Bromelaïna
La bromelaïna o bromelina és una proteasa d’origen vegetal procedent de la planta de la pinya tropical (Ananas comosus), que s’utilitza àmpliament en la indústria alimentària i de begudes (com a potenciador del sabor, per estovar la carn o per solubilitzar agregats proteics), així com en la indústria farmacèutica, biomèdica i cosmètica.[2][3]
El terme bromelaïna també fa referència a l’extracte aquós cru de la tija i el fruit de la pinya, que és una mescla d'enzims proteolítics (bromelaïna de la tija, de la fruita i ananaïna) i d’altres tipus (fosfatases, glucosidases, peroxidases, cel·lulases i glicoproteïnes).[2]
Origen
Aquest enzim està present de forma abundant a les diverses parts de la planta de la pinya (Ananas comosus), tot i que envers les fulles, la corona i l’escorça destaca la seva producció en la tija i el fruit (sobre tot en el cor). De fet aquestes dues fraccions permeten distingir-ne dos tipus: la bromelaïna de la fruita i la de la tija. Aquesta última té una major concentració de l’enzim en comparació al fruit i al considerar-se un subproducte del sector de transformació de la pinya, és una font més econòmica d’on extreure’l, motius pels quals se’n fa un ús més ampli a la indústria.[2]
Classificació i nomenclatura enzimàtica
| Identificadors | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Número EC | 3.4.22.32 | ||||||||
| Bases de dades | |||||||||
| IntEnz | IntEnz view | ||||||||
| BRENDA | BRENDA entry | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme view | ||||||||
| KEGG | KEGG entry | ||||||||
| MetaCyc | metabolic pathway | ||||||||
| PRIAM | profile | ||||||||
| Estructures PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum | ||||||||
| |||||||||
Existeix un codi enzimàtic per a cada tipus d’enzim: el de la bromelaïna de la tija (stem bromelain) és EC 3.4.22.32 [4] i el de la de la fruita (fruit bromelain) és EC 3.4.22.33.[5] Aquesta classificació es regeix segons el següent criteri:[3] [6][7]
- Tipus de reacció que catalitzen (classe): pertany al grup de les hidrolases (classe 3) ja que catalitza reaccions d'hidròlisi, és a dir, de degradació mitjançant aigua com a reactiu.
- Tipus d’enllaç que hidrolitzen (subclasse): enllaços peptídics (subclasse 4), d’aquí que també se’n faci referència com a hidrolases peptídiques o peptidases. Aquesta divisió a més, es subdivideix en exo- i endoproteases. Les bromelaïnes són endopeptidases i com a tals, actuen sobre les regions internes de les cadenes polipeptídiques, en contraposició a les exopeptidases que ho fan sobre zones terminals.
- Naturalesa del centre actiu (sub-subclasse): el centre actiu conté un residu de cisteïna que aporta un grup sulfhidril lliure necessari per la catàlisi enzimàtica. Per aquest motiu forma part del grup de les cisteïna proteases (sub-subclasse 22), també conegudes com tiol proteases.
- Número de sèrie que se l’atorga a l’enzim: és la xifra distintiva que identifica cada enzim dins del grup. És 32 en el cas de la bromelina de la tija i 33 en el de la fruita.
| Identificadors | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Número EC | 3.4.22.33 | ||||||||
| Bases de dades | |||||||||
| IntEnz | IntEnz view | ||||||||
| BRENDA | BRENDA entry | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme view | ||||||||
| KEGG | KEGG entry | ||||||||
| MetaCyc | metabolic pathway | ||||||||
| PRIAM | profile | ||||||||
| Estructures PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum | ||||||||
| |||||||||
Estructura
La bromelaïna de la tija és un polipèptid glicosilat que conté manosa, xilosa, fucosa i N-acetil-D-glucosamina.[7] Es tracta d'una sola cadena de 285 aminoàcids que es plega per formar una estructura secundària.[8] A més, conté tres ponts disulfur i està formada per dos subdominis ben diferenciats que es coneixen com L- i R- en referència a la seva posició.[9] El primer (L-) està format majoritàriament per hèlix-α, mentre que el segon (R-) està format per una làmina-β antiparal·lela (que forma el nucli d'aquest subdomini) i dos hèlix-α (situades a la regió superficial en extrems oposats de la làmina-β).[10] Aquesta disposició (L- i R-) possibilita que en la interfase d’aquests subdominis es formi una fenedura en forma de V a la superfície de l’enzim, en la qual els substrats es poden unir (zona activa).[11]
El centre actiu està format per quatre residus: un par iònic de cisteïna (Cys26) i histidina (His158) i com a suport, un d’asparagina (Asn179) i glutamina (Gln20) per ajudar a estabilitzar l’intermediari enzim-substrat que es forma durant la catàlisi. D’aquests, els de cisteïna i histidina es troben en subdominis oposats (L i R respectivament).[11]
Quant a la seva activitat i especificitat, la bromelaïna de la fruita té afinitat per la cadena Bz-Phe-Val-Arg-NHMec,[12] mentre que la de la tija té preferència per substrats que contenen la seqüència Arg-Arg, com la cadena Z-Arg-Arg-NHMec.[13]
Mecanisme d’acció
Per a que hi hagi activitat catalítica el grup tiol de l’enzim ha de trobar-se en forma reduïda i per això es requereix un medi reductor i àcid.[14]
El procés catalític s’inicia amb la unió no covalent de l'enzim lliure i el substrat peptídic, que genera un complex intermediari inestable. Aquest es forma mitjançant l’atac nucleofílic del grup tiol (-SH) de la cisteïna al grup carbonil (C=O) de l’enllaç peptídic del substrat i és estabilitzat pel residu de glutamina (Gln20). Això només és possible si els residus de cisteïna i histidina es troben en forma ionitzada com a ió tiolat (S-) i imidazol (ImH+). A continuació es produeix l'acilació de l'enzim i com a conseqüència es forma i allibera una amina (R’-NH₂). Finalment es produeix una desacilació, en la que el complex acil-enzim reacciona amb una molècula d'aigua per alliberar el grup carboxílic (-COOH) i així regenerar l'enzim lliure. A partir d’aquí es pot iniciar un nou cicle catalític.[15]
Propietats catalítiques
S’ha de distingir entre els dos tipus de bromelaïna.
La bromelaïna de la tija té un pes molecular de 24,5 kDa i un punt isoelèctric (pI) de 9,55 pel que es considera una proteïna força bàsica.[13] Presenta activitat enzimàtica en un ampli rang de condicions, té un pH òptim de 6-8,5 [14] però es manté més o menys estable entre pH de 7-10 per a la majoria dels seus substrats [13] i una temperatura òptima d’entre 50 i 60 ºC.[14]
La bromelaïna de la fruita té un pes molecular de 25 kDa[14] i un punt isoelèctric (pI) de 4,6 pel que es considera una proteïna relativament àcida.[12] Té un pH òptim de 4,5 però es manté activa entre pH de 3,5-5,5 [16] i una temperatura òptima d’entre 50 i 60 ºC.[17] Cal destacar que té encara més activitat proteolítica i una especificitat més àmplia pels enllaços peptídics que la bromelaïna de la tija.[14]
Fonts i mètodes d’obtenció
Natural
La bromelaïna no està present a les etapes inicials del desenvolupament del fruit i és, a mesura que aquest madura, quan la seva concentració augmenta. De fet, la pinya tropical es caracteritza i diferencia d’altres fruites (ex: la papaia i les figues) en que conté una quantitat relativament elevada de proteases quan és madura.[2]
La producció de bromelaïna de forma industrial comprèn una sèrie de processos diversos: l’extracció, la purificació, l’assecatge i l’envasament.[2]
L'extracció de la proteasa comença amb la obtenció del suc de la pinya a partir de la trituració de les parts seleccionades (part carnosa de la fruita o tija) per mitjà d’una liquadora, d’aquesta manera es facilita el trencament del teixit vegetal i la sortida del líquid o extracte enzimàtic cru que conté la bromelaïna.
La purificació consisteix en la separació de l’enzim que es vol aïllar de qualsevol matèria indesitjable. L’objectiu és retirar impureses i aconseguir l’homogeneïtat de l’extracte. El correcte i eficient desenvolupament d’aquesta fase és clau, ja que afecta el grau de puresa i rendiment que s’obté, l’activitat de l’enzim i influeix en els costos generals del procés.[2]
Habitualment aquesta etapa es realitza per mètodes convencionals però existeixen altres alternatives més modernes.
- Purificació per mètodes convencionals:[2]
És útil i un bon procediment de pre-purificació per a concentrar i incrementar la recuperació de bromelaïna tot i que és un procés tediós i que al involucrar varies etapes resulta en rendiments enzimàtics baixos. Consisteix en una centrifugació i ultrafiltració per membranes.
La centrifugació és el procés pel qual s’eliminen compostos sòlids. Afavoreix la disrupció de les cèl·lules vegetals i l’alliberació dels enzims intracel·lulars sense desnaturalització. Posteriorment és necessària una filtració.
La ultrafiltració és un dels millors mètodes per a concentrar proteïnes i permet eliminar altres soluts de menor pes molecular. Tot i així a l’extracte proteic poden quedar restes de pigments, carbohidrats, fibres i lípids, que s'eliminen utilitzant una mescla d'aigua/alcohol. Ara bé, per evitar la desnaturalització de l’enzim i la modificació del seu centre actiu s’ha de minimitzar l’ús de dissolvents orgànics.[3]
Té l’avantatge de que és més eficaç, més econòmic, permet millorar el rendiment enzimàtic, proporciona una major selectivitat i puresa del producte final i implica menys passos. Tanmateix, és car per a la recuperació de producte, presenta problemes d’estabilitat i gran part de les aplicacions comercials de la bromelaïna no requereixen un alt nivell de puresa. Es consideren d’aquest tipus: la filtració en gel, la cromatografia d’intercanvi iònic i la d’afinitat, l’extracció micel·lar inversa i l’extracció aquosa en dues fases.
La filtració en gel es basa en la separació per mida molecular de proteïnes, polisacàrids, àcids nucleics i altres macromolècules. És un tipus de cromatografia que separa les molècules entre una fase mòbil i una fase estacionaria que consta d’una matriu porosa de porositat definida (desitjada).
La cromatografia d’intercanvi iònic també es basa en les propietats àcid-base de les proteïnes. La fase estacionària consisteix en una columna de resina amb anions i cations ja que les proteïnes són amfòteres i sol ser de carboximetilcel·lulosa (CMC) o dietilaminoetil-cel·lulosa (DEAE-cel·lulosa). La CMC com té càrrega negativa, és un intercanviador de cations feble i la DEAE-cel·lulosa al tenir càrrega positiva, n’és un d'anions.
La cromatografia d’afinitat es basa en la separació per interacció química d’alta especificitat entre enzim i substrat. Les cromatografies en general comporten múltiples etapes, tenen una capacitat de mostra petita, la separació és poc eficient i impliquen costos elevats però són altament específiques.
L’extracció aquosa en dues fases es basa en la transferència de massa entre dues fases líquides immiscibles: una mescla de dos polímers incompatibles (polietilenglicol i dextrà) o d’un polímer i una sal, amb una solució rica en aigua. A l’afegir l’enzim a aquestes fases, mostra afinitat per una de les dues fases permetent la seva separació. En la distribució de l’enzim entre aquestes dues fases influeixen la força iònica, el pH, la temperatura, el pes molecular del polímer i el tipus de sal. Un aspecte molt positiu és que com un 70-80 % de les mescles és aigua, redueix la desnaturalització de l’enzim, a més és un mètode econòmic i la separació requereix poc temps.
L’extracció micel·lar inversa produeix la separació de l’enzim d’un dissolvent orgànic en forma de gotes per la presència de tensioactius (micel·les). El que succeeix és que les regions polars (hidròfiles) i no polars (hidròfobes) de la micel·la, indueixen el moviment de la proteïna al seu interior (que sigui solubilitzada). Aquest es veu afectat pel pH, la força iònica de la fase aquosa i la concentració de tensioactius. Té l’avantatge de ser un procés senzill i eficient des del punt de vista energètic, fàcil de traslladar a gran escala i de desenvolupar en continu. Tot i així és difícil recuperar la proteïna del dissolvent que conté restes de tensioactius.
Després de la purificació s’obté una fracció rica en proteasa, que es sotmet a un assecatge mitjançant una liofilització o deshidratació per congelació, en la que és important l’ús de crioprotectors per minimitzar la desnaturalització de l’enzim.[2]
Al final s’obté un extracte en pols groguenc que requereix d’un envasament amb un material adequat que eviti l’absorció d’humitat.[2]
ADN recombinant
Per fer front a l’elevada demanda d’aquest enzim a la indústria, sorgeix una alternativa a la producció per medis naturals: la bromelaïna recombinant.[8]
La tecnologia d’ADN recombinant es pot aplicar a la producció i modificació d’enzims d’interès alimentari i es basa en la clonació. Primer s’obté el gen que codifica per a la proteïna d’interès (bromelaïna procedent de A. comosus) i després s’insereix en un vector de clonació amb una alta capacitat de replicació (plasmidi). Durant aquest procés a més es poden inserir en el plasmidi elements per facilitar la purificació de l’enzim. Finalment el vector que conté el gen clonat s’introdueix en una cèl·lula hoste (fàbrica cel·lular) que és qui produirà l’enzim desitjat. Aquests hostes acostumen a ser de naturalesa bacteriana (Escherichia coli o Bacillus subtilis) o fúngica (Saccharomyces, Kluyveromyces o Pichia pastoris).[7]
Aquesta tècnica permet la sobreproducció d’enzims, simplificar el procés de purificació i reduir els costos de producció. Els enzims i proteïnes recombinants que s’obtenen són de major puresa, homogenis i poden produir-se fàcilment en gran quantitat i poc temps (dies), el que no succeeix mitjançant els mètodes convencionals de producció. També és un gran avantatge que no depèn de factors externs com en l’obtenció per medis naturals (planta vegetal).[7][8]
Per aconseguir la bromelaïna recombinant es clona i expressa el gen de la bromelaïna en E. coli.[2]
Addicionalment, al gen que es clona se li poden fer modificacions a la seva seqüència amb la finalitat de millorar alguna activitat catalítica (ex: termoestabilitat, eficiència catalítica, especificitat...) que faciliti el seu ús en la indústria.[2][7]
Àmbit d’aplicació a la indústria alimentària
Les proteases representen el 60% de tots els enzims comercialitzats en el món i tenen una gran varietat d'aplicacions industrials.[8]
Forma de presentació
La mida de partícula, la coloració i format depenen de factors com: el mètode de processament i les condicions d’operació, la matriu en la qual es pretén aplicar (si és sòlida o líquida) o l’ús previst (directament sobre la superfície de l’aliment, en solució o en forma d’injecció).
Per exemple, entre els mètodes més habituals per a produir proteïna en pols (atomització i liofilització), l’assecatge per polvorització permet controlar la mida, forma i morfologia de les partícules, que tendeix a ser esfèrica. A més el color de la pols obtingut és més fosc. Amb la liofilització, en canvi, s’obtenen formes menys definides (amorfes) i de coloració clara.[19]
Tenderització de la carn
A la indústria càrnia interessa controlar la tendresa de la carn ja que no només és una característica que determina la qualitat del producte final, sinó que també pot ser una manera d’aportar valor afegit a peces càrnies de menor categoria.[20]
En realitat en la transformació del múscul en carn de forma natural ja es desenvolupen reaccions d’auto proteòlisi mitjançant enzims endògens (catepsines, calpaïnes), tot i així l’ús de proteases vegetals és una alternativa que permet accelerar el procés.
La bromelaïna és capaç d’hidrolitzar algunes proteïnes miofibril·lars i té un gran efecte proteolitzador sobre carn de pollastre, calamar i vedella, així com en la d’ostra. De fet s’ha vist que marinar aquests aliments amb aquesta proteasa pot reduir la fermesa en més d’un 61%, encara que alhora pot provocar un entendriment excessiu en la superfície i per tant, una textura pastosa en el producte aplicat.[21]
En general aquest enzim millora les característiques sensorials i la tendresa de la carn en comparació amb d’altres enzims exògens i s’utilitza en forma líquida o en pols.
Quant a la textura, l’acció proteolítica permet reduir la duresa, gomositat i força de cohesió de la carn, a més de millorar la masticabilitat, disminuir l’elasticitat i la resistència al tall. És més, la possibilitat d’estovar la carn i els productes carnis pot millorar l’acceptabilitat de peces menys tendres per part dels consumidors, per exemple, persones amb dificultat en la masticació.[22]
Pel que fa al color, no es veu afectat en productes crus (refrigerats) ja que en aquestes condicions les proteases tenen poca activitat. Gran part de l’activitat enzimàtica ocorre durant el procés de cocció, en que les temperatures són superiors a 65 ºC. Els productes cuinats tractats amb proteases, adopten una coloració opaca que està relacionada amb la desnaturalització de la mioglobina i de l’actina i miosina (proteïnes contràctils).[22]
Una altra conseqüència de la proteòlisi del múscul és la millora i potenciació del flavor. Per una banda genera i acumula aminoàcids lliures i pèptids que contribueixen al sabor característic de la carn [8] i per l’altra, a l’hidrolitzar les proteïnes miofibrilars (exposar els grups sulfhidril) augmenta la seva capacitat per unir-se a components aromàtics.[23]
D’altra banda la proteòlisi del múscul allibera aminoàcids que poden reduir el pH. Amb la baixada del pH, també disminueix la disponibilitat dels grups reactius de les proteïnes per a interaccionar amb les molècules d’aigua i hi ha una lleugera desnaturalització de les miofibril·les que contribueixen a la retenció d’aigua. Tot plegat i juntament amb la mobilització de l’aigua de l’espai miofibril·lar cap a l’extracel·lular, genera una reducció de la capacitat de retenció d’aigua en la matriu.[23]
Producció d’hidrolitzats proteics
La hidròlisi de proteïnes, mediada per la bromelaïna, provoca l’alliberació d’aminoàcids lliures i pèptids, que actuen com a agents aromatitzants i contribueixen al flavor, i d’altres hidrolitzats proteics com són els pèptids bioactius. Aquests tenen efectes beneficiosos en la salut i es poden utilitzar com a suplements nutricionals, ingredients farmacèutics i potenciadors del gust.[8]
Els hidrolitzats proteics també tenen l’avantatge de tenir propietats funcionals d’interès, com per exemple activitat antioxidant i antimicrobiana,[8] característiques fisicoquímiques millorades (solubilitat, capacitat emulsionant, gelificant, escumant...) i una al·lergenicitat reduïda.[24]
Altres aplicacions
Panificació: s’utilitza per degradar el gluten ja que millora la qualitat de la massa: evita la seva contracció, millorar la seva mal·leabilitat, augmenta la seva solubilitat i afavoreix que augmenti de mida uniformement durant el procés de cocció. També s'usa per a produir farina hipoal·lergògena, gràcies a que hidrolitza l’estructura antigènica de la gliadina, la proteïna del gluten.[8]
Referències
- ↑ Bank, Azarkan, M., Charlier, P., Herman, R., Delbrassine, F., Sauvage, E., M Rabet, N., Calvo Esposito, R., Kerff, F. «6YCE: Structure the bromelain protease from Ananas comosus with a thiomethylated active cysteine» (en anglès). RCSB - Protein Data Bank.
- ↑ 2,00 2,01 2,02 2,03 2,04 2,05 2,06 2,07 2,08 2,09 2,10 2,11 Ramli, Aizi Nor Mazila; Aznan, Tuan Norsyalieza Tuan; Illias, Rosli Md «Bromelain: from production to commercialisation» (en anglès). Journal of the Science of Food and Agriculture, 97, 3-2017, pàg. 1386–1395. DOI: 10.1002/jsfa.8122.
- ↑ 3,0 3,1 3,2 David Troncoso, Franco; Alberto Sánchez, Daniel; Luján Ferreira, María «Production of Plant Proteases and New Biotechnological Applications: An Updated Review» (en anglès). ChemistryOpen, 11, 3-2022. DOI: 10.1002/open.202200017. ISSN: 2191-1363. PMC: PMC8919702. PMID: 35286022.
- ↑ «ExplorEnz: EC 3.4.22.32» (en anglès). The Enzyme Database. [Consulta: 4 gener 2023].
- ↑ «ExplorEnz: EC 3.4.22.33» (en anglès). The Enzyme Database. [Consulta: 4 gener 2023].
- ↑ «EC 3.4. Acting on Peptide Bonds (Peptidases)» (en anglès). International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). [Consulta: 3 gener 2023].
- ↑ 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 Badui Dergal, Salvador. Química de los alimentos. 5ª ed. Pearson, 2013, p. 744. ISBN 9786073215084.
- ↑ 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 8,7 Arshad, Zatul Iffah Mohd; Amid, Azura; Yusof, Faridah; Jaswir, Irwandi; Ahmad, Kausar «Bromelain: an overview of industrial application and purification strategies» (en anglès). Applied Microbiology and Biotechnology, 98, 01-09-2014, pàg. 7283–7297. DOI: 10.1007/s00253-014-5889-y. ISSN: 1432-0614.
- ↑ Novinec, Marko; Lenarčič, Brigita «Papain-like peptidases: structure, function, and evolution». BioMolecular Concepts, 4, 3, 01-06-2013, pàg. 287–308. DOI: 10.1515/bmc-2012-0054. ISSN: 1868-503X.
- ↑ Kamphuis, I. G.; Kalk, K. H.; Swarte, M. B. A.; Drenth, J. «Structure of papain refined at 1.65 Å resolution» (en anglès). Journal of Molecular Biology, 179, 2, 25-10-1984, pàg. 233–256. DOI: 10.1016/0022-2836(84)90467-4. ISSN: 0022-2836.
- ↑ 11,0 11,1 Azarkan, Mohamed; Maquoi, Erik; Delbrassine, François; Herman, Raphael; M’Rabet, Nasiha «Structures of the free and inhibitors-bound forms of bromelain and ananain from Ananas comosus stem and in vitro study of their cytotoxicity» (en anglès). Scientific Reports, 10, 11-11-2020, pàg. 19570. DOI: 10.1038/s41598-020-76172-5. ISSN: 2045-2322. PMC: PMC7658999. PMID: 33177555.
- ↑ 12,0 12,1 Rowan, Andrew D. Chapter 425 - Fruit Bromelain (en anglès). Academic Press, 2013, p. 1874–1875. DOI 10.1016/b978-0-12-382219-2.00424-5. ISBN 978-0-12-382219-2.
- ↑ 13,0 13,1 13,2 Rowan, Andrew D. Chapter 424 - Stem Bromelain (en anglès). Academic Press, 2013, p. 1871–1873. DOI 10.1016/b978-0-12-382219-2.00423-3. ISBN 978-0-12-382219-2.
- ↑ 14,0 14,1 14,2 14,3 14,4 Polaina, Julio; MacCabe, Andrew P. Industrial enzymes: structure, function and applications. 1ª ed. Springer, 2007, p. 641. ISBN 978-1-4020-5377-1.
- ↑ Grzonka, Zbigniew; Kasprzykowski, Franciszek; Wiczk, WiesŁaw. Cysteine Proteases. Springer, 2007, p. 181–195. DOI 10.1007/1-4020-5377-0_11. ISBN 978-1-4020-5376-4.
- ↑ «Reference to 3.4.22.33». BRENDA Enzyme Database. [Consulta: 3 gener 2023].
- ↑ «Reference to 3.4.22.33». BRENDA Enzyme Database. [Consulta: 3 gener 2023].
- ↑ Vasiljevic, Todor. Pineapple (en anglès). Elsevier, 2020, p. 203-225. DOI 10.1016/b978-0-12-817106-6.00010-1. ISBN 978-0-12-817106-6.
- ↑ Setthaya, Phatthawin; Jaturasitha, Sanchai; Ketnawa, Sunantha; Chaiyaso, Thanongsak; Sato, Kenji «Influence of Commercial Protease and Drying Process on Antioxidant and Physicochemical Properties of Chicken Breast Protein Hydrolysates» (en anglès). Foods, 10, 12-2021, pàg. 2994. DOI: 10.3390/foods10122994. ISSN: 2304-8158. PMC: PMC8700794. PMID: 34945544.
- ↑ Fernández-Lucas, Jesús; Castañeda, Daniel; Hormigo, Daniel «New trends for a classical enzyme: Papain, a biotechnological success story in the food industry» (en anglès). Trends in Food Science & Technology, 68, 01-10-2017, pàg. 91–101. DOI: 10.1016/j.tifs.2017.08.017. ISSN: 0924-2244.
- ↑ Madhusankha, G.D.M.P.; Thilakarathna, R.C.N. «Meat tenderization mechanism and the impact of plant exogenous proteases: A review» (en anglès). Arabian Journal of Chemistry, 14, 2-2021, pàg. 102967. DOI: 10.1016/j.arabjc.2020.102967.
- ↑ 22,0 22,1 Botinestean, Cristina; Gomez, Carolina; Nian, Yingqun; Auty, Mark A. E.; Kerry, Joseph P. «Possibilities for developing texture-modified beef steaks suitable for older consumers using fruit-derived proteolytic enzymes» (en anglès). Journal of Texture Studies, 49, 6-2018, pàg. 256–261. DOI: 10.1111/jtxs.12305.
- ↑ 23,0 23,1 Ketnawa, Sunantha; Rawdkuen, Saroat «Application of Bromelain Extract for Muscle Foods Tenderization» (en anglès). Food and Nutrition Sciences, 2, 05-07-2011, pàg. 393–401. DOI: 10.4236/fns.2011.25055.
- ↑ Parkin, Kirk L.; Damodaran, Srinivasan. Fennema Química de los alimentos. 4ª ed. Saragossa: Acribia, 2019, p. 1126. ISBN 978-84-200-1192-9.