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Abstract

Platelets are an important component of blood that help maintain haemostasis. They are derived from large bone marrow residents, called megakaryocytes, which release tubular processes into the blood stream that fragment and eventually form 2 to 3 μm sized enucleate discoid platelets. Activation of platelets is caused by factors released into the bloodstream upon endothelial damage, to which they respond by undergoing a distinct order of shape transition, from discoid, to spheroid, to dendritic, and finally an extended morphology, required to form a clot. Despite the simple architecture, platelets are able to drastically alter their morphology owing to the repertoire of cytoskeletal proteins they express. Microtubules, which form a bundle running along the platelet periphery, are known to be important for maintaining the resting discoid morphology of a platelet, while actin is heavily implicated in the later stages that require adhesion. During the first step of platelet activation, the microtubule marginal band undergoes coiling, while the platelet changes from a disc to a sphere shape. Both actin and microtubules are implicated in this process but the mechanics of the process are not clearly understood.

The following project has been carried out to explore the role of cytoskeletal mechanics in triggering activation of a platelet. A combination of experimental and analysis techniques was used to quantitatively assess mechanical properties of the system in a resting state, as well as during activation, by direct measurement of the marginal band morphology. The structure and composition of the marginal band was analyzed using electron tomography, which provided detailed information on individual microtubules. Super-resolution microscopy was also used to visualize the overall morphology and composition of the marginal band. With this data we could infer the mechanical properties of the resting marginal band in fixed platelets. To analyze the dynamics of coiling process, live cell fluorescence microscopy was used in combination with a microfluidic system. With this setup, changes in the marginal band shape could be followed in response to treatment with agonists or inhibitors that affect the cytoskeleton, that is, a process analogous to mechanical perturbations of the platelet. A large population of platelets was also analyzed to infer the intrinsic variations mechanical properties of the marginal band. The Cytosim software was used to set up simulation of marginal band coiling.

By using a multifaceted approach, we were able to get novel insight into the mechanics of marginal band coiling. Firstly, we showed that length distribution of microtubules in a set of resting platelet marginal bands follows an exponential distribution. The sum of all polymerized microtubule length was found to be 101.84µm ±12.63 per platelet. The typical distance between two microtubules was found to be 30nm in a tightly packed marginal band. Secondly, by measuring the dynamics of coiling, we could infer that the marginal band behaves like a visco-elastic ring upon activation with ADP. This response was found to be dependent on actin, while thrombin activation elicited a response that manifested in an actin independent manner. Analysis of large population of platelets showed that the tubulin intensity scales as a power of five to the platelet radius, indicating a possible enrichment of tubulin in platelets. Finally, our data suggests that platelets with longer marginal bands have a higher propensity to coil.

Although some of our results need to be followed up with further investigations, this study provides an experimental and analysis framework that allows us to quantitatively analyze platelet cytoskeleton morphology with an aim to understand the mechanics of platelet activation in healthy and disease states.

Translation of abstract (German)

Thrombozyten sind ein wichtiger Blutbestandteil, durch ihre Rolle in der Aufrechterhaltung der Hämostase. Sie entstehen aus großen, im Knochenmark befindlichen Zellen, sogenannten Megakaryozyten, welche schlauchförmige Fortsätze in die Blutbahn entsenden. Diese Fortsätze fragmentieren und bilden im Ergebnis die 2 bis 3 µm großen, kernfreien diskussförmigen Thrombozyten. Die Aktivierung der Thrombozyten erfolgt durch Signalstoffe, die nach Verletzung des Epithels in die Blutbahn freigesetzt werden, und verursacht eine Reihe spezifischer Formveränderungen der Thrombozyten von diskussförmig zu kugelförmig zu dendritisch und endet in einer ausgebreiteten Form, welche einer Voraussetzung für die Bildung eines Blutgerinsels darstellt. Trotz ihrer einfachen Architektur ist es den Thrombozyten durch ein Repertoire an Zytoskelettproteinen möglich ihre Morphologie drastisch zu verändern. Microtubuli, welche ein Bündel entlang der Thrombozyten-Periphärie bilden, spielen eine entscheidende Rolle in der Erhaltung der ruhenden Diskusform, während Aktin hauptsächlich in den späteren Stadien bei der Adhäsion wichtig ist. Im ersten Schritt der Thromboyztenaktivierung windet sich das aus Mikrotubuli bestehende Randband und es kommt zu einer Formveränderung des Thrombozyten von diskussförmig zu kugelförmig. Sowohl Aktin als auch Mikrotubuli sind in diesem Prozess von Bedeutung, aber die Mechanik der Formveränderung ist nicht gut erforscht.

Das im folgenden beschriebene Projekt wurde durchgeführt, um die Rolle der Mechanik des Zytoskeletts während der Aktivierung der Thrombozyten zu erforschen. Eine Kombination aus experimentellen und analytischen Techniken wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften des Systems, sowohl im Ruhezustand, als auch während der Aktivierung, durch direkte Vermessung der Morphologie des Randbandes quantitiativ zu ermitteln. Die Struktur und Zusammensetzung des Randbandes wurden mit Hilfe von Elektronentomographie ermittelt, wodurch detailierte Informationen über einzelne Mikrotubuli zugänglich wurden. Hoch auflösende Superresolutionsmikroskopie wurde ebenfalls verwendet um die Gesamtmorphologie und Zusammensetzung des Ranbandes zu erfassen. Mit Hilfe dieser Daten konnten die mechanischen Eigenschaften des ruhenden Randbandes in fixierten Thrombozyten erschlossen werden. Die Dynamik des Windungsprozesses des Randbandes wurde unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen in einem Mikrofluidik-System analysiert.

Mit diesem System können Veränderung der Form des Randbandes als Folge einer Behandlung mit Agonisten oder Inhibitorien, welche das Zytoskelett in einem Prozess analog zur mechanischen Störung der Thrombozyten beeinflussen, verfolgt werden. Eine große Anzahl von Thrombozyten wurde analysiert um die intrinsische Variabilität der mechanischen Eigenschaften des Randbandes zu ermitteln. Die Software Cytosim wurde verwendet um den Windungsprozess des Randbandes zu simulieren.

Durch diese vielseitige Herangehensweise ist es uns möglich neue Erkenntnisse über die Mechanik des Windungsprozess des Randbandes zu gewinnen. Erstens können wir beweisen, dass die Längen der Mikrotubuli eines ruhenden Thrombozyten exponentiell verteilt sind. Die Summe aller Mikrotubuli beträgt 101.84µm ±12.63 je Thrombozyt. Der normale Abstand zwischen zwei Mikrotubuli beträgt im sehr eng gepackten Randband 30 nm. Zweitens können wir durch die Messung der Dynamik des Windungsprozess erschließen, dass sich das Randband bei Aktivierung mit ADP wie ein visco-elestiascher Ring verhält. Diese Reaktion ist von Aktin abhängig, während eine Aktivierung mittels Thrombin aktinunabhängig ist. Die Analyse einer großen Anzahl von Thrombozyten zeigt, dass sich die Intensität des Tubulin-Signales maßstäblich zum Radius des Thrombozyten zur fünften Potenz verhält, was auf eine mögliche Anreicherung von Tubulin in Thrombozyten hinweißt. Schließlich suggerieren unsere Daten das Thrombozyten mit einem längeren Randband eine höhere Tendenz zum Windungsprozess aufweisen.

Obwohl einige unserer Ergebnisse durch weitere Experimente vervollständigt werden müssen, gibt diese Untersuchung einen experimentellen und analytischen Rahmen welcher es uns erlaubt die Morphologie des Thrombozytenzytoskellets quantitativ zu analysieren, mit dem Ziel die Mechanik der Thrombozytenaktivierung in gesunden wie auch im Krankheitszustand zu verstehen.