. Visceral leishmaniasis in the German shepherd dog. II. Pathology. Vet Pathol. 1984; 21(1):80-86. Kelly, P.J.; Carter, S.D.; Bobade, P.A.; Matthewman, L.A., and Bell, S.C. Absence of antinuclear antibodies in dogs infected with Ehrlichia canis. Vet Rec. 1994a; 134(15):382. Kelly, P.J.; Matthewman, L.A.; Mahan, S.M.; Semu, S.; Peter, T.; Mason, P.R.; Brouqui, P., and Raoult, D. Serological evidence for antigenic relationships between Ehrlichia canis and Cowdria ruminantium. Res Vet Sci. 1994b; 56(2):170-174. Keren, D.F. History and evolution of surface marker assays. In Keren DF, Hanson, CA, Hartubise PE (Eds): Flow Cytometry and Clinical Diagnosis. Chicago, American Society of Clinical Pathologists . 1994; 1. Kidd, L. and Breitschwerdt, E.B. Transmission times and prevention of tick-borne diseases in dogs. Compendium. 2003; 25(10):742-751. Kitron, U. and Kazmierczak, J.J. Spatial analysis of the distribution of Lyme disease in Wisconsin. Am J Epidemiol. 1997; 145:558-566. Klein, M.B.; Miller, J.S.; Nelson, C.M., and Goodman, J.L. Primary bone marrow progenitors of both granulocytic and monocytic lineages are susceptible to infection with the agent of human granulocytic ehrlichiosis. J Infect Dis. 1997; 176(5):1405-1409. Klein M.B.; Hu S.; Chao C.G., and Goodman J.L. The agent of human granulocytic ehrlichiosis induces the production of myelosuppressing chemokines without induction of proinflamatory cytokines. J Infect Dis. 2000; 41(6):263-265. Knapp, W. Antibody-defined surface molecules of normal and malignant hematopoietic cells. In Laerum OD, Bjerknes R (Eds): Flow Cytometry in Hematology. London, Academic Press. 1992; 213. Kontos, V.I.; Papadopoulos, O., and French, T.W. Natural and experimental canine infections with a Greek strain of Ehrlichia platys. Vet Clin Pathol. 1991; 20(4):101-105. Kontos, V.I. and Athanasiou, L.V. Use of enrofloxacin in the treatment of acute canine ehrlichiosis . Canine Practice. 1998; 23:10-14. Kopecky, J.; Kuthejlova, M., and Pechova, J. Salivary glands extract from Ixodes ricinus ticks inhibits production of interferon-gamma by the upregulation of interleukin-10. Parasite Immunol . 1999; 21(7):351-6.
- 292 -
Bibliografa
Kordick, S.K.; Breitschwerdt, E.B.; Hegarty, B.C.; Southwick, K.L.; Hancock, S.I.; Bradley, J.M.; Rumbough, R.; Mcpherson, J.T., and McCormack, N. Coinfection with multiple tick-borne pathogens in a Walker Hound kennel in North Carolina. J Clin Microbiol. 1999; 37(8):2631-2368. Krause, P.J.; Corrow, C.L., and Bakken, J.S. Successful treatment of human granulocytic ehrlichiosis in children using rifampin. Pediatrics. 2003; 112(3):252-253. Kuehn, N.F. and Gaunt, S.D. Clinical and hematologic findings in canine ehrlichiosis. J Am Vet Med Assoc. 1985; 186(4):355-358. Kuttler, K.L. Pharmacotherapeutics of drugs used in treatment of anaplasmosis and babesiosis. J Am Vet Med Assoc. 1980; 176(10):1103-1108. Kuzin, I.I.; Snyder, J.E.; Ugine, G.D.; Wu, D.; Lee, S.; Bushnell, T.Jr; Insel, R.A.; Young, F.M., and Bottaro, A. Tetracyclines inhibit activated B cell function. Int Immunol. 2001 ; 13(7):921-31. Larsen, H. J.; Overnes, G.; Waldeland, H., and Johansen, G.M. Immunosuppression in sheep experimentally infected with Ehrlichia phagocytophila. Res Vet Sci. 1994; 56(2):216-224. Lewis, G.E.; Huxsoll, D.L.; Ristic, M., and Johnson, A. J. Experimentally induced infection of dogs, cats, and nonhuman primates with Ehrlichia equi, etiologic agent of equine ehrlichiosis. Am J Vet Res. 1975; 36(1):85-88. Lewis, G.E.; Ristic, M.; Smith, R.D.; Lincoln, T., and Stephenson, E.H. The brown dog tick Rhipicephalus sanguineus and the dog as experimental hosts of Ehrlichia canis. Am J Vet Res. 1977; 38(12):19531955. Liew, F.Y. Suppressor cells for cell-mediated immunity in infectious diseases. Res Immunol. 1989;140(3):328-333. Lilliehk, I.; Egenval, A., and Tvedten, H.W. Hematopathology in dogs experimentally infected with a swedish granulocytic ehrlichia species. Vet Clin Pathol. 1998; 27(4):116-122. Lilliehk, I.; Johannisson, A.; Magnusson, U.; Egenvall, A.; Trowald-Wigh, G., and Hakansson, L. Granulocyte function in dogs experimentally infected with a Swedish granulocytic Ehrlichia species. Vet Immunol Immunopathol. 1999; 67:141-152. Liz, J.S.; Anderes, L.; Sumner, J.W.; Massung, R. F.; Gern, L.; Rutti, B., and Brossard, M. PCR detection of granulocytic Ehrlichia in Ixodes ricinus ticks and wild small mammals in Western Switzerland. J Clin Microbiol. 2000; 38(3):1002-1007. Loken, M.R.; Brosnan, J.M.; Bach, B.A., and Ault, K.A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 1990; 11:453-459. Long, M.T.; Goetz, T.E.; Kakoma, I.; Whiteley, H.E.; Lock, T.E.; Holland, C.J.; Foreman, J.H., and Baker, G.J. Evaluation of fetal infection and abortion in pregnant ponies experimentally infected with Ehrlichia risticii . Am J Vet Res. 1995a; (56):1307-1316. Long, M.T.; Goetz, T.E.; Whiteley, H.E.; Kakoma, I., and Lock, T.E. Identification of Ehrlichia risticii as the causative agent of two equine abortions following natural maternal infection. J Vet Diagn Invest. 1995b; 7:201-205. Lotric-Furlan,S.; Avsic-Zupanc,T.; Petrovec, M.; Nicholson, W.L.; Sumner, J.W.; Childs, J.E., and Strle, F. Clinical and serological follo-up of patients with human granulocytic ehrlichiosis in Slovenia. Clin Diag Lab Immunol. 2001; 8(5):899-903.
- 293 -
Bibliografa
Loughran, T.J.; Starkebaum, G., and Aprile, J. Rearrangement and expression of T-cell receptor genes in large granular lymphocyte leukemia. Blood. 1988; 71:822-824. Madewell, B.R. and Gribble, D.H. Infection in two dogs with an agent resembling Ehrlichia equi. J Am Vet Med Assoc. 1982; 180(5):512-514. Madigan, J.E.; Hietala, S.; Chalmers, S., and DeRock, E. Seroepidemiologic survey of antibodies to Ehrlichia equi in horses of northern California. J Am Vet Med Assoc. 1990; 196(12):1962-1964. Madigan, J.E. and Pusterla, N. Ehrlichial diseases. Vet Clin North Am Equine Pract. 2000; 16(3):487-499. Madigan, J.E.; Pusterla, N.; Johnson, E.; Chae, J.S.; Pusterla, J.B.; Derock, E., and Lawler, S.P. Transmission of Ehrlichia risticii, the agent of Potomac horse fever, using naturally infected aquatic insects and helminth vectors: preliminary report. Equine Vet J. 2000; 32:275-279. Maeda, K.; Markowitz, N.; Hawley, R.C.; Ristic, M; Cox, D., and McDade, J.E. Human infection with Ehrlichia canis a leukocytic rickettsia. N Engl J Med. 1987; 853-856. Magnarelli, L.A. and Anderson, J.F. Serologic evidence of canine and equine ehrlichiosis in north-eastern United States. J Clin Microbiol. 1993 . 1993; 31(11):2857-2860. Magnarelli, L.A.; Ijdo, J.W., and Anderson, J.F. Antibodies to Ehrlichia equi in dogs from the north-eastern United States. J Am Vet Med Assoc. 1997; 211(9):1134-1137. Magnarelli, L.A.; Ijdo, J.W.; Anderson, J.F.; Padula, S.J.; Flavell, R.A., and Fikrig, E. Human exposure to a granulocytic ehrlichia and other tick-borne agents in Connecticut. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(10):2823-2827. Magnarelli, L.A.; Van Andel, A.E.; Ijdo, J.W.; Heimer, R., and Fikrig, E. Serologic testing of horses for granulocytic ehrlichiosis, using indirect fluorescent antibody staining and immunoblot analysis. Am J Vet Res. 1999; 60(5):631-635. Makinde, M.O. and Bobade, P.A. Osmotic fragility of erythrocytes in clinically normal dogs and dogs infected with parasites. Res Vet Sci. 1994; 57(3):343-348. Manian, F.A.; Weidner, J., and Costello, J. Human ehrlichiosis. Mo Med. 1989; 86:691-695. Mansueto, S.; D'Ancona, F. P.; Colletti, P.; Graceffa, R.; La Seta, F.; Pecoraro, V.; Gambino, G.; Grillo, G.; Vitale, G.; Richiusa, P.; D'Agostino, P., and Cillari, E. Alteration of interleukin-2 (IL-2) and soluble IL-2 receptor secretion in the sera and urine of patients with rickettsial boutonneuse fever. J Infect Dis. 1997; 175(1):142-145. Maretzki, C.H.; Fisher, D.J., and Greene, C.E. Granulocytic ehrlichiosis and meningitis in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1994; 205(11):1554-1556. Martin, G.S.; Christman, B.W., and Standaert, S.M. Rapidly fatal infection with Ehrlichia chaffeensis. N Engl J Med. 1999; 341:763-764. Martinez-Moreno, A.; Moreno, T.; Martinez-Moreno, F.J.; Acosta, I., and Hernandez, S. Humoral and cellmediated immunity in natural and experimental canine leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol. 1995 Oct;48(3-4):209-20. Marty, A.M.; Dumler, J.S., and Imes, G. Ehrlichiosis mimicking thrombotic thrombocytopenic purpura: case report and pathological correlation. Hum Pathol. 1995; 26:920-925.
- 294 -
Bibliografa
Massung, R.F.; Owens, J.H.; Ross, D.; Reed, K.D.; Petrovec, M.; Bjoersdorff, A.; Coughlin, R.T.; Beltz, G.A., and Murphy, C.I. Sequence analysis of the ank gene of granulocytic ehrlichiae. J Clin Microbiol. 2000; 38(8):2917-2922. Matthewman, L.A.; Kelly, P.J.; Mahan, S.M.; Semu, S.M.; Mason, P.R.; Bruce, D.; Brouqui, P., and Raoult, D. Reactivity of sera collected from dogs in Mutare, Zimbabwe, to antigens of Ehrlichia canis and Cowdria ruminantium. Vet Rec. 1994a; 134(19):498-499. Matthewman, L.A.; Kelly, P.J.; Brouqui, P., and Raoult, D. Further evidence for the efficacy of imidocarb dipropionate in the treatment of Ehrlichia canis infection. J S Afr Vet Assoc. 1994b; 65(3):104-107. Matus, R.E.; Leifer, C.E., and Hurvitz, A.I. Use of plasmapheresis and chemotherapy for treatment of monoclonal gammopathy associated with Ehrlichia canis infection in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1987; 190(10):1302-1304. McBride, J.W.; Corstvet, R.E.; Gaunt, S.D.; Chinsangaram, J.; Akita, G.Y., and Osburn, B.I. PCR detection of acute Ehrlichia canis infection in dogs. J Vet Diagn Invest. 1996; 8(4):441-447. McDevitt, H.O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 2000; 18:1-17. McDonough, S.P. and Moore P.F. Clinical, hematologic and immunophenotypic characterization of canine granular lymphocytosis. Vet Pathol. 2000; 37(6):637-646. McKoy, J.P.Jr. Basic principles in clinical flow cytometry. In Keren DF, Hanson, CA, Hartubise PE (Eds): Flow Cytometry and Clinical Diagnosis. Chicago, American Society of Clinical Pathologists . 1994; 26. McQuiston, J.H.; Paddock, C.D.; Holman, R.C., and Childs, J.E. Human ehrlichiosis in the United States. Emerg Infect Dis. 1999; 5:635-642. Meinkoth, J.H.; Ewing, S.A.; Cowell, R.L.; Dawson, J.E.; Warner, C.K; Mathew, J.S; Bowles, M; Thiessen, A.E; Panciera, R.J., and Fox, C. Morphologic and molecular evidence of a dual species ehrlichial infection in a dog presenting with inflammatory central nervous system disease. J Vet Intern Med. 1998; 12(5):389-393. Meinkoth, J.H and Clinkenbeard, D.C. Normal hematology of the dog. En: Schalm's Veterinary Hematology, 5th Ed. Feldman BF, Zinkl JG, Jain NC (Eds). Baltimore. 2000. Mendonca, S.C.; De Luca, P.M.; Mayrink, W.; Restom, T.G.; Conceicao-Silva, F.; Da-Cruz, A.M.; Bertho, A.L.; Da Costa, C.A.; Genaro, O., and Toledo, V.P. Characterization of human T lymphocytemediated immune responses induced by a vaccine against American tegumentary leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg. 1995; 53(2):195-201. Messick J.B., and Rikihisa Y. Supression of Ia antigen expression on gamma interferon treated macrophages infected with Ehrlichia risticii. Vet Immunol Immunopathol. 1992;32(3-4):225-241. Messick J.B. and Rikihisa Y. Characterization of Ehrlichia risticii binding, internalization , and proliferation in host cells by flow cytometry. Infect Immun. 1993; 61(9):3803-3810. Messick J.B. and Rikihisa Y. Inhibition of binding, entry or intracellular proliferation of Ehrlichia risticii in P388D1 cells by anti-E. risticii serum, immunoglobulin G or Fab fragment. Infect Immun. 1994; 62(8):3156-3161.
- 295 -
Bibliografa
Misao, T and Kobayashi, Y. Studies on infectious mononucleosis (glandular fever). Isolation of etiologic agent from blood, bone marrow and lymph node of patients with infectious mononucleosis using mice. Kiushu J Med Sci. 1955; 6:145-152. Misao, T. and Kobayashi, Y. Studies on infectious mononucleosis (glandular fever). 1. Isolation of the etiological agent from blood, bone marrow and lymph nodes of a patient infected with infectious mononucleosis by using mice. Kyushu J. Med. Sci. 1987; 155:1059-1062. Moore, P.F; Rossitto, P.V.; Danilenke, D.M.; Wielenga, J.J.; Raff, R.F., and Severns, E. Monoclonal antibodies specific for canine CD4 and CD8 define functional T-lymphocyte subsets and highdensity expression of CD4 by canine neutrophils. Tissue Antigens . 1992; 40:75-85. Morais, D.; Dawson, J.E.; Greene, C.; Filipe, A.R.; Galharda, L.C., and Bacellar, F. First european case of ehrlichiosis. Lancet. 1991; 338:633-634. Morales, M.; Mateu, C., and Guitart, P. Seroprevalencia de ehrlichiosis y rickettsiosis. Libro de Resmenes del XXXV Congreso Nacional de AVEPA. Madrid. 2000. Moreno, J.A. and Estrada-Pea, A. Prevalence and seasonal activity of Ixodes ricinus on domestic ruminants of the Basque country, Spain. Exp Appl Acarol . 1997; 21(1):41-48. Moreno, J.; Nieto, J.; Chamizo, C.; Gonzlez, F.; Blanco, F.; Barker, D.C., and Alvar, J. The immune response and PBMC subsets in canine visceral leishmaniasis, before and after, chemotherapy. Vet Immunol Immunopathol. 1999; 71:181-195. Moshkovski, S.D. Cytotropic inducers of infection and the classification of the Rickettsiae with Clamydozoa. Adv Mod Biol (Moscow). 1945; 19:1-44. Motoi, Y.; Satoh, H.; Inokuma, H.; Kiyuuna, T.; Muramatsu, Y.; Ueno, H., and Morita, C. First detection of Ehrlichia platys in dogs and ticks in Okinawa, Japan. Microbiol Immunol. 2001; 45(1):89-91. Moulder, J.W. Interaction of Chlamydiae and host cells in vitro. Microbiol Rev. 1991; 55(1):143-190. Murnaghan, M.F. and O'Rourke, F.J. Tick paralysis. In Bettini, S. (ed): Arthropod Venoms. New York: Springer-Verlag; 1978; p. 419. Murphy, G.L; Ewing, S.A.; Whitworth, L.C.; Fox, J.C., and Kocan, A.A. A molecular and serologic survey of Ehrlichia canis, E. chaffeeensis and E. ewingii in dogs and ticks from Oklahoma. Vet Parasitol. 1998; 79:325-339. Mylonakis, M.E.; Koutinas, A.F.; Billinis, C.; Leontides, L.S.; Kontos, V.; Papadoupolos, O.; Rallis, T., and Fytianou, A. Evaluation of cytology in the diagnosis of acute canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a comparison between five methods. Vet Microbiol. 2003; 91:197-204. Mller, I.; Pedrazzini, T.; Kropf, P.; Louis, J., and Milon, G. Establishment of resistance to Leishmania major infection in susceptible BALB/c mice requires parasite-specific CD8+ Tcells. Intern Immunol. 1991; 3:587-597. Mller, I.; Kropf, P.; Etges, R.J., and Louis, J.A. Gamma interferon response in secondary Leishmania major infection: role of CD8+ T cells. Infect Immun. 1993; 61(9):3730-3738.
Mller, I.; Kropf, P.; Louis, J.A., and Milon, G. Expansion of gamma interferon-producing CD8+ T cells following secondary infection of mice immune to Leishmania major. Infect Immun. 1994; 62(6):2575-1581.
- 296 -
Bibliografa
Nadelman, R.B.; Horowitz, H.W., and Hsieh, T.C. Simultaneous human granulocytic ehrlichiosis and Lyme borreliosis. N Engl J Med. 1997; 337:27-30. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Clinical applications of flow cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes; tentative guideline. NCCLS, Villanova PA. Vol 12 No 6. 1992; NCCLS Document H42-T. Neer, T.M. Ehrlichiosis: canine monocytic and granulocytic ehrlichiosis. Greene, G.E., editor. Infectious diseases of the dog and the cat. 2 ed. Philadelphia: WB Saunders Co; 1998; pp. 139-149. Neer, T.M.; Eddlestone, S.M.; Gaunt, S.D., and Corstvet, R.E. Efficacy of enrofloxacin for the treatment of experimentally induced Ehrlichia canis infection. J Vet Intern Med. 1999; 13(5):501-504. Neer, T.M.; Breitschewerdt, E.B., and Green, R.T. Consensus statement on ehrlichial disease of small animals from the infectious disease study group of the ACVIM. J Vet Intern Med. 2002; 16( 3):309315. Nims, R.M.; Ferguson, J.A.; Walker, J.S.; Hildebrant, P.K.; Huxsoll, D.L.; Reardon, M.J.; Varley, J.E.; Kolaja, G.J.; Watson, W.T.; Shroyer; E.L.; Elwell, P.A., and Vacura, G.W. Epizootiology of tropical canine pancytopenia in Southeast Asia. J Am Vet Med Assoc. 1971; 158:53-63. Novotney, C.; English, R.V.; Housman, J.; Davidson, M.G.; Nasisse, M.P.; Jeng, C.R.; Davis, W.C., and Tompkins, M.B. Lymphocyte populations changes in cats naturally infected with feline immunodeficiency virus. AIDS. 1990; 4:1213-1218. Nyindo, M.; Huxsoll D.L.; Ristic, M.; Kakoma, I.; Brown, J.L; Carson, C.A., and Stephenson, E.H. Cellmediated and humoral immune responses of german shepherd dogs and beagles to experimental infection with Ehrlichia canis. Am J Vet Res. 1980; 41(2):250-254. Nyindo, M.; Kakoma, I., and Hansen, R. Antigenic analysis of four species of the genus Ehrlichia by use of protein immunoblot. Am J Vet Res. 1991; 52(8):1225-1230. Ogunkoya, A.B.; Adeyanju, J.B., and Aliu, Y.O. Experiences with the use of Imizol in treating canine blood parasites in Nigeria. J Small Anim Pract. 1981; 22(12):775-777. Olano, J.P.; Masters, E.; Hogrefe, W., and Walker, D.H. Human monocytotropic ehrlichiosis, Missouri. Emerg Infect Dis . 2003; 9(12):1579-1586. Olmeda, S.; Martn, R.; Ruprez, C.; Badiola, C.; Montes, C., and Mir, G. Estudio epidemiolgico de las parasitosis de perros abandonados en la provincia de Madrid. Datos preliminares. III: Ectoparasitosis. Acta Parasitolgica Portuguesa. 1993; 1:218. Ostfeld, R. The ecology of Lyme disease risk. Am Sci. 1997; 85:338-346. Otani, I.; Niwa, T.; Tajima, M.; Ishikawa, A.; Watanabe, T; Tsumagari, S.; Takeishi, M., and Kanayama, K. CD56 is expresed exclusively on CD3+ T lymphocytes in canine peripheral blood. J Vet Med Sci. 2002; 64(5):441-444. Oteo, J.A.; Blanco, J.R.; Marnez de Atola, V., and Ibarra, V. First report of human granulocytic ehrlichiosis from Southern Europe. Emerg Infect Dis. 2000; 6(4):430-432. Oteo, J.A.; Gil, H.; Barral, M.; Perez, A.; Jimenez, S.; Blanco, J.R.; Martnez de Artola, V.; Garca-Prez, A., and Juste, R.A. Presence of granulocytic Ehrlichia in ticks and serological evidence of human infection in La Rioja, Spain. Epidemiol Infect. 2001; 127(2):353-358.
- 297 -
Bibliografa
Owens, M.A. and Loken, M.R. Components of flow cytometric Immunophenotyping in : Flow cytometry principles for clinical laboratory practice. 2002; pp. 17-43. Paddock, C.D.; Suchard, D.P.; Grunbach, K.L.; Hadley, W.K.; Kerschmann, R.L.; Abbey, N.W.; Dawson, J.E.; Anderson, B.E.; Sims, K.G.; Dumler, J.S., and Herndier, B.G. Brief report: fatal seronegative ehrlichiosis in a patient with HIV infection. N Engl J Med. 1993; 1164-1167. Paddock, C.D.; Sumner, J.W.; Shore, M.; Bartley, D.C.; Elie, D.C.; Mcquade, J.G.; Martin, C.R.; Goldsmith, C.S., and Childs, J.E. Isolation and characterization of Ehrlichia chaffeensis strains from patients with fatal ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 1997; 35:2496-2502. Paddock, C.D.; Folk, S.M.; Shore, G.M.; Machado, L.J.; Huycke, M.M.; Slater, L.N.; Liddell, A.M.; Buller, R.S.; Storch, G.A.; Monson, T.P.; Rimland, D.; Sumner, J.W.; Singleton, J.; Bloch, K.C.; Tang, Y.W.; Standaert, S.M., and Childs, J.E. Infections with Ehrlichia chaffeensis and Ehrlichia ewingii in persons coinfected with human immunodeficiency virus. Clin Infect Dis. 2001; 33(4):1586-1594. Paddock, C.D. and Childs, J.E. Ehrlichia chaffeensis: a prototypical emerging pathogen. Clin Microbiol Rev. 2003; 16(1):37-64. Palmer, J.E. and Benson, C.E. Studies on oral transmission of Potomac horse fever. J Vet Intern Med. 1994; 8(2):87-92. Pandolfi, F.; Zambello, R.; Cafaro, A., and Semenzato, G. Biologic and clinical heterogeneity of lymphoproliferative diseases of peripheral mature T lymphocytes. Lab Invest. 1992; 67:274-302. Park, J. and Rikihisa, Y. Inhibition of Ehrlichia risticii infection in murine peritoneal macrophages by gamma interferon, a calcium ionophore, and concanavalin A. Infect Immun. 1991; 59(10):34183423. Park, J. and Rikihisa, Y. L-Arginine-dependent killing of intracellular Ehrlichia risticii by macrophages treated with interferon. Infect Immun. 1992; 60:3504. Parola, P.; Beati, L., and Cambon, M. Ehrlichial DNA amplified from Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in France. J Med Entomol. 1998; 35(2):180-183. Parola, P. and Raoult, D. Ticks and tickborne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat. Clin Infect Dis . 2001; 33 (5):749. Patel, R.G. and Byrd, M.A. Near fatal acute respiratory distress syndrome in a patient with human ehrlichiosis. South Med J . 1999; 92(3):333-335. Pearce, C.J.; Conrad, M.E.; Nolan, P.E.; Fishbein, D.B., and Dawson, J.E. Ehrlichiosis: a cause of bone marrow hypoplasia in humans. Am J Hematol. 1988; 28:53-55. Prez, M.; Rikihisa, Y., and Wen, B. Ehrlichia canis-like agent isolated from a man in Venezuela: antigenic and genetic characterization. J Clin Microbiol. 1996; 34:2133-2139. Perille, A.L. and Matus, R.E. Canine ehrlichiosis in six dogs with persistently increased antibody titers. J Vet Intern Med. 1991; 5(3):195-198. Perkocha, L.A. and Rodgers, G.M. Hematologic aspects of human immunodeficiency virus infection: laboratory and clinical considerations. Am J Hematol. 1988; 29:94-105.
- 298 -
Bibliografa
Perterson, L.R.; Sawyer, L.A.; Fishbein, D.B.; Kelley, P.W.; Thomas, R.J.; Magnarelli, L.A.; Redus, M., and Dawson, J.E. An outbreak of ehrlichiosis in members of an army reserve unit exposed to ticks. J Infect Dis. 1989; 159:562-568. Petrovec, M.; Lotric Furlan, S., and Avsic Zupanc, T. Human disease in Europe caused by a granulocytic Ehrlichia species. J Clin Microbiol. 1997; 35:1556-1559. Philip, C.B.; Hadlow, W.J., and Hughes, L.E. Neorickettsia helminthoeca, a new rickettsia-like disease agent in dogs in western United States transmitted by an helminth. Riass Commun VI Congr Int Microbiol, Roma. 1953; 2:256-257. Piesman J. and Spielman A. Human babesiosis on Nantucker Island: Prevalence of Babesia microti in ticks. Am J Trop Med Hyg. 1980; 29:742-746. Pinelli, E.; Boog, C.J.P.; Rutten, V.P.M.G. ; Van Dijk, B.; Bernadina, W.E., and Ruitenberg, E.J. A canine CD8+ cytotoxic T cell line specific for Leishmania infantum-infected macrophages. Tissue Antigens. 1994; 43:189-192. Pinelli, E.; Gonzalo, R.M.; Boog, C.J.P.; Rutten, V.P.M.G.; Bebhard, D.; Del Real, G., and Ruitenberg, E.J. Leishmania infantum-specific T cell lines derived from asymtomatic dogs that lyse infected macrophages in a major histocompatibility complex-restricted manner. Eur J Immunol. 1995; 25:1594-1600. Popov, V.L.; Han, V.C.; Chen, S.M.; Dumler, J.S.; Feng, H.M.; Andreadis, T.G.; Tesh, R.B., and Walker, D.H. Ultraestructural differentiation of the genogroups in the genus Ehrlichia. J Med Microbiol. 1998; 47:235-251. Price, J.E.; Sayer, P.D., and Dolan, T.T. Improved clinical approach to the diagnosis of canine ehrlichiosis. Tropical Animal Health and Production in Africa. 1987; 19:1-8. Prieto, M. Estudio sobre la incidencia de garrapatas y piroplasmosis durante 19998. Libro de Resmenes del XXXIV Congreso Nacional de AVEPA. Barcelona. 1999; 287. Prieto, M. Aspectos clnicos de la babesiosis canina y de la infeccin simultnea por Ehrlichia y Borrelia. Libro de Resmenes del XXXVIII Congreso Nacional de AVEPA. Sevilla. 2003; 285. Pusterla, N.; Pusterla, J.B.; Deplazes, P.; Wolfensberger, C.; Muller, W.; Horauf, A.; Reusch, C., and Lutz, H. Seroprevalence of Ehrlichia canis and of canine granulocytic Ehrlichia infection in dogs in Switzerland. J Clin Microbiol. 1998; 36(12):3460-3462. Pusterla, N.; Leutenegger, C.M.; Huder, J.B.; Weber, R.; Braun, U., and Lutz, H. Evidence of the human granulocytic ehrlichiosis agent in Ixodes ricinus ticks in Switzerland. J Clin Microbiol. 1999; 37:1332-1334. Pusterla, N.; Madigan, J E.; Chae, J.; Derock, E.; Johnson, E., and Pusterla, J.B. Helminthic transmission and isolation of Ehrlichia risticii , the causative agent of Potomac horse fever, by using trematode stages from freshwater stream snails. J Clin Microbiol. 2000; 38:1293-1297. Quiroz, H. Ixdidos. En: Parasitologa y Enfermedades Parasitarias de Animales Domsticos. 1984; 767-802. Rapmund, G. Rickettsial diseases for the Far East: new perspectives. J Infect Dis. 1984; 149:330-338. Ratnasamy, N.; Everett, E.D.; Roland, W.E.; McDonald, G., and Caldwell, C.W. Central nervous system manifestations of human ehrlichiosis. Clin Infect Dis. 1996; 23(2):314-319.
- 299 -
Bibliografa
Raziuddin, S.; Telmasani, A.W.; El-Awad, M.E.; El-Amari, O., and Al-Janadi, M. T cells and the immune response in visceral leishmaniasis. Eur J Immunol. 1992; 22:1143-1148. Reardon, M.J. and Pierce, K.R. Acute experimental canine ehrlichiosis. Vet. Pathol. 1981; 18:48-61. Reddy, G.R.; Sulsona, C.R.; Barbet, A.F.; Mahan, S.M.; Burridge, M.J., and Alleman, A.R. Molecular characterization of a 28 kDa surface antigen gene family of the tribe Ehrlichiae. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 247(3):336-343. Reed, K.D.; Mitchell, P.D.; Persing, D.H.; Kolbert, C.P., and Cameron, V. Transmission of human granulocytic ehrlichiosis. JAMA. 1995; 273-283. Ribeiro, J.M.C.; Makoul, G., and Levine, J. Antihemostatic, antiinflammatory and immunosuppressive properties of the saliva of a tick, Ixodes damming. J Exp Med. 1985; 161:332. Ribeiro, J.M.C. Role of saliva in blood-feeding by arthropods. Ann Rev Entomol. 1987; 32 :463. Richards, S.J. and Scott, C.S. Human NK cells in health and disease: clinical, functional, phenotypic and DNA genotypic characteristics. Leek Lymphoma. 1992; 7:377-399. Rikihisa, Y.; Perry, B.D., and Cords, D.O. Ultra structural study of ehrlichial organisms in the large colons of ponies infected with Potomac horse fever. Infect Immun. 1985; 49(3):505-512. Rikihisa, Y. The tribe Ehrlichiae and ehrlichial diseases. Clin Microbiol Rev. 1991; 4:286-308. Rikihisa, Y.; Stills, H., and Zimmerman, G. Isolation and continuous culture of Neorickettsia helminthoeca in a macrophage cell line. J Clin Microbiol. 1991; 29(9):1928-1933 Rikihisa, Y.; Ewing, S.A.; Fox, J.C.; Sidebar, A.G.; Ascribe, F.H., and Malone, M.B. Analyses of Ehrlichia canis and a canine granulocytic Ehrlichia infection. J Clin Microbiol. 1992; 30(1):143-148. Rikihisa, Y. Clinical and biological aspects of infection caused by Ehrlichia chaffeensis. Microbes Infect. 1999; 1(5):367-376. Ristic, M.; Huxsoll, D.L.; Weedier, R.M.; Hildebrandt, P.K., and Nyindo, M.B. Serological diagnosis of tropical canine pancytopenia by indirect immunofluorescence. Infect Immun. 1972; 6(3):226-231. Ristic, M. Tick-borne rickettsias of veterinary importance with emphasis on the immunology of the disease. En: Tick-Borne Diseases and Their Vectors. Wilde, J.K.H. (Ed.). Edinburgh University Press. Edinburgh. 1976; 475-481. Ristic, M.; Huxsoll, D.L.; Tachibana, N., and Rapmund, G. Evidence of a serologic relationship between Ehrlichia canis and Rickettsia sennetsu. Am J Trop Med Hyg. 1981; 30(6):1324-1328. Ristic, M. and Huxsoll, D.L. Tribe II. Ehrlichieae Philip 1957, 948AL. En Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol1, Pp. 704-711. Edited by N.R. Krieg y J.G. Holt. Baltimore: Williams y Wilkins. 1984. Ristic, M. and Kreier, J.P. Family III. Anaplasmataceae Philip 1957, 980AL. En Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol1, Pp. 719-729. Edited by N.R. Krieg y J.G. Holt. Baltimore: Williams y Wilkins. 1984. Ristic, M.; Dawson, J.; Holland, C.J., and Jenny, A. Susceptibility of dogs to infection with Ehrlichia risticii, causative agent of equine monocytic ehrlichiosis (Potomac horse fever). Am J Vet Res. 1988; 49(9):1497-1500.
- 300 -
Bibliografa
Ristic, M., Williams, J.C. and Kakoma, I. Current strategies in research on ehrlichiosis. Ehrlichiosis. Netherlands: Kluwer Academic Publishers.; 1990; pp. 138-153. Ristic, M. and Holland, C.J. Canine ehrlichiosis. En: Rickettsial and Chlamydial Diseases of Domestic Animals. Woldehiwet, Ristic (Eds). Pergamon Press, Oxford, United Kingdom. 1993; 169-186. Rivas, L.R. Functional and phenotypic analysis of in vitro stimulated canine peripheral blood mononuclear cells. Vet Immunol Immunopathol. 1995; 45:55-71. Rocha, B.; Dautigny, N., and Pereira, P. Peripheral T lymphocytes: expansion potential and homeostatic regulation of pool sizes and CD4/CD8 ratios in vivo. Eur J Immunol. 1989; 19(5):905-911. Rohrbach, B.W.; Harkess, J.R.; Ewing, S.A.; Kudlac, J.; Mckee, G.L., and Istre, G.R. Epidemiologic and clinical characteristics of persons with serologic evidence of E. canis infection. Am J Pub Health. 1990; 80:442-445. Roitt, I. La base de la inmunologa: Inmunidad innata e Inmunidad adquirida especfica. En: Inmunologa Fundamentos. Ivan Roitt (Eds). Editorial Mdica Panamericana. 1998a.; 3-39. Roitt, I. El reconocimiento de los antgenos: Anticuerpos y Receptores de membrana. En: Inmunologa Fundamentos. Ivan Roitt (Eds). Editorial Mdica Panamericana. 1998b. Rosell, A.I. Anlisis de la expresin de molculas de adhesin celular en la leucemia linftica crnica y otros sndromes linfoproliferativos crnicos con expresin leucmica. Tesis Doctoral. Universidad De Valencia (Ed). 2002; 64-65. Russo, D.M.; Armitage, R.J.; Barral-Netto, M.; Barral, A.; Grabstein, K.H., and Reed, S.G. Antigen-reactive T cells in human leishmaniasis. J Immunol. 1993; 151:3712-3718. Sacks, D.L.; Lal, S.L.; Shrivastava, S.N.; Blackwell, J., and Neva, F.A. An analysis of T cell responsiveness in Indian kala-azar. J Immunol. 1987; 138(3):908-913. Sadikot, R.; Shaver, M.J., and Reeves, W.B. Ehrlichia chaffeensis in a renal transplant recipient. Am J Nephrol. 1999; 19:674-676. Sagredo, P.; Fraile, C.; Sainz, A.; Ruprez, C.; Tesouro, M., and Gonzlez, J.L. Skin lesions associated with Ehrlichia canis infection in a dog. Proceedings 11th Annual Congress European Society of Veterinary Dermatology. Bordeaux. 1994. Sainz, A.; Tesouro, M.A.; Rodrguez, F., and Mazzucchelli, F. Seroprevalence of Ehrlichia canis infections in police dogs in Spain. Preventive Vet Med. 1995; 23:179-182. Sainz, A. Aspectos clnicos y epizootolgicos de la ehrlichiosis canina. Estudio comparado de la eficacia teraputica de la doxiciclina y el dipropionato de imidocarb. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid (Ed). 1996. Sainz, A.; Delgado, S.; Amusategui, I.; Tesouro, M.A., and Crmenes, P. Seroprevalence of canine ehrlichiosis in Castilla-Len (NW Spain). Preventive Veterinary Medicine. 1996; 29:1-7. Sainz, A.; Amusategui, I., and Tesouro, M.A. Canine ehrlichiosis in the Comunidad de Madrid (Central Spain). Annals of New York Academy of Sciences. 1998a; 849:438-440. Sainz, A.; Muoz, M.C.; Montoya, J.A.; Amusategui, I., and Tesouro, M.A. Estudio de seroprevalencia de Ehrlichia canis en perros de la isla de Gran Canaria (Espaa). IV Simposium Ibrico Sobre Ixodoidea y Enfermedades Transmitidas. Setubal (Portugal) 24-26 de Septiembre. 1998b.
- 301 -
Bibliografa
Sainz, A.; Kim, C.H.; Tesouro, M.A.; Hansen, R.; Amusategui, I.; Koo, H.Y., and Kakoma, I. Serological evidence of exposure to Ehrlichia risticii in dogs in Spain. Proceedings 5th Conference Society for Tropical Veterinary Medicine. Florida (USA). 1999a. Sainz, A.; Amusategui, I, and Tesouro, M.A. Ehrlichia platys infection and disease in dogs in Spain. J Vet Diagn Invest. 1999b; 11(4):382-384. Sainz, A.; Amusategui, I.; Kakoma, I.; Rodrguez, F., and Tesouro, M.A. Estudio sobre la presencia de anticuerpos frente a diferentes Ehrlichia spp, en perros de la zona centro de Espaa. Libro De Ponencias y Comunicaciones. XXXV Congreso Nacional De AVEPA. Madrid 12-15 Octubre. 2000a. Sainz, A.; Tesouro, M.A.; Hansen, R.; Amusategui, I.; Hyun-Young, K., and Kakoma, I. Serological evidence of exposure to Ehrlichia species in dogs in Spain. Ann N Y Acad Sci. 2000b; 916:635642. Sainz, A.; Tesouro, M.A., and Amusategui, I. Prospective comparative study of three treatment protocols using doxycycline or imidocarb dipropionate in dogs with naturally occurring ehrlichiosis. J Vet Intern Med . 2000c; 14(2):134-139. Sainz, A. and Tesouro, M.A. Alteraciones Biopatolgicas: Hematologa, Bioqumica Sangunea, Urianlisis. En: Ehrlichiosis. Canis Et Felis. 2001; 51:41-48. Sakai, M.; Otani, I.; Watari, T.; Sato, T.; Kanayama, K.; Takeuchi, A., and Hasegawa, A. Phenotypic analysis of hepatic lymphocytes from healthy dogs. J Vet Med Sci. 2003; 65(1):157-159. Sauer, J.R.; Mane, S.D., and Smichmidt, S.P. Molecular basis for salivary fluid secretion in ixodid ticks. In Sauer, J.R, Hair J.A (Eds): Morphology, Physiology and Behavioural Biology of Ticks. Chichester, England, Ellis Horwood. 1986; 55. Saz, J.V.; Dawson , J.E.; Bacellar, F.; Merino, F.J., and Filipe, A.R. Human ehrlichiosis in Spain. Enferm Infecc Microbiol Clin. 1994; 12(7):357-358. Scharton, T.M. and Scott, P. Natural killer cells are a source of interferon gamma that drives differentiation of CD4+ T cells subsets and induces early resistance to Leishmania major in mice. J Exp Med. 1993; 178. Schwartz, I.; Fish, D., and Daniels, T.J. Prevalence of the rickettsial agent of human granulocytic ehrlichiosis in ticks from a hyperendemic focus of Lyme disease. N Engll J Med. 1997; 337:49-50. Scott, C. and Richards, S. Classification of large granular lymphocyte (LGL) and NK-associated (NKa) disorders. Blood Rev. 1992; 6 :220-233. Scott, D.W.; Miller, W.H., and Griffin, G.E. Small Animal Dermatology. Diagnostic Methods. 6th ed. W.B. Saunders Company; 2001; pp. 93-94. Sellon, R.K. Update on molecular techniques for diagnostic testing of infectious disease . Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2003; 33(4):677-693. Shanahan, T. Application of flow cytometry in transplantation medicine. Immunological Investigation. 1997; 26:91-101. Shaw, D.H. and Rubin, S.I. Pharmacologic activity of doxycycline. J Am Vet Med Assoc. 1986; 189(7):808810.
- 302 -
Bibliografa
Shaw, S. Ehrlichiosis and Anaplasmosis. Tijdsch Diergeneeskd. 2003; 128(11): 353-354. Silverstein, A.M. On the naming of Rickettsiae after Paul Ehrlich. Bull Hist Med. 1998; 72:731-733. Simpson, T.M.; Gaunt, S.D.; Hair, J.A.; Kocan, K.M.; Henk, W.G., and Casey, H.W. Evaluation of Riphicephalus sanguineus as a potential biologic vector of Ehrlichia platys. Am J Vet Res. 1991; 52(9):1537-1541. Skotarczak, B. Canine ehrlichiosis. Ann Agric Environ Med. 2003. 2003; 10(2):137-141. Slappendel, R.J. Canine leishmaniasis. A review based on 95 cases in The Netherlands. Vet Q. 1988; 10(1):116. Sloand, E.M.; Klein, H.G., and Banks, S.M. Epidemiology of thrombocytopenia in HIV infection. Eur J Haematol. 1992; 48:168-172. Smith, R.D.; Sells, D.M.; Stephenson, E.H.; Ristic, M, and Huxsoll, D.L. Development of Ehrlichia canis, causative agent of canine ehrlichiosis, in the tick Rhipicephalus sanguineus and its differentiation from a symbiotic Rickettsia. Am J Vet Res. 1976; 37(2):119-126. Smyth, M.J. and Trapini, J.A. Granzymes: exogenous proteinases that induce target cell apoptosis. Immunol Today. 1995; 16:202-206. Sonea, I.M.; Jergens, A.E; Sacco, R.E.; Niyo, Y.; Merten, E.; Kauffman, L.K, and Moore, P.F. Flow cytometric analysis of colonic and small intestinal mucosal lymphocytes obtained by endoscopic biopsy in the healthy dog. Vet Immunol Immunopathol. 2000; 77:103-119. Sood, S.; Salzman, M.B., and Johnson, B.J.B. Duration of tick attachment as a predictor of the risk of Lyme disease in an area in which Lyme disease is endemic. J Infect Dis. 1997; 175:996-999. Stewart, C.C. Identification and function of host defense cells by flow cytometry. Immunological Investigations . 1997; 26:83-89. Stone, B.F. Tick paralysis, particularly involving Ixodes holocyclus and other Ixodes species. Biology of ticks: Harris KF (ed). Current Topics in Vector Research. New York: Springer Verlag; 1988; p. 61. Stone, B.F.; Binnington, K.F., and Gauci, M. Tick/host interactions for Ixodes holocyclus: Role, effects, biosynthesis and nature of its toxics and allergenic oral secretions. Experimental and Applied Acarology. 1989; 7:59. Stone, M.; Fortin, P.R.; Pacheco-Tena, C., and Inman, R.D. Should tetracycline treatment be used more extensively for rheumatoid arthritis? Metaanalysis demonstrates clinical benefit with reduction in disease activity. J Rheumatol. 2003; 30(10):2085-2097. Suksawat, J.; Pitulle, Ch.; Arraga-Alvarado, C.; Madrigal, K.; Hancock, S.I., and Breitschwerdt, E.B. Coinfection with three Ehrlichia species in dogs from Thailand and Venezuela with emphasis on consideration of 16S ribosomal DNA secondary structure. Journal of Clinical Microbiology. 2001; 39(1):90-93. Sumner, J.W.; Nicholson, W.L., and Massung, R.F. PCR amplification and comparison of nucleotide sequences from the groESL heat shock operon of Ehrlichia species. J Clin Microbiol. 1997; 35:2087-2092. Tarello, W. Canine granulocytic ehrlichiosis (CGE) in Italy. Acta Vet Hung. 2003; 51(1):73-90.
- 303 -
Bibliografa
Tatchell, R.J. Salivary secretion in the cattle tick as a means of water elimination. Nature. 1967; 213:940. Tatchell, R.J. The ionic regulatory role of the salivary secretions of the cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini). Journal of Inse Ct Physiology. 1969; 15:1421 . Tatchell, R.J. and Moorhouse, D.E. Neutrophils: their role in the formation of a tick feeding lesion. Science. 1970; 167:1002. Taylor, A.W.; Holman, H.H., and Gordon, W.S. Attemps to reproduce the pyaemia associated with tickborne fever. Vet Rec. 1941; 24:337-344. Telford, S.R.; Dawson, J.E.; Katavolos, P.; Warner, C.K.; Kolbert, C.P., and Persing, D.H. Perpetuation of the agent of human granulocytic ehrlichiosis in a deer tick-rodent cycle. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:6209-6214. Tesouro, M.A. Aspectos clnicos y laboratoriales de la lesishmaniosis canina. Estudio espizootolgico en la provincia de Madrid. 1984. Tesis doctoral. Madrid. Tesouro, M.A.; Amusategui, I.; Mazzuchelli, F.; Sainz, A., and Rodriguez, F. Tratamientos actuales. En: Tratamiento de la leishmaniosis canina. Encuesta epizootolgica en la Comunidad Autnoma de Madrid, pp. 7-54. Ed. Por Ilustre Colegio Oficial de Veterinarios de Madrid, Madrid 28009, 1995. Tesouro, M.A.; Amusategui, I.; Rodrguez, F.; Alonso, A.; Mir, G., and Sainz, A. Deteccin de anticuerpos frente a E. canis en sangre de gatos de la zona centro de Espaa (Madrid). Proceedings IV SISIET. Setbal (Portugal). 1998. Tesouro, M.A. and Sainz, A. Profilaxis, Ehrlichiosis canina en Espaa. Canis Et Felis. 2001; 51:65-71. Theiler, A. Anaplasma marginale (gen. and spec. nov.). The marginal points in the blood of cattle suffering from a specific disease. In Report to the Goverment, Transvaal, South Africa. Veterinary Bacteriology, Dept of Agriculture 1908-1909. 1910; 7-64. Theis, J.H. and Budwiser, P.D. Rhipicephalus sanguineus: sequential histopathology at the host-arthropod interface. Exp Parasitol. 1997; 36(1):77-105. Titus, R.G.; Ceredig, R.; Cerottini, J.C., and Louis, J.A. Therapeutic effect of anti-L3T4+ monoclonal antibody GK1-5 on cutaneous leishmaniasis in genetically-susceptible BALB/c mice. J Immunol. 1985; 135:2108-2114. Tompkins, M.B.; Nelson, P.D., and English, R.V. Early events in the immunopathogenesis of feline retroviral infections. J Am Vet Med Assoc. 1991; 199:1311-1313. Troy, G.C.; Vulganot, J.C., and Turnwalt, G.H. Canine ehrlichiosis: a retrospective study of 30 naturally occurring cases. J Am Anim Hosp Assoc. 1980; 16:181-187. Troy, G.C. and Forrester, S.D. Ehrlichia canis, E. equi, and E. risticii infections. En: Infectious Diseases of the Dog and Cat. C.E. Greene (Ed.). W.B. Saunders. Philadelphia. 1990; 404-414. Tyzzer, E.E. Cytoecetes microti n. gen. n.sp. A parasite developing in granulocytes and infection in small rodents. Parasitology. 1938; 30:242-257. Uhaa, I.J.; McLean, J.D.; Greene, C.R., and Fishbein, D.B. A case of human ehrlichiosis adquired in Mali: clinical and laboratoey findings. Am J Trop Med Hyg. 1992; 46:161-164.
- 304 -
Bibliografa
Uilenberg, G.; Dobbelaere, D.A.; de Gee, A.L., and Koch, H.T. Progress in research on tick-borne diseases: theileriosis and heartwater. Vet Q. 1993; 15(2):48-54. Unver, A.; Perez, M.; Orellana, N.; Huang, H., and Rkihisa, Y. Molecular and antigenic comparison of Ehrlichia canis isolates from dogs, ticks and a human in Venezuela. J Clin Microbiol. 2001; 39(8):2788-2793. Van der Kolk, J.H; Van der Wijden, M.W., and Jongejan, F. Equine granulocytic ehrlichiosis (EGE), a review. Tijdschr Diergeneeskd. 1993; 118(7):227-229. Van Dobbenburgh, A.; Van Dam, A.P., and Fikrig, E. Human granulocytic ehrlichiosis in western Europe. N Engl J Med. 1999; 340:1214-1216. Van Heerden, J. and Immelman, A. The use of doxycycline in the treatment of canine ehrlichiosis. J S Afr Vet Assoc. 1979; 50(4):241-244. Van Heerden, J. and Van Heerden, A. Attempted treatment of canine ehrlichiosis with imidocarb dipropionate. J S Afr Vet Assoc. 1981; 52(3):173-175. Vugia, D.J. and Kramer, V.L. A human case of monocytic ehrlichiosis with adult respiratory distress syndrome in northern California. West J Med. 1996; 164(6):525-528. Waddle, J.R. and Littman, M.P. A retrospective study of 27 cases of naturally occurring canine ehrlichiosis. J Am Anim Hosp Assoc. 1988; 24:615-620. Walker, J.B. and Olwage, A. The tick vectors of Cowdria ruminantium (Ixodoidea, Ixodidae, genus Amblyomma) and their distribution. Onderstepoort J Vet Res. 1987; 54(3):353-379. Waner, T.; Harrus, S.; Weiss, D.J.; Bark, H., and Keysary, A. Demonstration of serum antiplatelet antibodies in experimental acute canine ehrlichiosis. Vet Immunol Immunopathol. 1995; 48(1-2):177-182. Waner, T.; Rosner, M.; Harrus, S.; Naveh, A.; Zass, R., and Keysary, A. Detection of ehrlichial antigen in plasma of beagle dogs with experimental acute Ehrlichia canis infection. Vet Parasitol. 1996; 63(34):331-335. Waner, T.; Leykin, I.; Shinitsky, M.; Sharabani, E.; Buch, H.; Keysary, A.; Bark, H., and Harrus, S. Detection of platelet-bound antibodies in beagle dogs after artificial infection with Ehrlichia canis. Vet Immunol Immunopathol. 2000a; 77:145-150. Waner, T.; Strenger, C., and Keysary, A. Comparison of a clinic-based ELISA test kit with the immunofluorescence test for the assay of Ehrlichia canis antibodies in dogs. J Vet Diagn Invest. 2000b; 12(3):240-244. Waner, T.; Harrus, S.; Jongejan, F.; Bark, H.; Keysary, A., and Cornelissen, A.W. Significance of serological testing for ehrlichial diseases in dogs with special emphasis on the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis. Vet Parasitol. 2001; 95(1):1-15. Weaver, R.A.; Virella, G., and Weaver, A. Ehrlichiosis with severe pulmonary manifestations despite early treatment. South Med J. 1999; 92(3):336-339. Weisburg, W.G.; Barns, S.M.; Pelletier, D.A., and Lane, D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 1991; 173(2):697-703. Weiser, M.G.; Thrall, M.A., and Fulton, R. Granular lymphocytosis and hyperproteinemia in dogs with cronic ehrlichiosis. J Am Anim Hosp Assoc. 1991; 27:84-88.
- 305 -
Bibliografa
Weisiger, R.M.; Ristic, M., and Huxsoll, D.L. Kinetics of antibody response to Ehrlichia canis assayed by indirect fluorescent antibody method. Am J Vet Res. 1975; 36(5):689-694. Weiss, D.J. Evaluation of monoclonal antibodies for identifications of subpopulations myeloid cells in bone marrow obteined from dogs. Am J Vet Res. 2001a; 62(8):1229-1233. Weiss, D.J. Evaluation of proliferative disorders in canine bone marrow by use of flow cytometric scatter plots and monoclonal antibodies. Vet Pathol. 2001b; 38(5):512-518. Weiss, D.J. Flow cytometric and immunophenotypic evaluation of acute lymphocytic leukemia in dog bone marrow. J Vet Intern Med. 2001c; 15:589-594. Weiss, D.J. Use of monoclonal antibodies to refine flow cytometric differential counting of canine bone marrow cells. Am J Vet Res. 2001d; 62(8):1273-1278. Weiss, D.J. Flow cytometric evaluation of hemophagocytic disorders in canine. Vet Clin PAthol. 2002; 31(1):36-41. Wellman, M.; Couto, C.; Starkey, R., and Rojko, J. Lymphocytosis of large granular lymphocytes in three dogs. Vet Pathol. 1989; 26:158-163. Wells, M.Y. and Rikihisa, Y. Lack of lysosomal fusion with phagosomes containing Ehrlichia risticii in P388D1 cells: abrogation of inhibition with oxytetracycline. Infect Immun. 1988 Dec;56(12):32093215. Wen, B.; Rikihisa, Y.; Mott, J.; Fuerst, P.A.; Kawahara, M., and Suto, C. Ehrlichia muris sp. nov. identified on the basis of 16S rRNA base sequences and serological, morphological, and biological characteristics. Int J Syst Bacteriol. 1995; 45:250-254. Wen, B.; Cao, W., and Pan, H. Ehrlichiae and ehrlichial diseases in China. Ann N Y Acad Sci. 2003; 990:4553. Whist, S.K.; Storset, A.K., and Larsen, H.J.S. Functions of neutrophils in sheep experimentally infected with Ehrlichia phagocytophila. Vet Immunol Immunopathol. 2002; 86(3-4):183-193. Whist, S.K.; Storset, A.K.; Johansen, G.M., and Larsen, H.J. Modulation of leukocyte populations and immune responses in sheep experimentally infected with Anaplasma (formerly Ehrlichia) phagocytophilum. Vet Immunol Immunopathol. 2003; 94(3-4):163-175. Williams, D.L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 1997; 153:31-39. Williams, N.M.; Cross, R.J., and Timoney, P.J. Respiratory burst activity associated with phagocytosis of Ehrlichia risticii by mouse peritoneal macrophages. Res Vet Science. 1994; 57(2):194-199. Williams, R.C.; Koste, F.T., and Kilpatrick, K.A. Alterations in lymphocyte cell surface markers during various human infections. Am J Med. 1983; 75:807-810. Wiltrout, R.H. Regulation and antimetastatic functions of liver-associated natural killer cells. Immunol Rev. 2000; 174:63-76. Winnicka, A.; Jagielski, D.; Hoffmann-Jagielska, M., and Lechowski, R. Cytometric evaluation of peripheral blood lympjocytes in dogs with lymphoma during chemotherapy. J Vet Med. 2002; 49:303-306.
- 306 -
Bibliografa
Winslow, G.M.; Yager, E.; Shilo, K.; Volk, E.; Reilly, A., and Chu, F.K. Antibody-mediated elimination of the obligate intracellular bacterial pathogen Ehrlichia chaffeensis during active infection. Infect Immun. 2000; 2187-2195. Woese, C.R.; Kandler, O., and Wheelis, M.L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990; 87(12):4576-4579. Woldehiwet, Z. and Scott, G.R. Tick-borne fever: leucocyte migration inhibition. Vet Microbiol. 1982a; 7(5):437-445. Woldehiwet, Z. and Scott, G.R. Immunological studies on tick-borne fever in sheep. J Comp Pathol. 1982b; 92(3):457-467. Woldehiwet, Z. Depression of lymphocyte response to mitogens in sheep infected with tick-borne fever. J Comp Pathol. 1987; 97(6):637-643. Woldehiwet Z. Lymphocyte subpopulations in peripheral blood of sheep experimentally infected with tickborne fever. Research in Veterinary Science. 1991; 51(1):40-43. Wolf, L.; McPherson, T.; Harrison, B.; Engber, B.; Anderson, A., and Whitt, P. Prevalence of Ehrlichia ewingii in Amblyomma americanum in North Carolina. J Clin Microbiol . 2000; 38:2795. Wong, S.J. and Thomas, J.A. Cytoplasmatic, Nuclear and platelet autoantibodies in human granulocytic ehrlichiosis patients. J Clin Microbiol. 1998; 1959-1963. Woody, B.J and Hoskins, J.D . Ehrlichial diseases of dogs. Vet Clin North Am. Small Anim Pract. 1991; 21(1):75-98. Young, D.R.; Davis, W., and Arther, R.G. Evaluation of K9 Advantix versus Frontline Plus topical treatments to repel brown dog ticks (Rhipicephalus sangineus) on dogs. Compend Contin Educ Pract Vet. 2003; 25 (supl):19-21. Yu, X.; McBride, J.W.; Diaz, C.M., and Walke,r D.H. Molecular cloning and characterization of the 120kilodalton protein gene of Ehrlichia canis and application of the recombinant 120-kilodalton protein for serodiagnosis of canine ehrlichiosis. J Clin Microbiol. 2000; 38(1):369-374. Zhang, Y.; Ohashi, N.; Lee, E.H.; Tamura, A., and Rikihisa, Y. Ehrlichia sennetsu groE operon and antigenic properties of the GroEL homolog. FEMS Immunol Med Microbiol. 1997; 18:39-46.
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Evaluación Hematológica e Inmunofenotípica de La Erlichiosis Canina

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Medicina y Ciruga Animal

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

Carmen Lorente Mndez

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Carmen Lorente Mndez

ngel Sainz Rodrguez Miguel ngel Tesouro Dez

73 73 74 75 75 76 76 77 80 82 85 87 90 93 95 95 96 96 97 98 99 103 105 106 108 108 109

161 162 164 169 173

179 179 186 188 194 215 223

242 246 246 249

258 263 269 273 277

1.- INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

2.1. CLASIFICACIN TAXONMICA DE EHRLICHIA

Clasificacin taxonmica de Ehrlichia

Clasificacin taxonmica de Ehrlichia

En quidos, la enfermedad cursa de manera semejante con

depresin, edema de extremidades, trombocitopenia, leucopenia y anemia (Gribble, 1969).

2.3. EHRLICHIOSIS HUMANA

2.3.1. ETIOLOGA Y EPIDEMIOLOGA

2.4. EHRLICHIOSIS EN ESPAA

Transmisin por garrapatas

2.5. TRANSMISIN POR GARRAPATAS DE LAS EHRLICHIOSIS HUMANAS Y ANIMALES

Transmisin por garrapatas

Transmisin por garrapatas

2.7. CUADRO CLNICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

2.8. ALTERACIONES LABORATORIALES EN EL CURSO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

2.8.2. ALTERACIONES BIOQUMICAS Hiperproteinemia con hipoalbuminemia, hiperglobulinemia e

2.9. DIAGNSTICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

2.10. TRATAMIENTO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA

2.12. CITOMETRA DE FLUJO

2.12.2 COMPONENTES DEL CITMETRO DE FLUJO

FOCO DEL LASER

dispersin frontal y lateral, anlisis morfolgico celulares. de las poblaciones

emitida por la poblacin sesgada de linfocitos.

FOTO 2.12.1.- Imagen de los componentes de un citmetro de flujo.

3.1. PLAN DE TRABAJO

3.2. SELECCIN DE LOS ANIMALES

3.4. PLANIFICACIN DE LOS CONTROLES

3.5. RECOLECCIN DE LA SANGRE

3.6. HEMATOLOGA COMPLETA

3.7. BIOQUMICA SANGUNEA

3.8. DIAGNSTICO INMUNOLGICO: INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

3.9. CITOMETRA DE FLUJO

Fig. 3.9.1.- Histograma biparamtrico de FS frente a SS.

Fig. 3.9.2.- Acotamiento de la ventana de linfocitos sobre el histograma morfolgico.

Histograma biparamtrico de CD4 frente a CD3, se incluyen

nicamente las clulas acotadas en la regin de linfocitos.

-/-/+ +/+ -/+

3.10. ANTICUERPOS MONOCLONALES (MAB)

Monoclonal CD3 CD4

Especificidad Linfocitos T Linfocitos T auxiliares Linfocitos T citotxicos Linfocitos B

Clon CA 17.2A12 CA 13.1E4#3

Tabla 3.10.1: Monoclonales empleados en el estudio

Monoclonales CD3 / CD4 CD3 / CD8 CD3 / CD21

Tabla 3.10.2: Panel empleado en el estudio

3.11. POBLACIONES LEUCOCITARIAS E INMUNOFENOTIPO

3.12. ESTUDIO ESTADSTICO

4.1 SEROPREVALENCIA DE EHRLICHIOSIS EN LOS COLECTIVOS ESTUDIADOS