Revista Amaznica de Investigacin Alimentaria, v.2 n 2 p.

35 - 43 (2002)

Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias UNAP, Iquitos Per ISSN

DETERMINACIN DE RESIDUOS DE ANTIBITICOS EN LA LECHE FRESCA QUE CONSUME LA POBLACIN DE CAJAMARCA.

Gladis A. Llanos Cortesana Mdico Veterinario: Docente de la Universidad Nacional de la Amazona Peruana (Tesis para optar el ttulo)

______________________________________________________________
RESUMEN

En el presente trabajo de investigacin, se realiz la recoleccin de muestras de leche fresca en los diferentes lugares de expendio como: mercados, tiendas y algunos fundos de la ciudad de Cajamarca, con la finalidad de determinar la presencia de residuos de antibiticos, utilizando para tal efecto los mtodos cualitativos del cultivo de la cepa Stearothermophilus, y la prueba de difusin estndar Delvotest. Los anlisis se llevaron a cabo en los Laboratorios: Regional del Norte (LABRENOR) y en la Industrias Cajamarquinas Lcteas (INCALAC), del Distrito Baos del Inca, Provincia de Cajamarca. Se trabajaron 216 muestras de leche fresca, entre diciembre 1990 a febrero 1991, los cuales dieron los siguientes resultados. En mercados, de 50 vendedores, se obtuvieron 150 muestras de leche, resultando 31 positivos a la presencia de antibiticos, lo que significa el 20.67% En tiendas y fundos, de 22 vendedores se trabajaron 66 muestras de los cuales 14 fueron positivas lo que hace un 21.21% de positividad a la presencia de antibiticos en la leche fresca. Los resultados en promedio (20.83%) indican un alto nivel de contaminacin con antibiticos de la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca, que es indicativo adems de la inexistencia de un control sanitario en la comercializacin de leche fresca, as como evidencia el uso indiscriminado de antibiticos en vacas en produccin en la campia de Cajamarca y el serio riesgo que significa para la salud de los consumidores en especial de lactantes y nios. Palabras claves: cepas, Bacilus stearothermophilus, residuos de antibitico, delvovest, leche fresca

______________________________________________________________

Gladis Llanos

1. INTRODUCCIN La leche es un producto universal de origen animal que por su alto valor nutritivo y alto grado de digestividad es de suma importancia en la alimentacin humana. Por esta razn el control higinico sanitario debe ser realizado en forma estricta por los organismos competentes. La incidencia de enfermedades en las vacas lecheras requiere de la utilizacin de antibiticos en su tratamiento. Son varios los antibiticos cuyo uso estn ampliamente difundidos en la ganadera lechera, constituyndose en los principales contaminantes de la leche, a la vez que la hace inapto para el consumo humano por contravenir el Reglamento Sanitario de Alimentos. El uso indiscriminado de estos frmacos, especialmente cuando no es aplicado por el profesional Mdico Veterinario, determina su presencia en la leche, con consecuencia grave en la salud del consumidor, como son: sensibilidad, resistencia, alergias, cambios en la flora intestinal (Lewis, 1967). La leche de alta calidad debe poseer las siguientes caractersticas: 1. Estar libre de todo organismo patgeno. 2. Estar libre de sedimientos y materias totales. 3. Tener un ligero sabor dulce, un gusto y aroma suave, estar libre de olores extraos. 4. Cumplir con los requisitos estatales (Judkins et al., 1984). Los hbitos de consumo cotidiano va a estribar el riesgo constante de la poblacin de adquirir la leche fresca o sus derivados contaminados con residuos de antibiticos. Ello conlleva a la imperiosa necesidad de efectuar muestras continuas que faciliten su deteccin e impedir la comercializacin del producto, en vista de que estos frmacos no se metabolizan en su totalidad, ni se inactiva con la industrializacin (Benzunce 1988). El nivel y la duracin de la infusin de antibiticos en la leche depende de numerosos factores, siendo los mas importantes, el

tipo de presentacin de la preparacin de antibiticos, utilizados (solucin acuosa, pomada, preparacin de accin prolongada) y el tipo de administracin (va intramamaria, intrauterina e intramuscular) (Techinical Management Communications 1991). La finalidad del presente trabajo de investigacin es dar a conocer el grado de contaminacin con residuos de antibiticos, de la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca, los que permitir a su vez la toma de decisiones orientada a la preservacin de la Salud Pblica.

2. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Muestras Biolgicas Para la ejecucin del presente trabajo se recolect un total de 216 muestras de leche, proveniente de 72 vendedores que expenden sus productos diariamente en los mercados, en tiendas y algunos fundos, de la ciudad de Cajamarca. As mismo se utiliz muestras de leche libre de antibiticos. 2.2 Materiales de Laboratorio Frascos de 100, 10 y 5 mL limpios y estriles, pipetas graduadas de 1 mL, placas petri, varillas agitadoras, cajas porta placas, canastillas, cilindro porta pipetas, ampollas con Bacilus stearothermophilis, tabletas nutritivas, jeringas dosificadoras, pipetas descartables, pinzas plsticas, fichas de trabajo. 2.3 Equipo Autoclave, estufa, horno elctrico, mechero, refrigerador, incubador seco, bao mara. 2.4 Reactivos y medios de cultivos Dextrosa, triptona, estracto de levadura, agar

36

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

Determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.

para recuento en placa, cepas de B. Stearothermophilus, discos de antibiticos, penicilina de 15,000 U.I. 2.5 Metodologa Se emplearn dos mtodos de laboratorio para la determinacin de residuos de antibiticos en leche fresca. Primer mtodo: cultivando la Cepa de B. Stearothermophilus. Segundo mtodo: empleando la prueba de Difusin Estndar Delvotest. 5.1 Recoleccin y transporte de muestras Se recolectaron muestras de leche empleando un cucharon metalico lmpio.Cada muestra de 50 mL fueron depositados en frascos limpios y estriles. Luego fueron transportados en condiciones ambientales al laboratorio para su procesamiento en forma inmediata. La recoleccin y las pruebas se realizaron en 3 muestreos con intervalo aproximadamente de 15 das en el lapso que dur el trabajo. 2.5.2 Descripcin del mtodo de cultivo de la Cepa B.stearothermophilus a) Preparacin de caldo triptona Triptona Yeast extracto Dextrosa Agua destilada 5,0 g 1,0 g 0,05 g 100 mL

b) Preparacin del agar de recuento en placa Agar de recuento en placa Agua destilada Ajustarse a un pH 8. 2,35 g 100 mL

Estos ingredientes fueron depositados en un matraz limpio y agitando hasta disolverlos, se reparti 5 mL en cada frasco pequeo y se procedi a esterilizarlo a 121C durante 15 minutos a 15 libras de presin. Se dej enfriar y finalmente se conserv en refrigeracin hasta el momento de trabajarlo. c) Realizacin de la prueba Los frascos con el agar de recuento fueron colocados en bao Mara a 45C, una ves disuelto ste se verti en la cantidad de 3 mL, en una placa petri estril, se agreg 1 mL de caldo cultivado con la cepa de B. Stearothermophilus y al final los 2 mL restantes del medio licuado (agar de recuento). La placa con la siembra respectiva, es agitada en forma rotatoria por unos minutos, luego se dej enfriar. La placa con el medio solidificado se invierte para ser divididos en 12 recuadros numerados del 1 al 12), de 1 cm2 cada uno utilizando el lpiz de cera. d) Preparacin de la Solucin de Penicilina a) Matraz I. se coloca 150 mL de agua destilada estril, se agrega una pastilla de penicilina en 15,000 U.I. agitando suavemente hasta disolverlo. b) Matraz II. Se coloca 99 mL, de agua destilada estril, se agrega 1 mL, de la solucin del matraz I. c) Matraz III. Se coloca 49 mL, de leche fresca libre de antibiticos luego se agrega 1 mL de la solucin de matraz II.

Este medio debe tener de un pH 8, luego se reparte 10 mL en frascos pequeos, se esterilizarlo a 121C durante 15 minutos y a 15 libras de presin. Seguidamente los frascos con tiptona fueron inoculados con la cepa de B. Stearothermophilus e incubados a 55C durante 18 h.

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

37

Gladis Llanos

e) Preparacin de los discos Los discos utilizados en la placa, son de celulosa de 4 mm de dimetro. De los discos anteriores se toma con una pinza estril 3 de ellos, estos son embebidos en la solucin del matraz III. Estos vienen a ser discos controles identificados con los nmeros 2, 3 y 9 que corresponden a los recuadros enumerados de la placa con el cultivo. Nueve discos son embebidos en las muestras de leche problema, los que son colocados en el recuadro numerados con los nmeros 1, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12), respectivamente de la placa con cultivo. Esta operacin se realiza usando una pinza estril. f) Lectura de resultados La placa de cultivo que lleva los 12 discos es identificado, se encuba a 55C por dos horas y media. Despus del perodo de incubacin los discos controles nmeros 2, 3 y 9, presentarn un halo transparente que significa inhibicin del desarrollo del bacillus como consecuencia de la presencia de penicilina en el disco. Esta reaccin observaremos en los discos embebidos con la leche problema que contiene trozos de antibiticos. Cuando no se presenta el halo transparente, indica que la leche no contiene antibiticos, y como consiguiente el resultado es negativo. La formacin del halo transparente indica la presencia de antibiticos, cuando mayor es el halo, mayor es la concentracin.

2.5.3 Descripcin de la prueba de difusin Estndar Delvotest. a) Realizacin de la prueba Abrir la tapa de aluminio de las ampollas (que contienen el Bacillus) para cada muestra de leche problema. Colocar con la pinza, una tableta nutritiva en las ampollas. Con ayuda de una micropipeta en condiciones estriles, coger 0.1 mL de muestra de leche y depositar en la ampolla sobre el agar y la tableta. Se colocan las ampollas en el calentador o bao mara a 64C, durante 2 horas. b) Condiciones de conservacin Las ampollas y los frascos que contienen las tabletas nutritivas deben mantenerse a una temperatura de 6 15C. Antes de abrir los frascos de las tabletas nutritivas hay que dejarlos adaptarse a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez que el frasco ha sido abierto, se mantendr a una temperatura de 15 25C, con el fin de evitar la condensacin en el frasco (El tapn de silicato se dejar puesto en el frasco) c) Lectura de los resultados de la prueba Amarillo: No contiene ningn residuo de antibiticos o sulfamidas. Purpureo: Contiene residuos de antibitico o de sulfamidas. Amarillo/purpureo: Resultado dudoso. d) Analisis de datos Se utiliz la estadstica descriptiva, promedio, porcentaje y representacin grfica con diagrama de barras.

38

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

Determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.

4. RESULTADOS En la Tabla 1 se indican los resultados obtenidos en el presente trabajo.

Tabla 1: Determinacin de la presencia de residuos de antibiticos en leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.
Nmeros y porcentajes de muestras positivas N Mercados Tiendas y Fundos Total 150 66 216 31 14 45 % 20,67 21,21 20,83

Lugares de expendio

Muestras analizadas

Tabla 2: Muestras positivas y negativas por muestreo en la determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.

Nmero y porcentaje por muestreo Muestra N Positivas Negativas Total 14 58 72 M1 % 19,4 80,6 100 N 21 51 72 M2 % 29,2 70,8 100 N 10 58 72 M3 % 13,9 86,1 100 45 171 216 20,83 79,17 100 Total Porcentaje

M1

M2

M3

= Muestreo

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

39

Gladis Llanos

Tabla 3: Comparacin de las dos pruebas para determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca

Lugares de expendio

Muestras Analizadas

N de muestras positivas a las pruebas de antibiticos Cepa P. D. St. Delvotest 31 14 45

(%) de Positivo

Mercados Tiendas y fundos Total

150 66 216

31 14 45

20,67 21,21 20,83

P.D.St %

= Prueba de Difusin Standard = Porcentaje

90

80 70

60

Porcentajes

Porcentajes RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

50

40

30 20

10 0

Figura 1: Presencia de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca (mercados, tiendas y fundos)

Figura 2: presencia y ausencia de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca

5. DISCUSIONES Como se puede observar en la Tabla 2, de las 216 muestras de leche analizadas, resultaron positivas, un 20,83% y 79,17% resultaron negativos. El estudio efectuado revela presencia de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.

De un trabajo similar efectuado en cinco rutas de la campia de Cajamarca, Benzunce (1988), encontr 11,5% de positividad a la presencia de residuos de antibiticos en la leche fresca. Esta diferencia podra deberse a las formas de interpretacin de las pruebas de determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca. Nuestro resultado es mucho mas alto, en vista de que en el presente

40

Determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.

trabajo se emplearon mtodos cualitativos, donde se consideran positivos la formacin del halo de inhibicin, y el cambio de color (Delvotest). No obstante al analizar el trabajo de Benzunce (1988) ruta por ruta, se da cuenta que la ruta 73 tiene de positividad un 25.75%, la cual es muy superior a la nuestra. Si se compara los porcentajes de positividad en mercados 20.67%, tiendas y fundos con 21.21%, tales resultados tienen similitud, lo que es indicativo de que el nivel de contaminacin es indiferente a los mencionados lugares, esto indica que la mayora de expendedores son pequeos ganaderos o revendedores, los mismos que no cuentan con asesoramiento tcnico y administran a los frmacos indiscriminadamente en forma emprica. Nuestro resultado difiere de los obtenidos por Pozo et al., (1987), quienes trabajaron en dos pasteurizadoras de la ciudad y una provincia de La Habana (Cuba); all encontraron 49.43% y 36.11% de positividad a la presencia de residuos a antibiticos en leche fresca, resultados muy superiores a los nuestros. Esto posiblemente se debe a uso indiscriminado de antibiticos en la ganadera lechera cubana. Encontramos tambin difrencias con los resultados obtenidos por Pozo et al., (1986), en Cuba en donde 12 vaqueras de la periferia de La Habana, el 17,5% de las muestras estudiadas resultaron positivas. Esta cercana coincidencia, pensamos se deba a que en su estudio se efectu la determinacin de residuos de Estreptomicina, empleando para tal efecto un mtodo cuantitativo. El nivel de contaminacin de leche fresca con residuos de antibiticos fue 20,83% obtenidos en este trabajo, resulta perjudicial para la salud humana, as lo corrobora Veisseire (1988), quien afirma que la ingestin de leche con penicilina puede provocar una antibioresistencia con infecciones ulteriores rebeldes en los lactantes que la ingieren. De igual modo, se encuentran marcadas

diferencias con los reportes de Technical Management Communications (1991). En Grecia y Dinamarca donde 2,0 y 0,0035% de muestras de leche son positivas a antibiticos. Estos resultados son inferiores a los nuestros debindose, entre otros factores, al control estricto y a las condenas y/ o castigos impuestos a la leche contaminada en dichos pases. As mismo los criterios de rechazo y/o condena de la leche con antibiticos en pases como Alemania es considerada no detectable, Blgica, la penicilina menos a 0,004 mg/1mL, Espaa rechaza con 0,004 mg/1mL, Francia desclasificacin de la leche, se corrobora esta forma y las condiciones de calidad requeridas, debido a los bajos niveles de contaminacin.

6. CONCLUSIONES La determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin Cajamarquina, no lleva a las siguientes conclusiones: De las 216 muestras de leche fresca analizadas, 4.5 resultaron positivas a la presencia de residuos de antibiticos alcanzando un porcentaje 20,83% de positividad. No hay diferencia en la presencia de residuos antibiticos en la leche fresca que se comercializa en los diferentes lugares de expendio (20,67% en mercados y 21,21% en tiendas y fundos). La contaminacin encontrada en la leche que consume diariamente la poblacin de Cajamarca, no responde a una de las condiciones del Reglamento Sanitario de Alimentos (1986), en donde dice que la leche cruda que se expende no deber contener sustancias conservadoras (antispticos, antibiticos, plaguicidas u otros). No existe un control sanitario para determinar la presencia de antibiticos en leche fresca, por parte de las autoridades pertinentes, pues ellas son las responsables de hacer cumplir lo estipulado por el Cdigo

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

41

Gladis Llanos

Sanitario. Con los resultados del presente trabajo, podemos decir que existe un uso indiscriminado de los antibiticos en el tratamiento de las vacas lecheras por tcnicos, ganaderos y no son controlados especialmente cuando esta leche va a la comercializacin. La frecuencia de residuos antibiticos encontrados, en la leche fresca, se ha incrementado en un 9,33% con respecto al estudio realizado tres aos atrs (Benzunce, 1988). Los mtodos empleados para la determinacin de residuos de antibiticos en muestras de leche fresca, ofrecen una alta sensibilidad, existe sin embargo diferencia nicamente en la rapidez de la prueba de difusin Estdar Delvotest.

residuos de antibiticos, de uso comn en la campia de Cajamarca. Para garantizar la calidad sanitaria de la leche resulta indispensable, entre otras cosas, disponer de programas de muestreo adecuados y de mtodos tanto cualitativos como cuantitativos que permitan detectar los diferentes antibiticos. Deben idearse mtodos rpidos, sencillos y precisos, de bajo costo para detectar residuos de antibiticos en la leche. As mismo, un sistema de marcado o coloreado para los diferentes antibiticos de uso veterinario. Recomendamos la utilizacin de la Prueba de Difusin Standar Delvotest, para la determinacin de residuos antibiticos en leche fresca, debido a su rapidez, fcil de realizacin e interpretacin.

7. RECOMENDACIONES 8. BIBLIOGRAFA Realizar un control sanitario estricto y severo de la leche, condenndose aquella que resulte contaminada con antibiticos, por atentar contra la salud pblica. Educar y difundir a travs de campaas educativas, por parte de las personas que intervienen en el proceso de produccin lechera (profesionales, tcnicos, ganaderos u otros) exigiendo con rigor el cumplimiento del perodo de eliminacin del antibitico (72 horas) en las vacas tratadas. La Municipalidad debe establecer un programa, a mediano y largo plazo, que permita el expendio exclusivo de la leche pasteurizada a la poblacin, eliminndose paulatinamente el porongueo, como medida de higiene. Se debe empadronar a todos los proveedores y vendedores de leche, con la finalidad de orientar sobre el riesgo y peligro de la contaminacin por antibiticos. El estudio efectuado revel la presencia de penicilina en leche fresca, tales resultados nos permite recomendar que se debe continuar con trabajos de determinacin de Benzunce L. Determinacin de antibiticos en la Campia de Cajamarca. Universidad Nacional de Cajamarca. Tesis 1988 Pag.48. (1988) Blood y Herdenson Medicina Veterinaria. Nueva Editorial Interamericana. Quinta Edicin. Mxico. (1986) Centro Regional de Ayuda Tsnica (AID) Mxico . (1967) Comit Mixto FAO/OMS de Expertos de Higiene de la Leche: Tercer Informe. FAO: Estudios Agropecuarios N 83, Organizacin Mundial de la Salud. Serie de informes tcnicos N 453. Charles A. Ciencias de la leche. Editorial Esparza, Segunda Edicin. Espaa. (1980) Fernandez, A. Calidad higinica de la leche cruda. Tomo I, Centro Tecnolgico de la leche. Instituto Nacional de Capacitacin Profesional. Valdivia Chile, 1980, Pag. 197 (1980) Fuentes V. Farmacologa y teraputica Veterinaria, Editorial UTEA, Segunda Edicin

42

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

Determinacin de residuos de antibiticos en la leche fresca que consume la poblacin de Cajamarca.

Mxico. (1986) Judkins N.; F y Keener H. La leche, su produccin y sus procesos industriales, Editorial Continental, 2da. Edicin. (1984) Lampert L. M. Modern. Dairy Products, Edition Chemical Publis Hing Company. INC New Cork USA. Pag. 437. (1975) Lewis, And. A. K. Milk Production and Control, London Founth Edition. (1967) Manual Merk. Merck de Veterinaria, EEUU Editorial Mek Co Rahway (1970) Meyer Jones L. Farmacologa y teraputica Veterinaria, Editorial UTEA, Primera Edicin Mxico. (1980) Ministerio de Salud. Cdigo Sanitario de Alimentos D.S.N. 0014-86 S.A. MILK PRODUCER.M.M.B.OF ENGLAND AND WALES SURREY, England. Pag. 52 (1990) Pozo del E.; Rivero L.; Garca. M. Presencia de penicilina, Estreptomicina y Tetraciclina en leche fresca procedente

de dos plantas pasteurizadoras de la Provincia de La Habana. Rvta. Cub. Cienc. Vet Cuba Pag. 27 - 30. (1987) Pozo del E.; Rivero L.; Garca. M. Determinacin de residuos de Estreptomicina en muestras de leche, proveniente de algunas vaqueras de la Periferia de La Habana. Rvta. Cub. Cienc. Vet Cuba Pag. 145-148. (1986) Shmidt G. Biologa de la lactancia. Editorial Acribia. Segunda Edicin. Espaa. (1971) Technical Management Communications. Communications, Desarrollo de la Reunin sobre calidad de la leche fresca Ca. Nestl Limitada Verey Suiza Pag 56 (1991) Walter Col. Introduccin a la microbiologa. Editorial Continental. Segunda Edicin. Mxico. (1980) Veisseyre Roger. Lactancia Tcnica Editorial Acribia. Segunda Edicin Espaa. (1980).

RAIA, v,2, n 2, p.35 - 43 (2002)

43