מיצוי נוגדני של כרומטין
מיצוי נוגדני של כרומטין (באנגלית: Chromatin Immunoprecipitation; בראשי תיבות: ChIP) הוא שיטה המיישמת מיצוי נוגדני הבוחנת אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעין בתאים. מטרת השיטה היא לזהות חלבונים מסוימים הבאים למגע עם אתרים מסוימים בגנום של התא, כגון פקטורי שעתוק הבאים במגע עם פרומוטורים, או אתרי קישור DNA אחרים, והגדרה של ציסטרומים (cistromes) [1] . כמו כן מיצוי נוגדני של כרומטין משמש לזיהוי אתרים ספציפיים בגנום שבהם בוצעו עריכות היסטונים (histone remodeling), ומציינים את אתרי המטרה של חלבונים עורכי היסטונים.[2]
בקצרה, השיטה מתבצעת כדלהלן: חלבונים וכרומטין נמצאים בקישור זמני במיצוי תאים, גדילי הDNA נחתכים ותלכיד החלבון – DNA הקשורים לחלבונים ספציפיים מושקעים על ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים להם, גדילי DNA אלו מנוקים ונבדקים ולעתים מרוצפים. ניתן להסיק שרצפי DNA אלו באים במגע עם החלבון הנבדק בתוך התא (in vivo).
מיצוי נוגדני של כרומטין טיפוסי
ישנן שתי שיטות עיקריות של מיצוי נוגדני של כרומטין, והשלב השונה ביניהן הוא הכנת מיצוי התאים וצורת חיתוך גדילי הDNA. הראשונה משתמשת בטכניקת הצלבה הפיכה וחיתוך גדילי הDNA באמצעות סונקציה ונקראת מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב ( (XChIP. בעוד השיטה השנייה אינה מבצעת הצלבה ובה חיתוך הDNA מבוצע באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוס.
מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב (XChIP)
מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב היא שיטה למפות אתרי קישור של פקטורי שעתוק, וחלבונים קושרי כרומטין אחרים על גבי הDNA. חומרי המוצא שלו הוא מיצוי תאים שעבר קיבוע הצלבה הפיך. קיבוע זה נעשה באמצעות פורמלדהיד[3] או קרינה אולטרה סגולית (UV)[4].
תיאור השיטה
מצוי תאים עובר תהליך של קיבוע הצלבה הפיכה באחת השיטות המוזכרות לעיל. לאחר קיבוע ההצלבה גדילי הDNA מפורקים בדרך כלל על ידי סונקציה, תהליך המותיר שברים באורך של בין 300-1000 בסיסים חנקניים. שברים באורכים של בין 400-500 בסיסים מתאימים ביותר לזיהוי מוטיבים של קישור מאחר שהם באורך קורלטיבי למספר נוקלאוזומים בודד ומאפשרים הסקה של קישור על פי מבנה מרחבי. שאר מיצוי התא מופרד מהתמיסה בהשקעה, ותלכידי חלבון-DNA מושקעים בהשקעה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון הנבדק. נוגדנים אלו בדרך כלל מחוברים לחומר המאפשר הפרדה פשוטה, כגון : אגרוז, ספרוז או חלקיקים מגנטיים. התלכיד נוגדני המושקע (ז"א, החלקיק-הנוגדן-חלבון המטרה-הDNA) נאספים ונשטפים על מנת להפריד כרומטין שנקשר בצורה לא ספציפית. תלכידים אלו מעוכלים בפרוטאז K , על מנת לשחרר את הDNA להמשך אבחון. גרסאות מתויגות של החלבון הנבדק או ביוטינילציה [5] של החלבון יכולים לשמש במקום נוגדנים ספציפיים לחלבון ולאפשר להפרידו ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה משעולה לייצר נוגדן חד שבטי. ניתן לזהות את גדיל הDNA שהופרד מהתלכיד במספר שיטות, כגון : ריאקציית PCR , שבב, ריצוף מולקולרי, ריצוף מהיר-עיבוד.
מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP)
שיטה זו בעיקר משמשת למיפוי אתרי מטרה של חלבונים עורכי היסטונים. חומר המוצא הוא מיצוי תאים טבעי ללא טיפולים. הDNA במצבו הטבעי מלופף סביב ההיסטונים ליצירת הנוקלוזומים. חותכים את הDNA באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוס, אשר חותכים DNA בין הנוקלאוזומים ומשאירים את הנוקלוזומים שלמים, חלקי הDNA נעים באורכים בין 200 בסיסים (נוקלואוזם בודד), עד לכ1000 בסיסים (חמישה נוקלוזומים). שאר הטכניקה זהה למה שתואר במיצוי מוצלב (XChIP) , בנוגע לניקוי, מיצוי, הפקה ואנליזה של DNA מופרד.
השוואה בין שתי שיטות המיצוי
היתרון העיקרי בתנאים טבעיים הוא הספציפיות של הנוגדנים. חשוב להבין שנוגדנים הספציפיים להיסטונים ערוכים, הם ספציפיים לעריכות קטנות בחלבון, בעוד לאחר הקיבוע המוצלב בפורמלדהיד הקיבוע פוגע במבנה החלבונים ופוגע במבנה של אתרי המטרה של הנוגדנים בחלבונים אלו. זה גם מסביר את היעילות הנמוכה של מיצוי נוגדנים בקיבוע מוצלב לעומת בתנאים טבעיים. אך המטרות של שתי השיטות הן שונות כך שהיתרונות של שיטה אחת על האחרת הם יחסיים. קיבוע מוצלב משמש לזיהוי אתרי פעילות של פקטורי שעתוק וחלבונים קושרי כרומטין אחרים, בעוד מיצוי בתנאים טבעיים בוחן עריכות להיסטונים (ראה טבלה 1).
טבלה 1 הייתרונות והחסרונות של מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב ובתנאים טבעיים
| מיצוי בקיבוע מוצלב | מיצוי בתנאים טבעיים | |
|---|---|---|
| יתרונות |
|
|
| חסרונות |
|
|
ההיסטוריה של טכניקות מיצוי נוגדני של כרומטין
בשנת 1984 ג'ון ליס (John T. Lis) וחוקר במעבדתו דוד גילמור (David Gilmour), השתמשו בקרינה אולטרה סגולית על מנת לעשות קיבוע מוצלב של חלבונים לDNA בתאי חיידקים חיים. לאחר מיצוי תכולת התאים הם השקיעו באמצעות נוגדנים כנגד RNA פולימראז חיידקי, את הDNA שהושקע הם בדקו עם גלאים לאזורים שונים בגנום החיידק כדי לזהות פיזור וצפיפות של RNA פולימראז באזורי הגנים השונים. ב-1985 הם השתמשו באותה השיטה רק הפעם לבדיקת RNA פולימראז 2 באוקריוים בתאי זבוב הפירות, ובדיקה של גלאים של גני עקת חום. עבודות אלו מוגדרות כפריצות הדרך של עבודה עם מיצוי נוגדני של כרומטין.[6][7] מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב שופר ופותח על ידי אלקסנדר ורשבסקי (Alexander Varshavsky) ושותפים, שבדקו את הנוכחות של היסטון H4 על גני עקת חום, במקום להשתמש בקרינה אולטרה סגולית הם השתמשו בפורמלדהיד על מנת לקבע[8][9]. טכניקות אלו שופרו ופותחו מאוד מאז[10]. מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP) תואר לראשונה על ידי מעבדתו של הביס (Hebbes) ב-1988[11], וגם שיטה זו פותח ושופרה רבות לשימוש נפוץ[12]. שיטת המיצוי המקורית לוקחת כ 4-5 ימים ודורשת כ106- 107 תאים. שיטות חדשות מאפשרות לבצע את התהליך תוך יום אחד ודורשות הרבה פחות תאים כ100-1000.
מיצוי נוגדני של כרומטין באמצעות נשא - (Carrier ChIP (CChIP
שיטה זו יכולה להיות יעילה גם בשימוש של רק כ100 תאים, על ידי הוספה של תאי זבוב פירות (Drosophila) ככרומטין נשא, ובכך להפחית את אובדן הכרומטין הנבדק בהשקעה, על ידי הטיית שיווי המשקל של ההשקעה. אך כמובן הוא דורש גלאים ספציפיים שיוכלו לזהות את הDNA הנבדק על גבי הרקע של הכרומטין הנשא, שיטה זו לוקחת כיומיים שלושה.[13]
מיצוי מהיר נוגדני של כרומטין - (Fast ChIP (qChIP
שיטה זו מאיצה את התהליך על ידי האצה של שני שלבים במהלך המיצוי : 1. אמבט אולטראסוני מאיץ את תהליך הקשירה של הנוגדנים לחלבוני המטרה ובכך מאיץ את תהליך ההשקעה. 2. פרוטוקול מבוסס שרף (Chelex-100) להפרדת DNA מקצר את הפקת הDNA והיפוך הקיבוע המוצלב. הניצולת של תהליך זה אינה גבוהה ולכן צריך תמצית תאים המופקת מכמות תאים רבה (כ106~ 107)[14][15]. ניתן לייצר באמצעות שיטה זו עד 24 מקטעי DNA מוכנים לPCR בתוך 5 שעות, שיטה זו מאפשרת בדיקה של פעילות מספר פקטורי שעתוק בו זמנית ולהסתכל על שינויים באוכלוסיות תאים לאורך זמן[16].
מיצוי נוגדני של כרומטין מהיר וכמותי (Quick and quantitative ChIP (Q2ChIP
שיטה זו משתמשת בחומר מוצא מיצוי של 105 תאים, ומאפשרת בדיקה של 1000 היסטונים או 100 פקטורי שעתוק. בשיטה זו דוגמאות כרומטין רבות יכולות להיות מוכנות במקביל ולהיבדק במקביל. אורך הבדיקה הוא כיום[17] .
מיקרו מיצוי נוגדני של כרומטין (MicroChIP (µChIP
שיטה זו בדרך כלל משתמשת במיצוי מכ1000 תאים, ומאפשרת לבצע 8 תהליכי מיצוי ללא שימוש בנשא. שיטה זה יכולה להיעשות גם ממיצוי 100 תאים בלבד אך תהליך מיצוי בודד. כמוכן ניתן להשתמש ברקמת ביופסיה של 1 ממ3 . שיטה זו מבוצעת תוך יום אחד[18][19].
מיצוי נוגדני של כרומטין במיקרו-פלטה - Matrix ChIP
שיטה זו מאפשרת רמה גבוהה יותר של עבוד ומפשטת את התהליך, כל תהליך מבוצע במיקרו-פלטה ומאפשר את הפוטנציאל של אוטומציה. בתהליך זה ניתן לעשות 96 מיצויים במקביל, וכל התהליך לוקח יום בודד[20].
מיצוי נוגדני של כרומטין נעשה גם על גנום שלם באמצעות טכנולוגיית "מיצוי נוגדני של כרומטין על שבב" (ChIP-on-chip) או טכנולוגיית ריצוף DNA חדשניות (Chip-Sequencing). כמוכן ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקת "ריצוף קצוות מזווגים מתויגים" (paired end tags sequencing) בשיטה הנקראת "בחינת אינטראקציות כרומטין באמצעות ריצוף קצוות מזווגים" Chromatin Interaction Analysis using Paired End Tag sequencing (ChIA-PET), שיטה שנועדה לבחינה של אינטראקציות של כרומטין במבנה מרחבי של יצורים אוקריוטים[21][22][23].
הגבלות של מיצוי נוגדני של כרומטין
- בדיקה רחבת טווח באמצעות מיצוי נוגדני של כרומטין היא מאתגרת. מאחר שצריך ליצור נוגדן ספציפי לכל פקטור שעתוק, או אורגניזם מהונדס המכיל פקטורי שעתוק מתויגים.
- חקר דוגמאות ביטוי בשיטה זו מהווה בעיה מאחר שישנם שינויים בביטוי בתאים מסוימים בתנאים שונים לחלונות זמן מאוד קטנים.
- שיטות אלו מתקשות בהבדלה בין איזופומים שונים של פקטורי שעתוק.
ראו גם
- RIP-Chip שיטה דומה המנתחת אינטראקציות בין חלבונים ל-RNA
- DamID שיטה חלופית שאינה דורשת ייצור של נוגדנים ספציפיים
- ChIP-exo שיטה המוסיפה נוקלאזות לתהליך ומקטינה את תוצרי ההפקה למקטעים הקושרים.
- ChIP-on-chip שילוב של שיטת המיצוי עם טכנולוגיית המעבדה על שבב.
קישורים חיצוניים
הערות שוליים
- ^ Liu, Tao.; Ortiz, Jorge A. (2011). "Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies". Genome Biology. 12 (8): R83. doi:0.1186/gb-2011-12-8-r83. PMID 21859476.
{{cite journal}}: יש לבדוק את|doi=(עזרה) - ^ Collas, Philippe. (2010). "The Current State of Chromatin Immunoprecipitation". Molecular Biotechnology. 45 (1): 87–100. doi:10.1007/s12033-009-9239-8. PMID 20077036.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה) - ^ Jackson, Vaughn (1978). "Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent". Cell. 15 (3): 945–54. doi:10.1016/0092-8674(78)90278-7. PMID 569554. נבדק ב-2010-03-13.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה) - ^ Gilmour DS, Lis JT (1985). "In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster". Molecular and Cellular Biology. 5 (8): 2009–18. PMC 366919. PMID 3018544. נבדק ב-2010-03-13.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה) - ^ Viens A et al. "Use of protein biotinylation in vivo for chromatin immunoprecipitation" (2004) Analytical Biochemistry 325(1):68-76 [1]
- ^ [2]
- ^ [3]
- ^ Varshavsky A (2008). "Discovery of cellular regulation by protein degradation". Journal of Biological Chemistry. 283 (50): 34469–89. doi:10.1074/jbc.X800009200. PMID 18708349. נבדק ב-2010-03-06.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה) - ^ Solomon, Mark J; Larsen Pamela L; Varshavsky, Alexander. (1988). "Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene". Cell. 53 (6): 937–47. doi:10.1016/S0092-8674(88)90469-2. PMID 2454748. נבדק ב-2010-03-06.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Orlando V (2000). "Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation". Trends in Biochemical Sciences. 25 (3): 99–104. doi:10.1016/S0968-0004(99)01535-2. PMID 10694875. נבדק ב-2010-03-14.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה) - ^ Hebbes, Tim R; Thorne, Alan W; Crane-Robinson C. (1988). "A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin". The EMBO Journal. 7 (5): 1395–402. PMC 458389. PMID 3409869.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה); פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ O'Neill, Laura P; Turner, Bryan M (2003). "Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP". Methods (San Diego, Calif.). 31 (1): 76–82. doi:10.1016/S1046-2023(03)00090-2. PMID 12893176. נבדק ב-2010-03-14.
{{cite journal}}: פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ O'Neill, Laura P; VerMilyea, Matthew D; Turner, Bryan M (2006). "Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations". Nature Genetics. 38 (7): 835–41. doi:10.1038/ng1820. PMID 16767102.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה); פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Sova, Pavel; Bomsztyk, Karol (2006). "Fast chromatin immunoprecipitation assay". Nucleic Acids Research. 34 (1): e2. doi:10.1093/nar/gnj004. PMC 1325209. PMID 16397291.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol (2006). "Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method". Nature Protocols. 1 (1): 179–85. doi:10.1038/nprot.2006.27. PMID 17406230.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Nelson J, Denisenko O, Bomsztyk K (2009). "The fast chromatin immunoprecipitation method". Methods in Molecular Biology. 567: 45–57. doi:10.1007/978-1-60327-414-2_3. PMID 19588084.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2007). "Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells". Stem Cells. 25 (4): 1037–46. doi:10.1634/stemcells.2006-0430. PMID 17272500.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה); פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2008). "A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP)". Nature Protocols. 3 (6): 1032–45. doi:10.1038/nprot.2008.68. PMID 18536650.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe (2009). "MicroChIP: chromatin immunoprecipitation for small cell numbers". Methods in Molecular Biology. 567: 59–74. doi:10.1007/978-1-60327-414-2_4. PMID 19588085.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Flanagin, Steve ; Nelson, Joel D; Castner, David G; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol (2008). "Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events". Nucleic Acids Research. 36 (3): e17. doi:10.1093/nar/gkn001. PMC 2241906. PMID 18203739.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה); פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Fullwood, Melissa J; Han, Yuyuan; Wei, Chia-Lin; Ruan, Xiaoan; Ruan, Yijun (2010). "Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing". Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21: Unit 21.15.1–25. doi:10.1002/0471142727.mb2115s89. PMID 20069536.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה); פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ Li, Guoliang; Fullwood, Melissa J; Xu, Han; Mulawadi, Fabianus Hendriyan; Velkov, Stoyan; Vega, Vinsensius; Ariyaratne, Pramila Nuwantha; Mohamed, Yusoff Bin; Ooi, Hong-Sain; Tennakoon, Chandana; Wei, Chia-Lin; Ruan, Yijun; Sung, Wing-Kin (2010). "ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing". Genome Biology. 11 (2): R22. doi:10.1186/gb-2010-11-2-r22. PMC 2872882. PMID 20181287.
{{cite journal}}:|access-date=מצריך גם|url=(עזרה); פרמטר לא ידוע|month=(עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) - ^ "ChIA-PET: Novel Method For 3-D Whole Genome Mapping Research". ScienceDaily. Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore. 2009-11-08. נבדק ב-14 במרץ 2010.
{{cite web}}: (עזרה)