Santa Cruz startte zijn carrière bij Olimpia Asuncion, waar hij in 1997 als 15-jarige zijn debuut maakte. Hij eindigde zijn carrière bij de club, met een totaal van
13 doelpunten in 24 Liga Paraguaya wedstrijden. Op het Wereldkampioenschap voetbal onder 20 - 1999 maakte hij drie goals in vier wedstrijden voor Paraguay,
alvorens hij debuuterde voor het Paraguayaans voetbalelftal, op de Copa América 1999. Ook daar scoorde hij drie goals in vier wedstrijden.
Na de Copa América, werd hij direct overgenomen door Bundesliga club, Bayern München. Voor een transfersom van 5 miljoen euro. In de competitie scoorde hij
in zijn eerste seizoen 5 goals in 28 wedstrijden. Door hevige concurrentie van zijn teamgenoten, Giovane Élber, Roy Makaay en Claudio Pizarro, en zijn vele blessureleed
kwam hij niet verder dan 155 wedstrijden in 8 seizoenen.
Hij verruilde in december 2014 Málaga CF voor Cruz Azul, dat circa €2.000.000,- voor hem betaalde.[1] Cruz Azul verhuurde Santa Cruz in augustus 2015 voor een jaar aan Málaga CF. In 2016 keerde hij terug bij Olimpia Asunción.
Santa Cruz is momenteel topscorer aller tijden, met 32 goals, van het Paraguayaanse nationale team. En de zesde speler, die 100 interlands achter zijn naam heeft staan.
Hij speelde voor het nationale team, op het Wereldkampioenschap voetbal 2002, 2006 en 2010. Ook deed hij mee aan de Copa America 1999, 2007 en 2011.
In het 2011 eindigde het team als tweede.
Santa Cruz is meervoudig international voor Paraguay. In 1999 nam hij met het jeugdelftal deel aan het WK Onder-20. Santa Cruz scoorde driemaal op dit toernooi en zijn goede prestaties leverden hem een plaats op in het A-elftal van Paraguay voor de Copa América van 1999. Hij maakte zijn debuut op 28 april1999 in de vriendschappelijke thuiswedstrijd tegen Mexico (2-1) in Pedro Juan Caballero. In 2002, 2006 en 2010 speelde Santa Cruz met Paraguay op het WK. Na het Wereldkampioenschap 2010 in Zuid-Afrika liet Roque Santa Cruz weten dat dit zijn laatste WK was.